一種高活力酸性蛋白酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶制劑制備技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種高活力酸性蛋白酶。
【背景技術(shù)】
[0002]酸性蛋白酶是一類(lèi)最適pH值為2.5-5.0的天冬氨酸蛋白酶，相對(duì)分子質(zhì)量為30000—40000。酸性蛋白酶主要來(lái)源于動(dòng)物的臟器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根據(jù)其產(chǎn)生菌的不同，微生物蛋白酶可分為霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和擔(dān)子菌酸性蛋白酶。根據(jù)作用方式可分為兩類(lèi):一類(lèi)是與胃蛋白酶相似，主要產(chǎn)酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一類(lèi)是與凝乳酶相似，主要產(chǎn)酶微生物是毛霉等。由于酸性蛋白酶具有較好的耐酸性，因此被廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、輕工、皮革工藝以及飼料加工工業(yè)中。國(guó)外關(guān)于酸性蛋白酶的研究和生產(chǎn)從20世紀(jì)初就開(kāi)始了。乞今為止，已發(fā)現(xiàn)不少微生物可以產(chǎn)生酸性蛋白酶，如黑曲霉(Aspergillus niger)、大孢子黑曲霉突變株(A.niger var.microsporus)、根霉(Rhizopus sp.)、微小毛霉(M.pusillus)、粘紅酵母(Rhdotorula glutinis)、粟疫霉(Endothia parasitica)、血紅色陀螺孔菌(Trametessanguinca)、芽枝霉(Cladosporium sp.)等。1903年,德國(guó)科學(xué)家從動(dòng)物的胰臟中提取出胰蛋白酶，并將其用于皮革的柔制。1911年美國(guó)科學(xué)家從木瓜中提取木瓜蛋白酶，并將木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白渾濁物。自1954年吉田首次發(fā)現(xiàn)黑曲霉可產(chǎn)生酸性蛋白酶以來(lái)，國(guó)內(nèi)外開(kāi)始對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)酸性蛋白酶進(jìn)行了廣泛的研究。1964年國(guó)外科學(xué)家發(fā)現(xiàn)大孢子黑曲霉突變體能產(chǎn)生兩種不同的酸性蛋白酶。1965年又從血紅色陀螺孔菌產(chǎn)酸性蛋白酶，并對(duì)該酶進(jìn)行了純化和結(jié)晶。1968年從微小毛霉發(fā)酵物中篩選出一種酸性蛋白酶，并對(duì)其進(jìn)行了純化和酶學(xué)性質(zhì)分析。1995年國(guó)外科學(xué)家對(duì)煙曲霉酸性蛋白酶的基因進(jìn)行了克隆和測(cè)序。2001年又從假絲酵母中篩選出一種酸性蛋白酶菌株，并對(duì)該酶進(jìn)行了核苷酸序列分析和功能分析。到目前為止，國(guó)外科學(xué)家對(duì)酸性蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能等已經(jīng)進(jìn)行了廣泛系統(tǒng)的研究。
[0003]微生物產(chǎn)酸性蛋白酶我國(guó)從上世紀(jì)60年代就開(kāi)始研制，1970年上海工業(yè)微生物研究所首先從黑曲霉篩選一株3.350產(chǎn)酸性蛋白酶菌株，填補(bǔ)了我國(guó)酸性蛋白酶制劑的空白。但3.350酸性蛋白酶菌種發(fā)酵活力較低，生產(chǎn)工藝較繁雜。1977年中國(guó)科學(xué)院微生物研究所和新疆生物土壤沙漠研究所共同研制的由宇佐美曲霉經(jīng)誘變、篩選的537高產(chǎn)酸性蛋白酶菌種。近年來(lái)國(guó)內(nèi)在酸性蛋白酶方面的研究大多致力于選育產(chǎn)酶活力高、抗逆性好的菌種。目前用于酸性蛋白酶生產(chǎn)的菌種主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉以及它們突變株。錢(qián)玉英等(1994年)用60Co γ射線(xiàn)誘變處理黑曲霉CPu菌株，獲得突變菌株6042，產(chǎn)酶活力比出發(fā)菌株提高近4倍。章劍林等(1995年)以黑曲霉為出發(fā)菌株，采用高溫、超劑量常規(guī)誘變方法，獲得了產(chǎn)耐高溫酸性白酶的菌株S3-15，其所產(chǎn)酸性蛋白酶最適pH值為2.5，最適溫度為50°C，90°C下恒溫4h的酶活比出發(fā)菌株高64.2%。黃遵錫等(1999年)以黑曲霉YM3019為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線(xiàn)和亞硝基胍誘變處理，獲得高產(chǎn)酶菌株A-1-1，產(chǎn)酶活力約是原始出發(fā)菌株的4倍。李永泉等(1999年)，對(duì)宇佐美曲霉所產(chǎn)的酸性蛋白酶進(jìn)行了發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)研究。戚淑威等(2006年)對(duì)青霉產(chǎn)酸性蛋白酶的適宜條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。謝必峰等(2007)采用硫酸銨鹽析法和離子交換層析法分離純化了黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶，并對(duì)其氨基酸組分進(jìn)行了分析。王云(2008年)通過(guò)質(zhì)譜指紋法對(duì)黑曲霉發(fā)酵液中所產(chǎn)蛋白進(jìn)行了分析比對(duì)和鑒定酸性蛋白酶分子生物學(xué)方面的研究。
[0004]國(guó)內(nèi)生產(chǎn)酸性蛋白酶的廠(chǎng)家，基本上都是用537酸性蛋白酶菌種生產(chǎn)。早期生產(chǎn)的微生物酸性蛋白酶，只是工業(yè)級(jí)的，主要用于皮毛軟化。微生物菌種通過(guò)液體通風(fēng)發(fā)酵，成熟發(fā)酵醪再經(jīng)硫酸銨鹽析、板框壓濾、氣流(沸騰)干燥、粉碎、化驗(yàn)、包裝制成工業(yè)級(jí)酸性蛋白酶。隨著現(xiàn)代超濾膜濃縮技術(shù)在酶制劑行業(yè)上的應(yīng)用，近幾年生產(chǎn)了食品級(jí)酸性蛋白酶制劑。食品酸性蛋白酶發(fā)酵與工業(yè)級(jí)相同，只是后提取不同，成熟發(fā)酵醪進(jìn)入絮凝罐，加入絮凝劑絮凝沉淀再經(jīng)板框壓濾機(jī)壓濾，濾清液經(jīng)超濾膜濃縮器濃縮經(jīng)化驗(yàn)合格，加入防腐劑、穩(wěn)定劑就是成品的濃縮酸性蛋白酶制劑。
[0005]中國(guó)專(zhuān)利CN 102676395 A公開(kāi)了一株宇佐美曲霉突變菌株及其在制備酸性蛋白酶中的應(yīng)用，所述宇佐美曲霉突變菌株(Aspergillus sp.)M1223采用液體深層發(fā)酵，發(fā)酵液粗酶以酪蛋白為作用底物，該酶最適作用溫度為40°C，最適作用pH為3.0，最適作用條件下，酶活性達(dá)到5600U/ml。該酶分子量在45KD左右。中國(guó)專(zhuān)利CN 101948820 A公開(kāi)了一種酸性蛋白酶及其制備方法，以黑曲霉(Aspergillus niger)保藏于CICC編號(hào)2238為產(chǎn)酶菌種，采用固體發(fā)酵工藝制備，發(fā)酵產(chǎn)酶能力> 47000u/g(以干曲計(jì))，液體酶收率> 85%,固體酶收率彡80%，最適ρΗ2.5-3.5，穩(wěn)定ρΗ2.5-6.0 ;最適作用溫度為40_50°C，溫度穩(wěn)定性范圍為30°C?50°C。
[0006]綜上所述，無(wú)論酸性蛋白酶的制備方法如何，酸性蛋白酶酶活及其作用條件仍是本行業(yè)技術(shù)人員最為關(guān)注的問(wèn)題之一，生產(chǎn)高活力酸性蛋白酶對(duì)推動(dòng)酸性蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是以高產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉(Aspergillususamil)CCTCC NO:M 2013601為出發(fā)菌株，并進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝改進(jìn)，經(jīng)特定發(fā)酵條件下的液體深層發(fā)酵，制得一種酶活力高、耐受溫度較強(qiáng)、耐pH值較寬泛的酸性蛋白酶。
[0008]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0009]所述高活力酸性蛋白酶以高產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉CCTCC NO:M2013601為出發(fā)菌株，根據(jù)其最適生長(zhǎng)溫度和最適產(chǎn)酶溫度，進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝改進(jìn)，細(xì)化制定了孢子增殖和發(fā)酵產(chǎn)酶階段的工藝參數(shù)，采用梯度降溫和梯度升溫的發(fā)酵工藝，同時(shí)予以追加接種，尤其是梯度降溫和梯度升溫的發(fā)酵工藝顯著提高了出發(fā)菌株的抗應(yīng)激能力。并且對(duì)培養(yǎng)基組成實(shí)施全程優(yōu)化，添加了具有抗熱應(yīng)激原作用的黃芩、柴胡，添加了具有調(diào)整和修復(fù)機(jī)體功能、增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能、具有微生態(tài)調(diào)節(jié)功能的黃芪、黨參等，進(jìn)一步增強(qiáng)了微生物在同一發(fā)酵環(huán)境下的機(jī)體功能性、傳代適應(yīng)性和共同協(xié)作性，進(jìn)而增強(qiáng)了微生物的代謝功能。
[0010]所述高活力酸性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)如下:
[0011](1)溫度:該酶適應(yīng)反應(yīng)溫度30-55°C，最適反應(yīng)溫度40-50°C，在40-70°C之間具有較高的酶活；
[0012](2) pH:適應(yīng) pH 值范圍 2-6，最適 pH 值 2.5-3.5 ;
[0013](3)酶活性:發(fā)酵液酸性蛋白酶酶活可達(dá)13000-14000U/mL，是出發(fā)菌株的7倍。
[0014](4)熱穩(wěn)定性:該酶在70°C條件下保存lh后仍能保持75%以上酶活，65°C條件下保存lh后保持80%以上酶活；
[0015](5)存儲(chǔ)穩(wěn)定性:該酶在室溫下保存12個(gè)月后酶活損失小于2.2%。
[0016]所述高活力酸性蛋白酶制備方法包括如下步驟:保存完好的宇佐美曲霉CCTCCNO:M2013601的菌種經(jīng)斜面菌種活化、一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)至種子罐，將種子罐液體種子以5%接種量接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度31-32 °C，攪拌速度200-400r/m，通風(fēng)量1:1-2，培養(yǎng)時(shí)間10-12h ;然后以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至26_30°C，攪拌速度400-600r/m，通風(fēng)量1:1-3,恒溫培養(yǎng)8_10h ;繼續(xù)以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至23-25°C，攪拌速度500-700r/m，通風(fēng)量1:2-4，培養(yǎng)時(shí)間22_31h，然后，將種子罐液體種子以3%接種量追加接入發(fā)酵罐，最后以1-2 °C /h升溫速率緩慢升溫至31-32°C，攪拌速度200-400r/m，通風(fēng)量1:1-2，恒溫培養(yǎng)10_12h ;接著以1_2°C /h降溫速率緩慢降溫至23-25°C，攪拌速度500-700r/m，通風(fēng)量1:2-4，恒溫培養(yǎng)22_31h ;發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得固體酸性蛋白酶。
[0017]所述斜面培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20g，瓊脂20g，中草藥提取物5-10g，干酪素4g，磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0.6g，氯化鉀0.8g，蒸餾水1000mL，pH值5.8，121°C滅菌20min。