專(zhuān)利名稱(chēng)：在缺乏酶的黑曲霉突變體中生產(chǎn)生物物質(zhì)的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在缺乏酶的黑曲霉(Aspergillus niger)突變菌株中生產(chǎn)異源生物物質(zhì)的方法、獲得缺乏酶的黑曲霉突變菌株的方法、以及缺乏酶的黑曲霉突變菌株。
相關(guān)技術(shù)的說(shuō)明黑曲霉分泌大量的葡糖淀粉酶。然而，具有蛋白表達(dá)和分泌增加的所需要性狀的黑曲霉宿主未必具有用于成功發(fā)酵的最合乎需要的特性。由于需要在回收和純化令人感興趣的生物物質(zhì)期間移出分泌的多重酶或可能伴隨生物物質(zhì)共同純化該酶，因此發(fā)酵未必是最佳的。
Boel等人，1984，EMBO J.31097-1102，1581-1585，公開(kāi)了對(duì)黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)基因的克隆。Fowler等人，1990，Curr.Genet.18537-545公開(kāi)了黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)基因的缺失。
Korman等人，1990，Curr.Genet.17203-217公開(kāi)了來(lái)自黑曲霉泡盛曲霉(awamori)變體的2個(gè)α-淀粉酶基因(amyA和amyB)的克隆、表征鑒定和表達(dá)。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,252,726公開(kāi)了來(lái)自黑曲霉的2個(gè)全長(zhǎng)中性α-淀粉酶基因的克隆。
美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,252,726公開(kāi)了來(lái)自黑曲霉的部分酸穩(wěn)定的α-淀粉酶基因(asa)的克隆。
Pedersen等人，2000，Metabolic Engineering 234-41，和WO 00/50576公開(kāi)了在生產(chǎn)葡糖淀粉酶的黑曲霉菌株中編碼草酰乙酸水解酶(EC 3.7.1.1)的草酰乙酸水解酶(oah)基因的斷裂，其中所得到的菌株不能生產(chǎn)草酸。
WO 01/68864公開(kāi)了prtT-斷裂的黑曲霉菌株缺乏蛋白酶，表明宿主菌株中prtT表達(dá)的缺失可能導(dǎo)致對(duì)蛋白水解敏感的可回收蛋白的水平增加。
本發(fā)明的目的是提供改善的黑曲霉宿主，其兼?zhèn)浔磉_(dá)商品化的大量生物物質(zhì)的能力而缺乏生產(chǎn)可能使令人感興趣的生物物質(zhì)的回收和下游加工過(guò)程復(fù)雜化的酶。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及生產(chǎn)異源生物物質(zhì)的方法，包括(a)在適于生產(chǎn)異源生物物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)親本黑曲霉菌株的突變株，其中(i)該突變菌株包括編碼異源生物物質(zhì)的第一核苷酸序列和包括glaA和至少一個(gè)選自asa、amyA、amyB、prtT和oah的基因變體的一種或多種第二核苷酸序列，以及(ii)當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與親本黑曲霉菌株相比，該突變菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一個(gè)選自酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶的生產(chǎn)；以及(b)從培養(yǎng)基回收異源的生物物質(zhì)。
本發(fā)明也涉及缺乏酶的黑曲霉突變菌株和生產(chǎn)缺乏酶的黑曲霉突變菌株的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示pJRoy10的限制圖譜。
圖2顯示pMBin01+的限制圖譜。
圖3顯示pJRoy17的限制圖譜。
圖4.顯示pSMO127的限制圖譜。
圖5.顯示pMBin05的限制圖譜。
圖6.顯示pMBin04+的限制圖譜。
圖7顯示pMBin09的限制圖譜。
圖8顯示pMBin10的限制圖譜。
圖9顯示pMBin02的限制圖譜。
圖10顯示pMBin03的限制圖譜。
圖11顯示pMBin08的限制圖譜。
圖12顯示prtT缺失對(duì)蛋白酶活性的影響。
圖13顯示prtT缺失對(duì)南極洲假絲酵母(Candida antarctica)脂肪酶B活性的影響。
圖14顯示黑曲霉普通宿主菌株MBin114、MBin118和MBin120中Scytalidium thermophilum過(guò)氧化氫酶生產(chǎn)的比較。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及生產(chǎn)異源生物物質(zhì)的方法，包括(a)在適于生產(chǎn)異源生物物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)親本黑曲霉菌株的突變株，其中(i)該突變菌株包括編碼異源生物物質(zhì)的第一核苷酸序列和包括glaA和至少一個(gè)選自asa、amyA、amyB、prtT和oah的基因變體(modification)的一種或多種第二核苷酸序列，和(ii)當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，與親本黑曲霉菌株相比，該突變菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一個(gè)選自酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶的生產(chǎn)；以及(b)從培養(yǎng)基回收異源的生物物質(zhì)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是消除或減少異源生物物質(zhì)的黑曲霉發(fā)酵液體培養(yǎng)基簡(jiǎn)單化下游過(guò)程中的葡糖淀粉酶和至少一個(gè)選自酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶。
術(shù)語(yǔ)″淀粉葡萄糖苷酶″在此定義為糊精6-α-D-葡聚糖水解酶活性，其催化1，4-連接的α-D-葡萄糖殘基和末端1，4-連接的α-D-葡萄糖殘基鏈中分支點(diǎn)的1，6-α-D-糖苷連接的內(nèi)水解。為了本發(fā)明的目的，根據(jù)Fagershom和Kalkkinen，1995，Biotechnol.Appl.Biochem.21223-231描述的方法確定葡糖淀粉酶活性，其中利用葡萄糖氧化酶測(cè)定試劑盒(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)在pH4，25℃測(cè)量由葡糖淀粉酶從0.1M麥芽三糖產(chǎn)生的葡萄糖。1個(gè)單位的葡糖淀粉酶活性定義為在25℃，pH4每分鐘產(chǎn)生1.0μmol的葡萄糖。
術(shù)語(yǔ)“α-淀粉酶活性”在此定義為1，4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶活性，其催化具有3個(gè)以上α-1，4-連接的葡萄糖單元的多糖在存在水時(shí)內(nèi)水解為麥芽低聚糖。
術(shù)語(yǔ)″酸穩(wěn)定的α-淀粉酶活性″在此定義為在酸性pH范圍中具有最佳活性的α-淀粉酶活性。為了本發(fā)明，利用4，6-亞乙基(G7)-p-硝基苯基(G1)-α-D-maltoheptaside作為底物，利用Sigma Chemical Co.試劑盒577在pH4.0測(cè)定酸穩(wěn)定的α-淀粉酶活性。
術(shù)語(yǔ)″中性α-淀粉酶活性″在此定義為在中性pH范圍中具有最佳活性的α-淀粉酶活性。為了本發(fā)明，利用4，6-亞乙基(G7)-p-硝基苯基(G1)-α-D-maltoheptaside作為底物，利用Sigma Chemical Co.試劑盒577，在pH7.0測(cè)定中性α-淀粉酶活性。
術(shù)語(yǔ)″草酸水解酶″在此定義為在存在水時(shí)催化草酰乙酸轉(zhuǎn)化為草酸和乙酸酯的酶活性。分類(lèi)該酶為屬于EC 3.7.1.1。為了本發(fā)明，根據(jù)在本文實(shí)施例小節(jié)中描述的方法測(cè)定草酰乙酸水解酶活性。1個(gè)單位的草酰乙酸水解酶活性定義為在30℃，pH7.5每分鐘產(chǎn)生1.0μmol的草酸。
術(shù)語(yǔ)“變體”在此定義為在基因或?yàn)槠滢D(zhuǎn)錄或翻譯所需要的調(diào)控元件中導(dǎo)入、取代、或除去一個(gè)或多個(gè)核苷酸，以及基因斷裂、基因轉(zhuǎn)換、基因缺失、或glaA和至少一個(gè)選自asa、amyA、amyB、prtT、和oah的基因的隨機(jī)或特異的誘變。glaA基因和asa、amyA、amyB、prtT、和/或oah基因的缺失可以是部分或全部的。變體導(dǎo)致glaA和至少一個(gè)選自asa、amyA、amyB、prtT、和oah的基因的表達(dá)的降低或消除。
在優(yōu)選的方面，變體導(dǎo)致glaA和至少一個(gè)選自asa、amyA、amyB、prtT、和oah的基因的失活。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，變體導(dǎo)致glaA和至少一個(gè)選自asa、amyA、amyB、prtT、和oah的基因的表達(dá)降低。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，變體導(dǎo)致glaA和至少一個(gè)選自asa、amyA、amyB、prtT、或oah的基因的表達(dá)降低、消除、或其組合。
在優(yōu)選的方面，突變包括glaA和asa的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA和amyA的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA和amyB的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA和prtT的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA和oah的改變。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、asa、和amyA的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、asa、和amyB的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、asa、和prtT的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、asa、和oah的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、amyA、和amyB的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、amyA、和prtT的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、amyA、和oah的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、amyB、和prtT的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、amyB、和oah的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、prtT、和oah的改變。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、asa、amyA、和amyB的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、asa、amyB、和prtT的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、asa、prtT、和oah的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、asa、amyA、和prtT的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、asa、amyA、和oah的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、amyA、amyB、和prtT的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、asa、amyB、和oah的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、amyA、prtT、和oah的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、amyA、amyB、和oah的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、amyB、prtT、和oah的改變。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、asa、amyA、amyB、和prtT的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、asa、amyB、prtT、和oah的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、amyA、amyB、prtT、和oah的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、asa、amyA、amyB、和oah的改變。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、asa、amyA、prtT、和oah的改變。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，突變包括glaA、asa、amyA、amyB、prtT、和oah的改變。
術(shù)語(yǔ)“缺乏”(deficient)在此定義為當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與親本黑曲霉菌株相比，黑曲霉突變菌株沒(méi)有產(chǎn)生可檢測(cè)的葡糖淀粉酶和至少一個(gè)選自酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶，或備選的，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與親本黑曲霉菌株相比，優(yōu)選產(chǎn)生減少25％，更優(yōu)選減少至少50％，更優(yōu)選減少至少75％，以及最優(yōu)選減少至少95％的葡糖淀粉酶和至少一個(gè)選自酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶。可利用在此所描述的或本領(lǐng)域已知的方法測(cè)定由本發(fā)明黑曲霉突變菌株產(chǎn)生的酶的水平。
在本發(fā)明的方法中，親本黑曲霉菌株可以是野生型黑曲霉菌株或其突變株?？梢岳斫庑g(shù)語(yǔ)“黑曲霉”也包括黑曲霉的品種(參見(jiàn)，例如，Robert A.Samsom和John I.Pitt，編輯，Integration of Modern Taxonomic Methods forPenicillium and Aspergillus Classification，Harwood Academic Publishers，荷蘭)。在優(yōu)選的方面，親本黑曲霉菌株是黑曲霉DSM 12665。
可利用本領(lǐng)域公知的方法，例如插入、斷裂、替代或缺失，通過(guò)減少或消除glaA和至少一個(gè)選自asa、amyA、amyB、prtT和oah的基因的表達(dá)構(gòu)建缺乏酶的黑曲霉突變菌株。待改變或失活的基因部分可以是例如編碼區(qū)或?yàn)楸磉_(dá)編碼區(qū)所需要的調(diào)控元件。這種基因調(diào)節(jié)或調(diào)控序列的實(shí)例可以是啟動(dòng)子序列或其功能部分，即足夠影響基因表達(dá)的部分。可能用于改變的其它調(diào)控序列包括但不限于，前導(dǎo)序列、前肽序列、信號(hào)序列、轉(zhuǎn)錄終止子、和轉(zhuǎn)錄活化子。
可通過(guò)基因缺失技術(shù)構(gòu)建黑曲霉突變菌株來(lái)消除或減少glaA和至少一個(gè)選自asa、amyA、amyB、prtT和oah的基因的表達(dá)?；蛉笔Ъ夹g(shù)能夠部分或完全除去基因，由此消除其表達(dá)。在這種方法中，基因的缺失可利用已經(jīng)構(gòu)建的、連續(xù)包含基因側(cè)翼的5′和3′區(qū)的質(zhì)粒而伴隨有同源重組。
也可通過(guò)在基因或?yàn)槠滢D(zhuǎn)錄或翻譯所需要的調(diào)控元件中導(dǎo)入、取代、和/或除去一個(gè)或多個(gè)核苷酸來(lái)構(gòu)建黑曲霉突變菌株。例如，可插入或除去核苷酸以使得導(dǎo)入終止密碼子，除掉起始密碼子，或產(chǎn)生開(kāi)放閱讀框的讀框移位。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法這種改變可伴隨有定點(diǎn)誘變或PCR產(chǎn)生的誘變。參見(jiàn)例如，Botstein和Shortle，1985，Science 2294719；Lo等人，1985，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 812285；Higuchi等人，1988，Nucleic Acids Research 167351；Shimada，1996，Meth.Mol.Biol.57157；Ho等人，1989，Gene 7761；Horton等人，1989，Gene 7761；以及Sarkar和Sommer，1990，Bio Techniques 8404。
也可通過(guò)基因斷裂技術(shù)，通過(guò)將包含與基因同源的核酸片段的整合型質(zhì)粒插入令人感興趣的基因來(lái)構(gòu)建黑曲霉突變菌株，其可能產(chǎn)生同源性區(qū)域的重復(fù)并且在復(fù)制區(qū)域之間結(jié)合載體DNA。如果插入的載體分隔了基因的啟動(dòng)子和編碼區(qū)或打斷編碼序列以產(chǎn)生無(wú)功能的基因產(chǎn)物，這種基因斷裂可消除基因表達(dá)。斷裂構(gòu)建體可以只是伴有與基因5’和3’區(qū)域同源的可選擇的標(biāo)記基因。可選擇的標(biāo)記物能夠鑒定包含斷裂基因的轉(zhuǎn)化體。
也可通過(guò)基因轉(zhuǎn)換的方法(參見(jiàn)例如，Iglesias和Trautner，1983，Molecular General Genetics 18973-76)構(gòu)建黑曲霉突變菌株。例如，在基因轉(zhuǎn)換方法中，體外誘變處理相應(yīng)于基因的核苷酸序列以產(chǎn)生有缺陷的核苷酸序列，然后將其轉(zhuǎn)化入親本黑曲霉菌株以產(chǎn)生有缺陷的基因。通過(guò)同源重組，有缺陷的核苷酸序列替代內(nèi)源的基因。所需要的是有缺陷的基因或基因片段也包括可用于選擇包含有缺陷基因的轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記物。
也可通過(guò)已建立的反義技術(shù)，利用與基因的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列(Parish和Stoker，1997，F(xiàn)EMS Microbiology Letters 154151-157)來(lái)構(gòu)建黑曲霉突變菌株。更具體地說(shuō)，可通過(guò)導(dǎo)入與該基因核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列來(lái)減少或消除經(jīng)黑曲霉菌株的基因表達(dá)，其可在菌株中轉(zhuǎn)錄并能夠與菌株中產(chǎn)生的mRNA雜交。在容許互補(bǔ)的反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，因此減少或消除了翻譯蛋白的數(shù)量。
可通過(guò)隨機(jī)或特異的誘變，利用本領(lǐng)域公知的方法來(lái)進(jìn)一步構(gòu)建黑曲霉突變菌株，包括但不限于化學(xué)物誘變作用(參見(jiàn)例如，Hopwood，TheIsolation of Mutants in Methods in Microbiology(J.R.Norris and D.W.Ribbons，eds.)第363-433頁(yè)，Academic Press，紐約，1970)和轉(zhuǎn)位(參見(jiàn)例如，Youngman等人，1983，Proc.Natl.Acad Sci.USA 802305-2309)。可通過(guò)使親本菌株經(jīng)受誘變并且篩選其中基因表達(dá)已經(jīng)減少或消除的突變菌株來(lái)進(jìn)行基因的改變?？蛇M(jìn)行特異或隨機(jī)的誘變，例如使用合適的物理或化學(xué)誘變處理試劑，使用合適的寡核苷酸，或使DNA序列經(jīng)受PCR產(chǎn)生的誘變。此外，可使用這些誘變處理方法的任何組合進(jìn)行誘變。
適于本目的的物理或化學(xué)誘變處理試劑的實(shí)例包括紫外(UV)照射、羥胺、N-甲基-N′硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、N-甲基-N’-亞硝基胍(NTG)O-甲羥胺、亞硝酸、乙基甲烷磺酸鹽(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸、和核苷酸類(lèi)似物。當(dāng)使用這種試劑時(shí)，一般通過(guò)在存在所選擇的誘變處理試劑時(shí)在適宜條件下培養(yǎng)待誘變處理的親本進(jìn)行誘變，以及選擇顯示出基因表達(dá)減少或沒(méi)有表達(dá)的突變株。
在優(yōu)選的方面，glaA包括與SEQ ID NO1具有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，最優(yōu)選至少90％，以及最優(yōu)選至少95％同一性的核苷酸序列。在最優(yōu)選的方面，glaA包括SEQ ID NO1的核苷酸序列。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，glaA由SEQ ID NO1的核苷酸序列組成。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，glaA包括在極低嚴(yán)謹(jǐn)條件，優(yōu)選低嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選中等嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選中等-高嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)條件，以及最優(yōu)選極高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO1雜交的核苷酸序列。
在優(yōu)選的方面，asa包括與SEQ ID NO3具有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，最優(yōu)選至少90％，以及最優(yōu)選至少95％同一性的核苷酸序列。在最優(yōu)選的方面，asa包括SEQ ID NO3的核苷酸序列。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，asa由SEQ ID NO3的核苷酸序列組成。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，asa包括在極低嚴(yán)謹(jǐn)條件，優(yōu)選低嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選中等嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選中等-高嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)條件，以及最優(yōu)選極高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO3雜交的核苷酸序列。
在優(yōu)選的方面，amyA包括與SEQ ID NO5具有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，最優(yōu)選至少90％，以及最優(yōu)選至少95％同一性的核苷酸序列。在最優(yōu)選的方面，amyA包括SEQ ID NO5的核苷酸序列。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，amyA由SEQ ID NO5的核苷酸序列組成。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，amyA包括在極低嚴(yán)謹(jǐn)條件，優(yōu)選低嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選中等嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選中等-高嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)條件，以及最優(yōu)選極高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO5雜交的核苷酸序列。
在優(yōu)選的方面，amyB包括與SEQ ID NO7具有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，最優(yōu)選至少90％，以及最優(yōu)選至少95％同一性的核苷酸序列。在最優(yōu)選的方面，amyB包括SEQ ID NO7的核苷酸序列。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，amyB由SEQ ID NO7的核苷酸序列組成。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，amyB包括在極低嚴(yán)謹(jǐn)條件，優(yōu)選低嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選中等嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選中等-高嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)條件，以及最優(yōu)選極高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO7雜交的核苷酸序列。
在優(yōu)選的方面，oah包括與SEQ ID NO9具有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，最優(yōu)選至少90％，以及最優(yōu)選至少95％同一性的核苷酸序列。在最優(yōu)選的方面，oah包括SEQ ID NO9的核苷酸序列。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，oah由SEQ ID NO9的核苷酸序列組成。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，oah包括在極低嚴(yán)謹(jǐn)條件，優(yōu)選低嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選中等嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選中等-高嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)條件，以及最優(yōu)選極高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO9雜交的核苷酸序列。
在優(yōu)選的方面，prtT包括與SEQ ID NO11具有至少70％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少85％，最優(yōu)選至少90％，以及最優(yōu)選至少95％同一性的核苷酸序列。在最優(yōu)選的方面，prtT包括SEQ ID NO11的核苷酸序列。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，prtT由SEQ ID NO11的核苷酸序列組成。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，prtT包括在極低嚴(yán)謹(jǐn)條件，優(yōu)選低嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選中等嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選中等-高嚴(yán)謹(jǐn)條件，更優(yōu)選高嚴(yán)謹(jǐn)條件，以及最優(yōu)選極高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO11雜交的核苷酸序列。
為了本發(fā)明，通過(guò)Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman，1983，Proceedings of the National Academy of Science USA 80726-730)，利用具有同一性表的LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)，和下列多個(gè)序列對(duì)比參數(shù)缺口罰分10和缺口長(zhǎng)度罰分10來(lái)確定2個(gè)核苷酸序列之間的同一性程度。成對(duì)序列對(duì)比參數(shù)是Ktuple＝3，缺口罰分＝3，和windows＝20。
在此公開(kāi)的核苷酸序列或其亞序列，以及其氨基酸序列或其片段可用來(lái)設(shè)計(jì)核酸探針以從不同屬或種的菌株，根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法鑒定和克隆編碼涉及透明質(zhì)酸生物合成的酶的DNA。特別地，這種探針可用于與基因組或令人感興趣的屬或種的cDNA，按照標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法雜交，以便鑒定和分離其中的相應(yīng)基因。這種探針可以是比全部序列相當(dāng)短的，但應(yīng)該是至少15，優(yōu)選至少25，以及更優(yōu)選是至少35個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。也可使用更長(zhǎng)的探針?？墒褂肈NA和RNA探針。一般標(biāo)記探針用于檢測(cè)相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白)。
因此，可篩選從這種其它的生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)的與如上所述的探針雜交，并且編碼透明質(zhì)酸生物合成途徑中的酶的DNA?？赏ㄟ^(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其它分離技術(shù)分離來(lái)自這種其它生物體的基因組或其它的DNA。可將來(lái)自文庫(kù)的DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移并固定到硝化纖維素或其它合適的載體材料上。為了鑒定與在此公開(kāi)的核苷酸序列或其亞序列同源的克隆或DNA，在Southern印跡中使用載體材料。為了本發(fā)明的目的，雜交表明核酸序列與相應(yīng)于在此公開(kāi)的核苷酸序列、其互補(bǔ)鏈、或其亞序列的標(biāo)記核酸探針在極低至極高的嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交?？衫肵光膠片檢測(cè)在這些條件下與核酸探針雜交的分子。
對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，定義極低至極高的嚴(yán)謹(jǐn)條件為在42℃，在5×SSPE，3％ SDS，200μg/ml剪切和變性的鮭魚(yú)精DNA，以及對(duì)于極低和低嚴(yán)謹(jǐn)為25％甲酰胺、對(duì)于中等和中等-高嚴(yán)謹(jǐn)為35％甲酰胺、或?qū)τ诟吆蜆O高嚴(yán)謹(jǐn)為50％甲酰胺中，按照標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。
對(duì)于至少100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的長(zhǎng)探針，最后利用2×SSC，0.2％ SDS洗滌載體材料3次，每次15分鐘，優(yōu)選在45℃(極低嚴(yán)謹(jǐn))、更優(yōu)選至少在50℃(低嚴(yán)謹(jǐn))、更優(yōu)選至少在55℃(中等嚴(yán)謹(jǐn))、更優(yōu)選至少在60℃(中等-高嚴(yán)謹(jǐn))、更優(yōu)選至少在65℃(高嚴(yán)謹(jǐn))、以及最優(yōu)選70℃(極高嚴(yán)謹(jǐn))進(jìn)行洗滌。
對(duì)于大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的短探針，嚴(yán)謹(jǐn)狀態(tài)定義為在低于利用根據(jù)Bolton和McCarthy(1962，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 481390)的算法計(jì)算的Tm大約5℃至大約10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5％ NP-40，1×Denhardt′s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM一元磷酸鈉，0.1mM ATP，和每ml 0.2mg的酵母RNA中，按照標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法進(jìn)行預(yù)雜交、雜交、和雜交后洗滌。
對(duì)于大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的短探針，在6×SSC加0.1％ SDS中洗滌載體材料15分鐘一次，利用6×SSC在低于計(jì)算的Tm5℃至10℃洗滌兩次，每次15分鐘。
可從產(chǎn)生酶以改變所選擇的黑曲霉菌株中相應(yīng)基因的其它微生物來(lái)源使用與在此所描述的、涉及生產(chǎn)令人感興趣的酶的核苷酸序列同源或互補(bǔ)的核苷酸序列。
在優(yōu)選的方面，未用可選擇的標(biāo)記物標(biāo)記涉及在黑曲霉突變菌株中酶生產(chǎn)的基因變體。
除去可選擇的標(biāo)記基因可伴隨有在反選擇(counter-selection)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)突變株。其中可選擇的標(biāo)記基因包含側(cè)接其5′和3′末端的重復(fù)，該重復(fù)可當(dāng)突變菌株經(jīng)受反選擇時(shí)便于通過(guò)同源重組使可選擇的標(biāo)記基因環(huán)化突出(looping out of)。也可通過(guò)將包括有缺陷基因的5′和3′區(qū)，但缺乏可選擇標(biāo)記基因的核酸片段導(dǎo)入突變菌株，然后在反選擇培養(yǎng)基上選擇經(jīng)同源重組，而除去可選擇的標(biāo)記基因。通過(guò)同源重組，用缺乏可選擇標(biāo)記基因的核酸片段替換包含可選擇標(biāo)記基因的有缺陷基因。也可使用本領(lǐng)域已知的其它方法。
可以理解本發(fā)明的方法不限于為獲得黑曲霉突變菌株的特定順序。可將涉及酶生產(chǎn)的基因變體在構(gòu)建用于生產(chǎn)生物物質(zhì)的菌株的任何步驟導(dǎo)入親本。優(yōu)選在導(dǎo)入編碼異源生物物質(zhì)的基因前已經(jīng)使得黑曲霉突變菌株成為缺乏酶的。
在本發(fā)明進(jìn)一步的方面，黑曲霉菌株的突變株可包含附加的改變，例如可編碼對(duì)生產(chǎn)，回收或應(yīng)用特定生物物質(zhì)有害的物質(zhì)的其它基因的缺失或斷裂。
在優(yōu)選的方面，黑曲霉菌株進(jìn)一步包括變體，例如編碼蛋白質(zhì)分解活性的一個(gè)或多個(gè)基因的斷裂或缺失。在更優(yōu)選的方面，蛋白質(zhì)分解活性選自氨肽酶、二肽基氨肽酶、三肽基氨肽酶、羧肽酶、曲霉胃蛋白酶(aspergillopepsin)、絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、和液泡蛋白酶。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，黑曲霉菌株進(jìn)一步包括變體，例如一個(gè)或多個(gè)基因的斷裂或缺失，其中該基因編碼選自下列的酶糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶，酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、鹵素過(guò)氧化物酶(haloperoxidase)、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶(pectinolytic enzyme)、過(guò)氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、α-1，6-轉(zhuǎn)葡糖苷酶、α-1，6-轉(zhuǎn)葡糖苷酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、和木聚糖酶。
在本發(fā)明的方法中，當(dāng)在相同的生產(chǎn)條件下培養(yǎng)時(shí)黑曲霉突變菌株優(yōu)選生產(chǎn)與相應(yīng)的親本黑曲霉菌株至少相同數(shù)量的生物物質(zhì)。在更優(yōu)選的方面，當(dāng)在相同的生產(chǎn)條件下培養(yǎng)時(shí)該突變菌株比相應(yīng)的親本黑曲霉菌株生產(chǎn)至少多出25％，優(yōu)選至少多出50％，更優(yōu)選至少多出75％，以及最優(yōu)選地至少多出100％的生物物質(zhì)。
在適于利用該領(lǐng)域已知的方法生產(chǎn)異源生物物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)黑曲霉突變菌株。例如，可通過(guò)搖瓶培養(yǎng)、在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中、在合適的培養(yǎng)基和在容許生物物質(zhì)表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行小規(guī)模的或大規(guī)模的發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、分批飼養(yǎng)、或固態(tài)發(fā)酵)而培養(yǎng)菌株。在包括碳和氮源和無(wú)機(jī)鹽的合適營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中利用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行培養(yǎng)?？蓮纳虡I(yè)供應(yīng)商獲得合適的培養(yǎng)基或可根據(jù)公開(kāi)的組合物(例如，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)制備合適的培養(yǎng)基?？蓮呐囵B(yǎng)基直接回收分泌的生物物質(zhì)。如果生物物質(zhì)不是分泌的，可從細(xì)胞裂解物獲得該生物物質(zhì)。
可利用本領(lǐng)域已知的特異于該生物物質(zhì)的方法檢測(cè)生物物質(zhì)。這些檢測(cè)方法可包括使用特異的抗體、高效液相色譜法、毛細(xì)管色譜法、酶產(chǎn)物的形成、酶底物的消失、或SDS-PAGE。例如酶活性測(cè)定可用來(lái)測(cè)定該酶的活性。用于測(cè)定酶活性的方法是本領(lǐng)域已知用于許多酶的方法(參見(jiàn)例如，D.Schomburg和M.Salzmann(編輯)，Enzyme Handbook，Springer-Verlag，紐約，1990)。
可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法分離所得到的生物物質(zhì)。例如，可通過(guò)傳統(tǒng)方法從培養(yǎng)基分離令人感興趣的多肽，包括但不限于離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法進(jìn)一步純化本發(fā)明的分離多肽，包括但不限于色譜法(例如離子交換、親合的、疏水性的、色譜聚焦、和大小排阻)、電泳方法(例如預(yù)備性的等電聚焦(IEF)、差異溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、或提取(參見(jiàn)例如Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden，編輯，VCH Publishers，紐約，1989)。可通過(guò)例如提取、沉淀、或差異溶解度、或本領(lǐng)域已知的任何方法從培養(yǎng)基分離令人感興趣的代謝產(chǎn)物。然后可利用適于代謝產(chǎn)物的方法進(jìn)一步純化分離的代謝產(chǎn)物。
異源的生物物質(zhì)可以是任何生物聚合物或代謝產(chǎn)物?？赏ㄟ^(guò)單個(gè)基因或組成生物合成或代謝途徑的一系列基因編碼該生物物質(zhì)。因此，術(shù)語(yǔ)“編碼異源生物物質(zhì)的第一核苷酸序列”可理解為包括涉及該生物物質(zhì)生產(chǎn)的一個(gè)或多個(gè)基因。術(shù)語(yǔ)″異源生物物質(zhì)″在此定義為對(duì)宿主菌株不是天然的生物物質(zhì)；其中已經(jīng)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)改變以改變?cè)撎烊簧镂镔|(zhì)的天然生物物質(zhì)，例如天然多肽的蛋白質(zhì)序列；或由于通過(guò)例如強(qiáng)啟動(dòng)子的重組DNA技術(shù)，核苷酸序列或宿主菌株的操作其表達(dá)定量改變的天然生物物質(zhì)。
在本發(fā)明的方法中，生物聚合物可以是任何生物聚合物。術(shù)語(yǔ)“生物聚合物”在此定義為相同、相似或不同亞基(單體)的鏈(或聚合物)。該生物聚合物可以是，但不限于核酸、多胺、多元醇、多肽(或聚酰胺)、或多糖。
在優(yōu)選的方面，生物聚合物是多肽。多肽可以是具有令人感興趣的生物活性的任何多肽。術(shù)語(yǔ)“多肽”在此不是意味著是指特定長(zhǎng)度的編碼產(chǎn)物，因此包括肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“多肽”也包括兩個(gè)或多個(gè)多肽組合形成編碼的產(chǎn)物。多肽也包括雜合多肽，其包括從至少2個(gè)不同多肽獲得的部分或全部多肽序列的組合，其中一個(gè)或多個(gè)多肽可能與黑曲霉菌株是異源的。多肽進(jìn)一步包括上述多肽和雜合多肽的天然存在的等位的和工程化的變體。
優(yōu)選地，異源的多肽是抗體、抗原、抗菌肽、酶、生長(zhǎng)因子、激素、免疫擴(kuò)張劑(immunodilator)、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、報(bào)告蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、和轉(zhuǎn)錄因子。
在優(yōu)選的方面，異源的多肽是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、或連接酶。在更優(yōu)選的方面，多肽是α-葡糖苷酶、氨肽酶、α-淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶，α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、突變酶、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、尿激酶、或木聚糖酶。
在另一個(gè)優(yōu)選的方面，生物聚合物是膠原或白明膠(gelatin)。
在優(yōu)選的方面，生物聚合物是多糖。多糖可以是任何多糖，包括但不限于粘多糖或包含氮的多糖。在更優(yōu)選的方面，多糖是透明質(zhì)酸?！巴该髻|(zhì)酸”在此定義為非硫酸化的氨基多糖，其由通過(guò)交替的β-1，4和β-1，3糖苷鍵連接在一起的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcUA)的重復(fù)二糖單位組成。透明質(zhì)酸(hyaluronic acid)亦稱(chēng)透明質(zhì)酸(hyaluronan)，透明質(zhì)酸(hyaluronate)，或HA。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，多糖是殼多糖。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，多糖是肝素。
在本發(fā)明的方法中，代謝產(chǎn)物可以是任何代謝產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物可經(jīng)一個(gè)或多個(gè)基因編碼。術(shù)語(yǔ)“代謝產(chǎn)物”包括初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物。初級(jí)代謝產(chǎn)物是菌株的原始或總代謝產(chǎn)物，其是關(guān)于例如能量代謝、生長(zhǎng)和結(jié)構(gòu)。次級(jí)代謝產(chǎn)物是次級(jí)代謝的產(chǎn)物(參見(jiàn)例如，R.B.Herbert，The Biosynthesis ofSecondary Metabolites，Chapman and Hall，紐約，1981)。
初級(jí)代謝產(chǎn)物可以是但不限于，氨基酸、脂肪酸、核苷、核苷酸、糖、甘油三酸酯、或維生素。
次級(jí)代謝產(chǎn)物可以是但不限于，生物堿、香豆素、類(lèi)黃酮(flavonoid)、聚酮化合物(polyketide)、奎寧、類(lèi)固醇、肽、或萜烯。在優(yōu)選的方面，次級(jí)代謝產(chǎn)物是抗生素、拒食劑(antifeedant)、誘引劑(attractant)、殺菌劑、殺真菌劑、激素、殺蟲(chóng)劑、或滅鼠劑(rodenticide)。
在本發(fā)明的方法中，黑曲霉菌株的突變株是重組菌株，包括編碼異源生物物質(zhì)，例如多肽的核苷酸序列，其可有利地用于重組生產(chǎn)該生物物質(zhì)。優(yōu)選用包括編碼異源生物物質(zhì)的核苷酸序列的載體轉(zhuǎn)化菌株，然后將載體整合到染色體中?！稗D(zhuǎn)化”是指將包括核苷酸序列的載體導(dǎo)入宿主菌株以使得該載體保持為染色體的整合部分或作為染色體外自我復(fù)制的載體。一般認(rèn)為整合是有利的，因?yàn)楹塑账嵝蛄懈赡芊€(wěn)定地維持在該菌株中?？赏ㄟ^(guò)同源重組，非同源重組、或轉(zhuǎn)位使載體整合到染色體中。
可從任何原核的、真核的、或其它來(lái)源，例如原生細(xì)菌獲得編碼異源生物物質(zhì)的核苷酸序列。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)如在此使用的與給定來(lái)源相關(guān)的″獲得自″(obtained from)是指通過(guò)該來(lái)源或通過(guò)其中已經(jīng)插入來(lái)自該來(lái)源基因的菌株而生產(chǎn)生物物質(zhì)。
在本發(fā)明的方法中，黑曲霉菌株的突變株也可用于黑曲霉菌株中天然生物物質(zhì)的重組生產(chǎn)?？赏ㄟ^(guò)重組方式生產(chǎn)天然的生物物質(zhì)，例如將編碼生物物質(zhì)的基因置于不同啟動(dòng)子的控制下以增強(qiáng)該物質(zhì)的表達(dá)，使用例如信號(hào)序列促進(jìn)其運(yùn)輸?shù)骄晖獠浚蛟黾泳幋a由黑曲霉菌株正常生產(chǎn)的生物物質(zhì)基因的拷貝數(shù)。因此，本發(fā)明在術(shù)語(yǔ)“異源生物物質(zhì)”的范圍內(nèi)也包括這種天然生物物質(zhì)的重組生產(chǎn)，其達(dá)到的程度是這種表達(dá)包括使用黑曲霉菌株的非天然遺傳元件，或使用已經(jīng)操作的天然元件以不是通常存在于宿主菌株的方式發(fā)揮功能。
用于分離或克隆編碼生物物質(zhì)的核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括從基因組DNA分離、從cDNA制備、或其組合。例如可利用公知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)影響從這種基因組DNA克隆核苷酸序列。參見(jiàn)例如，Innis等人，1990，PCR Protocols A Guide to Methods and Application，Academic Press，紐約?？寺》椒砂ㄇ邢潞头蛛x包括編碼生物物質(zhì)的核苷酸序列的所需要核酸片段，將該片段插入到載體分子中，以及將重組載體整合到黑曲霉菌株中，其中可復(fù)制該核苷酸序列的多個(gè)拷貝或克隆。核苷酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成的、合成的起源、或其任何組合。
在本發(fā)明的方法中，生物物質(zhì)也可以是融合的多肽，其中另一個(gè)多肽融合在多肽或其片段的N-末端或C-末端。通過(guò)將編碼多肽的核苷酸序列(或其部分)與編碼另一個(gè)多肽的核苷酸序列(或其部分)融合而生產(chǎn)融合多肽。用于產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括連接編碼多肽的編碼序列以使得它們?cè)谧x框內(nèi)，并且融合多肽的表達(dá)是在相同啟動(dòng)子和終止子的調(diào)控之下。
在此定義″核酸構(gòu)建體″為單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因或已經(jīng)對(duì)其進(jìn)行改變而包含以不會(huì)另外存在于自然界的方式組合和毗鄰的核酸節(jié)段。當(dāng)核酸構(gòu)建體包含為表達(dá)編碼序列所需的所有調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與術(shù)語(yǔ)表達(dá)盒同義。術(shù)語(yǔ)“編碼序列”在此定義為當(dāng)置于下列提及的調(diào)控序列的控制下轉(zhuǎn)錄成為mRNA并且轉(zhuǎn)換為令人感興趣的生物物質(zhì)。一般通過(guò)開(kāi)放閱讀框確定編碼序列的邊界，其通常從ATG起始密碼子或備選的起始密碼子，例如GTG和TTG開(kāi)始。編碼序列可包括但不限于，DNA、cDNA和重組的核苷酸序列。
可以多種方式操作編碼生物物質(zhì)的分離核苷酸序列以保證生物物質(zhì)表達(dá)。在將核苷酸序列插入到載體中之前，根據(jù)表達(dá)載體或黑曲霉宿主菌株對(duì)核苷酸序列的操作可能是合乎需要的或必須的。利用克隆方法來(lái)改變核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。
將包括編碼生物物質(zhì)的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體可操作地與能夠指導(dǎo)編碼序列在本發(fā)明的突變黑曲霉菌株中，在與調(diào)控序列相適合的條件下表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列連接。
術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”在此定義為包括對(duì)核苷酸序列的編碼序列的表達(dá)必須或有利的所有組分。各個(gè)調(diào)控序列可以是天然的或與編碼生物物質(zhì)的核苷酸序列是外源的。這種調(diào)控序列包括但不限于，前導(dǎo)序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。至少調(diào)控序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號(hào)。對(duì)調(diào)控序列可提供接頭以便導(dǎo)入便于連接調(diào)控序列和編碼生物物質(zhì)的核苷酸序列編碼區(qū)的特異限制酶切位點(diǎn)。
調(diào)控序列可以是適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列，其由用于表達(dá)核苷酸序列的黑曲霉菌株識(shí)別。啟動(dòng)子序列包含介導(dǎo)生物物質(zhì)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是在突變黑曲霉菌株中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，并且可從編碼胞外或胞內(nèi)生物物質(zhì)的、與黑曲霉菌株同源或異源的基因獲得。
用于在本發(fā)明的方法中指導(dǎo)核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下列基因獲得的啟動(dòng)子米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、Fusarium venenatum淀粉葡萄糖苷酶(WO 00/56900)、Fusarium venenatum Daria(WO 00/56900)、Fusariumvenenatum Quinn (WO 00/56900)、尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉葡聚糖內(nèi)切酶II、里氏木霉葡聚糖內(nèi)切酶III、里氏木霉葡聚糖內(nèi)切酶IV、里氏木霉葡聚糖內(nèi)切酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動(dòng)子(來(lái)自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子的雜合體)；以及其突變的、截短的、和雜合的啟動(dòng)子。特別優(yōu)選的啟動(dòng)子是葡糖淀粉酶、TAKAα-淀粉酶、和NA2-tpi啟動(dòng)子。
調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，由黑曲霉菌株識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。將終止子序列可操作地與編碼異源生物物質(zhì)的核苷酸序列的3’末端連接。在黑曲霉菌株中有功能的任何終止子都可用于本發(fā)明。
優(yōu)選的終止子是從編碼米曲霉TAKAα-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因獲得的。
調(diào)控序列也可以是合適的前導(dǎo)序列，mRNA的非翻譯區(qū)，其對(duì)于經(jīng)黑曲霉菌株的翻譯是很重要的。將前導(dǎo)序列可操作地與編碼異源生物物質(zhì)的核苷酸序列的5’末端連接。在黑曲霉菌株中有功能的任何前導(dǎo)序列都可用于本發(fā)明。
優(yōu)選的前導(dǎo)序列是從編碼米曲霉TAKAα-淀粉酶和構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因獲得的。
調(diào)控序列也可以是多聚腺苷酸序列，是可操作地與核苷酸序列的3’末端連接的序列，并且當(dāng)其轉(zhuǎn)錄時(shí)，受到黑曲霉菌株識(shí)別而作為向轉(zhuǎn)錄的mRNA加入多聚腺苷殘基的信號(hào)。在黑曲霉菌株中有功能的任何多聚腺苷酸序列都可用于本發(fā)明。
優(yōu)選的多聚腺苷酸序列是從編碼米曲霉TAKAα-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉氨基苯甲酸合酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因獲得的。
調(diào)控序列也可以是編碼與異源多肽氨基末端連接的氨基酸序列的信號(hào)肽編碼區(qū)，并且指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入菌株的分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列的5’末端可固有地包含在翻譯閱讀框中天然連接編碼分泌多肽的編碼區(qū)節(jié)段的信號(hào)肽編碼區(qū)。備選地，編碼序列的5’末端可包含與編碼序列外源的信號(hào)肽編碼區(qū)。外源的信號(hào)肽編碼區(qū)可能是當(dāng)編碼序列通常不包含信號(hào)肽編碼區(qū)時(shí)所必需的。備選地，外源的信號(hào)肽編碼區(qū)可簡(jiǎn)單地替代天然的信號(hào)肽編碼區(qū)以獲得分泌增強(qiáng)的多肽。然而，任何指導(dǎo)表達(dá)異源多肽進(jìn)入黑曲霉菌株分泌途徑的信號(hào)肽編碼區(qū)可用于本發(fā)明。
用于黑曲霉宿主菌株的有效信號(hào)肽編碼區(qū)是從米曲霉TAKAα-淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖α-淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纖維素酶、和Humicola lanuginosa脂肪酶基因獲得的信號(hào)肽編碼區(qū)。
調(diào)控序列也可以是編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽編碼區(qū)。所得到的多肽稱(chēng)為原酶或原多肽(或有時(shí)稱(chēng)為酶原)。前多肽一般是非活化的并且可通過(guò)前肽的催化或自催化切割而從前多肽轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。前肽編碼區(qū)可從米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶基因、或嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)漆酶基因(WO 95/33836)獲得。
其中信號(hào)肽和前肽區(qū)都存在于多肽的氨基末端，前肽區(qū)緊接位于多肽的氨基末端而信號(hào)肽區(qū)緊接位于前肽區(qū)域的氨基末端。
核酸構(gòu)建體也可包括編碼一個(gè)或多個(gè)有利于指導(dǎo)異源生物物質(zhì)表達(dá)的因子的一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列，例如轉(zhuǎn)錄活化子(例如，反式作用因子)、伴侶分子、和加工蛋白酶。在黑曲霉菌株中有功能的任何因子都可用于本發(fā)明。編碼一種或多種這些因子的核酸不是必須與編碼異源生物物質(zhì)的核苷酸序列串聯(lián)的。
也可能需要加入容許調(diào)節(jié)異源生物物質(zhì)相對(duì)于黑曲霉菌株生長(zhǎng)而表達(dá)的調(diào)控序列。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是應(yīng)答化學(xué)或物理刺激，包括存在調(diào)控化合物時(shí)導(dǎo)致打開(kāi)或關(guān)閉基因表達(dá)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。TAKAα-淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子可用作調(diào)控序列。調(diào)控序列的其它實(shí)例是容許基因增殖的序列，例如隨重金屬擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。這樣的話，編碼異源生物物質(zhì)的核苷酸序列將可操作地與調(diào)控序列連接。
在本發(fā)明的方法中，包括核苷酸序列、啟動(dòng)子、及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)的重組表達(dá)載體可用于重組生產(chǎn)多肽或其它的生物物質(zhì)?？蓪⑷缟纤龅亩喾N核酸和調(diào)控序列連接在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，其可包括一個(gè)或多個(gè)便利的限制酶切位點(diǎn)以容許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽或生物物質(zhì)的核苷酸序列。備選地，可通過(guò)插入核苷酸序列或包括進(jìn)入適當(dāng)表達(dá)載體的序列的核酸構(gòu)建體來(lái)表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列。在表達(dá)載體的產(chǎn)生中，編碼序列位于載體中以便編碼序列與用于表達(dá)的適當(dāng)調(diào)控序列可操作地連接，并可能分泌。
重組表達(dá)載體可以是任何載體，其可便利地經(jīng)受重組DNA方法而實(shí)現(xiàn)核酸序列的表達(dá)。載體的選擇一般取決于載體與其中將導(dǎo)入該載體的黑曲霉菌株的相容性。載體可以是線性的或封閉的環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自我復(fù)制載體，即以染色體外的實(shí)體存在的載體，其復(fù)制不依賴(lài)于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒，染色體外的元件、微型染色體或人工染色體。載體可包含任何用于確保自我復(fù)制的方式。備選地，載體可以是當(dāng)被導(dǎo)入黑曲霉菌株時(shí)，整合到基因組中并與其已經(jīng)整合進(jìn)入的染色體一起復(fù)制的載體。此外，載體系統(tǒng)可以是單個(gè)載體或質(zhì)粒，或兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒，其同時(shí)包含將導(dǎo)入黑曲霉菌株基因組的總DNA或轉(zhuǎn)位子。
當(dāng)導(dǎo)入黑曲霉菌株時(shí)，可將載體整合到菌株基因組中。對(duì)于整合到本發(fā)明的突變黑曲霉菌株基因組中，載體可能依賴(lài)于編碼異源生物物質(zhì)的核苷酸序列，或通過(guò)同源或非同源重組將載體穩(wěn)定整合到基因組中的任何其它元件。備選地，載體可包含用于通過(guò)同源重組到黑曲霉菌株基因組中而指導(dǎo)整合的附加核苷酸序列。附加的核苷酸序列能夠使載體整合到宿主細(xì)胞基因組中染色體的準(zhǔn)確位置。為了增加在準(zhǔn)確位置整合的可能性，整合元件優(yōu)選應(yīng)包含足夠數(shù)目的核酸，例如100至1,500個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選400至1,500個(gè)堿基對(duì)，以及最優(yōu)選800至1,500個(gè)堿基對(duì)，其與相應(yīng)的靶序列是高度同源的以增強(qiáng)同源重組的可能性。整合元件可以是與黑曲霉基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，載體可通過(guò)非同源重組整合到菌株的基因組中。
對(duì)于自我復(fù)制，載體可進(jìn)一步包括能夠使載體在所述的黑曲霉中自主復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)。
可將如上所述的多種核酸和調(diào)控序列連接在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，其可包括一個(gè)或多個(gè)便利的限制酶切位點(diǎn)以容許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼異源生物物質(zhì)的核苷酸序列。備選地，可通過(guò)插入序列或包括進(jìn)入適當(dāng)表達(dá)載體的序列的核酸構(gòu)建體來(lái)表達(dá)編碼異源生物物質(zhì)的核苷酸序列。在表達(dá)載體的產(chǎn)生中，編碼序列位于載體中以便編碼序列與用于表達(dá)的適當(dāng)調(diào)控序列可操作地連接，并可能分泌。
載體優(yōu)選包含容許容易選擇轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株的一個(gè)或多個(gè)可選擇的標(biāo)記物?？蛇x擇的標(biāo)記物是提供抗微生物性或病毒抗性、重金屬抗性、原養(yǎng)型到營(yíng)養(yǎng)缺陷型等的基因產(chǎn)物。用于黑曲霉宿主菌株的選擇性標(biāo)記物可選自，包括但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥(niǎo)氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素轉(zhuǎn)乙酰酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸酯脫羧酶)、sC(硫酸腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶)、和trpC(氨基苯甲酸合酶)，以及來(lái)自其它種屬的等價(jià)物。優(yōu)選用于黑曲霉菌株的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。
載體優(yōu)選包含容許載體穩(wěn)定整合到基因組中或容許載體在菌株中不依賴(lài)于菌株基因組而自發(fā)復(fù)制的元件。
“導(dǎo)入”是指將包括核苷酸序列的載體導(dǎo)入黑曲霉菌株以使得該載體保持為染色體的整合部分或作為染色體外自我復(fù)制的載體。一般認(rèn)為整合是有利的，因?yàn)楹塑账嵝蛄懈赡芊€(wěn)定地維持在該菌株中。通過(guò)同源重組，非同源重組、或轉(zhuǎn)位使載體整合到染色體中。
將表達(dá)載體導(dǎo)入黑曲霉宿主菌株可包括由以本身已知的方式形成原生質(zhì)體、轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體、再生菌株壁組成的方法。轉(zhuǎn)化曲霉宿主菌株的合適方法在EP 238 023和Yelton等人，1984，Proceedings of the National Academyof Sciences USA 811470-1474中有描述。
用于連接在此所描述的元件以構(gòu)建重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見(jiàn)，例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，紐約)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，突變黑曲霉菌株可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)第三核苷酸序列的變體，該第三核苷酸序列編碼可能對(duì)生產(chǎn)、回收、和/或應(yīng)用令人感興趣的異源生物物質(zhì)有害的物質(zhì)。該變體減少或消除了一個(gè)或多個(gè)第三核苷酸序列的表達(dá)，產(chǎn)生當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)比沒(méi)有改變第三核苷酸序列的突變菌株可生產(chǎn)更多異源生物物質(zhì)的突變菌株。
第三核苷酸序列可以例如編碼酶。例如，該酶可以是氨肽酶、α-淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、突變酶、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。第三核苷酸序列優(yōu)選編碼蛋白水解酶，例如氨肽酶、羧肽酶、或蛋白酶。
本發(fā)明也涉及獲得親本黑曲霉菌株的突變株的方法，包括(a)在黑曲霉菌株中導(dǎo)入第一核苷酸序列，其包括glaA和至少一個(gè)選自asa、amyA、amyB、prtT和oah的基因的變體，其分別涉及葡糖淀粉酶、蛋白酶、草酸水解酶、酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B的生產(chǎn)；以及(b)鑒定來(lái)自步驟(a)的包括改變的核苷酸序列的突變菌株，其中當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，與親本黑曲霉相比突變菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一個(gè)選自酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶的生產(chǎn)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及親本黑曲霉菌株的突變株，其包括編碼異源生物物質(zhì)的第一核苷酸序列和包括glaA和至少一個(gè)選自的asa、amyA、amyB、prtT和oah的基因變體的一個(gè)或多個(gè)第二核苷酸序列，其分別涉及葡糖淀粉酶、蛋白酶、草酸水解酶、酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B的生產(chǎn)，其中當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與親本黑曲霉相比，該突變菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一個(gè)選自酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶的生產(chǎn)。
通過(guò)下列不應(yīng)被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍加以限制的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例所有的引物和oligos由MWG Biotech，Inc.，High Point，NC提供。
用ABI 3700測(cè)序儀(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)進(jìn)行DNA測(cè)序。
菌株所有的菌株來(lái)源于黑曲霉(Aspergillus niger)Bo-1(DSM 12665)。黑曲霉Bo-1包括α-1，6轉(zhuǎn)葡糖苷酶基因的突變而導(dǎo)致沒(méi)有α-1，6-轉(zhuǎn)葡糖苷酶活性。
培養(yǎng)基和溶液基本培養(yǎng)基的組成為每升6g NaNO3，0.52g KCl，1.52g KH2PO4，20gNoble瓊脂，10g葡萄糖，0.5g MgSO4·7H2O，和1ml的Cove微量元素。
Cove平板的組成為每升342.3g蔗糖，20ml Cove鹽(50×)，10mM乙酰胺，15mM CsCl，和25g Noble瓊脂。
50×Cove鹽溶液的組成為每升26g KCl，26g MgSO4，76g KH2PO4，和50ml的Cove微量元素。
Cove微量元素溶液的組成為每升0.004g Na2B4O7·10H2O，0.4gCuSO4·5H2O，1.2g FeSO4·7H2O，0.7g MnSO4·H2O，0.8g Na2MoO2·2H2O，和10g ZnSO4·7H2O。
AMG微量金屬溶液的組成為每升14.3g ZnSO4·7H2O，2.5gCuSO4·5H2O，0.5g NiCl2，13.8g FeSO4，8.5g MnSO4，和3.0g檸檬酸。
YP培養(yǎng)基的組成為每升10g酵母提取物和20g Bacto蛋白胨。
STC由0.8M山梨糖醇，50mM Tris，pH8，和50mM CaCl2組成。
SPTC由每升40％ PEG 4000，0.8M山梨糖醇，50mM Tris，pH8，50mMCaCl2組成。
SPC由每升40％ PEG 4000，0.8M山梨糖醇，和50mM CaCl2pH4.5組成。
酪蛋白平板的組成為每升7g NaH2PO4·H2O，0.5g KCl，0.2gMgSO4·7H2O，2g酵母提取物，10g葡萄糖，0.5g Triton X-100，20g Noble瓊脂，和10g酪蛋白。
淀粉苯胺藍(lán)平板的組成為每升0.1g葡萄糖，1g KH2PO4，0.5g MgSO4，0.5g KCl，3g NaNO3，0.1g酵母提取物，1ml Cove微量元素，5g淀粉苯胺藍(lán)，15g Noble瓊脂，和100mM甘氨酸pH2.9。
實(shí)施例1轉(zhuǎn)化方法用限制性?xún)?nèi)切酶消化下列實(shí)施例中所描述的20微克的每一個(gè)斷裂盒，利用QIAEX II凝膠提取試劑盒(QIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA)從1％瓊脂糖-50mM Tris base-50mM硼酸鹽-0.1mM EDTA二鈉緩沖液(TBE)凝膠切下和純化斷裂所待用的片段。用無(wú)菌的蒸餾水使總體積達(dá)到20μl并且分為4個(gè)轉(zhuǎn)化物。
利用下列的方法制備原生質(zhì)體。使含有補(bǔ)充有5％葡萄糖的20ml YP培養(yǎng)基的搖瓶接種密度為每ml大約106-108的黑曲霉分生孢子。在34℃(200rpm)孵育過(guò)夜(15-17小時(shí))后，通過(guò)用無(wú)菌的微孔布MiraclothTM(Calbiochem，San Diego，CA)過(guò)濾收集菌絲體，并轉(zhuǎn)入在10-20ml 1.2M山梨糖醇中的每ml 3-5mg NovozymTM234的溶液(黑曲霉菌株JRoy3、SMO110、和MBin111到MBin114，參見(jiàn)實(shí)施例6-9)或1M MgSO4溶液(黑曲霉菌株MBin115到MBin120，參見(jiàn)實(shí)施例9-12)中。NovozymTM234的消化一般在37℃，以80-100rpm的溫和搖動(dòng)進(jìn)行30-45分鐘。使原生質(zhì)體濾過(guò)無(wú)菌的MiraclothTM，用1.2M山梨糖醇(黑曲霉菌株MBin111到MBin114)或2M山梨糖醇(黑曲霉菌株MBin115到MBin120)漂洗，并且在3000×g離心10分鐘。用10ml 1.2M山梨糖醇洗滌黑曲霉菌株JRoy3、SMO110和MBin111到MBin114兩次，并用10ml 1.2M山梨糖醇-50mMCaCl2洗滌一次，然后以每ml 1.2M山梨糖醇3×107-1×108個(gè)原生質(zhì)體的濃度進(jìn)行重懸。用30ml 1M山梨糖醇洗滌黑曲霉菌株MBin115到MBin120一次，并用30ml STC洗滌一次，然后重懸在STC∶SPTC∶DMSO(8∶2∶0.1v/v)中以獲得每ml 3×107-1×108個(gè)原生質(zhì)體的濃度。直接使用該黑曲霉原生質(zhì)體用于隨后的轉(zhuǎn)化或在-80℃冷凍。
在轉(zhuǎn)化該原生質(zhì)體前，溶解選擇的蓋層(overlap)并置于50℃。用于pyrG選擇的蓋層的組成為每升20ml Cove鹽，273.8g蔗糖，8g Noble瓊脂，6g NaNO3，和1g NZAmine酪蛋白氨基酸，pH5.5。使用pyrG選擇蓋層來(lái)產(chǎn)生所有的基因斷裂。用于amdS選擇的蓋層的組成為每升20ml Cove鹽(50×)，273.8g蔗糖，8g Noble瓊脂，10mM乙酰胺，和15mM CsCl。當(dāng)轉(zhuǎn)化任何表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，使用amdS選擇蓋層。
將DNA加5μl肝素(5mg/ml STC)加入100μl的原生質(zhì)體并置于冰上30分鐘。在譜系中黑曲霉MBin115之前的黑曲霉菌株不接受肝素。在室溫下孵育30分鐘前，加入SPC(對(duì)于黑曲霉菌株JRoy3、SMO110和MBin111到MBin114為250μl，對(duì)于剩余的菌株為1ml)并溫和地混合。加入10ml體積的蓋層(50℃)并立即傾倒至選擇性平板上。利用pyrG作為可選擇標(biāo)記物的對(duì)基因斷裂的選擇是補(bǔ)充有1M蔗糖的基本培養(yǎng)基。在產(chǎn)生黑曲霉MBin111菌株中，使用組成為每升1M蔗糖，1g 5-氟-乳清酸(5-FOA)，和10mM尿嘧啶核苷的基本培養(yǎng)基平板。Cove平板用來(lái)選擇包含表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。平板在34℃培養(yǎng)3-7天。
實(shí)施例2Southern分析從包含補(bǔ)充有5％葡萄糖(以及當(dāng)適用時(shí)為10mM尿嘧啶核苷)的5mlYP培養(yǎng)基的15mm平板收獲黑曲霉菌絲體，用10mM Tris pH7.4-0.1mMEDTA pH8(TE)，利用有側(cè)臂的培養(yǎng)瓶和陶瓷濾器過(guò)濾并漂洗，最后置于微離心試管中，在加速真空下干燥1小時(shí)。
利用Qiagen DNeasy Plant Mini試劑盒(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)分離DNA。消化5微克的分離DNA 2小時(shí)(40μl總體積，4U的特異限制性核酸內(nèi)切酶/μl DNA)并且利用TBE緩沖液在1％瓊脂糖凝膠上電泳。通過(guò)用0.25M HCl處理，用1.5M NaCl-0.5M NaOH變性，以及用1.5M NaCl-1M Tris，pH8中和，使凝膠中的DNA片段化，然后在20×SSC中轉(zhuǎn)移至MSI MagnaGraph尼龍轉(zhuǎn)移膜上(Micron Separations，Inc.，Westborough，MA)。使DNA紫外交聯(lián)到膜上并且在20ml的DIG Easy Hyb(Roche DiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN)中在60℃預(yù)雜交1小時(shí)。
用PCR DIG探針合成試劑盒，如制造商(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)所描述的制備探針，電泳，并從1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠切下。在使用前，溶解凝膠并通過(guò)煮沸10分鐘使探針變性。將總凝膠體積的百分之十加入雜交緩沖液。將變性探針直接加入DIG Easy Hyb緩沖液并在60℃雜交過(guò)夜。進(jìn)行雜交后洗滌(在2×SSC中兩次，在0.4×SSC中一次，每次為60℃，10分鐘)，利用DIG檢測(cè)系統(tǒng)和CPD-Star(Roche DiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。使用DIG-標(biāo)記的DNA分子量標(biāo)示III(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)作為標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例3黑曲霉基因組λ文庫(kù)的構(gòu)建根據(jù)Wahleithner等人，1996，Current Genetics.29395-403的方法通過(guò)在鹽酸胍中裂解，然后如制造商所描述的在Qiagen Maxiprep柱上(QIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA)純化來(lái)分離黑曲霉Bo-1 DNA。根據(jù)制造商的指導(dǎo)，在EMBL4(Clonetech，Palo Alto，CA)中產(chǎn)生黑曲霉Bo-1的基因組文庫(kù)。用Sau3A部分消化黑曲霉Bo-1基因組DNA。消化后，DNA在預(yù)備的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上電泳，從凝膠切下包含8至23-kb DNA的區(qū)域。用β-瓊脂水解酶(New England Biolabs，Waltham，MA)從凝膠提取DNA。如供應(yīng)商指導(dǎo)所描述的用EMBL4臂(Clonetech，Palo Alto，CA)連接分離的DNA。用Gigapack Gold II包裝試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)體外包裝該連接物。測(cè)定文庫(kù)的滴度，并用大腸桿菌K802細(xì)胞擴(kuò)增該文庫(kù)(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)。估計(jì)未擴(kuò)增的文庫(kù)包含26,500個(gè)獨(dú)立的重組體。
實(shí)施例4pyrG盒的構(gòu)建將來(lái)自包含于EMBL4的黑曲霉Bo-1基因組文庫(kù)的大約26,500個(gè)噬菌斑復(fù)制接種到尼龍濾膜上，并用來(lái)自構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)pyrG基因的1.4kb片段探測(cè)。如制造商所描述的純化并增殖若干陽(yáng)性克隆。利用QiagenλMini Prep試劑盒(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)分離來(lái)自陽(yáng)性克隆的噬菌體DNA。用幾個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶消化噬菌體DNA，然后是Southern分析以鑒定包含pyrG基因的片段。標(biāo)明為克隆7b的一個(gè)克隆包含黑曲霉pyrG基因(SEQ ID NOs1[DNA序列]和2[推導(dǎo)的氨基酸序列])，在3.5kb的XbaI片段上包括啟動(dòng)子和終止子序列。
從克隆7b將pyrG基因片段以3.5kb的XbaI片段亞克隆到pUC118中(Roche Diagnostics Corporation，曼海姆，德國(guó))產(chǎn)生pJRoy10(圖1)。通過(guò)用KspI和SpeI消化從pJRoy10分離的包括啟動(dòng)子和終止子序列的pyrG基因。利用QIAEX II凝膠提取試劑盒，在1％瓊脂糖TBE凝膠上電泳后，分離在5’末端包含KspI位點(diǎn)和在3’末端包含SpeI位點(diǎn)的片段并且純化。
從pJRoy10PCR擴(kuò)增pyrG終止子序列的582bp片段，因此分別在該片段的5’和3’末端加入SpeI和KspI位點(diǎn)。使用引物1來(lái)產(chǎn)生SpeI位點(diǎn)而引物2加入KspI位點(diǎn)。
引物15’-GGGACTAGTGGATCGAAGTTCTGATGGTTA-3’(SEQ IDNO3)引物25’-ATACCGCGGGTTTCAAGGATGGAGATAGGA-3’(SEQ IDNO4)在50μl反應(yīng)物中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其組成為10ng pJRoy10質(zhì)粒DNA，50pmol每種引物，2.5mM各種dATP、dCTP、dGTP、和dTTP，具有2.5mMMgCl2的1×PCR緩沖液(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)，以及2.5單位的Taq DNA聚合酶(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)。在RoboCycler 40熱循環(huán)儀(Stratagene，La Jolla，CA)中進(jìn)行反應(yīng)，程序?yàn)?個(gè)循環(huán)的95℃，3分鐘；30個(gè)循環(huán)的95℃，1分鐘，60℃ 1分鐘，和72℃1.5分鐘；以及1個(gè)循環(huán)的72℃，5分鐘。
用SpeI和KspI消化582bp的PCR產(chǎn)物并如下所述直接使用。
通過(guò)將黑曲霉pyrG基因片段和黑曲霉pyrG終止子片段連接到pBluescript SK-(Stratagene，La Jolla，CA)的SpeI位點(diǎn)中，以使得pyrG在兩側(cè)都與582bp的終止子序列側(cè)鄰來(lái)構(gòu)建質(zhì)粒pMBin01+(圖2)。從pMBin01+分離2696bp的SpeI片段，并在1％瓊脂糖-TBE凝膠上電泳后利用QIAEX II凝膠提取試劑盒純化。利用Qiagen QiaPrep8小提或大提試劑盒(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)分離質(zhì)粒DNA。然后使用2696bp的SpeI片段構(gòu)建所有的斷裂盒。
實(shí)施例5尿嘧啶核苷營(yíng)養(yǎng)缺陷型的產(chǎn)生下列實(shí)施例中描述的基因斷裂使用黑曲霉pyrG基因作為選擇性標(biāo)記。pyrG基因編碼orotodine-5’-磷酸酯脫羧酶，其賦予在不加入尿嘧啶核苷而生長(zhǎng)的尿嘧啶核苷營(yíng)養(yǎng)缺陷型。通過(guò)向如實(shí)施例4所描述的標(biāo)記物末端加入重復(fù)序列使重復(fù)使用pyrG成為可能。通過(guò)當(dāng)對(duì)5-FOA進(jìn)行選擇時(shí)在直接重復(fù)之間的同源重組而發(fā)生pyrG的切割(d′Enfert，1996，Current Genetics3076-82)。
如實(shí)施例4所描述的，斷裂盒包含側(cè)接582bp的重復(fù)pyrG終止子序列的pyrG基因?；驍嗔押?，使每種菌株在含有10mM尿嘧啶核苷的基本培養(yǎng)基上傳代一次以便除去對(duì)pyrG基因的選擇。從包含10mM尿嘧啶核苷的平板收集孢子并且轉(zhuǎn)入包含10mM尿嘧啶核苷和每升1g 5-FOA的基本培養(yǎng)基平板。其中丟失pyrG基因的黑曲霉細(xì)胞在存在5-FOA時(shí)生長(zhǎng)，而保持該基因的細(xì)胞將5-FOA轉(zhuǎn)化為有毒的中間產(chǎn)物5-氟-UMP。從生長(zhǎng)遲緩的非生成孢子集落的菌苔挑選出生長(zhǎng)更快速的集落并生成孢子，通過(guò)在含有10mM尿嘧啶核苷和每升1g 5-FOA的基本培養(yǎng)基平板上傳代兩次進(jìn)行分離，并且選擇單個(gè)的、生成孢子的集落。如實(shí)施例2所描述的進(jìn)行Southern分析以保證已經(jīng)刪除pyrG基因。在斷裂位點(diǎn)留下1個(gè)拷貝的pyrG終止子。
實(shí)施例6黑曲霉SMO110(Δgla)的構(gòu)建從實(shí)施例3中所描述的基因組λ文庫(kù)分離8kb片段的黑曲霉葡糖淀粉酶(gla)基因(SEQ ID NOs5[DNA序列]和6[推導(dǎo)的氨基酸序列])，并亞克隆到pUC118(Roche Diagnostics Corporation，曼海姆，德國(guó))中以產(chǎn)生pJRoy13。將來(lái)自pJRoy13的包含黑曲霉葡糖淀粉酶基因的4kb SpeI片段和1.8kb的側(cè)翼DNA插入pBluescriptSK+中(Stratagene，La Jolla，CA)以產(chǎn)生pJRoy17(圖3)。
利用QIAEX II Gel提取試劑盒，在1％瓊脂糖-TBE凝膠上電泳后，從pJRoy10分離包含pyrG基因的2.3kb的SpeI/XhoI片段，并在1％瓊脂糖-TBE凝膠上電泳后利用QIAEX II凝膠提取試劑盒純化。用Klenow(RocheDiagnostics Corporation，Indianapolis，IN)補(bǔ)平限制性末端，將該片段插入pJRoy17的葡糖淀粉酶基因編碼區(qū)內(nèi)的BglII位點(diǎn)以產(chǎn)生質(zhì)粒pSMO127(圖4)。pSMO127的2個(gè)SpeI位點(diǎn)之間是分別側(cè)接2.2kb和2.3kb的5’和3’葡糖淀粉酶基因序列的2.3kb的pyrG基因。
用Spel消化質(zhì)粒pSMO127，分離由線性的斷裂盒組成的6kb片段并利用實(shí)施例1中所描述的轉(zhuǎn)化方法用于轉(zhuǎn)化缺失pyrG的菌株，黑曲霉JRoy3。利用實(shí)施例5中所描述的方法從黑曲霉Bo-1獲得黑曲霉JRoy3。獲得大約700個(gè)轉(zhuǎn)化體。
從黑曲霉葡糖淀粉酶基因座(起始密碼子前直接的1113bp)PCR擴(kuò)增包含葡糖淀粉酶基因啟動(dòng)子的1100bp片段并且用作Southern印跡分析中的探針。以引物3和4產(chǎn)生探針，其中引物3與5’末端的SpeI位點(diǎn)雜交，而引物4在3’末端加入SphI位點(diǎn)。
引物35’-ACTAGTGGCCCTGTACCCAGA-3’(SEQ ID NO7)
引物45’-GCATGCATTGCTGAGGTGTAATGATG-3’(SEQ ID NO8)在50μl的反應(yīng)物中進(jìn)行葡糖淀粉酶基因啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增，其組成為10ng的pJRoy17質(zhì)粒DNA，50pmol的每種引物，2.5mM每種dATP、dCTP、dGTP、和dTTP，具有2.5mM MgCl2的1×PCR緩沖液，以及2.5單位的TaqDNA聚合酶。在RoboCycler 40熱循環(huán)儀中進(jìn)行反應(yīng)，程序?yàn)?個(gè)循環(huán)的95℃，3分鐘；30個(gè)循環(huán)的95℃，1分鐘，55℃，1分鐘，和72℃，2分鐘；以及1個(gè)循環(huán)的72℃，5分鐘。
如實(shí)施例2所描述的分離和標(biāo)記葡糖淀粉酶基因啟動(dòng)子探針。
從如實(shí)施例2所描述的700個(gè)轉(zhuǎn)化體中的200個(gè)制備基因組DNA。用SpeI消化基因組DNA，然后用上述探針，利用實(shí)施例2中所描述的方法進(jìn)行Southern分析。斷裂盒基因替代到葡糖淀粉酶基因座中導(dǎo)致野生型4kb的葡糖淀粉酶基因條帶增加至6.3kb，這是由于增加了2.3kb的pyrG基因。鑒定了一個(gè)這種轉(zhuǎn)化體并指定為黑曲霉SMO110。
實(shí)施例7黑曲霉Mbin111(ΔpyrG，Δgla)的構(gòu)建用與3’末端的SpeI位點(diǎn)雜交的引物5和在5’末端加入SphI位點(diǎn)的引物6從pJRoy17擴(kuò)增800bp片段的黑曲霉葡糖淀粉酶基因終止子。
引物55’-GAGGTCGACGGTATCGATAAG-3’(SEQ ID NO9)引物65’-GCATGCAGATCTCGAGAATACACCGTTCCTCAG-3’(SEQID NO10)在50μl的反應(yīng)物中進(jìn)行g(shù)la基因終止子的PCR擴(kuò)增，其組成為10ngpJRoy17質(zhì)粒DNA，50pmol每種引物，2.5mM每種dATP、dCTP、dGTP、和dTTP，具有2.5mM MgCl2的1×PCR緩沖液，以及2.5單位的Taq DNA聚合酶。在RoboCycler40熱循環(huán)儀中進(jìn)行反應(yīng)，程序?yàn)?個(gè)循環(huán)的95℃，3分鐘；30個(gè)循環(huán)的95℃，1分鐘，55℃，1分鐘，和72℃，2分鐘；以及1個(gè)循環(huán)的72℃，5分鐘。
如下所述純化包含葡糖淀粉酶基因終止子的800bp片段并直接使用。
利用TOPO-TA克隆試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)，根據(jù)制造商的指導(dǎo)將葡糖淀粉酶基因啟動(dòng)子(實(shí)施例7)和終止子PCR產(chǎn)物亞克隆到pCR2.1載體中。利用QIAEX II凝膠提取試劑盒，在1％瓊脂糖-TBE凝膠上電泳后，分離包含葡糖淀粉酶基因啟動(dòng)子的1.1kb的SpeI/XhoI片段。以同樣的方式分離葡糖淀粉酶基因終止子，然而由于內(nèi)部的SphI位點(diǎn)，用SpeI/SphI消化產(chǎn)生554bp的片段。將啟動(dòng)子和終止子連接到pBluescript SK-(Stratagene，La Jolla，CA)的SpeI位點(diǎn)中產(chǎn)生pMBin05(圖5)。
通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶消化從pMBin05移出SpeI片段并在1％瓊脂糖-TBE凝膠上電泳后利用QIAEX II凝膠提取試劑盒純化。將分離的片段轉(zhuǎn)化入黑曲霉SMO110(實(shí)施例6)以利用實(shí)施例1中所描述的轉(zhuǎn)化方法刪除pyrG斷裂的葡糖淀粉酶位點(diǎn)。在將轉(zhuǎn)化體接種到5-FOA上來(lái)選擇減去pyrG的表型前(參見(jiàn)實(shí)施例5)，進(jìn)行生長(zhǎng)以在選擇前提供更多的時(shí)間用于重組。在補(bǔ)充有5％葡萄糖，0.9M蔗糖，和10mM尿嘧啶核苷的5ml YP培養(yǎng)基中在37℃和100rpm生長(zhǎng)24小時(shí)。
獲得9個(gè)轉(zhuǎn)化體，當(dāng)轉(zhuǎn)入實(shí)施例5中所描述的選擇培養(yǎng)基時(shí)一個(gè)保持pyrG表型。將保持pyrG-表型的轉(zhuǎn)化體指定為黑曲霉MBin111。
對(duì)黑曲霉葡糖淀粉酶和pyrG基因產(chǎn)生探針。利用實(shí)施例4中所描述的相同方法，使用上述的引物3和5來(lái)從pJRoy17PCR擴(kuò)增gla基因(包括啟動(dòng)子和終止子)，使用引物1和2(參見(jiàn)實(shí)施例4)來(lái)從pJRoy10擴(kuò)增pyrG終止子序列。如實(shí)施例2所描述的分離和標(biāo)記探針。
如實(shí)施例2所描述的，從黑曲霉菌株JRoy3、SMO110、和MBin111分離基因組DNA，用SpeI消化，并根據(jù)實(shí)施例2所描述的用于Southern分析的方法用黑曲霉葡糖淀粉酶基因檢測(cè)。在黑曲霉JRoy3中觀察到表示未斷裂的gla基因座的4kb條帶和6.3kb的條帶，這是由于插入了從黑曲霉SMO110獲得的斷裂盒。用來(lái)自黑曲霉MBin111的基因組DNA沒(méi)有檢測(cè)到雜交，表示已經(jīng)缺失了葡糖淀粉酶基因。此外，用pyrG終止子序列檢測(cè)用SpeI消化的DNA，再次沒(méi)有在黑曲霉MBin111菌株中觀察到雜交，但是黑曲霉SMO110保持有6.3kb的條帶。這些結(jié)果表示在黑曲霉MBin111中缺失了全部的葡糖淀粉酶基因座和pyrG基因。
實(shí)施例8黑曲霉MBin112(Δasa，ΔpyrG，Δgla)的構(gòu)建分離部分的黑曲霉酸穩(wěn)定的α-淀粉酶基因(asa)并如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,252,726所描述的克隆到pUC19(Roche Diagnostics Corporation，曼海姆，德國(guó))中。通過(guò)用HpaI消化從包含部分酸穩(wěn)定的α-淀粉酶基因的pUC19切下部分酸穩(wěn)定的α-淀粉酶基因的起始密碼子346bp上游的101bp片段，并通過(guò)平末端連接將來(lái)自pMBin01(實(shí)施例4)的SpeI片段插入這個(gè)位點(diǎn)以產(chǎn)生pMBin04+(圖6)。用SmaI和SpeI進(jìn)行pMBin04+的二重消化，在1％瓊脂糖-TBE凝膠上電泳后利用QIAEX II凝膠提取試劑盒分離4237bp的SmaI/SpeI片段。4237bp的SmaI/SpeI片段由酸穩(wěn)定的α-淀粉酶基因的5’末端、pyrG終止子、全部的pyrG基因(包括終止子)、和酸穩(wěn)定的α-淀粉酶基因的3’末端組成。
利用實(shí)施例1中描述的轉(zhuǎn)化方法，用來(lái)自pMBin04+的SmaI/SpeI片段轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株MBin111。在基本培養(yǎng)基上總共獲得160個(gè)轉(zhuǎn)化體。然后將轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)入淀粉苯胺藍(lán)平板以篩選缺乏酸穩(wěn)定的α-淀粉酶活性的轉(zhuǎn)化體。16個(gè)轉(zhuǎn)化體幾乎沒(méi)有產(chǎn)生澄清帶，在補(bǔ)充有10mM尿嘧啶核苷的基本培養(yǎng)基上分離單個(gè)集落兩次。
從酸穩(wěn)定的α-淀粉酶基因座PCR擴(kuò)增522bp的片段，用作Southern印跡分析中的探針。用引物7和8產(chǎn)生探針。
引物75’-CTCATTGGCCGAAACTCCGAT-3’(SEQ ID NO11)引物85’-AGCAGACGATGTCCTGAGCTG-3’(SEQ ID NO12)在50μl的反應(yīng)物中進(jìn)行522bp片段的PCR擴(kuò)增，其由10ngpUC19/HW360質(zhì)粒DNA，50pmol每種引物，2.5mM每種dATP、dCTP、dGTP、和dTTP，具有2.5mM MgCl2的1×PCR緩沖液，以及2.5單位的TaqDNA聚合酶組成。在RoboCycler 40熱循環(huán)儀中進(jìn)行反應(yīng)，程序?yàn)?個(gè)循環(huán)的95℃，3分鐘；30個(gè)循環(huán)的95℃，1分鐘，55℃ 1分鐘，又72℃ 1分鐘；以及1個(gè)循環(huán)的72℃，5分鐘。
如實(shí)施例2所描述的分離和標(biāo)記522bp的探針。
如實(shí)施例2所描述的從16個(gè)轉(zhuǎn)化體和作為對(duì)照的未轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株MBin111分離基因組DNA。然后用XhoI和SpeI消化基因組DNA，利用上述探針如實(shí)施例2中所描述的進(jìn)行Southern雜交。完整的酸穩(wěn)定的α-淀粉酶基因座顯示為2.3kb的條帶而斷裂位點(diǎn)是5.3kb大小。這個(gè)大小差異是由于插入了實(shí)施例4中所描述的3kb pMBin01+SpeI片段。獲得包含酸穩(wěn)定的α-淀粉酶基因斷裂的5個(gè)轉(zhuǎn)化體，將1個(gè)指定為黑曲霉MBin112。黑曲霉菌株MBin113中產(chǎn)生的斷裂盒的環(huán)突出留下了pyrG終止子并產(chǎn)生了2.8kb的條帶。如實(shí)施例5所描述的進(jìn)行環(huán)突出并產(chǎn)生黑曲霉MBin113。
實(shí)施例9黑曲霉MBin114(ΔprtT，Δasa，ΔpyrG，Δgla)的構(gòu)建利用WO 00/20596中描述的2個(gè)重疊的克隆，NcE 1.4和ClE 1.8構(gòu)建黑曲霉prtT基因(SEQ ID NOs13 DNA序列]和14[推導(dǎo)的氨基酸序列])(pMBin09，圖7)。用PstI消化NcE 1.4，ClE 1.8，和pZeRO-2(Invitrogen，Carlsbad，CA)，分別在克隆的5’和3’末端產(chǎn)生PstI位點(diǎn)，并且在多克隆位點(diǎn)使pZeRO-2線性化。利用prtT克隆的共享區(qū)中的SspI位點(diǎn)，通過(guò)在PstI位點(diǎn)將PstI/SspI克隆片段連接到pZeRO-2中進(jìn)行三線連接產(chǎn)生pMBin09。
通過(guò)用Bstl107I/SspI消化pMBin09首先產(chǎn)生233bp缺失的prtT編碼序列，將實(shí)施例4中描述的pMBin01 SpeI片段作為平端片段插入到消化的pMBin09中以產(chǎn)生pMBin10(圖8)。利用QIAEX II凝膠提取試劑盒在1％瓊脂糖-TBE凝膠上電泳后分離來(lái)自pMBin10的DraIII/NheI片段，用其進(jìn)行prtT斷裂。
利用實(shí)施例1中描述的轉(zhuǎn)化方法，用來(lái)自pMBin10的DraIII/NheI片段轉(zhuǎn)化黑曲霉MBin113。在酪蛋白平板上篩選102個(gè)轉(zhuǎn)化體。9個(gè)轉(zhuǎn)化體幾乎沒(méi)有或沒(méi)有顯示澄清帶，在補(bǔ)充有10mM尿嘧啶核苷的基本培養(yǎng)基上分離單個(gè)集落兩次。
從pMBin10中的prtT基因座PCR擴(kuò)增232bp片段的prtT編碼序列并且用作Southern印跡中的探針。利用引物9和10產(chǎn)生該片段。
引物95’-TGTGATTGAGGTGATTGGCG-3’(SEQ ID NO15)引物105’-TCAGCCACACCTGCAAAGGC-3’(SEQ ID NO16)在50μl的反應(yīng)物中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其由10ng pMBin10質(zhì)粒DNA，50pmol每種引物，2.5mM每種dATP、dCTP、dGTP、和dTTP，具有2.5mMMgCl2的1×PCR緩沖液，以及2.5單位的Taq DNA聚合酶組成。反應(yīng)在RoboCycler 40熱循環(huán)儀中進(jìn)行，程序?yàn)?個(gè)循環(huán)的95℃，3分鐘；30個(gè)循環(huán)的95℃，1分鐘，60℃，1分鐘，和72℃，1分鐘；以及1個(gè)循環(huán)的72℃，5分鐘。
如實(shí)施例2所描述的分離和標(biāo)記探針，其包含斷裂的232bp的prtT編碼序列下游。
如實(shí)施例2所描述的從9個(gè)轉(zhuǎn)化體，以及作為對(duì)照的黑曲霉Bo-1和黑曲霉MBin112分離基因組DNA，并且如實(shí)施例2所描述的進(jìn)行Southern分析。用PstI消化基因組DNA，在對(duì)照菌株中觀察到相應(yīng)于未斷裂的prtT基因的2.5kb條帶。當(dāng)探針與包含132bp的pyrG終止子和1198bp的prtT基因的PstI片段雜交時(shí)觀察到相應(yīng)于prtT基因斷裂的1.3kb條帶。選擇1個(gè)斷裂體并指定為黑曲霉MBin114。如實(shí)施例5所描述的外環(huán)化(loopedout)pyrG基因產(chǎn)生黑曲霉MBin115。
實(shí)施例10黑曲霉MBin116(ΔamyB，ΔprtT，Δasa，ΔpyrG，Δgla)的構(gòu)建如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,252,726中所公開(kāi)的內(nèi)容克隆黑曲霉中性α-淀粉酶基因，amyA和amyB(NA1＝amyA而NA2＝amyB)。
通過(guò)EcoRI/BglII消化，并利用QIAEX II凝膠提取試劑盒在1％瓊脂糖-TBE凝膠上電泳后分離，從pTaka17(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,536,661)分離2.6kb片段的黑曲霉中性α-淀粉酶基因(amyB)(SEQ ID NOs17[DNA序列]和18[推導(dǎo)的氨基酸序列])。將2.6kb片段插入pZero2.0(Invitrogen，Carlsbad，CA)的EcoRI/BamHI位點(diǎn)以產(chǎn)生pMBin02(圖9)。通過(guò)PmeI/SmaI消化在pMBin02中產(chǎn)生從同源amyB基因的第5個(gè)外顯子除去186bp和從第6個(gè)外顯子除去52bp的298bp缺失，并通過(guò)平末端連接插入pMBin01 2696bp SpeI片段(實(shí)施例4中描述的)以產(chǎn)生pMBin03(圖10)。
利用實(shí)施例1中描述的方法用分離來(lái)自pMBin03的EcoRI/AvrII片段轉(zhuǎn)化黑曲霉MBin115。獲得192個(gè)轉(zhuǎn)化體，如實(shí)施例8所描述的轉(zhuǎn)入淀粉苯胺藍(lán)平板，其中有下列改變淀粉苯胺藍(lán)平板缺乏甘氨酸并且pH是至少5。8個(gè)轉(zhuǎn)化體顯示減少的澄清帶，在補(bǔ)充有10mM尿嘧啶核苷的基本培養(yǎng)基上分離單個(gè)集落兩次。
利用引物11和12PCR擴(kuò)增產(chǎn)生具有相應(yīng)于黑曲霉amyA或amyB編碼序列的295bp，ATG位點(diǎn)的450bp下游(在該區(qū)域中amyA和amyB序列是相同的)的序列的探針。
引物115’-GGCAGCAGGATATGTAAGTCG-3’(SEQ ID NO19)引物125’-CACTGTAATCGACTGAGCTAC-3’(SEQ ID NO20)在50μl反應(yīng)物中進(jìn)行PCR，其由10ng pMBin03質(zhì)粒DNA，50pmol每種引物，2.5mM每種dATP、dCTP、dGTP、和dTTP，具有2.5mM MgCl2的1×PCR緩沖液，以及2.5單位的Taq DNA聚合酶組成。在RoboCycler 40熱循環(huán)儀中進(jìn)行反應(yīng)，程序?yàn)?個(gè)循環(huán)的95℃，3分鐘；30個(gè)循環(huán)的95℃，1分鐘，60℃，1分鐘，和72℃，1分鐘；以及1個(gè)循環(huán)的72℃，5分鐘.
如實(shí)施例2所描述的分離和標(biāo)記探針。如實(shí)施例2所描述的從8個(gè)轉(zhuǎn)化體和作為對(duì)照的未轉(zhuǎn)化黑曲霉MBin115分離基因組DNA并用EcoRI和BspLU11I消化。利用實(shí)施例2中描述的方法對(duì)消化的基因組DNA進(jìn)行Southern分析。起始密碼子的616bp上游存在EcoRI位點(diǎn)，終止密碼子的99bp下游存在BspLu11I位點(diǎn)。野生型黑曲霉菌株Bo-1 amyB基因條帶是2659bp。斷裂的amyB基因?qū)е?659bp條帶的消失，并且由于插入pMBin01 SpeI片段，在5359bp顯示條帶。
1個(gè)轉(zhuǎn)化體包含清楚的斷裂并被指定為黑曲霉MBin116。如實(shí)施例5所描述的從黑曲霉MBin116切下pyrG基因，并將該菌株指定為黑曲霉MBin117。
實(shí)施例11黑曲霉MBin118(ΔamyA，ΔamyB，ΔprtT，Δasa，ΔpyrG，Δgla)的構(gòu)建因?yàn)楹谇筧myA基因序列與amyB是基本上相同的，除在3’末端(Korman等人，1990，Current Genetics 17203-212)之外，因此應(yīng)用實(shí)施例10中所使用的斷裂構(gòu)建和方法。根據(jù)實(shí)施例1中描述的方法用來(lái)自pMBin03的EcoRI/AvrII片段轉(zhuǎn)化黑曲霉MBin117，以便斷裂a(bǔ)myA基因(SEQID NOs21 DNA序列]和22[推導(dǎo)的氨基酸序列])。
獲得356個(gè)轉(zhuǎn)化體并如實(shí)施例10所描述的轉(zhuǎn)入淀粉苯胺藍(lán)平板。在補(bǔ)充有10mM尿嘧啶核苷的基本培養(yǎng)基上分離在淀粉苯胺藍(lán)平板上沒(méi)有產(chǎn)生澄清帶的4個(gè)轉(zhuǎn)化體的單個(gè)集落兩次。
從4個(gè)轉(zhuǎn)化體和作為對(duì)照的黑曲霉MBin117分離基因組DNA并利用實(shí)施例2中描述的方法進(jìn)行Southern分析。用EcoRI和BspLU11I消化基因組DNA并如實(shí)施例10所描述的進(jìn)行檢測(cè)。在野生型黑曲霉Bo-1菌株中存在相應(yīng)于amyB基因的2.7kb條帶和表示amyA基因的略大的條帶。amyA條帶的確切大小不是已知的，因?yàn)锽spLU11I在amyA基因下游的未知位點(diǎn)有切割。在1個(gè)分析的轉(zhuǎn)化體中，相應(yīng)于amyA基因的條帶不再是用探針可檢測(cè)到的，表明已經(jīng)存在包括探針位置的amyA基因的缺失。將該轉(zhuǎn)化體指定為黑曲霉MBin118。如實(shí)施例5所描述的從黑曲霉MBin118切下pyrG基因，并將該菌株指定為黑曲霉MBin119。
實(shí)施例12黑曲霉MBin120(Δoxa，ΔamyA，ΔamyB，ΔprtT，Δasa，ΔpyrG，Δgla)的構(gòu)建根據(jù)WO 00/50576中描述的方法克隆黑曲霉草酸水解酶(oah)基因(SEQ NOs23[DNA序列]和24[推導(dǎo)的氨基酸序列])。如WO 00/50576所描述的構(gòu)建質(zhì)粒pHP1。
通過(guò)用BstEII消化pHP1除去285bp的缺失，其包括156bp的啟動(dòng)子和129bp的草酸水解酶基因編碼序列。將實(shí)施例4中描述的pMBin01 SpeI片段平末端連接到這個(gè)位點(diǎn)中以產(chǎn)生pMBin08(圖11)。用NotI消化質(zhì)粒pMBin08，在1％瓊脂糖-TBE凝膠上電泳后利用QIAEX II凝膠提取試劑盒分離7155bp的片段。來(lái)自pMBin08的NotI片段用來(lái)斷裂黑曲霉MBin119中的草酸水解酶基因。
利用實(shí)施例1中描述的轉(zhuǎn)化方法，用來(lái)自pMBin08的NotI片段轉(zhuǎn)化黑曲霉MBin119。獲得49個(gè)轉(zhuǎn)化體，利用Sigma草酸酯試劑盒(編號(hào)591，SigmaDiagnostics，St.Louis，MO)篩選草酸酯的產(chǎn)生。通過(guò)將密度為每ml大約104個(gè)轉(zhuǎn)化體的分生孢子接種到包含補(bǔ)充有5％葡萄糖的20ml YP培養(yǎng)基的125ml搖瓶中而在搖瓶中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體。在37℃和200rpm培養(yǎng)搖瓶3至6天。在第3天移出5μl的搖瓶培養(yǎng)物樣品并離心以產(chǎn)生上清液用于酶活性測(cè)定。將第3天的上清液加入96孔平板的孔中，然后按照制造商的說(shuō)明加入1/10體積的草酸酯試劑盒試劑。在590nm分光光度測(cè)量草酸酯的產(chǎn)量。1個(gè)轉(zhuǎn)化體沒(méi)有產(chǎn)生可檢測(cè)的草酸酯，在補(bǔ)充有10mM尿嘧啶核苷的基本培養(yǎng)基上分離單個(gè)集落兩次。
利用引物13和14從草酸水解酶基因內(nèi)(起始密碼子下游的404bp)PCR擴(kuò)增包括579bp序列的片段用作Southern印跡分析中的探針。
引物135’-CTACGACATGAAGACCAACGC-3’(SEQ ID NO25)引物145’-GCACCGTTCTCCACCATGTTG-3’(SEQ ID NO26)在50μl的反應(yīng)物中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其由10ng pMBin08質(zhì)粒DNA，50pmol每種引物，2.5mM每種dATP、dCTP、dGTP、和dTTP，具有2.5mMMgCl2的1×PCR緩沖液，以及2.5單位的Taq DNA聚合酶組成。在RoboCycler 40熱循環(huán)儀中進(jìn)行反應(yīng)，程序?yàn)?個(gè)循環(huán)的95℃，3分鐘；30個(gè)循環(huán)的95℃，1分鐘，60℃，1分鐘，和72℃，1分鐘；以及1個(gè)循環(huán)的72℃，5分鐘。
如實(shí)施例2所描述的分離和標(biāo)記探針。如實(shí)施例2所描述的從轉(zhuǎn)化體，以及作為對(duì)照的黑曲霉Bo-1和黑曲霉MBin118分離基因組DNA，并且用NdeI和SspI消化。用上述探針對(duì)黑曲霉對(duì)照菌株Bo-1和MBin118的Southern分析顯示相應(yīng)于未斷裂草酸水解酶基因的2.5kb條帶。該轉(zhuǎn)化體具有與在草酸水解酶基因座插入斷裂盒一致的4.9kb條帶。將該轉(zhuǎn)化體指定為黑曲霉MBin120。
實(shí)施例13黑曲霉普通宿主菌株的表達(dá)分析通過(guò)在搖瓶和/或發(fā)酵罐中培養(yǎng)菌株評(píng)估普通宿主黑曲霉菌株產(chǎn)生葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶、和蛋白酶的能力。黑曲霉Bo-1作為對(duì)照。
將密度為每ml大約104的黑曲霉菌株分生孢子接種到包含補(bǔ)充有5％葡萄糖的20ml YP培養(yǎng)基的125ml搖瓶中。搖瓶在37℃和200rpm培養(yǎng)3至6天。在第3-6天移出搖瓶培養(yǎng)物樣品，離心產(chǎn)生用于酶活性測(cè)定的上清液。
也將黑曲霉菌株接種到包含1.8升培養(yǎng)基的2升發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基組成為每升2g MgSO4·7H2O，2g KH2PO4，2g檸檬酸，2g K2SO4，0.5ml AMG微量金屬溶液，300g高麥芽糖糖漿，1.8g CaCl2·2H2O，和1.8ml普朗尼克酸(pluronic acid)。培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基是組成為每升50g尿素和5ml普朗尼克酸的培養(yǎng)基。發(fā)酵條件是34℃，pH4.5+/-0.05，1.0vvm曝氣(aeration)，和1000rpm進(jìn)行8天。在第1-8天移出發(fā)酵樣品，離心產(chǎn)生用于酶活性測(cè)定的上清液。
在25℃，pH4.3的0.1M醋酸鈉中利用麥芽糖作為底物測(cè)量葡糖淀粉酶活性。根據(jù)制造商的指導(dǎo)，利用Sigma Trinder顯色試劑(Sigma reagent kit315-100，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)在490nm測(cè)量葡萄糖。AMGTM(Novozymes A/S，Bagsvrd，丹麥；批次7-195)用作以AGU/ml測(cè)量的具有葡糖淀粉酶活性的標(biāo)準(zhǔn)物。
確定黑曲霉SMO110沒(méi)有產(chǎn)生可檢測(cè)的葡糖淀粉酶活性(在第4天的搖瓶樣品中小于0.5AGU/ml)。確定黑曲霉MBin111沒(méi)有產(chǎn)生可檢測(cè)的葡糖淀粉酶活性(在第4天的搖瓶或發(fā)酵樣品中小于0.5AGU/ml)。
分別在pH4.5和pH7.0，利用Sigmaα-淀粉酶底物(Sigma Kit #577，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)在30℃測(cè)量酸穩(wěn)定的和中性α-淀粉酶活性。檢測(cè)是在405nm。FungamylTM用作標(biāo)準(zhǔn)物并且以FAU/ml報(bào)告活性。
與黑曲霉Bo-1(在第5天的發(fā)酵樣品中為51FAU/ml)相比，對(duì)于黑曲霉MBin113、MBin116、和MBin118(在第3天的搖瓶或發(fā)酵樣品中都＞0.1FAU/ml)發(fā)現(xiàn)幾乎不能檢測(cè)到酸穩(wěn)定的α-淀粉酶活性。與發(fā)酵樣品中的黑曲霉Bo-1相比，對(duì)于黑曲霉MBin114(來(lái)自第3天的搖瓶樣品為未檢測(cè)到和在第5天的發(fā)酵樣品中為5.7FAU/ml)中性α-淀粉酶活性基本上減少了，而對(duì)于黑曲霉MBin118(在第5天的發(fā)酵樣品中為0.5FAU/ml)幾乎不能檢測(cè)到。
利用FITC-酪蛋白作為底物(Sigma Chemical Co.，St.Loius，MO)確定總的蛋白酶活性。通過(guò)混合40μl的FITC-干酪素底物(儲(chǔ)液1∶1，具有0.1M磷酸鉀，pH6.0或0.1M檸檬酸鈉，pH5.0)和在0.1M磷酸鉀pH6.0或0.1M檸檬酸鈉pH5.0中適當(dāng)稀釋的10μl培養(yǎng)物樣品，然后在37℃孵育該溶液1小時(shí)而進(jìn)行測(cè)定。孵育1小時(shí)后，用150μl的5％三氯乙酸淬滅反應(yīng)并在冷藏室中孵育1小時(shí)。將淬滅的反應(yīng)物轉(zhuǎn)入Eppendorf試管并離心10分鐘。將10μl等分的上清液轉(zhuǎn)入包含1ml 0.5M硼酸鹽pH9.0的試管并混合。將200μl等分的溶液轉(zhuǎn)入黑色的“U”底96孔平板(ThermoLabsystems，F(xiàn)ranklin，MA)。利用Fluorolite 1000儀器(ThermoLabsystems，F(xiàn)ranklin，MA)，用參考通路3和設(shè)置為1176測(cè)量熒光。以蛋白酶熒光單位測(cè)量活性。
對(duì)于黑曲霉MBin114中prtT基因的缺失，總的蛋白酶活性降低到黑曲霉Bo-1的大約20％。第6天的MBin114發(fā)酵樣品具有692的蛋白酶活性，而B(niǎo)o-1是至少3953熒光單位/ml。
實(shí)施例14南極洲假絲酵母脂肪酶B在黑曲霉MBin114、MBin118和MBin120中的表達(dá)如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,020,180所描述的克隆假絲酵母南極洲脂肪酶B基因(SEQ ID NOs27[DNA序列]和28[推導(dǎo)的氨基酸序列])。如Hoegh等人在Can.J.Bot.73(Suppl.1)S869-S875(1995)中所描述的構(gòu)建包含脂肪酶B基因的質(zhì)粒pMT1335。如WO 91/17243所描述的構(gòu)建包含構(gòu)巢曲霉amdS基因的質(zhì)粒pTOC90。根據(jù)實(shí)施例1中描述的方法將質(zhì)粒pMT1335和pTOC90共轉(zhuǎn)化入黑曲霉MBin114，并且在乙酰胺上選擇轉(zhuǎn)化體。
通過(guò)劃線至乙酰胺平板分離30個(gè)轉(zhuǎn)化體。從轉(zhuǎn)化體收集分生孢子，用于如實(shí)施例13所描述的接種于搖瓶。在第3-6天移出搖瓶培養(yǎng)物樣品，離心產(chǎn)生用于酶活性測(cè)定的上清液。
為了評(píng)估prtT基因的斷裂對(duì)蛋白酶活性的總水平的影響，和南極洲假絲酵母脂肪酶B(CLB)的產(chǎn)率，確定蛋白酶和脂肪酶B的活性。通過(guò)發(fā)酵評(píng)估產(chǎn)生脂肪酶B的幾個(gè)轉(zhuǎn)化體和最高的生產(chǎn)體。
如實(shí)施例13所描述的，在2升的發(fā)酵罐中培養(yǎng)黑曲霉MBin114和作為對(duì)照的黑曲霉Bo-1。
如實(shí)施例9所描述的測(cè)量總的蛋白酶活性。
在pH7，用p-硝基苯基丁酸(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)作為底物進(jìn)行脂肪酶B測(cè)定。在0.1M MOPS-4mM CaCl2pH7.0中適當(dāng)稀釋培養(yǎng)物上清液。將100μl等分的培養(yǎng)物上清液加入在96孔微平板孔中的100μl的p-硝基苯基丁酸底物溶液。p-硝基苯基丁酸底物溶液由10μl的p-硝基苯基丁酸，990μl的DMSO，和4ml的0.1M MOPS-4mM CaCl2pH7.0組成。用南極洲假絲酵母脂肪酶B標(biāo)準(zhǔn)物(Novozymes Japan Ltd.，Chiba-shi，日本)來(lái)計(jì)算LU/ml，在405nm分光光度測(cè)量脂肪酶活性。
圖14和15顯示了這些測(cè)定的結(jié)果?？偟牡鞍酌富钚越档偷揭吧偷拇蠹s20％(參見(jiàn)實(shí)施例13，圖12)，脂肪酶B活性在發(fā)酵的自始至終穩(wěn)定地上升(圖13)。
實(shí)施例15Scytalidium thermophilum過(guò)氧化氫酶在黑曲霉MBin114、MBin118和MBin120中的表達(dá)如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,646,025所描述的克隆Scytalidium thermophilum過(guò)氧化氫酶基因(SEQ ID NOs29[DNA序列]和30[推導(dǎo)的氨基酸序列])。如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,646,025所描述的構(gòu)建包含過(guò)氧化氫酶基因的質(zhì)粒pDM153。根據(jù)實(shí)施例1描述的方法將質(zhì)粒pDM153轉(zhuǎn)化入黑曲霉菌株MBin114、MBin118、和MBin120。
選擇40個(gè)轉(zhuǎn)化體，在包含1.5ml 1∶4稀釋度的M400培養(yǎng)基的24孔平板中培養(yǎng)。在34℃和125rpm培養(yǎng)平板90小時(shí)。在第90個(gè)小時(shí)移出樣品用于測(cè)定。在發(fā)酵罐中評(píng)估產(chǎn)生最高水平的過(guò)氧化氫酶活性的3個(gè)轉(zhuǎn)化體。
在25℃，包含18.2μl過(guò)氧化氫儲(chǔ)液的10mM磷酸鹽pH7緩沖液中測(cè)量過(guò)氧化氫酶活性。過(guò)氧化氫儲(chǔ)液由每10ml 10mM磷酸鉀pH7的30％過(guò)氧化氫組成。將25μl等分的培養(yǎng)物上清液加入在96孔微平板孔中的25μl的過(guò)氧化氫儲(chǔ)液。孵育5分鐘后，加入200μl的鈦試劑，在405nm讀取吸光率。鈦試劑由1.0g二氧化鈦和10g K2SO4組成，其用150ml濃縮的H2SO4在180-220℃消化2-3小時(shí)，冷卻，然后用1.5升去離子水稀釋。利用Catazyme(Novozymes A/S，Bagsvrd，丹麥，批次31-2197)作為標(biāo)準(zhǔn)物，并以KCIU/ml報(bào)告在405nm分光光度測(cè)量過(guò)氧化氫酶活性。
如實(shí)施例13所描述的，在2升發(fā)酵罐中培養(yǎng)黑曲霉菌株MBin114、MBin118、和MBin120。
圖15顯示了黑曲霉普通宿主菌株MBin114、MBin118和MBin120中Scytalidium thermophilum過(guò)氧化氫酶生產(chǎn)的比較。在任何測(cè)試的菌株中沒(méi)有觀察到酶生產(chǎn)量的明顯變化。
在此所描述和要求的本發(fā)明不限于在此所公開(kāi)的由特定方面所限制的范圍，因?yàn)檫@些方面旨在例證說(shuō)明本發(fā)明的幾個(gè)方面。任何等效方面限定為是在本發(fā)明的范圍內(nèi)的。實(shí)際上，除在此所顯示和描述的實(shí)施方案外，從上述說(shuō)明書(shū)看來(lái)，本發(fā)明的各種改變對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。這種改變也是屬于所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)的。就分岐來(lái)說(shuō)，包括定義的本公開(kāi)的內(nèi)容將進(jìn)行控制。
在此引用多種參考文獻(xiàn)，其公開(kāi)的內(nèi)容全部引入作為參考。
序列表<110>諾維信股份有限公司(Novozymes Biotech，Inc.)<120>在缺乏酶的黑曲霉突變體中生產(chǎn)生物物質(zhì)的方法<130>10345.204-WO<160>30<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1517<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>1gcagggaaaa atacgagctc caatgaacct gggtgtggca acttcaatgg aaaggaactg 60cctttgcagg tgtggctgaa ccccacggtt ccggtcggag gcggcgaaat cacccgatgt 120ggctggtgcg tggagggtcg cgatgattta ctgagctcct cttttgctcg acattgaatg 180tgcattgttc acctcatata agggccagtc gctgctaaat tattcggtag tatttgcgca 240tctctggatc taccaattag ggcctatcag tcgaaactcc aagctactca tattgcacaa 300gcctctttca tccccgcatt aacccctcca ccgacaccat gtcctccaag tcgcaattga 360cctacactgc ccgtgccagc aagcacccca atgctctggc caagcggctg ttcgaaattg 420ctgaggccaa gaagaccaat gtgaccgtct ctgccgacgt taccaccact aaggagctac 480tagatcttgc tgaccgtagg ccgacccgcc attctgcctg tttatgctgc atacaaactt 540attaacggtg ataccggact gaggtctcgg tccctacatc gccgtgatca aaacccacat 600cgatatcctc tctgacttca gcgacgagac cattgagggc ctcaaggctc ttgcgcagaa 660gcacaacttc ctcatcttcg aggaccgcaa attcatcgac attggcaaca ctgtccagaa 720gcaataccac cgtggtaccc tccgcatctc agaatgggcc catatcatca actgcagcat 780cctgcctggc gagggtatcg tcgaggctct cgctcagacg gcgtctgcac cggacttctc 840ctacggcccc gaacgtggtc tgttgatctt ggcggaaatg acctctaagg gttccttggc 900caccggccag tacactactt cttcggttga ttatgcccgg aaatacaaga acttcgtcat 960gggatttgtg tcgacccgct cgttgggtga ggtgcagtcg gaagtcagct ctccttcgga1020tgaggaggac tttgtggtct tcacgactgg tgtgaacatt tcgtccaagg gagataagct1080cggtcagcag taccagactc ccgcatcggc tatcggtcgg ggtgctgact tcattatcgc1140gggtcgcggt atctacgccg cgccggaccc ggtgcaggct gcgcaacagt accagaagga1200aggttgggag gcgtacctgg cccgtgtcgg cggaaactaa tactataaaa tgaggaaaaa1260agttttgatg gttatgaatg atatagaaat gcaacttgcc gctacgatac gcatacaaac1320taatgtcgag cacgggtagt cagactgcgg catcggatgt caaaacggta ttgatcctgc1380aggctattat agggtggcac gggattaatg cggtacgacg atttgatgca gataagcagg1440ctgcgaagta cttagtcctg taactcttgc gtagagcaaa tggcgacggg tggctgataa1500gggacggtga taagctt 1517
<210>2<211>277<212>PRT<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>2Met Ser Ser Lys Ser Gln Leu Thr Tyr Thr Ala Arg Ala Ser Lys His1 5 10 15Pro Asn Ala Leu Ala Lys Arg Leu Phe Glu Ile Ala Glu Ala Lys Lys20 25 30Thr Asn Val Thr Val Ser Ala Asp Val Thr Thr Thr Lys Glu Leu Leu35 40 45Asp Leu Ala Asp Arg Leu Gly Pro Tyr Ile Ala Val Ile Lys Thr His50 55 60Ile Asp Ile Leu Ser Asp Phe Ser Asp Glu Thr Ile Glu Gly Leu Lys65 70 75 80Ala Leu Ala Gln Lys His Asn Phe Leu Ile Phe Glu Asp Arg Lys Phe85 90 95Ile Asp Ile Gly Asn Thr Val Gln Lys Gln Tyr His Arg Gly Thr Leu100 105 110Arg Ile Ser Glu Trp Ala His Ile Ile Asn Cys Ser Ile Leu Pro Gly115 120 125Glu Gly Ile Val Glu Ala Leu Ala Gln Thr Ala Ser Ala Pro Asp Phe130 135 140Ser Tyr Gly Pro Glu Arg Gly Leu Leu Ile Leu Ala Glu Met Thr Ser145 150 155 160Lys Gly Ser Leu Ala Thr Gly Gln Tyr Thr Thr Ser Ser Val Asp Tyr165 170 175Ala Arg Lys Tyr Lys Asn Phe Val Met Gly Phe Val Ser Thr Arg Ser180 185 190Leu Gly Glu Val Gln Ser Glu Val Ser Ser Pro Ser Asp Glu Glu Asp195 200 205Phe Val Val Phe Thr Thr Gly Val Asn Ile Ser Ser Lys Gly Asp Lys210 215 220Leu Gly Gln Gln Tyr Gln Thr Pro Ala Ser Ala Ile Gly Arg Gly Ala225 230 235 240
Asp Phe Ile Ile Ala Gly Arg Gly Ile Tyr Ala Ala Pro Asp Pro Val245 250 255Gln Ala Ala Gln Gln Tyr Gln Lys Glu Gly Trp Glu Ala Tyr Leu Ala260 265 270Arg Val Gly Gly Asn275<210>3<211>30<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>3gggactagtg gatcgaagtt ctgatggtta 30<210>4<211>30<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>4ataccgcggg tttcaaggat ggagatagga 30<210>5<211>2103<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>5tcccttttag gcgcaactga gagcctgagc ttcatcccca gcatcattac acctcagcaa 60tgtcgttccg atctctactc gccctgagcg gcctcgtctg cacagggttg gcaaatgtga120tttccaagcg cgcgaccttg gattcatggt tgagcaacga agcgaccgtg gctcgtactg180ccatcctgaa taacatcggg gcggacggtg cttgggtgtc gggcgcggac tctggcattg240tcgttgctag tcccagcacg gataacccgg actacttcta cacctggact cgcgactctg300gtctcgtcct caagaccctc gtcgatctct tccgaaatgg agataccagt ctcctctcca360ccattgagaa ctacatctcc gcccaggcaa ttgtccaggg tatcagtaac ccctctggtg420atctgtccag cggcgctggt ctcggtgaac ccaagttcaa tgtcgatgag actgcctaca480ctggttcttg gggacggccg cagcgagatg gtccggctct gagagcaact gctatgatcg540gcttcgggca gtggctgctt gacaatggct acaccagcac cgcaacggac attgtttggc600ccctcgttag gaacgacctg tcgtatgtgg ctcaatactg gaaccagaca ggatatgatc660tctgggaaga agtcaatggc tcgtctttct ttacgattgc tgtgcaacac cgcgcccttg720tcgaaggtag tgccttcgcg acggccgtcg gctcgtcctg ctcctggtgt gattctcagg780cacccgaaat tctctgctac ctgcagtcct tctggaccgg cagcttcatt ctggccaact840tcgatagcag ccgttccggc aaggacgcaa acaccctcct gggaagcatc cacacctttg900atcctgaggc cgcatgcgac gactccacct tccagccctg ctccccgcgc gcgctcgcca960accacaagga ggttgtagac tctttccgct caatctatac cctcaacgat ggtctcagtg 1020
acagcgaggc tgttgcggtg ggtcggtacc ctgaggacac gtactacaac ggcaacccgt1080ggttcctgtg caccttggct gccgcagagc agttgtacga tgctctatac cagtgggaca1140agcaggggtc gttggaggtc acagatgtgt cgctggactt cttcaaggca ctgtacagcg1200atgctgctac tggcacctac tcttcgtcca gttcgactta tagtagcatt gtagatgccg1260tgaagacttt cgccgatggc ttcgtctcta ttgtggaaac tcacgccgca agcaacggct1320ccatgtccga gcaatacgac aagtctgatg gcgagcagct ttccgctcgc gacctgacct1380ggtcttatgc tgctctgctg accgccaaca accgtcgtaa ctccgtcgtg cctgcttctt1440ggggcgagac ctctgccagc agcgtgcccg gcacctgtgc ggccacatct gccattggta1500cctacagcag tgtgactgtc acctcgtggc cgagtatcgt ggctactggc ggcaccacta1560cgacggctac ccccactgga tccggcagcg tgacctcgac cagcaagacc accgcgactg1620ctagcaagac cagcaccagt acgtcatcaa cctcctgtac cactcccacc gccgtggctg1680tgactttcga tctgacagct accaccacct acggcgagaa catctacctg gtcggatcga1740tctctcagct gggtgactgg gaaaccagcg acggcatagc tctgagtgct gacaagtaca1800cttccagcga cccgctctgg tatgtcactg tgactctgcc ggctggtgag tcgtttgagt1860acaagtttat ccgcattgag agcgatgact ccgtggagtg ggagagtgat cccaaccgag1920aatacaccgt tcctcaggcg tgcggaacgt cgaccgcgac ggtgactgac acctggcggt1980gacaatcaat ccatttcgct atagttaaag gatggggatg agggcaattg gttatatgat2040catgtatgta gtgggtgtgc ataatagtag tgaaatggaa gccaagtcat gtgattgtaa2100tcg 2103<210>6<211>662<212>PRT<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>6Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly1 5 10 15Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser20 25 30Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Phe Thr Ile35 40 45Gly Ala Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val50 55 60Ala Ser Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg65 70 75 80Asp Ser Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly
85 90 95Asp Thr Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Phe Thr Tyr Ile Ser Ala100 105 110Gln Ala Ile Val Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser115 120 125Gly Ala Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr130 135 140Thr Gly Ser Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala145 150 155 160Thr Ala Met Ile Gly Phe Gly Phe Thr Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly165 170 175Tyr Thr Ser Thr Ala Thr Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp180 185 190Leu Ser Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp195 200 205Glu Glu Val Asn Gly Ser Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg210 215 220Ala Leu Val Glu Phe Thr Gly Ser Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser225 230 235 240Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu245 250 255Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser260 265 270Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe275 280 285Asp Phe Thr Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys290 295 300Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu Val Val Asp Ser Phe Arg305 310 315 320Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser Asp Ser Glu Ala Val Ala325 330 335Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr Asn Gly Asn Pro Phe Thr340 345 350Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Leu
355 360 365Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Asp Val Ser Leu370 375 380Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Ser385 390 395 400Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Phe Thr Ala Val Lys405 410 415Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala Ala Ser420 425 430Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu Gln Leu435 440 445Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr Ala Asn450 455 460Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Phe Thr Ala Ser Trp Gly Glu Thr465 470 475 480Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly485 490 495Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr500 505 510Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr515 520 525Ser Thr Ser Lys Thr Phe Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr530 535 540Ser Thr Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro Thr Ala Val Ala Val Thr545 550 555 560Phe Asp Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu Asn Ile Tyr Leu Val565 570 575Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Asp Trp Glu Thr Ser Asp Gly Ile Ala580 585 590Leu Ser Phe Thr Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Pro Leu Trp Tyr595 600 605Val Thr Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu Ser Phe Glu Tyr Lys Phe Ile610 615 620Arg Ile Glu Ser Asp Asp Ser Val Glu Trp Glu Ser Asp Pro Asn Arg625 630 635 640
Glu Tyr Thr Val Pro Gln Ala Cys Gly Thr Ser Thr Ala Thr Val Phe645 650 655Thr Thr Asp Thr Trp Arg660<210>7<211>21<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>7actagtggcc ctgtacccag a21<210>8<211>26<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>8gcatgcattg ctgaggtgta atgatg 26<210>9<211>21<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>9gaggtcgacg gtatcgataa g21<210>10<211>33<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>10gcatgcagat ctcgagaata caccgttcct cag 33<210>11<211>21<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>11ctcattggcc gaaactccga t21<210>12<211>21<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>12agcagacgat gtcctgagct g21<210>13<211>4098<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)
<400>13ttggtgctgg aaagcccatt taagggatct tataaggtaa ttgccaatgt tcagtcgcct 60atggtctttg tcgagagaaa ctctttctcg ttaagatcta catgatcgct tttgattttc 120tctgggttca cgcggtactt tctccccgtc aatccccaac cgctgttgtg cctgaccatc 180aatgtggaac ggataagggg acaagagaaa ttgaaggagc gatcataaaa agctaatttt 240ggtttattat ttttttttct tataaaactc aaaaaagaaa acgaaaacga aaaaggaaaa 300aagaaaaggt aaaatggaaa aagaaaggcg gtcatcactt ccaataacca tcagccaaag 360atacagacga gttactgacc ttcttatcct ggacttccgc ccgatccata tcttcatgat 420aagcagggaa ccgaacaaat caacgccaac ttcagcggca gttcctcact aatttcccac 480ttcccaccgg cgtcattttg gtcccaaccc cctccctgga agcagcggga tttagttacg 540atccggttta catcggagac tcggaaaata ccatagcgca tgccaatcaa aacccctccc 600agggtgactg gccagtatca cgacccattg tttctatctt tctagaagac ctgcagggac 660atggattggc tggccgccgt gctgccgtcc attagcgtct accccaggtc aagaacggac 720tggacggacc cataaccaat ctaaccaaag ccaatttcgt caattcccag ctggcgagca 780caatcccatt cccagggttg gccgccaact gttaaaaggc actatgtgtc tctccacctg 840cccgcccccc tcgatggcct gcgcgtaata actattctac tgctttttgc ctcttacttg 900cctcattatt agtattttac tctactctcc agattgcctg ccagcaattg gtccaaagtg 960gactttgttt gatgacatga ctcgaaccgt ggacgagatc aaatacgaaa cgccttcttc1020atgggagcac aagagcttgg acgttgccga ggatggcagg cgactagctc cccattccga1080cactgctcgt ccgaaaggcc gcatacgacg atcgatgact gcctgtcaca catgtcggaa1140gcttaaaact agatgtgatc tagatccgcg cggtcatgcg tgccgtcgct gtctatctct1200aaggtcagag gcactaccta cctgccagtt gaagctttgt ccttctgaac gcgacatgat1260actagtcgtg gaatataact gtcccaactt tgctgacagt ccacaatatc tttagaatcg1320attgtaagct gcctgaaacg accgaccgct tccaagacag tgctgcgatg tggccagacg1380ccacctcggc aattccctcc atcgaggagc gcctcacctc cctagaaaga tgcatgaggg1440agatgacggg catgatgcga cagatgctag atcactcccc aggtttcgca aatgcctcgg1500ttccgcattt gaccaaaagc atcatcacgg atgaaaccgc ctcgatggag ggaagcccgt1560cgtccccctt cctgcctaag cccgttcgcc tcattcagga cctccagtcc gacttcttcg1620gagaagcaga gacttccccc gttgactccc ctctctccag cgatggtaac gccaagggcg1680ctatcgactc taagctatcc ctcaaattgt tgcaaacgta tgggtatacc tgattgacaa1740ttaccaaaaa gctgctaatc cttggcgcaa atcaggtttg tcgatcactt tggcgcttgc1800gtttccattt acaatctctc cgacatccac aacgacatga aagcccccga ctctttactg1860tataatactg catgccttct agcttcacgc tatgtaccgg ggataccgac atctaccgtg1920catgctatat accttcaagt gcgacatgca gtagtcaata ttttgtggga aaaaccaccc1980ctgaagtatg agaccctcca agcacttgca cttctctgtc tctggccagc aaccgcccag2040
aaagagccac ccatggacag ctggctgctg agtggtatct caattaacca tgcaattatc2100gcgctcgatt tcctaaacta tgcgccctcg gaagtcatgg tggacaatga aacggctgcg2160cagctgcggc tatggaatac atattgcttg acacagctac agtgggtttc atctaagatc2220tcccgtccag aagatagcta acaagcttta gttttgcggt cgggaatgcg cgtcctttcc2280atatccagca aagatacctt gaccactgcc cacggatact ggagcaccca gcagcaactc2340tggaggacgc aagggttgta gcagaaatac agttgtattt gatgacattg cggctccaga2400gcaatagcag tcgaatgcgg ttggcggacc ttgactatga ggaaatagag cgatggaaga2460gggagtgggc tcaccttttc tgtaagaagc ctgttcttgt ttcccgggga ctaccactga2520cgagagcaac agctggggaa agttccacat tggagctgag cctttggttc tgccagacac2580tccttcaccg cacagcaatg aggcttcagc ccagatccga caggctcgca tctgaggttc2640tgcaaacctc acgtctgata atatcgcggt tcctccagat ccggtactct accgcattaa2700gccttgtcga ccaagtctat ttcattgtcg gctacgctgc actgaatctg tgcgatttca2760atcttatgga cccgcttatc gagcaagtgc agatgttcct gctgcatctc tccccgaacg2820aagaccacat cgcctaccgg ttttcgtgca tggtcgccga gttcaagcgg cgatgtggca2880gtgcggaatg caatgaccca tcatccactg tcaaggggtc tccgttatca tcctacggcg2940acagtcgtaa gatgagcatg gggcaagcac cgttcatgcc accgctcatg gatggcatga3000tcgaggggta cggcttcgag caactgatgc cagaagtcat gccgagttcc tttccggatg3060ggatactcaa cggaatgcct gtgactgggc tagcagcgta tcggtcagcg acgctgtaag3120taatcgagat cgggttggaa aggacatgag tgggggtggt ggtggtagta gcagtaacac3180cagggatgat aacctgcagc ggtggtttag ttcctgccca tgggctgaac taaaaccccg3240aacctagcat gatgacgtgc aacgaaagga tcataaccaa ggccaagtaa atactaaaat3300aaaataatat aattccacac gatccactac caccaccacc accggatcca tcaggttgcc3360ttcctgcaca ggcctattta gttagagggc ccgtgccacg aaacatcacg taattgagcg3420cttttgcttc cttgcaactt aaacaacccc atagacactc tcacattcac atgccaaact3480actaactcct actgaccacc agctgcagga agccagccag ccaccatttc ctaatcggat3540atatctccga aacgtacgct ttcctccttt gttcggaccg ttccgtgcct ccgcggagag3600ttgaacgagt cagaacacat tcttttcgtt tctatcgttt cttttccaag gcagcagaga3660gacgaacaag tcagtgcttg ctaactaact tacccctcag cattttagta aactactatt3720taggaaagag taatcattca tcgaagacaa gatgtttatt tctccgatcg accaaacaaa3780aacgttcagg tagactaagt agtagtagta gtatgtcttt gaccccttta ctccactatc3840cgttgactgc acatagtagt aagtaactat ctaaccagtt gccgaggaga ggaaagtgag3900tgggtgggag ccggaggatg ccgccgagaa ttattaagtc gatcattgct agttagttat3960cttttcatga tgaggagagg aaggagaggg gggacgggat tagagaaata aacttttctc4020tccaattaat tatctggatt aattaaaact tggagaggag ggtaggggag ttgggtattg4080gtatgttgct gtgaatgt 4098
<210>14<211>717<212>PRT<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>14Met Asn Arg Val Thr Asn Leu Leu Ala Trp Ala Gly Ala Ile Gly Leu1 5 10 15Ala Gln Ala Thr Cys Pro Phe Ala Asp Pro Ala Ala Leu Tyr Ser Arg20 25 30Gln Asp Thr Thr Ser Gly Gln Ser Pro Leu Ala Ala Tyr Glu Val Asp35 40 45Asp Ser Thr Gly Tyr Leu Thr Ser Asp Val Gly Gly Pro Ile Gln Asp50 55 60Gln Thr Ser Leu Lys Ala Gly Ile Arg Gly Pro Thr Leu Leu Glu Asp65 70 75 80Phe Met Phe Arg Gln Lys Ile Gln His Phe Asp His Glu Arg Val Pro85 90 95Glu Arg Ala Val His Ala Arg Gly Ala Gly Ala His Gly Thr Phe Thr100 105 110Ser Tyr Ala Asp Trp Ser Asn Ile Thr Ala Ala Ser Phe Leu Asn Ala115 120 125Thr Gly Lys Gln Thr Pro Val Phe Val Arg Phe Ser Thr Val Ala Gly130 135 140Ser Arg Gly Ser Ala Asp Thr Ala Arg Asp Val His Gly Phe Ala Thr145 150 155 160Arg Phe Tyr Thr Asp Glu Gly Asn Phe Asp Ile Val Gly Asn Asn Ile165 170 175Pro Val Phe Phe Ile Gln Asp Ala Ile Gln Phe Pro Asp Leu Ile His180 185 190Ser Val Lys Pro Arg Pro Asp Asn Glu Ile Pro Gln Ala Ala Thr Ala195 200 205His Asp Ser Ala Trp Asp Phe Phe Ser Gln Gln Pro Ser Thr Met His210 215 220Thr Leu Phe Trp Ala Met Ser Gly His Gly Ile Pro Arg Ser Tyr Arg225 230 235 240
His Met Asp Gly Phe Gly Val His Thr Phe Arg Phe Val Lys Asp Asp245 250 255Gly Ser Ser Lys Leu Ile Lys Trp His Phe Lys Ser Arg Gln Gly Lys260 265 270Ala Ser Leu Val Trp Glu Glu Ala Gln Val Leu Ser Gly Lys Asn Ala275 280 285Asp Phe His Arg Gln Asp Leu Trp Asp Ala Ile Glu Ser Gly Asn Gly290 295 300Pro Glu Trp Asp Val Cys Val Gln Ile Val Asp Glu Ser Gln Ala Gln305 310 315 320Ala Phe Gly Phe Asp Leu Leu Asp Pro Thr Lys Ile Ile Pro Glu Glu325 330 335Tyr Ala Pro Leu Thr Lys Leu Gly Leu Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro340 345 350Thr Asn Tyr Phe Ala Glu Thr Glu Gln Val Met Phe Gln Pro Gly His355 360 365Ile Val Arg Gly Ile Asp Phe Thr Glu Asp Pro Leu Leu Gln Gly Arg370 375 380Leu Phe Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Leu Asn Arg Asn Gly Gly Pro Asn385 390 395 400Phe Glu Gln Leu Pro Ile Asn Met Pro Arg Val Pro Ile His Asn Asn405 410 415Asn Arg Asp Gly Ala Gly Gln Met Phe Ile His Arg Asn Lys Tyr Pro420 425 430Tyr Thr Pro Asn Thr Leu Asn Ser Gly Tyr Pro Arg Gln Ala Asn Gln435 440 445Asn Ala Gly Arg Gly Phe Phe Thr Ala Pro Gly Arg Thr Ala Ser Gly450 455 460Ala Leu Val Arg Glu Val Ser Pro Thr Phe Asn Asp His Trp Ser Gln465 470 475 480Pro Arg Leu Phe Phe Asn Ser Leu Thr Pro Val Glu Gln Gln Phe Leu485 490 495Val Asn Ala Met Arg Phe Glu Ile Ser Leu Val Lys Ser Glu Glu Val500 505 510Lys Lys Asn Val Leu Thr Gln Leu Asn Arg Val Ser His Asp Val Ala
515 520 525Val Arg Val Ala Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Pro Asp Ala Asp Asp530 535 540Thr Tyr Tyr His Asn Asn Lys Thr Ala Gly Val Ser Ile Val Gly Ser545 550 555 560Gly Pro Leu Pro Thr Ile Lys Thr Leu Arg Val Gly Ile Leu Ala Thr565 570 575Thr Ser Glu Ser Ser Ala Leu Asp Gln Ala Ala Gln Leu Arg Thr Arg580 585 590Leu Glu Lys Asp Gly Leu Val Val Thr Val Val Ala Glu Thr Leu Arg595 600 605Glu Gly Val Asp Gln Thr Tyr Ser Thr Ala Asp Ala Thr Gly Phe Asp610 615 620Gly Val Val Val Val Asp Gly Ala Ala Ala Leu Phe Ala Ser Thr Ala625 630 635 640Ser Ser Pro Leu Phe Pro Thr Gly Arg Pro Leu Gln Ile Phe Val Asp645 650 655Ala Tyr Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Val Cys Gly Gly Lys Ser Ser660 665 670Glu Val Leu Asp Ala Ala Asp Val Pro Glu Asp Gly Asp Gly Val Tyr675 680 685Ser Glu Glu Ser Val Asp Met Phe Val Glu Glu Phe Glu Lys Gly Leu690 695 700Ala Thr Phe Arg Phe Thr Asp Arg Phe Ala Leu Asp Ser705 710 715<210>15<211>20<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>15tgtgattgag gtgattggcg 20<210>16<211>20<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>16tcagccacac ctgcaaaggc 20
<210>17<211>2443<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>r＝a，c，g或t<400>17ctgcagaatn aatttaaact cttctgcgaa tcgcttggat tccccgcccc tggccgtaga 60gcttaaagta tgtcccttgt cgatgcgatg tatcacaaca tataaatact agcaagggat120gccatgcttg gaggatagca accgacaaca tcacatcaag ctctcccttc tctgaacaat180aaaccccaca gaaggcattt atgatggtcg cgtggtggtc tctatttctg tacggccttc240aggtcgcggc acctgctttg gctgcaacgc ctgcggactg gcgatcgcaa tccatttatt300tccttctcac ggatcgattt gcaaggacgg atgggtcgac gactgcgact tgtaatactg360cggatcaggt gtgttgttac ctactagctt tcagaaagag gaatgtaaac tgacttgata420tagaaatact gtggtggaac atggcagggc atcatcgaca aggtaaattg cccctttatc480aaaaaaaaag aaggaaaagc agaagaaaaa taaaataaaa agaactctag tcctaaccat540cacatagttg gactatatcc agggaatggg cttcacagcc atctggatca cccccgttac600agcccagctg ccccagacca ccgcatatgg agatgcctac catggctact ggcagcagga660tatgtaagtc gatttcttta aatatctacc tgtcatcttt tacatcaata tgaactaact720tgatggtttt agatactctc tgaacgaaaa ctacggcact gcagatgact tgaaggcgct780ctcttcggcc cttcatgaga gggggatgta tcttatggtc gatgtggttg ctaaccatat840ggttcgtggt cctttgcaac tgacttcgcg gatatggttc atttcagtac tgacaatgag900taatatcagg gctatgatgg agcgggtagc tcagtcgatt acagtgtgtt taaaccgttc960agttcccaag actacttcca cccgttctgt ttcattcaaa actatgaaga tcagactcag 1020gttgaggatt gctggctagg agataacact gtctccttgc ctgatctcga taccaccaag 1080gatgtggtca agaatgaatg gtacgactgg gtgggatcat tggtatcgaa ctactccagt 1140aagatatttc tccctcattc tacaacttgg ctgatcgatg atacttacga aatcagttga 1200cggcctccgt atcgacacag taaaacacgt ccagaaggac ttctggcccg ggtacaacaa 1260agccgcaggc gtgtactgta tcggcgaggt gctcgacggt gatccggcct acacttgtcc 1320ctaccagaac gtcatggacg gcgtactgaa ctatcccatg tatggttcct ccaaccatga 1380gccttcttgc aagtctcatc tcctaacgaa acggctaaaa ccagttacta tccactcctc 1440aacgccttca agtcaacctc cggcagcatg gacgacctct acaacatgat caacaccgtc 1500aaatccgact gtccagactc aacactcctg ggcacattcg tcgagaacca cgacaaccca 1560cggttcgctt cgtaagtctt cccttttatt ttccgttccc aatttccaca cagaacccca 1620cctaacaaga gcaaagttac accaacgaca tagccctcgc caagaacgtc gcagcattca 1680
tcatcctcaa cgacggaatc cccatcatct acgccggcca agaacagcac tacgccggcg1740gaaacgaccc cgcgaaccgc gaagcaacct ggctctcggg ctacccgacc gacagcgagc1800tgtacaagtt aattgcctcc cggaacgcaa tccggaacta tgccattagc aaagatacag1860gattcgtgac ctacaaggta agcacaacct ctaagcatac cctaatggcc tatcttcaga1920gtatctgaca caagagacta atcactggca atacagaact ggcccatcta caaagacgac1980acaacgatcc cgatgcgcaa gggcacagat gggtcgcaga tcgtgactat cttgtccaac2040aagggtgctt cgggtgattc gtataccctc tccttgagtg gtgcgggtta cacagccggc2100cagcaattga cggaggtcat tggctgcacg accgtgacgg ttggttcgga tggaaatgtg2160cctgttccta tggcaggtgg gctacctagg gtattgtatc cgactgagaa gttggcaggt2220agcaagatct gtagtagctc gtgaagggtg gagagtatat gatggtactg ctattcaatc2280tggcattgga cagcgagatt gaatgtggtg gacgtaacct acgttgtgtc tgtagaatat2340atacatgtaa gatacatgag cttcggtgat ataatacaga agtaccatac agtaccgcgt2400tatggaatcg aactactaca gggcttttcc tataatagac tag 2443<210>18<211>499<212>PRT<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>18Met Met Val Ala Trp Trp Ser Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Gln Val Ala1 5 10 15Ala Pro Ala Leu Ala Ala Thr Pro Ala Asp Trp Arg Ser Gln Ser Ile20 25 30Tyr Phe Leu Leu Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Ser Thr Thr35 40 45Ala Thr Cys Asn Thr Ala Asp Gln Lys Tyr Cys Gly Gly Thr Trp Gln50 55 60Gly Ile Ile Asp Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala65 70 75 80Ile Trp Ile Thr Pro Val Thr Ala Gln Leu Pro Gln Thr Thr Ala Tyr85 90 95Gly Asp Ala Tyr His Gly Tyr Trp Gln Gln Asp Ile Tyr Ser Leu Asn100 105 110Glu Asn Tyr Gly Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ala Leu Ser Ser Ala Leu115 120 125His Glu Arg Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met130 135 140
Gly Tyr Asp Gly Ala Gly Ser Ser Val Asp Tyr Ser Val Phe Lys Pro145 150 155 160Phe Ser Ser Gln Asp Tyr Phe His Pro Phe Cys Phe Ile Gln Asn Tyr165 170 175Glu Asp Gln Thr Gln Val Glu Asp Cys Trp Leu Gly Asp Asn Thr Val180 185 190Ser Leu Pro Asp Leu Asp Thr Thr Lys Asp Val Val Lys Asn Glu Trp195 200 205Tyr Asp Trp Val Gly Ser Leu Val Ser Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu210 215 220Arg Ile Asp Thr Val Lys His Val Gln Lys Asp Phe Trp Pro Gly Tyr225 230 235 240Asn Lys Ala Ala Gly Val Tyr Cys Ile Gly Glu Val Leu Asp Gly Asp245 250 255Pro Ala Tyr Thr Cys Pro Tyr Gln Asn Val Met Asp Gly Val Leu Asn260 265 270Tyr Pro Ile Tyr Tyr Pro Leu Leu Asn Ala Phe Lys Ser Thr Ser Gly275 280 285Ser Met Asp Asp Leu Tyr Asn Met Ile Asn Thr Val Lys Ser Asp Cys290 295 300Pro Asp Ser Thr Leu Leu Gly Thr Phe Val Glu Asn His Asp Asn Pro305 310 315 320Arg Phe Ala Ser Tyr Thr Asn Asp Ile Ala Leu Ala Lys Asn Val Ala325 330 335Ala Phe Ile Ile Leu Asn Asp Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Ala Gly Gln340 345 350Glu Gln His Tyr Ala Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala Thr355 360 365Trp Leu Ser Gly Tyr Pro Thr Asp Ser Glu Leu Tyr Lys Leu Ile Ala370 375 380Ser Arg Asn Ala Ile Arg Asn Tyr Ala Ile Ser Lys Asp Thr Gly Phe385 390 395 400Val Thr Tyr Lys Asn Trp Pro Ile Tyr Lys Asp Asp Thr Thr Ile Pro405 410 415
Met Arg Lys Gly Thr Asp Gly Ser Gln Ile Val Thr Ile Leu Ser Asn420 425 430Lys Gly Ala Ser Gly Asp Ser Tyr Thr Leu Ser Leu Ser Gly Ala Gly435 440 445Tyr Thr Ala Gly Gln Gln Leu Thr Glu Val Ile Gly Cys Thr Thr Val450 455 460Thr Val Gly Ser Asp Gly Asn Val Pro Val Pro Met Ala Gly Gly Leu465 470 475 480Pro Arg Val Leu Tyr Pro Thr Glu Lys Leu Ala Gly Ser Lys Ile Cys485 490 495Ser Ser Ser<210>19<211>21<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>19ggcagcagga tatgtaagtc g21<210>20<211>21<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>20cactgtaatc gactgagcta c21<210>21<211>2520<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<220>
<221>misc_feature<223>n＝a，c，g或t<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>n＝a，c，g或t<400>21ctgcagaatn aatttaaact cttctgcgaa tcgcttggat tccccgcccc tggccgtaga 60gcttaaagta tgtcccttgt cgatgcgatg tatcacaaca tataaatact agcaagggat120gccatgcttg gaggatagca accgacaaca tcacatcaag ctctcccttc tctgaacaat180aaaccccaca gaaggcattt atgatggtcg cgtggtggtc tctatttctg tacggccttc240aggtcgcggc acctgctttg gctgcaacgc ctgcggactg gcgatcgcaa tccatttatt300
tccttctcac ggatcgattt gcaaggacgg atgggtcgac gactgcgact tgtaatactg 360cggatcaggt gtgttgttac ctactagctt tcagaaagag gaatgtaaac tgacttgata 420tagaaatact gtggtggaac atggcagggc atcatcgaca aggtaaattg cccctttatc 480aaaaaaaaag aaggaaaagc agaagaaaaa taaaataaaa agaactctag tcctaaccat 540cacatagttg gactatatcc agggaatggg cttcacagcc atctggatca cccccgttac 600agcccagctg ccccagacca ccgcatatgg agatgcctac catggctact ggcagcagga 660tatgtaagtc gatttcttta aatatctacc tgtcatcttt tacatcaata tgaactaact 720tgatggtttt agatactctc tgaacgaaaa ctacggcact gcagatgact tgaaggcgct 780ctcttcggcc cttcatgaga gggggatgta tcttatggtc gatgtggttg ctaaccatat 840ggttcgtggt cctttgcaac tgacttcgcg gatatggttc atttcagtac tgacaatgag 900taatatcagg gctatgatgg agcgggtagc tcagtcgatt acagtgtgtt taaaccgttc 960agttcccaag actacttcca cccgttctgt ttcattcaaa actatgaaga tcagactcag1020gttgaggatt gctggctagg agataacact gtctccttgc ctgatctcga taccaccaag1080gatgtggtca agaatgaatg gtacgactgg gtgggatcat tggtatcgaa ctactccagt1140aagatatttc tccctcattc tacaacttgg ctgatcgatg atacttacga aatcagttga1200cggcctccgt atcgacacag taaaacacgt ccagaaggac ttctggcccg ggtacaacaa1260agccgcaggc gtgtactgta tcggcgaggt gctcgacggt gatccggcct acacttgtcc1320ctaccagaac gtcatggacg gcgtactgaa ctatcccatg tatggttcct ccaaccatga1380gccttcttgc aagtctcatc tcctaacgaa acggctaaaa ccagttacta tccactcctc1440aacgccttca agtcaacctc cggcagcatg gacgacctct acaacatgat caacaccgtc1500aaatccgact gtccagactc aacactcctg ggcacattcg tcgagaacca cgacaaccca1560cggttcgctt cgtaagtctt cccttttatt ttccgttccc aatttccaca cagaacccca1620cctaacaaga gcaaagttac accaacgaca tagccctcgc caagaacgtc gcagcattca1680tcatcctcaa cgacggaatc cccatcatct acgccggcca agaacagcac tacgccggcg1740gaaacgaccc cgcgaaccgc gaagcaacct ggctctcggg ctacccgacc gacagcgagc1800tgtacaagtt aattgcctcc cggaacgcaa tccggaacta tgccattagc aaagatacag1860gattcgtgac ctacaaggta agcacaacct ctaagcatac cctaatggcc tatcttcaga1920gtatctgaca caagagacta atcactggca atacagaact ggcccatcta caaagacgac1980acaacgatcc cgatgcgcaa gggcacagat gggtcgcaga tcgtgactat cttgtccaac2040aagggtgctt cgggtgattc gtataccctc tccttgagtg gtgcgggtta cacagccggc2100cagcaattga cggaggtcat tggctgcacg accgtgacgg ttggttcgga tggaaatgtg2160cctgttccta tggcaggtgg gctacctagg gtattgtatc cgactgagaa gttggcaggt2220agcaagatct gttacggctg agcagtcaag ctcaagtccc aactgtattg actctgttga2280ctattcctgg gtctccttag atgatgcagt tggaggaata tgccaattgg cacttgtcgc2340gtgttggccg tgagatttat agagaccata ttaaaaaagc acgtgatgtg gcgttggaaa2400
atggattaga ccttcaacag gtttcgaagg aagacccaga cttcttcgtc aagcaagggg2460tgataattgg tgtcgcacgc cggttcgtta gcgacattag agattgggcc aaccaataca2520<210>22<211>498<212>PRT<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>22Met Met Val Ala Trp Trp Ser Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Gln Val Ala1 5 10 15Ala Pro Ala Leu Ala Ala Thr Pro Ala Asp Trp Arg Ser Gln Ser Ile20 25 30Tyr Phe Leu Leu Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Ser Thr Thr35 40 45Ala Thr Cys Asn Thr Ala Asp Gln Lys Tyr Cys Gly Gly Thr Trp Gln50 55 60Gly Ile Ile Asp Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala65 70 75 80Ile Trp Ile Thr Pro Val Thr Ala Gln Leu Pro Gln Thr Thr Ala Tyr85 90 95Gly Asp Ala Tyr His Gly Tyr Trp Gln Gln Asp Ile Tyr Ser Leu Asn100 105 110Glu Asn Tyr Gly Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ala Leu Ser Ser Ala Leu115 120 125His Glu Arg Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met130 135 140Gly Tyr Asp Gly Ala Gly Ser Ser Val Asp Tyr Ser Val Phe Lys Pro145 150 155 160Phe Ser Ser Gln Asp Tyr Phe His Pro Phe Cys Phe Ile Gln Asn Tyr165 170 175Glu Asp Gln Thr Gln Val Glu Asp Cys Trp Leu Gly Asp Asn Thr Val180 185 190Ser Leu Pro Asp Leu Asp Thr Thr Lys Asp Val Val Lys Asn Glu Trp195 200 205Tyr Asp Trp Val Gly Ser Leu Val Ser Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu210 215 220
Arg Ile Asp Thr Val Lys His Val Gln Lys Asp Phe Trp Pro Gly Tyr225 230 235 240Asn Lys Ala Ala Gly Val Tyr Cys Ile Gly Glu Val Leu Asp Gly Asp245 250 255Pro Ala Tyr Thr Cys Pro Tyr Gln Asn Val Met Asp Gly Val Leu Asn260 265 270Tyr Pro Ile Tyr Tyr Pro Leu Leu Asn Ala Phe Lys Ser Thr Ser Gly275 280 285Ser Met Asp Asp Leu Tyr Asn Met Ile Asn Thr Val Lys Ser Asp Cys290 295 300Pro Asp Ser Thr Leu Leu Gly Thr Phe Val Glu Asn His Asp Asn Pro305 310 315 320Arg Phe Ala Ser Tyr Thr Asn Asp Ile Ala Leu Ala Lys Asn Val Ala325 330 335Ala Phe Ile Ile Leu Asn Asp Gly Ile Pro Ile Ile Tyr Ala Gly Gln340 345 350Glu Gln His Tyr Ala Gly Gly Asn Asp Pro Ala Asn Arg Glu Ala Thr355 360 365Trp Leu Ser Gly Tyr Pro Thr Asp Ser Glu Leu Tyr Lys Leu Ile Ala370 375 380Ser Arg Asn Ala Ile Arg Asn Tyr Ala Ile Ser Lys Asp Thr Gly Phe385 390 395 400Val Thr Tyr Lys Asn Trp Pro Ile Tyr Lys Asp Asp Thr Thr Ile Pro405 410 415Met Arg Lys Gly Thr Asp Gly Ser Gln Ile Val Thr Ile Leu Ser Asn420 425 430Lys Gly Ala Ser Gly Asp Ser Tyr Thr Leu Ser Leu Ser Gly Ala Gly435 440 445Tyr Thr Ala Gly Gln Gln Leu Thr Glu Val Ile Gly Cys Thr Thr Val450 455 460Thr Val Gly Ser Asp Gly Asn Val Pro Val Pro Met Ala Gly Gly Leu465 470 475 480Pro Arg Val Leu Tyr Pro Thr Glu Lys Leu Ala Gly Ser Lys Ile Cys485 490 495
Tyr Gly<210>23<211>3494<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<220>
<221>misc_feature<222>(3370)..(3370)<223>n＝a，c，g或t<400>23tgctccctcg gccaagcgcc aataacgtcc gattcatccc attcctcgtc cagctggcga 60actccggagg ttgattgctc gctcgctctc agttggccac caaacttact cgtccccctc120cttcaccctc cctcctctgc caatgctaca gagtacttgg ctaggctact atcttctcag180ctgggtgaag aacaacgggc cccgtgcgtg atgagcaaaa gcgtctgaca tgcagcaact240gcagtatact ggagcccgcg gctaccgagg aactcgtgct cgtgtgccac cacatcgaag300tgagttgatg cgtcttgtcc atgcagtgtc ggcgtggcct aaagtacggg ccaaacctgt360ctgacttcat cccacactat taccccctcc ctcattctcc cctgattcgg cccaataagg420aaatcactta gtcaatcaat cctgccatta ccggcgcgta atctgaaact acgcgcggac480tgtctcttac tcccctcgcg gtgggcggcc cagccagccc catccttact agatttagcg540aattactggt cattagccct gtacggggga ggggcgggaa aacaaaaatg cgaataatag600aataaattta ataaagaaaa aagagggggg gggagcttat ctaggcccct gctgcattgc660attcggacat ttttcgactt gtcacaggca caaatcatag tccgccgatg gcgtcgattg720accattttct tttcttttct cggcgctggg atggtggcca agaaaattga atggcaatgg780ttcgttcacc ggagtagggt gtacgtgcat tgtgtggatt gacgatgatt ctcggccaag840ggcttgcgtt gcaatcccac caggagggga atgttgcaga cagacagaaa gcaaaagaag900tattggaggg aaaaaaacaa ttcttgaaaa atgatcttct caggtaatga atattggttg960ctggcgggct gatcttctcc cgacacgtct atataaactg gtcaccttct ggcccttcct 1020ttctatctct tccttctcat catcagtctc aaacaagcct ctttctctcc taccttcact 1080ctccactttc tcctttcgaa agggataaaa ctctcctcct cattctcacc tatatatacc 1140ttgtgctttt ctcgcaatga aagttgatac ccccgattct gcttccacca tcagcatgac 1200caacactatc accatcaccg tagagcagga cggtatctat gagatcaacg gtgcccgtca 1260agagcccgtg gtcaacctga acatggtcac cggtgcgagc aaactgcgca agcagcttcg 1320cgagaccaat gagttgctcg tgtgtcctgg tgtgtacgac ggtctgtccg cccgtattgc 1380catcaacctg ggcttcaagg gcatgtacat ggtatgttgg attccttaga ctacctttcc 1440ccacagtcaa cacttctccg cttccgcgat ggagaaaaaa gatcatacta acggaaaggt 1500cagaccggcg ccggtactac cgcgtctaga ctgggcatgg ccgatctggg tctagcccac 1560atctacgaca tgaagaccaa cgcagagatg atcgcgaacc tggaccccta cggtcctccc 1620
ctgatcgcag acatggacac tggctacgga ggtgagaatc ccccatctcc actgtctgcc1680aagacataat gatctacccg cgccaaaaag caaaacggca atatagaccc agttccccac1740taacaccaaa aaaacaaaaa taggccccct gatggtcgcc cgttccgttc aacaatacat1800ccaagccgga gtcgcgggat tccacatcga agatcagatc caaaacaagc gatgcggaca1860cctggcaggc aagcgcgtcg tcaccatgga cgaatacttg actcgcatcc gcgccgccaa1920gctcaccaag gaccgcctcc gcagcgacat cgtgctgatt gcccgcaccg acgccctcca1980gcagcacggc tacgacgagt gcattcgccg ccttaaggcc gcccgcgatc ttggcgccga2040tgttggtctc ctcgagggct tcaccagtaa ggagatggcg aggcggtgtg tccaggacct2100tgcgccttgg ccgcttctgc tcaacatggt ggagaacggt gctgggccgg ttatttccgt2160cgatgaggct agggaaatgg gcttccgcat tatgatcttc tcgttcgctt gcattactcc2220tgcctatatg gggattaccg ctgctctgga gaggctcaag aaggatggtg tggttgggtt2280gcccgagggg atggggccga agaagctgtt tgaggtgtgc ggattgatgg actcggtgag2340ggttgatacc gaggctggtg gagatgggtt tgctaatggt gtttaattct tttctttttt2400tgattcttaa ttccctggtt gttttgttgt gaaagtttct tatttttctg gtttgtttta2460tttccccttc tggtaactaa ttttgtgtga gaaagagttg ttgagttggg ttgaactgca2520ttggatggga ttgatttatt ttcgggatca aagtgaaagg aagggaaggg ggctgtgtta2580ttggttttcg agtggggacc gatatattcc tactatacat atcgaagctt gcgtggtaca2640tatactagta tctactacat taccaagaat ggaaatgaaa actgggtgtt agatttcagt2700tgacaggtct tatgttcgtt taccgataga gtaattcctg cttctcactc catgtgagcc2760caatcacaat ggaattgtaa tctggttgcc ttataagtac ttagtactct gtactctgta2820ctacttctcg catcacatca aatcttaata cttagtacgt agtttgtttc acccagcaaa2880accttattgc cttaacaatc atattctcag taagcacgag acacagaaac gagagaagta2940ttctagaccc tgacagaacw ccctgatcga cagtcactta cccaacaaag taagtggtct3000ctaccctctg attacagtta aggcaggcag tagtaagcaa gaagaagaaa gaaagaataa3060ttaactacta agtttctcac tactgcatgc acgaccacgg agtcgccgtg caaaaaaatt3120ggtgcgtgct cagctagctg cactctgcac actgccaccc tcgccctaca aaagaaacca3180tgctgtttct ccactatact gttcccgcga tgaaactagg gccaataacc atgcagttac3240tattggtccc actggggtgg gttgggtagc cttatggtat taaaaggagt aggggtcttt3300gtcgatcgtt ttctgttttc tttttgkatt tttatttytg ttggwctctg tttgtgttgt3360gttgggccgn ttttgttttc tttgggtaac gagggatggg aatatattca tatggaaatg3420gaaatggatt atgctattga ttgatgaatg gtgatgatct gcgtggaaat taatgtcaga3480gtcttgmtga ttca 3494<210>24<211>341<212>PRT
<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>24Met Lys Val Asp Thr Pro Asp Ser Ala Ser Thr Ile Ser Met Thr Asn1 5 10 15Thr Ile Thr Ile Thr Val Glu Gln Asp Gly Ile Tyr Glu Ile Asn Gly20 25 30Ala Arg Gln Glu Pro Val Val Asn Leu Asn Met Val Thr Gly Ala Ser35 40 45Lys Leu Arg Lys Gln Leu Arg Glu Thr Asn Glu Leu Leu Val Cys Pro50 55 60Gly Val Tyr Asp Gly Leu Ser Ala Arg Ile Ala Ile Asn Leu Gly Phe65 70 75 80Lys Gly Met Tyr Met Thr Gly Ala Gly Thr Thr Ala Ser Arg Leu Gly85 90 95Met Ala Asp Leu Gly Leu Ala His Ile Tyr Asp Met Lys Thr Asn Ala100 105 110Glu Met Ile Ala Asn Leu Asp Pro Tyr Gly Pro Pro Leu Ile Ala Asp115 120 125Met Asp Thr Gly Tyr Gly Gly Pro Leu Met Val Ala Arg Ser Val Gln130 135 140Gln Tyr Ile Gln Ala Gly Val Ala Gly Phe His Ile Glu Asp Gln Ile145 150 155 160Gln Asn Lys Arg Cys Gly His Leu Ala Gly Lys Arg Val Val Thr Met165 170 175Asp Glu Tyr Leu Thr Arg Ile Arg Ala Ala Lys Leu Thr Lys Asp Arg180 185 190Leu Arg Ser Asp Ile Val Leu Ile Ala Arg Thr Asp Ala Leu Gln Gln195 200 205His Gly Tyr Asp Glu Cys Ile Arg Arg Leu Lys Ala Ala Arg Asp Leu210 215 220Gly Ala Asp Val Gly Leu Leu Glu Gly Phe Thr Ser Lys Glu Met Ala225 230 235 240Arg Arg Cys Val Gln Asp Leu Ala Pro Trp Pro Leu Leu Leu Asn Met245 250 255Val Glu Asn Gly Ala Gly Pro Val Ile Ser Val Asp Glu Ala Arg Glu
260 265270Met Gly Phe Arg Ile Met Ile Phe Ser Phe Ala Cys Ile Thr Pro Ala275 280 285Tyr Met Gly Ile Thr Ala Ala Leu Glu Arg Leu Lys Lys Asp Gly Val290 295 300Val Gly Leu Pro Glu Gly Met Gly Pro Lys Lys Leu Phe Glu Val Cys305 310 315 320Gly Leu Met Asp Ser Val Arg Val Asp Thr Glu Ala Gly Gly Asp Gly325 330 335Phe Ala Asn Gly Val340<210>25<211>21<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>25ctacgacatg aagaccaacg c21<210>26<211>21<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>26gcaccgttct ccaccatgtt g21<210>27<211>1389<212>DNA<213>南極洲假絲酵母(Candida antarctica)<400>27atgcgagtgt ccttgcgctc catcacgtcg ctgcttgcgg cggcaacggc ggctgtgctc 60gcggctccgg cggccgagac gctggaccga cgggcggcgc tgcccaaccc ctacgacgat120cccttctaca cgacgccatc caacatcggc acgtttgcca agggccaggt gatccaatct180cgcaaggtgc ccacggacat cggcaacgcc aacaacgctg cgtcgttcca gctgcagtac240cgcaccacca atacgcagaa cgaggcggtg gccgacgtgg ccaccgtgtg gatcccggcc300aagcccgctt cgccgcccaa gatcttttcg taccaggtct acgaggatgc cacggcgctc360gactgtgctc cgagctacag ctacctcact ggattggacc agccgaacaa ggtgacggcg420gtgctcgaca cgcccatcat catcggctgg gcgctgcagc agggctacta cgtcgtctcg480tccgaccacg aaggcttcaa agccgccttc atcgctggct acgaagaggg catggctatc540ctcgacggca tccgcgcgct caagaactac cagaacctgc catccgacag caaggtcgct600cttgagggct acagtggcgg agctcacgcc accgtgtggg cgacttcgct tgctgaatcg660
tacgcgcccg agctcaacat tgtcggtgct tcgcacggcg gcacgcccgt gagcgccaag720gacaccttta cattcctcaa cggcggaccc ttcgccggct ttgccctggc gggtgtttcg780ggtctctcgc tcgctcatcc tgatatggag agcttcattg aggcccgatt gaacgccaag840ggtcagcgga cgctcaagca gatccgcggc cgtggcttct gcctgccgca ggtggtgttg900acctacccct tcctcaacgt cttctcgctg gtcaacgaca cgaacctgct gaatgaggcg960ccgatcgcta gcatcctcaa gcaggagact gtggtccagg ccgaagcgag ctacacggta 1020tcggtgccca agttcccgcg cttcatctgg catgcgatcc ccgacgagat cgtgccgtac 1080cagcctgcgg ctacctacgt caaggagcaa tgtgccaagg gcgccaacat caatttttcg 1140ccctacccga tcgccgagca cctcaccgcc gagatctttg gtctggtgcc tagcctgtgg 1200tttatcaagc aagccttcga cggcaccaca cccaaggtga tctgcggcac tcccatccct 1260gctatcgctg gcatcaccac gccctcggcg gaccaagtgc tgggttcgga cctggccaac 1320cagctgcgca gcctcgacgg caagcagagt gcgttcggca agccctttgg ccccatcaca 1380ccaccttag 1389<210>28<211>462<212>PRT<213>南極洲假絲酵母(Candida antarctica)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1389)..(1389)<223>X＝Xaa<400>28Met Arg Val Ser Leu Arg Ser Ile Thr Ser Leu Leu Ala Ala Ala Thr1 5 10 15Ala Ala Val Leu Ala Ala Pro Ala Ala Glu Thr Leu Asp Arg Arg Ala20 25 30Ala Leu Pro Asn Pro Tyr Asp Asp Pro Phe Tyr Thr Thr Pro Ser Asn35 40 45Ile Gly Thr Phe Ala Lys Gly Gln Val Ile Gln Ser Arg Lys Val Pro50 55 60Thr Asp Ile Gly Asn Ala Asn Asn Ala Ala Ser Phe Gln Leu Gln Tyr65 70 75 80Arg Thr Thr Asn Thr Gln Asn Glu Ala Val Ala Asp Val Ala Thr Val85 90 95Trp Ile Pro Ala Lys Pro Ala Ser Pro Pro Lys Ile Phe Ser Tyr Gln100 105 110
Val Tyr Glu Asp Ala Thr Ala Leu Asp Cys Ala Pro Ser Tyr Ser Tyr115 120 125Leu Thr Gly Leu Asp Gln Pro Asn Lys Val Thr Ala Val Leu Asp Thr130 135 140Pro Ile Ile Ile Gly Trp Ala Leu Gln Gln Gly Tyr Tyr Val Val Ser145 150 155 160Ser Asp His Glu Gly Phe Lys Ala Ala Phe Ile Ala Gly Tyr Glu Glu165 170 175Gly Met Ala Ile Leu Asp Gly Ile Arg Ala Leu Lys Asn Tyr Gln Asn180 185 190Leu Pro Ser Asp Ser Lys Val Ala Leu Glu Gly Tyr Ser Gly Gly Ala195 200 205His Ala Thr Val Trp Ala Thr Ser Leu Ala Glu Ser Tyr Ala Pro Glu210 215 220Leu Asn Ile Val Gly Ala Ser His Gly Gly Thr Pro Val Ser Ala Lys225 230 235 240Asp Thr Phe Thr Phe Leu Asn Gly Gly Pro Phe Ala Gly Phe Ala Leu245 250 255Ala Gly Val Ser Gly Leu Ser Leu Ala His Pro Asp Met Glu Ser Phe260 265 270Ile Glu Ala Arg Leu Asn Ala Lys Gly Gln Arg Thr Leu Lys Gln Ile275 280 285Arg Gly Arg Gly Phe Cys Leu Pro Gln Val Val Leu Thr Tyr Pro Phe290 295 300Leu Asn Val Phe Ser Leu Val Asn Asp Thr Asn Leu Leu Asn Glu Ala305 310 315 320Pro Ile Ala Ser Ile Leu Lys Gln Glu Thr Val Val Gln Ala Glu Ala325 330 335Ser Tyr Thr Val Ser Val Pro Lys Phe Pro Arg Phe Ile Trp His Ala340 345 350Ile Pro Asp Glu Ile Val Pro Tyr Gln Pro Ala Ala Thr Tyr Val Lys355 360 365Glu Gln Cys Ala Lys Gly Ala Asn Ile Asn Phe Ser Pro Tyr Pro Ile370 375 380Ala Glu His Leu Thr Ala Glu Ile Phe Gly Leu Val Pro Ser Leu Trp
385 390 395 400Phe Ile Lys Gln Ala Phe Asp Gly Thr Thr Pro Lys Val Ile Cys Gly405 410 415Thr Pro Ile Pro Ala Ile Ala Gly Ile Thr Thr Pro Ser Ala Asp Gln420 425 430Val Leu Gly Ser Asp Leu Ala Asn Gln Leu Arg Ser Leu Asp Gly Lys435 440 445Gln Ser Ala Phe Gly Lys Pro Phe Gly Pro Ile Thr Pro Pro450 455 460<210>29<211>2794<212>DNA<213>Scytalidum thermophilum<400>29atgaacagag tcacgaatct cctcgcctgg gccggcgcga tagggctcgc ccaagcaaca 60tgtccctttg cggaccctgc cgctctgtat agtcgtcaag atactaccag cggccagtcg 120ccacttgcag catacgaggt ggatgacagc accggatacc tgacctccga tgttggcggg 180cccattcagg accagaccag cctcaaggca ggcatccggg gtccgaccct tcttgaggac 240tttatgttcc gccagaagat ccagcacttc gaccatgaac gggtaaggac ataatgctca 300cacgagcggc tgcgtgccca cctatttccg agacattggg ctggctggct ggctgtgact 360gcttgagttt ggggacatac ggagtacctt actgacgcgc tgaaccactc caggttcccg 420aaagggcggt ccatgctcga ggcgctggag cacacgggac cttcacgagt tacgccgact 480ggagtaacat caccgcggcg tcctttctga acgccactgg aaagcagacg ccggtgtttg 540tccggttctc gaccgttgct gggtctcgag ggagcgcaga cacggcgaga gacgttcatg 600gtttcgcgac gcggtttgta agttttgttg tgtttcattc gttccggtct gtagaggagg 660gttaggatat gagctaacgt gtgtgtgtgt gtgaagtaca ctgatgaagg caactttgta 720cgtcccacgc atggtcctca attctcttat ctggcagcca tgtggtcatt gtcgacgttg 780ctaacttgcg taggatatcg tcggaaacaa catcccggta ttcttcattc aagatgcaat 840ccagttccct gaccttatcc actcggtcaa gccgcgtccc gacaacgaga ttccccaagc 900ggcgacggct catgattcag cttgggactt cttcagccag cagccaagca ccatggtaag 960caatggacca aggagccgca cctggggtga catgccaggg agtacacaag gcgttccgat1020gaccctcgtg tgaccaaggc agtacaacac tccacggagg actcgaagag attcggcaat1080atggaacaca gaactgacag gatggtagca cacgttgttc tgggccatgt ccggccacgg1140aatccctcgc agctaccgcc atatggtacg tttgcctggc tgagatgacc gtgaatccat1200ttctaacctc aagcccagga tggcttcggc gtccacacgt tccggtttgt caaagatgac1260ggctcgtcca agttgatcaa gtggcatttc aagtcacgcc agggaaaggc gagtctagtc1320
tgggaagagg cgcaggttct ttctggcaag aatgccgact tccaccgtca ggacctctgg1380gatgctattg agtccgggaa cggaccagaa tgggatgtct gcgtccagat tgtcgatgag1440tcccaggcgc aagcctttgg cttcgacttg ctggacccga caaagatcat ccccgaggag1500tacgccccct tgacgaagct gggcctcttg aagctggatc gcaatccgac caactacttc1560gccgagacgg agcaggtcat gttccaaccc ggtcatatcg tccgcggcat cgacttcacg1620gaggatcccc tgctacaggg acgcctcttt tcgtaccttg acacgcagct gaaccggaat1680ggcgggccca actttgagca gctgcccatc aacatgccgc gggtgccgat tcacaacaat1740aatcgcgacg gcgccggcca gatgttcatc cacaggaaca agtatcctgt aagtgcctct1800tttgcctcga tcgttgtggt gccggcttgc tgacagacgc agtacactcc caacaccctg1860aacagtggtt atccgcggca agccaaccaa aatgccggac gcggattctt cacagcgcct1920ggccgtaccg ccagcggtgc cctcgtccgt gaggtgtcgc caacattcaa cgaccactgg1980tcgcagcccc gtctcttctt caactccctc actcccgtcg aacaacagtt cctcgtcaac2040gccatgcgct tcgaaatcag ccttgtgaag tcggaagaag tcaagaagaa cgtgctcacc2100cagctcaacc gcgtcagcca tgacgtggcc gtgcgcgtgg ccgccgctat cggcctcggc2160gcgcccgacg cggacgacac atactaccac aacaacaaga cggctggcgt ctcaatcgtt2220ggaagcgggc ccttgcctac catcaagact ctccgcgtcg gcatcctggc taccacgagc2280gagtcgagcg cgctggatca ggcggcccag ctccgcaccc gtctggaaaa ggacgggctt2340gtggtcacgg ttgtggctga aacgctgcgc gagggggtag accagacgta ctcgacggcg2400gatgccacgg gtttcgacgg cgttgttgtt gtggacgggg cggcggcgct gtttgccagc2460accgcgtcgt cgccgttgtt cccgacgggc aggccgttgc agatctttgt ggacgcgtat2520cggtggggaa agccggtcgg tgtgtgtggt gggaagtcga gcgaggtgtt ggatgcggcg2580gatgttccgg aagacgggga cggggtgtat tcggaggagt cggtggacat gtttgtggag2640gagtttgaga aggggttggc tactttcagg gtgagtcttg atgcctttgt ttgttgtgat2700gttattgttt tgttttgtct cggactttgt gaaagaatga cggactgacg tctttggtat2760ctagtttacc gatcggtttg ctctcgactc ttag2794<210>30<211>717<212>PRT<213>Scytalidium thermophilum<400>30Met Asn Arg Val Thr Asn Leu Leu Ala Trp Ala Gly Ala Ile Gly Leu1 5 10 15Ala Gln Ala Thr Cys Pro Phe Ala Asp Pro Ala Ala Leu Tyr Ser Arg20 25 30Gln Asp Thr Thr Ser Gly Gln Ser Pro Leu Ala Ala Tyr Glu Val Asp35 40 45
Asp Ser Thr Gly Tyr Leu Thr Ser Asp Val Gly Gly Pro Ile Gln Asp50 55 60Gln Thr Ser Leu Lys Ala Gly Ile Arg Gly Pro Thr Leu Leu Glu Asp65 70 75 80Phe Met Phe Arg Gln Lys Ile Gln His Phe Asp His Glu Arg Val Pro85 90 95Glu Arg Ala Val His Ala Arg Gly Ala Gly Ala His Gly Thr Phe Thr100 105 110Ser Tyr Ala Asp Trp Ser Asn Ile Thr Ala Ala Ser Phe Leu Asn Ala115 120 125Thr Gly Lys Gln Thr Pro Val Phe Val Arg Phe Ser Thr Val Ala Gly130 135 140Ser Arg Gly Ser Ala Asp Thr Ala Arg Asp Val His Gly Phe Ala Thr145 150 155 160Arg Phe Tyr Thr Asp Glu Gly Asn Phe Asp Ile Val Gly Asn Asn Ile165 170 175Pro Val Phe Phe Ile Gln Asp Ala Ile Gln Phe Pro Asp Leu Ile His180 185 190Ser Val Lys Pro Arg Pro Asp Asn Glu Ile Pro Gln Ala Ala Thr Ala195 200 205His Asp Ser Ala Trp Asp Phe Phe Ser Gln Gln Pro Ser Thr Met His210 215 220Thr Leu Phe Trp Ala Met Ser Gly His Gly Ile Pro Arg Ser Tyr Arg225 230 235 240His Met Asp Gly Phe Gly Val His Thr Phe Arg Phe Val Lys Asp Asp245 250 255Gly Ser Ser Lys Leu Ile Lys Trp His Phe Lys Ser Arg Gln Gly Lys260 265 270Ala Ser Leu Val Trp Glu Glu Ala Gln Val Leu Ser Gly Lys Asn Ala275 280 285Asp Phe His Arg Gln Asp Leu Trp Asp Ala Ile Glu Ser Gly Asn Gly290 295 300Pro Glu Trp Asp Val Cys Val Gln Ile Val Asp Glu Ser Gln Ala Gln305 310 315 320
Ala Phe Gly Phe Asp Leu Leu Asp Pro Thr Lys Ile Ile Pro Glu Glu325 330 335Tyr Ala Pro Leu Thr Lys Leu Gly Leu Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro340 345 350Thr Asn Tyr Phe Ala Glu Thr Glu Gln Val Met Phe Gln Pro Gly His355 360 365Ile Val Arg Gly Ile Asp Phe Thr Glu Asp Pro Leu Leu Gln Gly Arg370 375 380Leu Phe Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Leu Asn Arg Asn Gly Gly Pro Asn385 390 395 400Phe Glu Gln Leu Pro Ile Asn Met Pro Arg Val Pro Ile His Asn Asn405 410 415Asn Arg Asp Gly Ala Gly Gln Met Phe Ile His Arg Asn Lys Tyr Pro420 425 430Tyr Thr Pro Asn Thr Leu Asn Ser Gly Tyr Pro Arg Gln Ala Asn Gln435 440 445Asn Ala Gly Arg Gly Phe Phe Thr Ala Pro Gly Arg Thr Ala Ser Gly450 455 460Ala Leu Val Arg Glu Val Ser Pro Thr Phe Asn Asp His Trp Ser Gln465 470 475 480Pro Arg Leu Phe Phe Asn Ser Leu Thr Pro Val Glu Gln Gln Phe Leu485 490 495Val Asn Ala Met Arg Phe Glu Ile Ser Leu Val Lys Ser Glu Glu Val500 505 510Lys Lys Asn Val Leu Thr Gln Leu Asn Arg Val Ser His Asp Val Ala515 520 525Val Arg Val Ala Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Pro Asp Ala Asp Asp530 535 540Thr Tyr Tyr His Asn Asn Lys Thr Ala Gly Val Ser Ile Val Gly Ser545 550 555 560Gly Pro Leu Pro Thr Ile Lys Thr Leu Arg Val Gly Ile Leu Ala Thr565 570 575Thr Ser Glu Ser Ser Ala Leu Asp Gln Ala Ala Gln Leu Arg Thr Arg580 585 590
Leu Glu Lys Asp Gly Leu Val Val Thr Val Val Ala Glu Thr Leu Arg595 600 605Glu Gly Val Asp Gln Thr Tyr Ser Thr Ala Asp Ala Thr Gly Phe Asp610 615 620Gly Val Val Val Val Asp Gly Ala Ala Ala Leu Phe Ala Ser Thr Ala625 630 635 640Ser Ser Pro Leu Phe Pro Thr Gly Arg Pro Leu Gln Ile Phe Val Asp645 650 655Ala Tyr Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Val Cys Gly Gly Lys Ser Ser660 665 670Glu Val Leu Asp Ala Ala Asp Val Pro Glu Asp Gly Asp Gly Val Tyr675 680 685Ser Glu Glu Ser Val Asp Met Phe Val Glu Glu Phe Glu Lys Gly Leu690 695 700Ala Thr Phe Arg Phe Thr Asp Arg Phe Ala Leu Asp Ser705 710 71權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)異源生物物質(zhì)的方法，包括(a)在適于生產(chǎn)異源生物物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)親本黑曲霉菌株的突變體，其中(i)該突變菌株包括編碼異源生物物質(zhì)的第一核苷酸序列和包括glaA和至少一個(gè)選自asa、amyA、amyB、prtT或oah的基因變體的一種或多種第二核苷酸序列，以及(ii)當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與親本黑曲霉菌株相比，該突變菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一個(gè)選自酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的酶的生產(chǎn)；以及(b)從培養(yǎng)基回收異源的生物物質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中至少一個(gè)基因是asa。
3.權(quán)利要求1的方法，其中至少一個(gè)基因是amyA。
4.權(quán)利要求1的方法，其中至少一個(gè)基因是amyB。
5.權(quán)利要求1的方法，其中至少一個(gè)基因是prtT。
6.權(quán)利要求1的方法，其中至少一個(gè)基因是oah。
7.權(quán)利要求1-6中任何的方法，其中由第一核苷酸序列編碼的生物物質(zhì)是生物聚合物。
8.權(quán)利要求7的方法，其中生物聚合物選自核酸、聚酰胺、多胺、多元醇、多肽或多糖。
9.權(quán)利要求8的方法，其中多肽選自抗原、酶、生長(zhǎng)因子、激素、免疫擴(kuò)張劑、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、報(bào)告蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、或轉(zhuǎn)錄因子。
10.權(quán)利要求9的方法，其中酶是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、或連接酶。
11.權(quán)利要求8的方法，其中多糖是殼多糖、肝素、或透明質(zhì)酸。
12.權(quán)利要求1-6中任何的方法，其中由第一核苷酸序列編碼的生物物質(zhì)是代謝產(chǎn)物。
13.權(quán)利要求1的方法，其中第一核苷酸序列包括生物合成或代謝途徑。
14.權(quán)利要求1-13中任何的方法，其中突變菌株包括至少2個(gè)拷貝的編碼生物物質(zhì)的第一核苷酸序列。
15.權(quán)利要求1-14中任何的方法，其中當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與親本黑曲霉菌株相比，突變菌株生產(chǎn)至少減少25％的葡糖淀粉酶和選自酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的一種或多種酶。
16.權(quán)利要求1-14中任何的方法，其中當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與親本黑曲霉菌株相比，該突變菌株完全缺乏葡糖淀粉酶和至少一個(gè)選自酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的酶。
17.權(quán)利要求1-16中任何的方法，其中該突變菌株進(jìn)一步包括編碼蛋白質(zhì)分解活性的一種或多種基因的變體。
18.權(quán)利要求17的方法，其中蛋白質(zhì)分解活性選自氨肽酶、二肽基氨肽酶、三肽基氨肽酶、羧肽酶、曲霉胃蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、或液泡蛋白酶。
19.權(quán)利要求1-17中任何的方法，其中突變菌株進(jìn)一步包括編碼選自糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、鹵素過(guò)氧化物酶、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、α-1，6-轉(zhuǎn)葡糖苷酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶的酶的一種或多種基因的變體。
20.一種親本黑曲霉菌株的突變株，包括編碼異源生物物質(zhì)的第一核苷酸序列和包括glaA和至少一個(gè)選自asa、amyA、amyB、prtT和oah的基因變體的一種或多種第二核苷酸序列，其中當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與親本黑曲霉菌株相比，該突變菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一個(gè)選自酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的酶。
21.權(quán)利要求20的突變菌株，其中至少一個(gè)基因是asa。
22.權(quán)利要求20的突變菌株，其中至少一個(gè)基因是amyA。
23.權(quán)利要求20的突變菌株，其中至少一個(gè)基因是amyB。
24.權(quán)利要求20的突變菌株，其中至少一個(gè)基因是prtT。
25.權(quán)利要求20的突變菌株，其中至少一個(gè)基因是oah。
26.權(quán)利要求20-25中任何的突變菌株，其中由第一核苷酸序列編碼的生物物質(zhì)是生物聚合物。
27.權(quán)利要求26的突變菌株，其中生物聚合物選自核酸、聚酰胺、多胺、多元醇、多肽或多糖。
28.權(quán)利要求27的突變菌株，其中多肽選自抗原、酶、生長(zhǎng)因子、激素、免疫擴(kuò)張劑、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、報(bào)告蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、或轉(zhuǎn)錄因子。
29.權(quán)利要求28的突變菌株，其中酶是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、或連接酶。
30.權(quán)利要求20-25中任何的突變菌株，其中由第一核苷酸序列編碼的生物物質(zhì)是代謝產(chǎn)物。
31.權(quán)利要求20的突變菌株，其中第一核苷酸序列包括生物合成或代謝途徑。
32.權(quán)利要求20-31中任何的突變菌株，其包括至少2個(gè)拷貝的編碼生物物質(zhì)的第一核苷酸序列。
33.權(quán)利要求20-32中任何的突變菌株，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與親本黑曲霉菌株相比，其生產(chǎn)至少減少25％的葡糖淀粉酶和選自酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的一種或多種酶。
34.權(quán)利要求20-32中任何權(quán)利要求的突變菌株，當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與親本黑曲霉菌株相比，其完全缺乏葡糖淀粉酶和至少一個(gè)選自酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的酶。
35.權(quán)利要求20-34中任何的突變菌株，其進(jìn)一步包括編碼蛋白質(zhì)分解活性的一種或多種基因的變體。
36.權(quán)利要求35的突變菌株，其中蛋白質(zhì)分解活性選自氨肽酶、二肽基氨肽酶、三肽基氨肽酶、羧肽酶、曲霉胃蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、或液泡蛋白酶。
37.權(quán)利要求20-36中任何的突變菌株，其進(jìn)一步包括編碼選自糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、鹵素過(guò)氧化物酶、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、α-1，6-轉(zhuǎn)葡糖苷酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶的酶的一種或多種基因的變體。
38.一種用于獲得親本黑曲霉菌株的突變株的方法，包括(a)將編碼異源生物物質(zhì)的第一核苷酸序列和包括glaA和至少一個(gè)選自asa、amyA、amyB、prtT或oah的基因變體的一種或多種第二核苷酸序列導(dǎo)入親本黑曲霉菌株；以及(b)鑒定來(lái)自步驟(a)的包括改變的核苷酸序列的突變菌株，其中當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與親本黑曲霉菌株相比，該突變菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一個(gè)選自酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的酶的生產(chǎn)。
39.權(quán)利要求38的方法，其中至少一個(gè)基因是asa。
40.權(quán)利要求38的方法，其中至少一個(gè)基因是amyA。
41.權(quán)利要求38的方法，其中至少一個(gè)基因是amyB。
42.權(quán)利要求38的方法，其中至少一個(gè)基因是prtT。
43.權(quán)利要求38的方法，其中至少一個(gè)基因是oah。
44.權(quán)利要求38-43中任何的方法，其中由第一核苷酸序列編碼的生物物質(zhì)是生物聚合物。
45.權(quán)利要求44的方法，其中生物聚合物選自核酸、聚酰胺、多胺、多元醇、多肽或多糖。
46.權(quán)利要求45的方法，其中多肽選自抗原、酶、生長(zhǎng)因子、激素、免疫擴(kuò)張劑、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、報(bào)告蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、和轉(zhuǎn)錄因子。
47.權(quán)利要求46的方法，其中酶是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、或連接酶。
48.權(quán)利要求45的方法，其中多糖是殼多糖、肝素、或透明質(zhì)酸。
49.權(quán)利要求38-43中任何的方法，其中由第一核苷酸序列編碼的生物物質(zhì)是代謝產(chǎn)物。
50.權(quán)利要求38的方法，其中第一核苷酸序列包括生物合成或代謝途徑。
51.權(quán)利要求38-50中任何的方法，其中突變菌株包括至少2個(gè)拷貝的編碼生物物質(zhì)的第一核苷酸序列。
52.權(quán)利要求38-51中任何的方法，其中當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與親本黑曲霉菌株相比，該突變菌株生產(chǎn)至少減少25％的葡糖淀粉酶和選自酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的一種或多種酶。
53.權(quán)利要求38-51中任何的方法，其中當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與親本黑曲霉菌株相比，該突變菌株完全缺乏葡糖淀粉酶和選自酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的一種或多種酶。
54.權(quán)利要求38-53中任何的方法，其中該突變菌株進(jìn)一步包括編碼蛋白質(zhì)分解活性的一種或多種基因的變體。
55.權(quán)利要求54的方法，其中蛋白質(zhì)分解活性選自氨肽酶、二肽基氨肽酶、三肽基氨肽酶、羧肽酶、曲霉胃蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、或液泡蛋白酶。
56.權(quán)利要求38-55中任何的方法，其中突變菌株進(jìn)一步包括編碼選自糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、鹵素過(guò)氧化物酶、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、α-1，6-轉(zhuǎn)葡糖苷酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶的酶的一種或多種基因的變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)異源生物物質(zhì)的方法，包括(a)在適于生產(chǎn)異源生物物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)親本黑曲霉(Aspergillus niger)菌株的突變株，其中(i)該突變菌株包括編碼異源生物物質(zhì)的第一核苷酸序列和包括glaA和至少一個(gè)選自asa、amyA、amyB、prtT或oah的基因變體的一種或多種第二核苷酸序列，和(ii)當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)與親本黑曲霉菌株相比，該突變菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一個(gè)選自酸穩(wěn)定的α－淀粉酶、中性α－淀粉酶A、或中性α－淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的酶的生產(chǎn)；以及(b)從培養(yǎng)基回收異源的生物物質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1798848SQ200480015112
公開(kāi)日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月31日
發(fā)明者瑪麗亞·康奈利, 霍華德·布羅迪 申請(qǐng)人:諾維信股份有限公司