一種消化酶組合物及成纖維細(xì)胞和飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種消化酶組合物及成纖維細(xì)胞和飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESCs，簡(jiǎn)稱ES、ΕΚ或ESC細(xì)胞)是早期胚胎(原腸胚期之前)或原始性腺中分離出來(lái)的一類細(xì)胞，它具有體外培養(yǎng)無(wú)限增殖、自我更新和多向分化的特性。無(wú)論在體外還是體內(nèi)環(huán)境，ES細(xì)胞都能被誘導(dǎo)分化為機(jī)體幾乎所有的細(xì)胞類型。胚胎干細(xì)胞在組織工程與再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域極具應(yīng)用價(jià)值。
[0003]然而，由于其難以獲得且涉及敏感的倫理問題，使得研究一度陷入尷尬境地。2006年8月，日本Yamanaka研究小組向小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入4種轉(zhuǎn)錄因子基因(0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4)，成功地將其重編程為ESCs樣誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)。2007 年底，日本 Yamanaka 小組和美國(guó) Thomson小組相繼將這一革命性技術(shù)在人類細(xì)胞中得以實(shí)現(xiàn)。iPSCs的研究是一項(xiàng)具有開創(chuàng)性治療性克隆的基礎(chǔ)研究，避開了長(zhǎng)期以來(lái)ESCs難以獲取且極易引發(fā)倫理爭(zhēng)議的問題，為干細(xì)胞醫(yī)學(xué)應(yīng)用開辟了一條新的途徑，被認(rèn)為是干細(xì)胞領(lǐng)域乃至整個(gè)生物學(xué)領(lǐng)域的重大發(fā)現(xiàn)。包括英國(guó)愛丁堡大學(xué)Ian ffilmut教授在內(nèi)的許多科學(xué)家均認(rèn)為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞才是干細(xì)胞未來(lái)的研究方向。iPSCs細(xì)胞不僅對(duì)于干細(xì)胞研究具有重要的理論意義，而且在細(xì)胞治療、組織器官再生、藥物篩選與評(píng)價(jià)等領(lǐng)域極具應(yīng)用價(jià)值。
[0004]現(xiàn)在的iPS技術(shù)較初始建立的iPS技術(shù)已成熟很多，但目前其距全能干細(xì)胞還有一定的差距，且iPS細(xì)胞的臨床應(yīng)用研究?jī)H限于理論或初步試驗(yàn)方面。多能干細(xì)胞的潛能是巨大的，若能排除iPS細(xì)胞應(yīng)用的安全隱患，提高iPS細(xì)胞的得率，進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化率則可給更多重大疾病患者帶來(lái)福音。提高iPS細(xì)胞的得率，需要多方面條件的改善，正確選擇和優(yōu)化iPS細(xì)胞的培養(yǎng)體系也是至關(guān)重要的。目前iPS細(xì)胞的培養(yǎng)主要分為以下兩種培養(yǎng)方式:無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)和有飼養(yǎng)層培養(yǎng)?，F(xiàn)在市面上所售的無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基五花八門，然而iPS細(xì)胞在初期培養(yǎng)階段一般都需依賴于能分泌他們?cè)隗w外存活增殖所必需的生長(zhǎng)因子的飼養(yǎng)層細(xì)胞。飼養(yǎng)層細(xì)胞所分泌的生長(zhǎng)因子是iPS細(xì)胞培養(yǎng)常用的生長(zhǎng)增殖促進(jìn)劑和分化抑制劑。
[0005]目前，制備iPS細(xì)胞飼養(yǎng)層細(xì)胞的方法是分離出小鼠胚胎，將小鼠胚胎消化成細(xì)胞并接種。具體為:采用斷頸法處死C57孕鼠，將小鼠放入75%的酒精中浸泡3-5分鐘，取出小鼠，放入無(wú)菌超凈臺(tái)中，用鑷子和剪刀依次剪開皮膚和內(nèi)膜，暴露出內(nèi)臟，找到胚胎，在35mm培養(yǎng)皿中洗滌3次，將胚胎用剪刀剪碎，用0.25%的胰蛋白酶消化15-20分鐘，用含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，300-600g離心5-10分鐘；將得到的細(xì)胞沉淀用含8%?15%的胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸，采用臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后接種到細(xì)胞預(yù)先用0.1?0.5 %的明膠溶液包被0.5?2小時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然而，采用該方法獲得的飼養(yǎng)層細(xì)胞的得率較低。因此，建立一種高效的飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方法是iPS細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明提供了一種消化酶組合物及成纖維細(xì)胞和飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方法。該消化酶組合物將胰蛋白酶和分散酶以一定比例聯(lián)合使用后，在大大減少消化酶用量的情況下，反而可起到更好的消化效果，成纖維細(xì)胞的得率更高。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0008]本發(fā)明提供了一種消化酶組合物，包括胰蛋白酶和分散酶。
[0009]胰蛋白酶(EC 3.4.4.4)為蛋白酶的一種，是從牛、羊、豬的胰臟提取的一種絲氨酸蛋白水解酶。在脊椎動(dòng)物中，作為消化酶而起作用。在胰臟是作為酶的前體胰蛋白酶原而被合成的。作為胰液的成分而分泌，受腸激酶，或胰蛋白酶的限制分解成為活化胰蛋白酶，是肽鏈內(nèi)切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷。它不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，在決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。
[0010]分散酶是一類中性金屬蛋白水解酶，與胰酶、膠原酶相比，它的作用更加溫和，所以不會(huì)損傷細(xì)胞。此外，分散酶也可以用于組織分離。
[0011]本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)使用胰蛋白酶或分散酶相比，將胰蛋白酶和分散酶以一定比例聯(lián)合使用后，在大大減少消化酶用量的情況下，反而可起到更好的消化效果，成纖維細(xì)胞的得率更高。
[0012]作為優(yōu)選，以酶活力單位U計(jì)，胰蛋白酶與分散酶的酶活力比值為(1000?2000):
(1 ?10)ο
[0013]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，以酶活力單位U計(jì)，胰蛋白酶與分散酶的酶活力比值為1250:2.2。
[0014]在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，以酶活力單位U計(jì)，胰蛋白酶與分散酶的酶活力比值為100:lo
[0015]在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，以酶活力單位U計(jì)，胰蛋白酶與分散酶的酶活力比值為2000:lo
[0016]本發(fā)明還提供了該消化酶組合物在制備成纖維細(xì)胞中的應(yīng)用；該消化酶組合物包括胰蛋白酶和分散酶；作為優(yōu)選，以酶活力單位U計(jì)，胰蛋白酶與分散酶的酶活力比值為(1000?2000):(1?10);在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，以酶活力單位U計(jì)，胰蛋白酶與分散酶的酶活力比值為1250:2.2 ;在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，以酶活力單位U計(jì)，胰蛋白酶與分散酶的酶活力比值為100:1 ;在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，以酶活力單位U計(jì)，胰蛋白酶與分散酶的酶活力比值為2000:1。
[0017]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，成纖維細(xì)胞為動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞。
[0018]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，成纖維細(xì)胞為胎齡為10?15天的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。
[0019]本發(fā)明還提供了一種成纖維細(xì)胞的制備方法，包括:
[0020]將動(dòng)物胚胎剪碎，加入胰蛋白酶和分散酶進(jìn)行消化，終止消化后去除未消化的組織，獲得成纖維細(xì)胞。
[0021]作為優(yōu)選，消化的時(shí)間為15?20min。
[0022]作為優(yōu)選，胚胎為胚胎軀干。為了保證成纖維細(xì)胞的純度，本發(fā)明中所用胚胎為去除頭、四肢和內(nèi)臟的胚胎軀干。
[0023]作為優(yōu)選，動(dòng)物胚胎為胎齡為10?15天的小鼠胚胎。
[0024]作為優(yōu)選，以酶活力單位U計(jì)，胰蛋白酶的用量為1000?2000U/胚胎，分散酶的用量為1?10U/胚胎。
[0025]作為優(yōu)選，在將動(dòng)物胚胎剪碎與加入胰蛋白酶和分散酶進(jìn)行消化之間，還包括加入胰蛋白酶繼續(xù)剪1?3min。
[0026]本發(fā)明還提供了一種飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方法，包括:
[0027]將動(dòng)物胚胎剪碎，加入胰蛋白酶和分散酶進(jìn)行消化，終止消化后去除未消化的組織，獲得成纖維細(xì)胞；
[0028]采用絲裂霉素C處理成纖維細(xì)胞，經(jīng)消化、細(xì)胞培養(yǎng)，獲得飼養(yǎng)層細(xì)胞。
[0029]作為優(yōu)選，成纖維細(xì)胞為P3代成纖維細(xì)胞。
[0030]作為優(yōu)選，細(xì)胞培養(yǎng)為在37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%的C02條件下培養(yǎng)24h。
[0031]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，絲裂霉素C處理的條件為:在37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%的C02條件下采用絲裂霉素C處理2?3h。
[0032]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，采用絲裂霉素C處理成纖維細(xì)胞后，采用胰蛋白酶消化1?2min。
[0033]作為優(yōu)選，細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞濃度為(1?10) X 107/Lo
[0034]優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞濃度為5.0 X 107/L。
[0035]本發(fā)明提供了一種消化酶組合物及成纖維細(xì)胞和飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方法。該消化酶組合物包括胰蛋白酶和分散酶。本發(fā)明至少具有如下優(yōu)勢(shì)之一:
[0036]1、本發(fā)明將胰蛋白酶和分散酶以一定比例聯(lián)合使用后，在大大減少消化酶用量的情況下，可起到更好的消化效果，成纖維細(xì)胞的得率更高；
[0037]2、成纖維細(xì)胞分離過(guò)程中只保留胚胎的軀干，得到的成纖維細(xì)胞的純度更高。
【附圖說(shuō)明】
[0038]圖1示P。代MEF的形態(tài)；
[0039]圖2示飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備流程；
[0040]圖3示飼養(yǎng)層細(xì)胞的活力曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0041]本發(fā)明公開了一種消化酶組合物及成纖維細(xì)胞和飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0042]術(shù)語(yǔ)解釋:
[0043]飼養(yǎng)層細(xì)胞:是指一些特定細(xì)胞(如顆粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞等已在體外養(yǎng)的細(xì)胞)，經(jīng)有絲分裂阻斷劑(常用絲裂霉素)處理后所得的細(xì)胞單層。飼養(yǎng)層細(xì)胞大部分可用MEF(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)經(jīng)處理獲得。
[0044]成纖維細(xì)胞(fibroblast):是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞(mesenchymal cell)分化而來(lái)。成纖維細(xì)胞較大，輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)，其細(xì)胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯。根據(jù)不同功能活動(dòng)狀態(tài)，可將細(xì)胞劃分成成纖維細(xì)胞和纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞功能活動(dòng)旺盛，細(xì)胞質(zhì)嗜弱堿性，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動(dòng)，在一定條件下，它可以實(shí)現(xiàn)跟纖維細(xì)胞的互相轉(zhuǎn)化。成纖維細(xì)胞對(duì)不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺損以及骨創(chuàng)傷的修復(fù)有著十分重要的作用。
[0045]本發(fā)明提供的消化酶組合物及成纖維細(xì)胞和飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備方法中所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、消化酶、試劑等均可由市場(chǎng)購(gòu)得。在本發(fā)明實(shí)施例中，胰蛋白酶的酶活力為250U/mg，分散酶的酶活力為1.lU/mgo小鼠類型:C57BL/6。
[0046]下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明:
[0047]實(shí)施例1胚胎成纖維細(xì)胞的制備
[0048]從廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買13天的C57孕鼠，采用斷頸法處死小鼠，將小鼠放入75%的酒精中浸泡3-5分鐘，取出小鼠，放入無(wú)菌超凈臺(tái)中，用一套干凈的鑷子和剪刀剪開皮膚，換一套干凈的鑷子和剪刀，剪開皮膚內(nèi)膜，暴露出內(nèi)臟，找到胚胎，一般8-10個(gè)胚胎/孕鼠，在35mm培養(yǎng)