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凝乳性天冬氨酸蛋白酶組合物的制作方法

文檔序號:9650228閱讀:621來源:國知局
凝乳性天冬氨酸蛋白酶組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及液態(tài)或干燥粒狀的凝乳性天冬氨酸蛋白酶組合物和一種分離目的凝 乳性天冬氨酸蛋白酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳凝固酶(例如凝乳酶和胃蛋白酶)使奶發(fā)生酶促凝結(jié)是干酪制造中最重要的過 程之一。酶促乳凝結(jié)是兩階段工藝:第一階段,在此階段,蛋白水解酶、凝乳酶或胃蛋白酶攻 擊κ -酪蛋白,導(dǎo)致酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)的亞穩(wěn)態(tài),和第二階段,在此階段,奶隨后凝結(jié)并且形 成凝結(jié)物。
[0003] 凝乳酶(EC 3. 4. 23. 4)和胃蛋白酶(EC 3. 4. 23. 1)(哺乳動物胃的乳凝固酶)是 屬于一個(gè)肽酶大類的天冬氨酸蛋白酶。
[0004] 商業(yè)上相關(guān)的乳凝固酶產(chǎn)品通常是液態(tài)組合物,且在所屬領(lǐng)域中描述了用于使產(chǎn) 品中的乳凝固酶穩(wěn)定的多種不同方法,例如為了提高酶的儲存穩(wěn)定性。
[0005] 舉例來說,EP2333056A1(DSM,申請日12. 04. 2007)描述了甲酸酯、乙酸酯、乳酸 酯、丙酸酯、蘋果酸酯、富馬酸酯或丙二醇可以增加液態(tài)組合物/產(chǎn)品中的天冬氨酸蛋白酶 的穩(wěn)定性。
[0006] W02012/127005A1 (DSM)描述了一種穩(wěn)定的液態(tài)凝乳酶組合物,其包含濃度為 2-100g/kg的無機(jī)鹽和防腐劑,例如甲酸酯、乙酸酯、乳酸酯、丙酸酯、蘋果酸酯、苯甲酸酯、 山梨酸酯或富馬酸酯、乙二醇(乙二醇)、丙二醇(丙二醇)、甘油、赤蘚糖醇、木糖醇、甘露 醇、山梨糖醇、肌醇或半乳糖醇。
[0007] 聚乙二醇(PEG)是環(huán)氧乙烷的聚合物,其可替代性地被稱為聚氧乙烯(POE)。PEG 是以例如300g/mol到10, 000, 000g/m〇l的廣范圍分子量市售的。
[0008] US5139943(Genencor,1992年8月18日公開)描述了使用PEG通過所謂的液液兩 相系統(tǒng)回收由微生物生產(chǎn)的凝乳酶,其中將PEG和無機(jī)鹽添加到發(fā)酵基質(zhì)/啤酒中以便形 成液液(水性)兩相系統(tǒng),然后從PEG相中回收/分離凝乳酶。在工作實(shí)施例中,描述了使 用約4-5% wt/vol PEG8000和約10% wt/vol硫酸鈉鹽以便能夠獲得液液(水性)兩相系 統(tǒng)。
[0009] US7998705B2(Fujifilm,2011年8月16日公開)描述了使用PEG增加高鹽溶液 (例如細(xì)胞培養(yǎng)肉湯)在離子交換色譜樹脂上的動態(tài)結(jié)合能力,從而能夠純化目的蛋白質(zhì)。 作為目的蛋白質(zhì)的實(shí)例,提及了牛球蛋白、牛血清白蛋白和溶菌酶,但是沒有明確提及乳凝 固酶(例如凝乳酶)。在工作實(shí)施例(參見例如實(shí)施例1)中描述了通過使用約6% w/v的 PEG (優(yōu)選地PEG4600)獲得最佳的蛋白質(zhì)回收,例如,使用僅0. 5 % PEG對蛋白質(zhì)回收/分 離幾乎沒有積極影響。
[0010] 如所屬領(lǐng)域中已知的,術(shù)語聚乙二醇化作用(PEGylation)涉及聚乙二醇(PEG)結(jié) 構(gòu)與另一個(gè)更大分子(例如治療蛋白質(zhì))共價(jià)偶聯(lián)的行為(所述更大分子于是被稱為經(jīng)過 聚乙二醇化)。通過增加分子的分子量,聚乙二醇化作用可以賦予優(yōu)于未改性形式的若干顯 著的藥理學(xué)優(yōu)點(diǎn),例如改善的藥物溶解度、降低的給藥頻率。
[0011] US2011/0008846A1 (Qiagen)描述工業(yè)用酶的聚乙二醇化作用,且在一長串提及的 合適工業(yè)用酶內(nèi)提及粗制凝乳酶(凝乳酶)作為合適工業(yè)用酶的一個(gè)實(shí)例。工作實(shí)施例僅 涉及聚合酶的聚乙二醇化,即,沒有工作實(shí)施例涉及粗制凝乳酶(凝乳酶)的聚乙二醇化。
[0012] 本f中可能相關(guān)的是,應(yīng)灃意以h引用的現(xiàn)有摶術(shù)參考f獻(xiàn)都沒有描沭PEG可以 增加天冬氨酸蛋白酶乳凝固酶(例如凝乳SS)的穩(wěn)宙件。
[0013] DE1492060A1 (Nordmark-Werke GmbH,1969 年公開)公開了一種通過以 l_20wt% (相當(dāng)于1000 Oppm到200000ppm)的濃度添加分子量為400-6000的PEG來制造胃蛋白酶組 合物的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明打算解決的一個(gè)問題是提供一種新穎的凝乳性天冬氨酸蛋白酶(例如凝 乳酶)組合物,其中所述天冬氨酸蛋白酶具有增加的穩(wěn)定性和/或活性。
[0015] 本發(fā)明打算解決的另一個(gè)問題是提供一種用于分離天冬氨酸蛋白酶(例如凝乳 酶)的新穎方法,其中所述方法可以使分離的天冬氨酸蛋白酶組合物具有增加的活性。
[0016] 解決方案是基于諸位發(fā)明人已經(jīng)確定,通過將PEG或類似的經(jīng)取代聚氧乙烯(例 如Brij35)添加到凝乳酶中,可以顯著提高凝乳酶的物理穩(wěn)定性。
[0017] 本文圖1顯示PEG和Bri j35的結(jié)構(gòu)。
[0018] 如本文的工作實(shí)施例中所論述,通過色譜法純化重組生產(chǎn)的牛凝乳酶 (CHY-MAX' Chr. Hansen A/S)和胳盤凝乳酶(.CHY-MAX? M,Chr. Hansen A/S),其 中在從柱上洗脫之前添加 PEG8000和Bri j35,或者將PEG8000和Bri j35添加到洗脫緩沖液 中。
[0019] 相比在未添加 PEG/Brij35的情況下純化的對照樣品,含有PEG8000或Bri i35的 樣品的比活件增加了 1. 5到2倍(參見本文工作實(shí)施例2中的論述和本文圖2)。
[0020] 凝乳酶的顯著增加的比活件的效果令諸位發(fā)明人吃驚,尤其閔為其可以在蛋白質(zhì) 分離后立即看到。
[0021] 這種立即的觀察到的增加的比活性不能如下解釋:PEG/Brij35僅例如通過減少 可能的長期儲存沉淀問題來增加酶的長期儲存穩(wěn)定性,因?yàn)樵诟鶕?jù)本文中的工作實(shí)施例中 所用的純化方案/方法分離蛋白質(zhì)之后,沒有立即出現(xiàn)酶的顯著沉淀,即,在未添加 PEG/ Brij35的對照實(shí)驗(yàn)中,在蛋白質(zhì)分離之后也沒有立即出現(xiàn)酶的顯著沉淀。
[0022] 不希望夸限于理論,認(rèn)為PEG/Bri i35對凝乳酶提供增加的構(gòu)象穩(wěn)宙件,并目這可 以解釋在本文工作實(shí)施例中所觀察到的立即觀察到的增加的比活性。
[0023] 不希望夸限于理論,認(rèn)為在現(xiàn)有摶術(shù)中還沒有描沭或律議PEG或在結(jié)構(gòu)h類似的 聚合物可以增加天冬氨酸蛋白酶乳凝固酶(例如凝乳S每)的穩(wěn)宙件,尤其是還沒有描述可 以增加構(gòu)象穩(wěn)定性。
[0024] 本文圖3中說明了酶的構(gòu)象穩(wěn)定性。
[0025] 如所屬領(lǐng)域中已知的,構(gòu)象的損失等于酶活性的損失。
[0026] 在本f的工作實(shí)施例中,還證明了添加 PEG可以增加液杰和/或粒狀凝乳S每組合 物的長期儲存穩(wěn)宙件。
[0027] 不希望受限于理論,情況可能是,對于天冬氨酸蛋白酶乳凝固酶(例如凝乳酶)來 說,結(jié)構(gòu)構(gòu)象的損失可以導(dǎo)致在例如長期儲存期間在例如液態(tài)制劑中酶的沉淀增加。
[0028] 因此,情況可能是,PEG幫助減少乳凝固酶在儲存期間的沉淀,例如因?yàn)镻EG對酶 提供構(gòu)象穩(wěn)定性。
[0029] 聚乙二醇(PEG)是環(huán)氧乙烷的聚合物,且可被替代性地稱為聚氧乙烯(POE),PEG 的基于結(jié)構(gòu)的IUPAC命名為聚(氧乙烯)。
[0030] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員在本篇上下文中所理解的,Brij35可被稱為經(jīng)取代聚氧乙烯, 其中取代基可被視作本文圖1中所示的"C12"結(jié)構(gòu)。
[0031] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員在本篇上下文中所理解的,例如聚乙烯聚吡咯烷酮、聚乙烯醇、 聚乙酸乙烯酯、聚丙烯腈、聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯等聚合物可被視為在結(jié)構(gòu)上和功 能上與PEG/Bri j35有關(guān)。
[0032] 如所屬領(lǐng)域中已知的,聚合物可以是雜聚物或共聚物,其是衍生自兩種(或更多 種)單體物質(zhì)的聚合物,與之相反的是均聚物,其中僅使用一種單體。
[0033] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員在本篇上下文中所理解的,衍生自單體物質(zhì)環(huán)氧乙烷、乙烯聚 吡咯烷酮、乙烯醇、乙酸乙烯酯、丙烯腈、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯中的兩種(或更多種)的 共聚物在本篇上下文中可被視為在結(jié)構(gòu)上和功能上有關(guān)的。
[0034] 不希望受限于理論,認(rèn)為沒有明顯的技術(shù)原因讓人不相信在結(jié)構(gòu)上和功能上與 PEG/Bri j35有關(guān)的這些聚合物能實(shí)現(xiàn)凝乳性天冬氨酸蛋白酶穩(wěn)定性在本文中的相關(guān)改善。
[0035] 在本文的相關(guān)工作實(shí)施例中使用了 PEG8000和Bri j35,其分別具有8000g/mol和 1225g/mol的平均分子質(zhì)量。
[0036] 在本篇上下文中,認(rèn)為分子質(zhì)量(或者被稱為分子量(Mff))為200g/mol到 50,000g/mol的本文中相關(guān)聚合物將是合適的。
[0037] 在本篇上下文中,認(rèn)為重復(fù)單體/單元數(shù)(所謂的"η"數(shù)值)為n = 5到η= 1250 的本文中相關(guān)聚合物將是合適的。
[0038] 作為一個(gè)實(shí)例,在圖1中可以見到Bri j35具有η = 23。
[0039] 如所屬領(lǐng)域中已知的,η = 1250的PEG具有約50, 000g/mol的MW,且PEG8000具 有約 8, 000g/mol 的 Mff 和 η = 200。
[0040] 圖6顯示另一種本文中相關(guān)聚合物聚山梨酸酯20的一個(gè)實(shí)例,其包含總計(jì)20個(gè) 環(huán)氧乙烷單體。
[0041] 在本文的工作實(shí)施例4中證明了添加聚山梨酸酯20增加了所測試的液態(tài)凝乳性 天冬氨酸蛋白酶組合物的穩(wěn)定性。
[0042] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員在本篇上下文中所理解的,聚山梨酸酯20是就本文第一方面 的特征(c)來說,重復(fù)單體/單元數(shù)(所謂的"η"數(shù)值)為20的聚合物。
[0043] 舉例來說,使用圖6的命名法,聚山梨酸酯20可以例如具有w、x、y和ζ = 5,即各 自具有η = 5的4組單體。
[0044] 因此,如本領(lǐng)域技術(shù)人員在本篇上下文中所理解的,此類聚山梨酸酯20聚合物在 本篇上下文中將是就本文第一方面的特征(c)來說,具有η = 5X4 = 20的聚合物。
[0045] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員在本篇上下文中所理解的,在本篇上下文中相關(guān)的是所述聚合 物中存在的本文中相關(guān)單體(例如環(huán)氧乙烷)的數(shù)量。
[0046] 舉例來說,所述聚合物中存在的本文中相關(guān)單體(例如環(huán)氧乙烷)的總數(shù)對于例 如該聚合物的本文中相關(guān)分子質(zhì)量是重要的。
[0047] 因此,如本領(lǐng)域技術(shù)人員在本篇上下文中所理解的,與本文第一方面的特征(C) 有關(guān)的術(shù)語"重復(fù)單體"涉及所述聚合物中存在的本文中相關(guān)單體(例如環(huán)氧乙烷)的總 數(shù)。
[0048] 如所屬領(lǐng)域中已知的,凝乳性天冬氨酸蛋白酶可被視為在結(jié)構(gòu)上相對類似的。
[0049] 如所屬領(lǐng)域中已知的,從不同的哺乳動物或真菌物種(例如牛、駱駝、羊、豬或毛 霉)獲得的不同天然野生型凝乳性天冬氨酸蛋白酶多肽序列具有相對較高的三級結(jié)構(gòu)相 似性。
[0050] 在本文圖4中提供來自于不同的哺乳動物物種(奶牛、水牛、山羊、綿羊、駱駝和 豬)的本文中相關(guān)的不同凝乳性凝乳酶序列的比對,如圖4中可以見到,所述序列具有緊密 的序列關(guān)系且已知具有非常高的三級結(jié)構(gòu)相似性。
[0051] 在本文圖5中提供來自于不同哺乳動物或真菌物種的本文中相關(guān)的市售的不同 凝乳性天冬氨酸蛋白酶序列(駱駝凝乳酶、奶牛凝乳酶、奶牛胃蛋白酶、真菌毛霉胃蛋白酶 和真菌內(nèi)座殼屬(Endothia)胃蛋白酶)的比對。
[0052] 可以說圖5的5種不同序列并不是高度相同,但是如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,所有 這5種不同的凝乳性天冬氨酸蛋白酶已知都具有較高的三級結(jié)構(gòu)相似性。
[0053] 如上文所論述的和在本文工作實(shí)施例中所示的,對于牛凝乳酶和駱駝凝乳酶已經(jīng) 證明了本文中相關(guān)的提高/增加的穩(wěn)定性。
[0054] 不希望受限于理論,認(rèn)為沒有明顯的技術(shù)原因使人不相信本文中相關(guān)的提高/增 加的穩(wěn)定性效果相關(guān)于一般性的凝乳性天冬氨酸蛋白酶一一如上文所論述的,已知所述天 冬氨酸蛋白酶具有較高的三級結(jié)構(gòu)相似性,并且如本領(lǐng)域技術(shù)人員在本篇上下文中所理解 的,這種三級結(jié)構(gòu)相似性使得以下情況顯得合理:本文描述的提高穩(wěn)定性的聚合物-酶相 互作用將是在結(jié)構(gòu)上類似的本文中相關(guān)的凝乳性天冬氨酸蛋白酶的一般性的類效果。
[0055] 因此,本發(fā)明的第一方面涉及一種液態(tài)凝乳性天冬氨酸蛋白酶組合物,其包含:
[0056] (i):強(qiáng)度為25頂CU/g所述組合物到3000(HMCU/g所述組合物的凝乳性天冬氨酸 蛋白酶;
[0057] (ii):濃度為Ippm到10000ppm(w/w)的聚合物,以及
[0058] (iii)濃度為 lg/kg 到 350g/kg 的鹽;
[0059] 且其中所述組合物的pH為2到8 ;
[0060] 且其中所述聚合物是具有以下特征(a)、(b)和(c)的聚合物:
[0061] (a):所述聚合物是選自由以下各項(xiàng)組成的單體群組的至少一種單體的聚合物: 環(huán)氧乙燒、乙烯聚吡咯烷酮、乙烯醇、乙酸乙烯酯、丙烯腈、丙烯酸酯和甲
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