一種催化速率提高的角蛋白酶突變體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種催化速率提高的角蛋白酶突變體及其制備方法，屬于酶工程領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】 陽(yáng)〇〇引角蛋白酶化eratinase)為一種可W特異性降解角蛋白的酶類，由真菌、放線菌和 細(xì)菌等多種微生物產(chǎn)生。角蛋白酶在食品、醫(yī)藥、飼料、精化和制革等工業(yè)中廣泛應(yīng)用，具 有嫩化肉類、生產(chǎn)高級(jí)營(yíng)養(yǎng)品、免疫制劑和飼料添加劑W及美容、軟化皮革等作用，并可導(dǎo) 致瘋牛病和人類克雅氏癥的阮蛋白（Prion)的降解。目前已經(jīng)報(bào)道的角蛋白酶基因主要 來(lái)自國(guó)外的一株地衣芽胞桿菌的kerA基因。雖然角蛋白酶有著巨大的應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值， 但是從野生菌中篩選出的角蛋白酶催化效率低，底物專一性不高，不能耐鹽耐去垢劑，大 大降低了角蛋白酶的開發(fā)和運(yùn)用。本發(fā)明將來(lái)自嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia)BBEll-l的角蛋白酶KerSMD進(jìn)行分子改造，提高角蛋白酶對(duì)底物催化速率， W及對(duì)高鹽高去垢劑環(huán)境的耐受性，對(duì)角蛋白酶的規(guī)?；a(chǎn)及推廣具有深遠(yuǎn)的技術(shù)指導(dǎo) 意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種催化速率提高的角蛋白酶突變體，所 述突變體是將來(lái)源于嗜麥芽窄食單胞菌的角蛋白酶KerSMD的C端結(jié)構(gòu)進(jìn)行剪切。
[0004] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述來(lái)源于嗜麥芽窄食單胞菌的角蛋白酶的氨基酸 序列如沈Q ID NO. 1所示。 陽(yáng)0化]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述剪切是根據(jù)角蛋白酶C端結(jié)構(gòu)主要是由六個(gè)反 向平行的P折疊組成，逐步去除P折疊結(jié)構(gòu)可W暴露平行膚鏈上活性氨基酸的位點(diǎn)，從而 采用選擇環(huán)狀結(jié)構(gòu)中間區(qū)域進(jìn)行剪切，得到各種新型突變體。
[0006] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述剪切是剪切掉第355位、第370位、第380位、 第395位、第415位或者第435位氨基酸之后的C端序列，得到的突變體分別命名為V355、 V370、V380、V395、V415、V435。
[0007] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述剪切是將第355位的亮氨酸后面所有的氨基酸 進(jìn)行去除。
[0008] 本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種所述突變體的制備方法，包括：
[0009] (1)根據(jù)目標(biāo)突變體的蛋白序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增或者化學(xué)合成法得到含有編 碼角蛋白酶突變體的核巧酸片段；
[0010] (2)將上一步得到的突變體的核巧酸片段連接到質(zhì)粒祀T2化中，得到重組質(zhì)粒；
[0011] (3)將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌化21 〇)E3)得到重組菌，將重組菌發(fā)酵培養(yǎng)， 得到的發(fā)酵上清液即含有角蛋白酶突變體。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵是將重組菌于37°C培養(yǎng)至0的。。=0. 6,然 后降溫至20°C并加入終濃度0.1 mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)7化時(shí)離屯、獲得上清酶液。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述制備方法還進(jìn)一步包括使用AKTA蛋白純化儀 和HisTrap FF crude 1ml的儀柱對(duì)發(fā)酵上清液中的角蛋白酶進(jìn)行純化。
[0014] 本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種提高角蛋白酶催化速率的方法，所述 方法是將氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的角蛋白酶KerSMD的C端結(jié)構(gòu)進(jìn)行剪切；所述剪 切是將角蛋白酶KerSMD的C端末尾六個(gè)P折疊序列逐步去除并選擇環(huán)狀結(jié)構(gòu)中間區(qū)域進(jìn) 行剪切。
[0015] 本發(fā)明還要求保護(hù)編碼所述突變體的基因W及表達(dá)所述突變體的基因工程菌。
[0016] 本發(fā)明也要求保護(hù)所述突變體在食品、飼料、化工、制革或者制備藥物方面的應(yīng) 用，尤其是在制備日化洗涂產(chǎn)品、在皮革領(lǐng)域或者在飼料消化中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的有益效果：
[0018] 通過(guò)對(duì)角蛋白酶KerSMD的C端結(jié)構(gòu)進(jìn)行剪切，本發(fā)明得到了一系列對(duì)酪蛋白底 物催化速率明顯提高的角蛋白酶突變體，催化速率提高了 33% -103%。而且突變體V355、 V370 的酶活分別比原始酶 KerSMD 提高了 20. 5%、41. 35%，突變體 V435、V380、V370、V355 在5%鹽濃度下的酶活也得到了提升，此外V355還具有顯著增強(qiáng)的抗去垢劑SDS能力。本 發(fā)明的角蛋白酶，尤其是V355,在洗涂、紡織、飼料消化、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1 :角蛋白酶KerSMD的C端預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)序列和構(gòu)建不同C端剪切突變體示 意圖；
[0020] 圖2 :角蛋白酶KerSMD及其突變體的SDS-PA(iE電泳圖；M，蛋白分子量仙a)，所有 蛋白的分子大小接近43kDa; 陽(yáng)02U 圖3 :角蛋白酶突變體V355,野生酶KerSMD化及堿性蛋白酶對(duì)降解牛跟腫膠原I 型蛋白的SDS-PAGE分析圖；左邊下劃線的=個(gè)樣品是反應(yīng)上清液，中間和右邊=個(gè)樣品是 膠原蛋白的反應(yīng)沉淀蛋白；
[0022] 圖4 :角蛋白酶KerSMD及其突變體在不同食鹽濃度下的酶活比較；
[0023] 圖5 :角蛋白酶KerSMD及其突變體在不同濃度去垢劑SDS下的酶活比較。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 角蛋白酶的酶活力測(cè)定原理：角蛋白酶屬于蛋白酶，可W水解酪蛋白底物，釋放出 酪氨酸，通過(guò)酪氨酸與福林酪顯色，在660nm下測(cè)定吸光度值。吸光值的大小直接與酶活力 的高低成正比。
[0025]角蛋白酶酶活力測(cè)定步驟：0.1血經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液，加入0.1血的1 % (w/v)酪 蛋白底物（使用前和0.1mol/L的抑9. 0的Gly-NaOH緩沖液混合），在50°C反應(yīng)20min，每個(gè) 反應(yīng)樣品中加入0. 2血TCA反應(yīng)終止蛋白沉淀劑，搖勻后10, OOOr/min離屯、5min，取0. 2血 上清液加入ImL的4% (wAONazCA，再加入0. 2mL上海生工公司購(gòu)買的福林酪試劑（預(yù)先 稀釋3倍）在50°C下反應(yīng)15分鐘。使用0. 5cm的石英比色杯測(cè)定清液在660皿處的吸光 值?？瞻讓?duì)照是在加入底物之前已經(jīng)加入同等體積的TCA終止酶活，其他步驟相同。酶活 定義為每毫升酶液每分鐘釋放出多少微克酪氨酸。
[0026] 角蛋白酶催化速率測(cè)定方法：采用合成性底物succin}d-Ala-Ala-P;r〇-Phe-pNA( AAP巧，溶解在含有5% (v/v)的二甲基甲酯胺的lOOmM化is-HCl緩沖液中，pH 9.0,在25°C 下測(cè)定405皿（e 4。5= 9600M 1畑11)處每秒鐘吸光度變化值。采用酶的濃度在1. 5x 10 8M左 右，底物濃度在0. 1和1. 5mM之間。并采用非線性回歸分析得出反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
[0027] 實(shí)施例1表達(dá)角蛋白酶C端剪切突變體的重組菌的制備
[0028] (1)根據(jù)C端特殊的P折疊結(jié)構(gòu)，確定剪切位點(diǎn)如圖1。然后使用一對(duì)攜帶雙 酶切位點(diǎn)化〇1和化〇1的引物（表1)，W含有嗜麥芽窄食單胞菌（stenotrophomonas maltophilia)BBEll-l (于2011年4月3日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏編號(hào)為 CCTCC No :M 2011193)角蛋白酶基因kerSMD的質(zhì)粒祀T22b+kerSMD為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增。反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5min后進(jìn)入一下循環(huán)：98°C變性10s，55°C退火10s，72°C延 伸71111115〇3,30個(gè)循環(huán)；72°(：延伸11111115〇3，然后再降溫到12°(：得到最終反應(yīng)液。使用的 DNA擴(kuò)增酶為TaKaRa公司的Primer STAR,使用配