專利名稱：胰酶制劑和可比組合物的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析樣品的同一性、蛋白質(zhì)和/或肽模式以及穩(wěn)定性的新方法，所述樣品包含具有脂肪分解、蛋白水解和淀粉分解活性的生理可接受酶混合物，但特別是消化酶如胰酶制劑的混合物，特別涉及包含所述酶混合物如脫溶胰酶制劑(precipitated pancreatin)或胰酶制劑的微小微球體(mini-microsphere)的藥用產(chǎn)品的制造方面。
本發(fā)明地目的是提供適于包含消化酶如胰酶制劑的藥物制劑的新分析方法，特別是還涉及包含所述酶混合物如胰酶制劑或胰酶制劑的微小微球體的藥用產(chǎn)品的制造方面。具體而言所述目的是提供用于驗(yàn)證藥物制造的適合并可靠的分析方法，該方法分析并確定所述消化酶樣品的同一性、蛋白質(zhì)和/或肽模式以及穩(wěn)定性。另一個(gè)目的是提供在最適于分析胰酶制劑(特別是脫溶胰酶制劑或胰酶制劑的微小微球體)條件下的所述分析方法。
根據(jù)本發(fā)明，具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的生理可接受的酶混合物，例如微生物來(lái)源的適當(dāng)酶混合物和/或特別是動(dòng)物來(lái)源的消化酶混合物，例如優(yōu)選地為胰酶制劑或胰酶制劑樣消化酶混合物，是按照基本上描述于本專利說(shuō)明書的分析方法進(jìn)行分析的。
對(duì)于本發(fā)明，能夠分析任意動(dòng)物或微生物來(lái)源的具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的生理可接受酶混合物。通過(guò)本發(fā)明方法分析的具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的酶混合物可以是純微生物來(lái)源的和純動(dòng)物來(lái)源的，或者也可以是動(dòng)物和微生物來(lái)源的酶混合物。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)變體中，所使用的酶混合物是純微生物來(lái)源的。特別是由細(xì)菌，即由桿菌屬(Bacillus)或假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株，產(chǎn)生的酶，或者由如霉菌的真菌培養(yǎng)物，例如根霉菌屬(Rhizopus)或曲霉屬(Aspergillus)菌株，產(chǎn)生的酶特別適合作為微生物酶。在本領(lǐng)域的敘述中已經(jīng)描述了此類生理可接受細(xì)菌和/或霉菌真菌酶的實(shí)例，例如與其合成和用于治療消化不良的用途相關(guān)。脂肪酶可以來(lái)自例如桿菌屬或假單胞菌屬菌株，淀粉酶和脂肪酶可以來(lái)自霉菌真菌，例如根霉菌屬菌株，并且蛋白酶也可以來(lái)自例如曲霉屬。
然而，本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的變體將涉及具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的消化酶混合物的用途，其特性近似于胰酶制劑。對(duì)于本發(fā)明，優(yōu)選地使用包含胰酶制劑的消化酶混合物并且特別是胰酶制劑自身，并且如果期望，可以將脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶類的一種或多種微生物酶，即由微生物合成的酶，加入到胰酶制劑中或者包含胰酶制劑的消化酶混合物中。根據(jù)本發(fā)明最優(yōu)選的方法適合用于分析脫溶胰酶制劑或胰酶制劑的微小微球體樣品。
胰酶制劑是已知的具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的酶混合物，其是可以獲得的，例如商品名Creon，其可以為顆粒、片劑或包含包有腸溶衣的微球體的膠囊，并且胰酶制劑在醫(yī)學(xué)上可以用作酶替代品，例如在胰腺機(jī)能不全、胃手術(shù)后的消化機(jī)能不全、肝和膽疾病、囊性纖維化和慢性胰腺炎情況下。胰酶制劑通常是作為天然酶混合物通過(guò)從豬胰腺提取獲得的，例如按照描述于德國(guó)專利申請(qǐng)DE25 12 746和DE 42 03 315中的方法，并且然后以本領(lǐng)域已知的方式將胰酶制劑制成預(yù)期的蓋侖制劑形式。胰酶通常以固形制劑形式口服施用。
在本發(fā)明的一個(gè)變體中，根據(jù)本發(fā)明將分析的藥物制劑優(yōu)選地包括胰酶制劑或包含胰酶制劑的消化酶混合物。根據(jù)本發(fā)明所分析的這些藥物制劑可以包括胰酶制劑或包含胰酶制劑的消化酶混合物，并且除了胰酶制劑還可能包含來(lái)自一組從微生物獲得的脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶的一種或多種生理可接受酶。用于該添加劑中的微生物酶特別包括上面已經(jīng)提及的細(xì)菌合成酶，例如由桿菌屬或假單胞菌屬菌株合成的細(xì)菌合成酶，或者由如霉菌真菌的真菌培養(yǎng)物，如根霉菌屬或曲霉屬菌株合成的細(xì)菌合成酶。除了胰酶制劑或包含胰酶制劑的酶混合物，所包含的脂肪酶可以來(lái)自例如桿菌屬或假單胞菌屬菌株，所加入的淀粉酶和脂肪酶來(lái)自霉菌真菌，例如根霉菌屬菌株，并且所加入的蛋白酶還可以來(lái)自曲霉屬。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的生理可接受酶混合物，如胰酶制劑或者可以從微生物和/或動(dòng)物來(lái)源獲得的并且參照本發(fā)明所描述的非動(dòng)物來(lái)源酶混合物，能夠按照本發(fā)明的方法進(jìn)行非常有效地分析。本發(fā)明提供了用于分析和確定所述包含具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的生理可接受酶混合物的消化酶組合物或樣品的同一性、蛋白質(zhì)和/或肽模式以及穩(wěn)定性的強(qiáng)有力且可靠(可重復(fù))的方法。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員很明顯他可以某種程度上改變所給定的參數(shù)而不減少根據(jù)本發(fā)明的方法的全部功能性；例如可以期望調(diào)整在下面敘述中、實(shí)施例中、表和圖中表明執(zhí)行該方法的參數(shù)的+/-10％，特別是調(diào)整+/-5％。
因此，本發(fā)明適于通過(guò)二維凝膠電泳(2D GE)表征和/或說(shuō)明包含具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的生理可接受消化酶混合物的蛋白質(zhì)樣品的分析方法，其中蛋白質(zhì)樣品用于制造用于治療疾病和/或失調(diào)的藥物制劑，所述方法包括
(a)通過(guò)將酶混合物樣品溶于用于凝膠電泳的溶劑組合物的樣品制備，其中溶劑組合物包含適于溶解蛋白質(zhì)物質(zhì)的特定溶劑、用于蛋白質(zhì)定量的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)和蛋白酶抑制劑；
(b)用于界定第一維凝膠電泳并應(yīng)用梯度分離蛋白質(zhì)級(jí)分的等電聚焦步驟；
(c)包括再緩沖的隨后預(yù)處理步驟；
(d)轉(zhuǎn)移至第二維凝膠電泳并通過(guò)SDS-PAGE分離；
(e)將步驟(d)所得到的凝膠固定并染色；和
(f)通過(guò)熒光掃描進(jìn)行光密度測(cè)量法評(píng)價(jià)。
所述2D GE方法特別適于分析并確定包含具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的生理可接受消化酶混合物的所述消化酶組合物或樣品的同一性、蛋白質(zhì)和/或肽模式以及穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)或肽級(jí)分的分子量為大于大約8kDa(千道爾頓)。在一個(gè)變體中本發(fā)明特別適于分析并確定胰酶制劑的同一性、蛋白質(zhì)和/或肽模式以及穩(wěn)定性，并且特別是所述胰酶制劑為脫溶胰酶制劑或者胰酶制劑的微小微球體。應(yīng)用于執(zhí)行本發(fā)明方法變體的參數(shù)下面詳細(xì)描述于說(shuō)明書中涉及“使用MALDI-TOF MS鑒定斑點(diǎn)”、“脫溶胰酶制劑的應(yīng)激試驗(yàn)研究”、“通過(guò)2D凝膠電泳確定脫溶胰酶制劑樣品的同一性和蛋白質(zhì)模式的分析方法”的部分及相關(guān)表格中，并且通過(guò)本發(fā)明上下文中所給出的圖進(jìn)一步圖解說(shuō)明。
對(duì)于消化酶樣品，例如胰酶制劑并且特別是脫溶胰酶制劑或者胰酶制劑的微小微球體，其中蛋白質(zhì)或肽級(jí)分的分子量低于大約8kDa(千道爾頓)，根據(jù)本發(fā)明的變體通過(guò)另外關(guān)于分析用RP-HPLC方法的申請(qǐng)可以補(bǔ)充該方法。
如上面所定義本發(fā)明一方面涉及微生物合成的脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶酶混合物的分析。如上面所定義本發(fā)明另一方面涉及消化酶的胰酶制劑和/或胰酶制劑樣混合物的分析。如上面所定義本發(fā)明另一方面還涉及胰酶制劑樣品的分析，其中胰酶制劑樣品是胰酶制劑或者胰酶制劑的微小微球體。
如上面所定義本發(fā)明另一方面涉及分析方法，其中(a)溶解樣品步驟中所使用的溶劑是含7M脲、2M硫脲、4％(w/v)CHAPS、1％(w/v)DTT和0.5％Pharmalyte的pH 3-10的裂解緩沖液。
如上面所定義本發(fā)明另一方面還涉及分析方法，其中用于定量步驟(a)中所使用的蛋白質(zhì)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)是磷酸化酶B，優(yōu)選地為兔磷酸化酶B，或者碳酸酐酶，優(yōu)選地為牛碳酸酐酶。
如上面所定義本發(fā)明另外一方面涉及分析方法，其中蛋白酶抑制劑是Mini Complete和/或Pefabloc。
如上面所定義本發(fā)明另一方面進(jìn)一步涉及分析方法，其中(a)溶解樣品步驟中所使用的溶劑是Lp3，由溶于2ml裂解緩沖液的1.5mgMini Complete和溶于2ml裂解緩沖液的1mg Pefabloc組成，比例為1∶1v/v，其中裂解緩沖液含有7M脲、2M硫脲、4％(w/v)CHAPS、1％(w/v)DTT和0.5％Pharmalyte，pH 3-10。
如上面所定義本發(fā)明還涉及分析性2D GE方法，其中所述方法用于表征和定量分子量大于大約8kD的蛋白質(zhì)和/或肽級(jí)分。
如上面所定義本發(fā)明另一方面涉及分析方法，該方法包括確定胰酶制劑的同一性和/或蛋白質(zhì)和/或肽模式，胰酶制劑優(yōu)選地為脫溶胰酶制劑樣品或者胰酶制劑的微小微球體樣品。
如上面所定義本發(fā)明另一方面涉及分析方法，該方法包括另外使用MALDI-TOF-MS鑒定蛋白質(zhì)和/或肽斑點(diǎn)。
如上面所定義本發(fā)明一方面涉及分析方法，該方法作為應(yīng)激性或穩(wěn)定性試驗(yàn)進(jìn)行以確定胰酶制劑和雜質(zhì)和/或降解物的同一性和/或蛋白質(zhì)和/或肽模式，胰酶制劑優(yōu)選地為脫溶胰酶制劑樣品或者胰酶制劑的微小微球體樣品，并且任選地還包括定量所述蛋白質(zhì)、肽、雜質(zhì)和/或降解物。
如上面所定義本發(fā)明另一方面涉及分析方法，其中所述方法進(jìn)一步包括通過(guò)RP-HPLC表征或定量分子量低于大約8kD的低分子量蛋白質(zhì)和/或肽級(jí)分。
如上面所定義本發(fā)明另一方面還涉及適于通過(guò)2維凝膠電泳表征和/或說(shuō)明具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的生理可接受酶混合物樣品的溶劑組合物，其中生理可接受酶混合物用于制造治療疾病和/或失調(diào)的藥物制劑，溶劑組合物包括
(a)適于凝膠電泳的溶劑并溶解蛋白質(zhì)物質(zhì)，其中溶劑是含7M脲、2M硫脲、4％(w/v)CHAPS、1％(w/v)DTT和0.5％Pharmalyte的裂解緩沖液，pH 3-10；
(b)用于蛋白質(zhì)定量的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)；和
(c)和蛋白質(zhì)抑制劑。
該溶劑的變體中，使用的是溶劑組合物，其中溶解樣品的溶劑是Lp3，包含溶于2ml裂解緩沖液的1.5mg Mini Complete和溶于2ml裂解緩沖液的1mg Pefabloc組成，比例為1∶1v/v，其中緩沖液含有7M脲、2M硫脲、4％(w/v)CHAPS、1％(w/v)DTT和0.5％Pharmalyte，pH 3-10。
下面所使用的一些縮略語(yǔ)和/或術(shù)語(yǔ)的列表
根據(jù)本發(fā)明的分析方法，特別是驗(yàn)證藥物和調(diào)控目的之后，優(yōu)選地試圖用于表征和說(shuō)明脫溶胰酶制劑背景并且還可以應(yīng)用于胰酶制劑包有腸溶衣的微小微球體(胰酶制劑的微小微球體)。
例如，提交給NDA的關(guān)于活性成分脫溶胰酶制劑和劑型胰酶制劑包有腸溶衣mms的產(chǎn)品說(shuō)明書涵蓋酶的鑒定、純度、測(cè)定法、胃液抗性和釋放條目。鑒定工藝水平基于酶學(xué)測(cè)定法，酶學(xué)測(cè)定法用于確定API和劑型兩種形式的酶的活性。“純度”還包括確定殘余溶劑(API，mms)、脂肪(API)、水(API，mms)和微生物學(xué)性質(zhì)?？紤]到目前FDA基于Q6B指南“生物技術(shù)/生物制品的說(shuō)明書、測(cè)試方法和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)”的需求和期望，更加詳細(xì)的表征對(duì)于藥品和劑型是必需的，并且特別關(guān)注對(duì)不同類型酶、雜質(zhì)和這些酶的降解物進(jìn)行鑒定和定量。表征的結(jié)果和方法將選擇用于詳細(xì)說(shuō)明背景。
因此本發(fā)明意圖表征并詳細(xì)說(shuō)明2D凝膠電泳(2D GE)的使用，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)了盡管脫溶胰酶制劑是不同類型組分的復(fù)雜混合物，二維電泳仍然有希望提供最好的選擇性以分離肽和蛋白質(zhì)，即不同類型的酶、雜質(zhì)和蛋白質(zhì)的降解物。而且，染色凝膠成像允許對(duì)組分進(jìn)行定量并比較胰酶制劑樣品、脫溶胰酶制劑或胰酶制劑的微小微球體樣品中的蛋白質(zhì)和/或肽模式。本發(fā)明表明胰蛋白酶消化后通過(guò)斑點(diǎn)選擇和MALDI-TOF MS能夠完成最顯著的斑點(diǎn)的鑒定。
一般而言，在樣品脫鹽之后，根據(jù)本發(fā)明通過(guò)2D GE方法的分離將在胰酶制劑樣品或mms樣品的水緩沖溶液的第一維電泳(步驟(b)等電聚焦)的凝膠上進(jìn)行，使用pH梯度為3-10以覆蓋寬范圍的可能組分或化合物。聚焦在固定化電解質(zhì)干燥條帶(immobiline Dry Strip)上進(jìn)行。作為例證的起始梯度下面列表顯示
一般而言，根據(jù)本發(fā)明2D GE方法的第二維電泳(步驟(d)SDS-PAGE)中的分離將在使用如SDS-GLYCIN-TRIS緩沖液在手工制備凝膠(例如在以下條件T＝13％，C＝3％)上進(jìn)行，電泳使用下面表中列出的梯度
一般而言，使用例如乙醇/乙酸混合物固定之后用熒光燃料進(jìn)行染色并隨后在例如乙醇/乙酸中進(jìn)行脫色。用水洗滌后，進(jìn)行光密度掃描。然后，使用例如膠體考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色以通過(guò)MALDI-TOF MS進(jìn)行鑒定。為了該目的，將從凝膠中挑取斑點(diǎn)并進(jìn)行胰蛋白酶消化。使用例如乙腈/0.1％TFA從凝膠中洗脫肽并在C18 ZipTip柱上進(jìn)行純化。使用2，5-二羥苯甲酸共結(jié)晶后，用吸量管將提取物吸到目的板上。
作為舉例說(shuō)明在分析方法中本發(fā)明的適用性和有用性的實(shí)例，選擇了三批三種脫溶胰酶制劑(腺體來(lái)自不同國(guó)家并用不同加工方法加工)，包括胰酶制劑SPL 85。對(duì)于每種脫溶胰酶制劑的每一批，將每批中的一個(gè)樣品應(yīng)用于凝膠進(jìn)行三次分析以檢驗(yàn)脫溶步驟、樣品制備和分離的重復(fù)性。將斑點(diǎn)定量并鑒定特征斑點(diǎn)。
作為舉例說(shuō)明本發(fā)明在穩(wěn)定性測(cè)試中的適用性和有用性的實(shí)例，將先前用于舉例說(shuō)明適用性和有用性的相同批次的樣品置于應(yīng)激條件下(溫度、濕度、光)以確定任何活性損失并且然后還分析或觀察差別并且，如果適用，可鑒定潛在的降解物。
如上面所指出，對(duì)于消化酶樣品例如胰酶制劑并且特別是脫溶胰酶制劑或酶制劑的微小微球體，含有分子量低于大約8kDa(千道爾頓)的蛋白質(zhì)或肽級(jí)分，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)變體可通過(guò)另外應(yīng)用分析性RP-HPLC方法對(duì)本方法進(jìn)行補(bǔ)充。應(yīng)用于本發(fā)明RP-HPLC方法變體中的參數(shù)在下面詳細(xì)描述于說(shuō)明書涉及“具有MALDI-TOF-MS的RP-HPLC用于胰酶制劑分析的可行性”的部分中。
使用“MALDI-TOF MS”、“脫溶胰酶制劑應(yīng)激試驗(yàn)研究”、“通過(guò)2D凝膠電泳確定脫溶胰酶制劑同一性和蛋白質(zhì)模式的分析方法”鑒定斑點(diǎn)以及相關(guān)表格進(jìn)一步在上下文中通過(guò)給出的圖進(jìn)行圖解說(shuō)明。
HPLC在很大程度上是自動(dòng)化的、可重復(fù)性好的、廣泛用于常規(guī)分析的高度選擇性方法，該方法同樣用于蛋白質(zhì)分析?；衔锒渴侨菀椎牟⑶夷軌蛲ㄟ^(guò)LC-ESI-MS進(jìn)行峰的鑒定。能夠檢測(cè)并鑒定低分子量肽和其他低分子量化合物以便使該方法補(bǔ)充例如2D凝膠電泳或SDS-PAGE。因此該方法可以特別地用于酶類、雜質(zhì)和降解物的指紋分析、鑒定和定量。
通常HPLC方法涉及例如由以下組成的靈敏HPLC裝置自動(dòng)采樣器G 1313A；Quat.pump G 1311A；紫外分光光度檢測(cè)器G 1314A；真空除氣器G 1322A；HP柱加熱爐G1316A；1100控制模塊G 1323A；LAN-界面35900E和Chem-Server或等同的系統(tǒng)。典型的HPLC柱可以是例如MODULO O-CART QS UPTISPHERE 5 WRP、Interchim(UP5WRP$15QS)，具有RP 18固定相，5.0μm，長(zhǎng)度為150mm且內(nèi)徑為3.0mm的不銹鋼管材料；或者可比的相應(yīng)HPLC柱。RP 18、5.0μm相是有益的，例如有可能使用100％水操作，并且對(duì)于蛋白質(zhì)和肽是適當(dāng)?shù)?。適當(dāng)柱的其它實(shí)例是例如從Varian B.V.，Middelburg，TheNetherlands可獲得的Polaris 5μm C18-A 150×4.6mm(商品訂購(gòu)號(hào)A2000150X046)；或者例如MicroSolv技術(shù)公司，Long Branch，NJ07740，USA的Cogent Bidentate，C((Octyl)，4μm，300A，150×4.6mm。
HPLC方法可以在以下例證條件下進(jìn)行操作
操作模式梯度HPLC
流動(dòng)相 流動(dòng)相A水/TFA 0.05％(v/v)
流動(dòng)相B乙腈/TFA 0.05％(v/v)
梯度
流率1.0ml/分鐘
分析期 75分鐘
溫度20±5.0℃
注入柱 10μl
對(duì)于例如UV-檢測(cè)器可以使用波長(zhǎng)214nm。
使用MALDI-TOF MS鑒定斑點(diǎn)
根據(jù)本發(fā)明的一方面，分析方法包括從2D凝膠鑒定蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，例如脫溶胰酶制劑樣品。使用MALDI-TOF MS進(jìn)行的斑點(diǎn)鑒定更加詳細(xì)描述于下面段落中。下面更加詳細(xì)描述了2D凝膠電泳和MALDI-TOF MS的方法步驟。通過(guò)從進(jìn)行2D凝膠方法獲得的濕凝膠建立肽質(zhì)量指紋圖譜，并且通過(guò)附加的對(duì)未能清楚鑒定的斑點(diǎn)應(yīng)用MALDI-MS/MS對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行表征。
肽質(zhì)量指紋圖譜
對(duì)于肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，使用直徑0.2cm的可操作吸量管手工從濕凝膠上切取各個(gè)斑點(diǎn)。然后將每個(gè)斑點(diǎn)轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的管中(0.5ml)。使用特殊洗滌步驟1.100μl 10mM碳酸氫銨，振蕩5分鐘，2.10mM碳酸氫銨、50％乙腈，振蕩5分鐘對(duì)考馬斯亮藍(lán)染色的斑點(diǎn)進(jìn)行脫色。該過(guò)程必須重復(fù)至少3次或者直至全部斑點(diǎn)完全無(wú)色。最后一次洗滌步驟后將5μl乙腈加到每個(gè)管中。當(dāng)斑點(diǎn)為白色時(shí)，依賴于管內(nèi)凝膠的量可以加入2-6μl消化緩沖液。消化緩沖液為含有0.01μg/μl改性牛胰蛋白酶(Roche Diagnostics，Basel，Switzerland)的10mM碳酸氫銨。在37℃消化過(guò)夜。
消化后，取出上清液，在管中留下凝膠基質(zhì)。如果沒(méi)有留下上清液，將加入5-μl提取介質(zhì)(1％TFA、50％乙腈)。在超聲浴中超聲作用10分鐘后，將兩個(gè)管轉(zhuǎn)移至真空離心蒸發(fā)濃縮器中以去除乙腈。然后濃縮所述肽并通過(guò)使用C18 Zip-Tip(Millipore，USA)按照制造商說(shuō)明書將樣品脫鹽?，F(xiàn)在可以將提取的混合物轉(zhuǎn)移至MALDI-MS靶(Applied Biosystems)上。將0.1μl量的樣品與0.1μl DHBS基質(zhì)(2，5二羥苯甲酸∶2羥基-5甲氧基-苯甲酸9∶1)混合。然后通過(guò)MALDI質(zhì)譜儀測(cè)量靶(Voyager STR，Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)。反射器模式中使用質(zhì)量范圍600-4200道爾頓(Da)。由于基質(zhì)效應(yīng)低分子量范圍(＜600Da)難以檢測(cè)。
示蹤PMF波譜并且內(nèi)部校準(zhǔn)至2個(gè)質(zhì)量已知自體胰蛋白酶的肽(805.42Da；2163.05Da)。通常校準(zhǔn)的波譜具有小于50ppm的精確度。使用軟件ProFound(Genomic Solutions，USA)對(duì)PMF進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。當(dāng)采樣點(diǎn)1和采樣點(diǎn)2之間的缺口為至少e-04且能夠解釋最強(qiáng)質(zhì)譜或者如果序列覆蓋度相對(duì)較高(＞30％)時(shí)達(dá)到顯著采樣數(shù)。
鑒定結(jié)果列于下面表A并且

圖1顯示使用示蹤脫溶胰酶制劑的已鑒定斑點(diǎn)而獲得的2D-凝膠。
而且，圖2描述根據(jù)本發(fā)明方法的高度重復(fù)性。在不同的4天制備單一脫溶胰酶制劑樣品的三個(gè)凝膠。
MALDI-MS/MS
選擇不能夠通過(guò)PMF清楚鑒定的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)用于ProteomicsAnalyzer 4700(Applied Biosystems，F(xiàn)ramingham，CA，USA)的MALDI-MS/MS分析。為了該目的，選擇具有某些峰強(qiáng)度的肽并進(jìn)行片段化以獲得序列信息。使用Mascot軟件(Matrixscience，London，UK)，將所獲得的波譜片斷用于搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http//www.ncbi.nih.gov/)，National Center for BiotechnologyInformation，National Library of Medicine，Building 38A，Bethesda，MD 20894，USA。超過(guò)一定Mascot值的波譜是有意義的。在可疑的實(shí)例中進(jìn)行手工控制。
表A顯示通過(guò)MALDI-MS/MS獲得的結(jié)果。
脫溶胰酶制劑的應(yīng)激試驗(yàn)研究
根據(jù)本發(fā)明另一方面，2D凝膠電泳方法用于分析監(jiān)測(cè)降解過(guò)程和/或監(jiān)測(cè)脫溶胰酶制劑樣品的穩(wěn)定性。該穩(wěn)定性試驗(yàn)更加詳細(xì)描述于下面涉及脫溶胰酶制劑的應(yīng)激(穩(wěn)定性)試驗(yàn)的測(cè)試報(bào)告中。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，在應(yīng)激試驗(yàn)中，對(duì)于(a)當(dāng)應(yīng)用于脫溶胰酶制劑時(shí)的穩(wěn)定性試驗(yàn)，(b)定位應(yīng)激試驗(yàn)中所形成的潛在降解產(chǎn)物，和(c)鑒定顯示降解作用的斑點(diǎn)，觀察了2D凝膠電泳(2D GE)方法的適應(yīng)性。研究揭示出已經(jīng)鑒定的一些斑點(diǎn)的顯著變化，這對(duì)于包括于本研究中的兩種類型脫溶胰酶制劑是可比較的。因此該方法被當(dāng)作穩(wěn)定性指示。
為了評(píng)價(jià)2D GE方法用于表征脫溶胰酶制劑的適應(yīng)性，將脫溶胰酶制劑樣品置于應(yīng)激試驗(yàn)條件下貯存并且根據(jù)本法明方法進(jìn)行觀察。通過(guò)2D GE檢測(cè)等份這些樣品以確定進(jìn)行應(yīng)激試驗(yàn)所需要的持續(xù)時(shí)間并且尋找能夠與胰酶制劑降解產(chǎn)物相關(guān)的斑點(diǎn)。
根據(jù)如下面詳細(xì)描述的分析性方法“通過(guò)2D凝膠電泳鑒定同一性和蛋白質(zhì)模式”進(jìn)行應(yīng)激試驗(yàn)。
對(duì)于應(yīng)激試驗(yàn)使用了以下樣品
將大量20g脫溶胰酶制劑加入培養(yǎng)皿并用第二塊培養(yǎng)皿覆蓋。將樣品置于40℃/75％相對(duì)濕度貯存。在開始時(shí)和1、2、4、8、16和32天后分別收獲100mg樣品。通過(guò)2D GE檢測(cè)0、16和32天后取出的樣品。將全部樣品深度冰凍貯存，即-15℃以下，避光并保持一定濕度，直到這些樣品用于研究。
結(jié)果顯示于表A-1和圖1-7，它們描述了在脫溶胰酶制劑樣品應(yīng)激穩(wěn)定性試驗(yàn)中所獲得的2D凝膠。所述表和圖的內(nèi)容概括如下
表A-I內(nèi)容
表A來(lái)自2D-GE具有NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)的斑點(diǎn)(也見圖1)
表B胰酶制劑批次1(t＝0和16天)的斑點(diǎn)強(qiáng)度，具平均值和標(biāo)準(zhǔn)差和相對(duì)t0的斑點(diǎn)調(diào)節(jié)。
表C胰酶制劑批次1(t＝0和16天)的斑點(diǎn)強(qiáng)度，具平均值和標(biāo)準(zhǔn)差和相對(duì)t0的斑點(diǎn)調(diào)節(jié)。
表D胰酶制劑批次1(t＝32天)的斑點(diǎn)強(qiáng)度，具平均值和標(biāo)準(zhǔn)差和相對(duì)t0的斑點(diǎn)調(diào)節(jié)。
表E胰酶制劑批次1(t＝32天)的斑點(diǎn)強(qiáng)度，具平均值和標(biāo)準(zhǔn)差和相對(duì)t0的斑點(diǎn)調(diào)節(jié)。
表F胰酶制劑批次2(t＝0和15天)的斑點(diǎn)強(qiáng)度，具平均值和標(biāo)準(zhǔn)差和相對(duì)t0的斑點(diǎn)調(diào)節(jié)。
表G胰酶制劑批次2(t＝0和15天)的斑點(diǎn)強(qiáng)度，具平均值和標(biāo)準(zhǔn)差和相對(duì)t0的斑點(diǎn)調(diào)節(jié)。
表H胰酶制劑批次2(t＝32天)的斑點(diǎn)強(qiáng)度，具平均值和標(biāo)準(zhǔn)差和相對(duì)t0的斑點(diǎn)調(diào)節(jié)。
表E胰酶制劑批次2(t＝32天)的斑點(diǎn)強(qiáng)度，具平均值和標(biāo)準(zhǔn)差和相對(duì)t0的斑點(diǎn)調(diào)節(jié)。
圖1-7內(nèi)容
圖1使用具已鑒定標(biāo)記斑點(diǎn)的脫溶胰酶制劑所獲得的2D-凝膠(也參見表J和K中的數(shù)據(jù))
圖2使用單一脫溶胰酶制劑樣品2D-凝膠方法的重復(fù)性；在不同的4天進(jìn)行3次凝膠電泳(IPG 3-10NL、熒光染色、外標(biāo)準(zhǔn)碳酸酐酶、應(yīng)用量320ng)
圖3應(yīng)激試驗(yàn)后所獲得的相對(duì)胰酶制劑批次1的2D-凝膠(SyproRuby)
圖4應(yīng)激試驗(yàn)后所獲得的相對(duì)胰酶制劑批次2的2D-凝膠(SyproRuby)
圖5對(duì)于胰酶制劑批次1所計(jì)算的平均凝膠數(shù)(n＝3)
圖6對(duì)于胰酶制劑批次2所計(jì)算的平均凝膠數(shù)(n＝3)
圖7添加兩個(gè)內(nèi)部標(biāo)記蛋白質(zhì)磷酸化酶B和碳酸酐酶的脫溶胰酶制劑的2D凝膠，如本說(shuō)明書涉及分析性方法“同一性和蛋白質(zhì)模式”部分中所描述獲得。
通過(guò)2D凝膠電泳確定脫溶胰酶制劑樣品同一性和蛋白質(zhì)模式的分析方法
根據(jù)本法明方法一方面，2D凝膠電泳方法被用作通過(guò)2D凝膠電泳確定脫溶胰酶制劑樣品同一性和蛋白質(zhì)模式的分析性方法。文中更加詳細(xì)地描述了該方法，使用以下縮略語(yǔ)
CHAPS 3-(3-chol氨基丙基)二甲基銨基-1-丙烷-磺酸鹽
DTT 二硫蘇糖醇
TRIS 三(羥甲基)氨基甲烷
APS 過(guò)硫酸銨
TEMED N，N，N′，N′-四甲基乙二胺
SDS 十二烷基硫酸鈉
所應(yīng)用的2D GE方法說(shuō)明書
二維凝膠電泳(2D GE)分離技術(shù)(O′Farrell PH，J.Biol.Chem.2504007-4021(1975))利用蛋白質(zhì)復(fù)合體混合物各種組分的電泳遷移率，在第一維電泳中根據(jù)電荷(pI)通過(guò)等電聚焦(IEF)進(jìn)行分離并且在第二維電泳中根據(jù)大小(Mr)通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分離。
一般而言，電泳是按照歐洲藥典(Ph.Eur.2.2.31)進(jìn)行的，并且在上下文中術(shù)語(yǔ)“水”無(wú)特別限制意思是指雙蒸水或去離子水或等同性質(zhì)的水。
在該方法中應(yīng)用以下材料和試劑
-乙腈，例如Merck，產(chǎn)品編號(hào)1033530220
-丙烯酰胺，例如Serva，產(chǎn)品編號(hào)10688.02
-瓊脂糖，例如VWR International，產(chǎn)品編號(hào)1.16802.0025
-過(guò)硫酸銨，例如Serva，產(chǎn)品編號(hào)13 375.01
-溴酚藍(lán)，例如VWR International，產(chǎn)品編號(hào)1.08122.0005
-2-丁醇，例如VWR International，產(chǎn)品編號(hào)8.22263.1000
-CHAPS，例如Roth，產(chǎn)品編號(hào)1479.2
-DTT，1，4-二硫蘇糖醇，例如Roth，產(chǎn)品編號(hào)6908.2
-電極紙，例如Amersham Biosciences，產(chǎn)品編號(hào)80-1106-19
-電極紙條，例如Amersham Biosciences，產(chǎn)品編號(hào)18-1004-40
-乙醇，例如VWR International，產(chǎn)品編號(hào)TC212-9025
-乙酸，例如Roth，產(chǎn)品編號(hào)3738.2
-固定化電解質(zhì)干燥條，pH 3-10NL，例如AmershamBiosciences，產(chǎn)品編號(hào)17-1235-01
-甘油，例如Serva，產(chǎn)品編號(hào)23176
-甘氨酸，例如Roth，產(chǎn)品編號(hào)3908.3
-脲，例如Roche Diagnostics，產(chǎn)品編號(hào)1 685 902
-碘乙酰胺，例如Sigma，產(chǎn)品編號(hào)I-6125
-PharmalyteTM 3-10，Amersham Biosciences，產(chǎn)品編號(hào)17-0456-01
-蛋白質(zhì)測(cè)試混合物4，例如Serva，產(chǎn)品編號(hào)39208.01
-蛋白質(zhì)測(cè)試混合物5，Serva，產(chǎn)品編號(hào)39209.01
-Roti-Blue-濃縮劑，產(chǎn)品編號(hào)A152.1
-樣品杯，例如Amersham Biosciences，產(chǎn)品編號(hào)18-1004-35
-SDS，十二烷基硫酸鈉，例如Serva，產(chǎn)品編號(hào)20 763.02
-硅油，例如Serva，產(chǎn)品編號(hào)35132
-TEMED，例如Bio-Rad，產(chǎn)品編號(hào)161-0800
-硫脲，例如Fluka，產(chǎn)品編號(hào)88810
-TRIS，用于電極緩沖液，例如Roth，產(chǎn)品編號(hào)4855.2
-TRIS，用于其它溶液，例如Bio-Rad，產(chǎn)品編號(hào)161-0719
在該方法中應(yīng)用以下溶液
(1)裂解緩沖液
7M脲、2M硫脲、4％(w/v)CHAPS、1％(w/V)DTT、0.5％PharmalyteTM pH 3-10
(2)樣品Lp3的溶劑
溶解于2ml裂解緩沖液l的1.5mg Mini Complete溶解于2ml裂解緩沖液的1mg Pefabloc(1∶l v/v)
(3)再水合溶液
6M脲、2M硫脲、4％CHAPS、0.2％DTT、0.2％PharmalyteTM pH3-10、少許溴酚藍(lán)
(4)凝膠溶液(T＝13％，C＝3％)
75g甘油、425mL水、375mL分離膠緩沖液(5)、630mL丙烯酰胺溶液
(5)分離膠緩沖液
將181.66g TRIS、4g SDS溶解于900ml水并且用鹽酸R調(diào)整至pH8.8，用水調(diào)整至體積1000ml
(6)APS-溶液
10％(w/v)過(guò)硫酸銨溶于水
(7)甘油溶液
50％(v/v)甘油溶于水，加入少許溴酚藍(lán)
(8)丁醇，用水飽和
2-丁醇，貯于上面水中
(9)電極緩沖液
19.9g SDS、299.6g甘氨酸、58.0g TRIS溶于20l水
(10)DTT-溶液
1％DTT溶于平衡緩沖液
(11)碘乙酰胺溶液
4％碘乙酰胺溶解于平衡緩沖液
(12)平衡緩沖液
在水中溶解30％甘油、6M脲、4％SDS和33.40mL分離膠緩沖液(5)并將體積調(diào)至1000ml
(13)瓊脂糖溶液
將300mg瓊脂糖和少許溴酚藍(lán)溶解于60ml緩沖液(9)中并煮沸直到溶液變得澄清
(14)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液
將10mg每種蛋白質(zhì)測(cè)試混合物4和5溶解于1mL裂解緩沖液(1)。
通過(guò)加入小量溴酚藍(lán)使溶液染色。蛋白質(zhì)分子量為6.5kDa、12.5kDa、21kDa、29kDa、45kDa、67kDa、97.4kDa。
(15)乙醇/乙酸混合物7％乙酸、10％乙醇
(16)Sypro Ruby溶液，Biorad
(17)考馬斯溶液
一邊攪拌一邊將180mL水和60mL甲醇加入到60mL Roti-Blue-濃縮劑中
Pefabloc SC說(shuō)明書
AEBSF 4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟鹽酸化物；它具有以下特性在TLC中是均質(zhì)的；公式C8H10N02SF×HCl；分子量Mr＝239.5；絲氨酸蛋白酶的特異、有效且不可逆的抑制劑。Pefabloc SC的抑制活性可以與PMSF或DFP相比，然而，它是非毒性的。建議起始濃度是0.1-1.0mg/ml(0.4-4mM)。
Mini Complete說(shuō)明書
Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail Tablet；它具有以下產(chǎn)品描述特異性抑制劑；具有寬抑制特異性的幾種蛋白酶抑制劑混合物。抑制絲氨酸、半胱氨酸和金屬蛋白酶，以及鈣蛋白酶。用于來(lái)自組織或細(xì)胞，包括動(dòng)物、植物、細(xì)菌、酵母和真菌，的提取物。包含可逆的和不可逆的蛋白酶。溶解性/穩(wěn)定性在水性緩沖液中可溶、或者直接加到提取介質(zhì)中。備選地，可在1.5ml水中制備7x貯存液或者100mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0。貯存液在4℃可穩(wěn)定1-2周或者在-20℃穩(wěn)定至少12周。通過(guò)透析能夠去除Complete中的全部抑制劑。推薦使用截止值＞10kDa的膜。Complete能夠在室溫用于含硫醇溶液。建議起始濃度為在10ml水性緩沖液或水中溶解一片片劑。如果存在非常高的蛋白水解活性，7ml緩沖液使用一片片劑。
使用以下裝置或者使用技術(shù)人員已知的適當(dāng)?shù)韧b置進(jìn)行該方法
-超聲器Bandelin electronics，Sonoplus，HD 2070
-再溶脹盤(Reswelling Tray)固定化電解質(zhì)干燥條再溶脹盤用于7-18cm IPG條；產(chǎn)品編號(hào)80-6371-84，Amersham Biosciences
-電泳儀Multiphor II，產(chǎn)品編號(hào)18-1018-06，固定化電解質(zhì)干燥條試劑盒，產(chǎn)品編號(hào)18-1004-30，Amersham Biosciences
-制膠器DALT Multiple Gel Caster，產(chǎn)品編號(hào)80-6330-61，Amersham Biosciences
-灌制盒Dalt Gel Cassette，產(chǎn)品編號(hào)80-6067-27，AmershamBiosciences
-分離片Separator Sheets，產(chǎn)品編號(hào)80-6436-63，AmershamBiosciences
-Hoefer Dalt-分離室IsoDalt凝膠電泳系統(tǒng)ID 440-230V，產(chǎn)品編號(hào)80-6068-98，Amersham Biosciences
-恒溫裝置MultiTemp III恒溫循環(huán)器，產(chǎn)品編號(hào)18-1102-78，Amersham Biosciences
-電泳電源EPS 3501 XL電源，產(chǎn)品編號(hào)18-1130-05，Amersham Biosciences
-熒光掃描儀FLA3000(Raytest)
-ProteomWeaver 2.2(Definiens AG，80339 München，Germany)
(A)樣品制備
將所要檢測(cè)的10mg脫溶胰酶制劑樣品溶解于500μl Lp3。室溫振蕩5分鐘后，離心懸浮液。將澄清的上清液用于測(cè)定蛋白質(zhì)含量(Bradford)。兩種不同的蛋白質(zhì)用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，即磷酸化酶b(來(lái)自兔)和牛碳酸酐酶。在進(jìn)行第一維凝膠分離之前將這些標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)加到樣品中。為了改變澄清上清液的量(5-15μl)，加入2μl內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)溶液1和6.7μl內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)溶液2。
內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)溶液1(磷酸化酶b)的制備
制備磷酸化酶b溶液-通過(guò)在20℃振蕩30分鐘低壓凍干于裂解緩沖液3中(Sigma，目錄號(hào)P-6635)，濃度為1μg/μl。
內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)溶液2(碳酸酐酶)的制備
制備碳酸酐酶溶液-通過(guò)在20℃振蕩30分鐘低壓凍干于裂解緩沖液3中(Sigma，目錄號(hào)P-6403)，濃度為0.03μg/μl。
(B)固定化電解質(zhì)干燥條再水合作用
待切割的IPG條(固定化電解質(zhì)干燥條(T＝4％、C＝2.7％、pH3-10NL)以干燥和冰凍狀態(tài)遞送。使用之前，將條在再溶脹盤內(nèi)再水合過(guò)夜。對(duì)于18cm條，使用350μL再水合溶液(3)。
(C)等電聚焦法(第一維電泳)
(C.1)經(jīng)再水合的固定化電解質(zhì)干燥條的制備
將電聚焦槽的冷卻塊恒溫至20℃。將再水合條浸泡入水中并放置于凝膠上面的水飽和濾紙片(貼附電極用紙)上。用水弄濕第二層濾紙片上，吸干以去除多余的水并將其放置于IPG凝膠條表面。輕輕將它們吸干幾秒鐘以去除多余的再水合溶液。
(C.2)按照以下步驟1-13進(jìn)行本方法
1.將冷卻板放入Multiphor II電泳裝置內(nèi)。將5ml硅油移吸到冷卻板上，隨后將固定化電解質(zhì)干燥條盤放在冷卻板上面。避免盤和冷卻板之間的大氣泡。
2.將盤上的電極鉛連接到Multiphor II裝置。
3.向盤中倒入大約5ml硅油。
4.在油上面將固定化電解質(zhì)條校準(zhǔn)器放入盤內(nèi)。
5.將經(jīng)再水合的IPG凝膠條(凝膠側(cè)面向上且酸性末端朝向陽(yáng)極)轉(zhuǎn)移入盤內(nèi)校準(zhǔn)器的相鄰凹槽內(nèi)。調(diào)整條從而使陽(yáng)極凝膠邊緣排齊。
6.切割兩個(gè)IEF電極條或者從2mm厚濾紙(例如MN 440，Macherey&Nagel，Germany)制備的紙條，使得長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)放于盤中的全部IPG凝膠條的寬度。用水浸泡電極條，通過(guò)用濾紙吸干去除多余水分并將弄濕的IEF電極條放置于陰極和陽(yáng)極附近對(duì)齊的條頂端。
7.放置電極并輕輕向下將它們壓到IEF電極條頂端。
8.將樣品杯放到樣品杯連接桿上。杯在樣品杯連接桿上的位置足夠高以避免接觸到凝膠表面。將樣品杯連接桿放置于一定位置，使得在樣品杯和陽(yáng)極(或者陰極，在陰極點(diǎn)樣的情況下)之間存在幾毫米的距離。
9.將樣品杯移動(dòng)至一定位置，使得每個(gè)IPG凝膠條上面一個(gè)樣品杯，并且最后向下壓樣品杯以保證與每個(gè)條良好接觸。
10.一旦樣品杯放于適當(dāng)位置，將大約50ml硅油倒入盤中從而完全覆蓋IPG凝膠條。如果油漏入樣品杯，吸出油，重新調(diào)整樣品杯并檢查是否再次漏油。用幾滴硅油填滿每個(gè)樣品杯。
11.通過(guò)底層放置將樣品吸至杯內(nèi)，并且再次注意是否漏油。
12.關(guān)閉Multiphor II電泳槽的蓋并按照下面表中給出的參數(shù)(運(yùn)行條件)開始運(yùn)行。對(duì)于對(duì)于改進(jìn)的樣品輸入，電壓限于低電壓(150-300V)電泳最開始的幾個(gè)小時(shí)。然后繼續(xù)保持穩(wěn)定狀態(tài)。
pH 3-10NL運(yùn)行條件
13.當(dāng)IEF運(yùn)行完成后，從盤中取出電極、樣品杯連接條和IEF電極條。使用干凈的鑷子并從盤中取出IPG凝膠條。那些不立即用于第二維電泳運(yùn)行和/或繼續(xù)進(jìn)一步參照的IPG凝膠條在-78℃貯存于兩層塑料薄膜之間可長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月。
(D)灌制凝膠用于第二維電泳(SDS PAGE)
灌制凝膠之前一天，制備1.5L凝膠溶液并除氣和過(guò)濾。將溶液在緊緊密封燒瓶?jī)?nèi)4℃貯存過(guò)夜。使用澆筑漏斗封閉灌制室的貯液槽。加入125ml甘油溶液。灌制之前，立刻在凝膠溶液中一邊攪拌一邊加入75μL TEMED和8ml APS-溶液，并且將凝膠溶液倒入灌制室。全部轉(zhuǎn)移凝膠溶液之后，取出澆筑漏斗并加入貯液槽內(nèi)的甘油溶液。現(xiàn)在將凝膠溶液僅放置于灌制室的灌制盒內(nèi)。立即用丁醇覆蓋凝膠，用水飽和，并且將凝膠聚合三小時(shí)。
(E)第二維電泳(SDS-PAGE)
按照以下步驟1-11進(jìn)行SDS-PAGE操作
1.用電極緩沖液(9)加滿電泳槽并冷卻(13℃)。用少許水覆蓋灌制室中的凝膠直到使用之前。
2.對(duì)于每塊凝膠，使用5μl蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液浸濕濾紙小條。
3.以垂直方向固定SDS凝膠以易于使用第一維IPG條。
4.如下平衡IPG凝膠條
從冰箱中取出聚集的IPG凝膠條并將它們放入各個(gè)測(cè)試管中。加入10ml平衡緩沖液。用Parafilm膜密封測(cè)試管，將它們?cè)趽u動(dòng)器上搖動(dòng)10分鐘，并且然后倒掉平衡緩沖液。如上向測(cè)試管中加入10ml碘乙酰胺溶液并繼續(xù)在搖動(dòng)器上平衡10分鐘。
5.第二次平衡之后，用電極緩沖液漂洗IPG凝膠條幾秒鐘。
6.從凝膠中去除多余水分，將IPG凝膠條和含蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濾紙?jiān)谂赃叿胖糜赟DS凝膠頂端并用熱的凝膠溶液(75℃)覆蓋。使用匙突小心將IPG條壓到SDS凝膠表面以實(shí)現(xiàn)完全接觸。允許瓊脂糖凝固至少5分鐘。對(duì)剩余的IPG條重復(fù)該步驟。
7.將凝膠盒插入電泳儀中并開始電泳。
8.如下表中說(shuō)明運(yùn)行SDS-PAGE凝膠過(guò)夜。步驟1持續(xù)50Vh。
第二維電泳運(yùn)行條件(SDS-PAGE)
9.當(dāng)溴酚藍(lán)示蹤染料已經(jīng)到達(dá)凝膠較低邊緣時(shí)，終止運(yùn)行。
10.用匙突小心打開盒，并還使用匙突從聚丙烯酰胺凝膠中去除瓊脂糖層。
11.從盒固定器上取出凝膠并然后將其浸入水中以從玻璃板中去除凝膠。然后繼續(xù)固定、蛋白質(zhì)染色或印跡。
(F)凝膠固定和染色
分別固定每塊凝膠。用350mL乙醇/乙酸混合物固定30分鐘。使用SyproRuby-溶液(350ml)避光染色3小時(shí)。使用350mL乙醇/乙酸混合物進(jìn)行背景脫色30分鐘，避光。掃描之前，用水洗滌凝膠兩次。如果需要，掃描后用膠體考馬斯亮藍(lán)溶液染膠過(guò)夜。第二天在水中振蕩染色的凝膠。當(dāng)背景幾乎脫色時(shí)，利用可視掃描儀進(jìn)行掃描。
分析性2D凝膠電泳方法評(píng)價(jià)
使用脫溶胰酶制劑獲得的典型2D凝膠顯示于圖1，帶有已鑒定的示蹤斑點(diǎn)。
利用熒光掃描儀FLA3000(Raytest)檢測(cè)所有獲得的2D-凝膠評(píng)價(jià)圖像。將凝膠掃描為16-bit文件，像素大小為100μ。激發(fā)光波長(zhǎng)為473nm。
使用ProteomWeaver 2.2(Definiens)進(jìn)行tiff-文件的評(píng)價(jià)。通過(guò)將圖像排列于適當(dāng)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。然后根據(jù)軟件的算法對(duì)全部凝膠進(jìn)行斑點(diǎn)檢測(cè)。所使用的檢測(cè)設(shè)置為缺省設(shè)置并且對(duì)于凝膠中幾乎全部可見斑點(diǎn)是足夠的。斑點(diǎn)檢測(cè)后，將全部各個(gè)凝膠重新手工檢測(cè)以確信使錯(cuò)誤檢測(cè)降低到最小。當(dāng)斑點(diǎn)檢測(cè)的同時(shí)，通過(guò)軟件進(jìn)行斑點(diǎn)自動(dòng)定量，并且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)量以易于凝膠中不同斑點(diǎn)的斑點(diǎn)鑒定的比較。該標(biāo)準(zhǔn)化過(guò)程不依賴于實(shí)驗(yàn)中凝膠的數(shù)量并且對(duì)于那些在不同時(shí)間點(diǎn)整合入實(shí)驗(yàn)的凝膠都能夠進(jìn)行。然后開始匹配過(guò)程，將相同斑點(diǎn)鑒定分配到整個(gè)凝膠的相同斑點(diǎn)。
此外，使用添加兩種內(nèi)部標(biāo)記蛋白質(zhì)磷酸化酶B和碳酸酐酶的脫溶胰酶制劑所獲得的典型2D凝膠顯示于圖7。標(biāo)準(zhǔn)化、定量和所進(jìn)行的匹配過(guò)程使得能夠?qū)⒁粋€(gè)參照斑點(diǎn)的強(qiáng)度與已知蛋白質(zhì)量的兩個(gè)內(nèi)部標(biāo)記蛋白質(zhì)的強(qiáng)度進(jìn)行比較。在一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明將磷酸化酶B和碳酸酐酶摻入至全部具有特征性且總是恒量的蛋白質(zhì)的樣品(分別為2μg和0.2μg)。已顯示了兩種蛋白質(zhì)在2D-凝膠中表現(xiàn)為不變模式并且不與胰臟樣品現(xiàn)存斑點(diǎn)重疊。碳酸酐酶僅產(chǎn)生一個(gè)單一斑點(diǎn)，磷酸化酶B顯示至少5個(gè)亞型，但是兩種蛋白質(zhì)都能夠進(jìn)行斑點(diǎn)檢測(cè)并因此非常容易進(jìn)行定量。將目的斑點(diǎn)的強(qiáng)度直接與兩種標(biāo)記蛋白質(zhì)的強(qiáng)度相比較導(dǎo)致只要斑點(diǎn)強(qiáng)度在標(biāo)記蛋白質(zhì)強(qiáng)度范圍內(nèi)就可以進(jìn)行絕對(duì)定量。為了獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的結(jié)果，全部凝膠重復(fù)運(yùn)行，至少重復(fù)運(yùn)行三次，并且各組凝膠彼此之間進(jìn)行比較。所得到的斑點(diǎn)平均強(qiáng)度是斑點(diǎn)彼此之間進(jìn)行比較的基礎(chǔ)。
使用MALDI-TOF-MS的RP-HPLC用于胰酶制劑分析的可行性
可行性研究的目的是為了顯示使用MALDI-TOF-MS的RP-HPLC對(duì)于分析胰酶制劑，特別是脫溶胰酶制劑或者胰酶制劑微小微球，的有用性。在以下測(cè)試中，Peptidomics平臺(tái)(BioVisioN AG，Hannover)應(yīng)用于如下面詳細(xì)描述表征脫溶胰酶制劑，包括與HPLC方法特異性相關(guān)的詳細(xì)評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。
作為樣品，兩批胰酶制劑(批1和批2)用于HPLC測(cè)試。樣品必須貯存于5+/-3℃，避免光照和潮濕，例如在密封瓶中，直到這些樣品用于表征鑒定。打開之前，將瓶子調(diào)整至室溫，例如通過(guò)將它們貯存于室溫條件直到完全平衡。
下面描述的HPLC方法用于檢驗(yàn)樣品。按照技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)㈦S后通過(guò)MALDI-TOF-MS表征的樣品分為部分，例如按照Peptidomics平臺(tái)程序。根據(jù)歐洲藥典(Ph.Eur.，2.2.29)進(jìn)行液相層系。
通過(guò)在RP-18反相柱上進(jìn)行梯度HPLC，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，確定脫溶胰酶制劑特征組分(化合物)的蛋白質(zhì)和/或肽模式。按照面積％方法進(jìn)行定量。通常，歐洲藥典試劑由字母R表示，稱重并測(cè)量的數(shù)量使用歐洲藥典(1.，一般注意事項(xiàng))中所標(biāo)明的精確度程度進(jìn)行同量。此外，無(wú)質(zhì)地限制的術(shù)語(yǔ)“水”指去離子水，電阻系數(shù)為NLT 0.18MΩm且TOC為NMT 0.5mg/ml。
以下試劑用于測(cè)試實(shí)驗(yàn)
·用于層析R的乙腈，例如Baker，編號(hào)9017
·三氟乙酸R
·氯化鈉R
·溶劑在1l水中溶解20.00g氯化鈉R(2％NaCl溶液)
以下儀器或等同系統(tǒng)用于測(cè)試實(shí)驗(yàn)
Agilent HPLC裝置由以下組成
·自動(dòng)采樣器G 1313A
·ALSTherm G1330A
·Quat.泵G 1311A
·UV-檢測(cè)器G 1314A
·真空除氣器G 1322A
·HP柱恒溫箱G1316A
·1100控制模塊G 1323A
·LAN-界面35900E
·ChemServer
Heraeus Biofuge 17RS或等同系統(tǒng)。
柱
·類型MODULO O-CART QS UPTISPHERE 5 WRP，Interchim(UP5WRP$15QS)
·固定相RP-18，5.0μm
·管道材料不銹鋼
·長(zhǎng)度150mm
·內(nèi)徑3.0mm
在以下條件下進(jìn)行HPLC測(cè)試
操作模式 梯度HPLC
流動(dòng)相 流動(dòng)相A水/TFA 0.05％(v/V)
流動(dòng)相B乙腈/TFA 0.05％(v/v)
梯度
流率 1.0ml/分鐘
分析期 95分鐘
溫度 27±2.0℃
注射體積 10μl
自動(dòng)采樣器溫度 4℃±1℃
通過(guò)UV-檢測(cè)器在214nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。
測(cè)定制劑
在30ml燒杯中稱量將用于檢測(cè)的大約80.0mg脫溶胰酶制劑。對(duì)于胰酶制劑包有腸溶衣的微小微球體的檢測(cè)，之前微小微球體必須研磨并且稱重140mg粉末。在＜4℃，15分鐘內(nèi)一邊攪拌一邊將樣品溶解于10ml冰冷的溶劑。離心溶液(對(duì)于Heraeus Biofuge 17RS，應(yīng)用8ml、10min、15000U/min、4℃)。作為樣品溶液注射入澄清上清液。在開始該順序之前必須立即新鮮制備樣品制劑。
性能
通過(guò)使用上述RP-HPLC方法已經(jīng)檢測(cè)了不同批次脫溶胰酶制劑及其制品。已經(jīng)將選擇性最適化以在適當(dāng)運(yùn)行時(shí)間內(nèi)獲得最大數(shù)量的峰。使用胰酶制劑批次1獲得的典型層析圖描述于圖8-11和表J和K。
表J和K的內(nèi)容
表J胰酶制劑斑點(diǎn)鑒定的數(shù)據(jù)(參見圖11)鑒定20+
表K胰酶制劑斑點(diǎn)鑒定的數(shù)據(jù)(參見圖11)鑒定20+X
圖8-11的內(nèi)容
圖8脫溶胰酶制劑的典型層析圖，批次1，
圖9脫溶胰酶制劑的典型層析圖(0-14分鐘)，批次1
圖10脫溶胰酶制劑的典型層析圖(60-90分鐘)，批次1
圖11脫溶胰酶制劑的注解RP-HPLC層析圖(分鐘35)，批次1
關(guān)于峰特異性和鑒定的評(píng)價(jià)，已經(jīng)試圖將LC連接至ESI-MS但信號(hào)會(huì)重疊。因此，通過(guò)應(yīng)用Peptidomics技術(shù)，檢測(cè)了脫溶胰酶制劑樣品。將層析圖自動(dòng)分割為96份，每份對(duì)應(yīng)大約55.1秒的運(yùn)行時(shí)間。然后，自動(dòng)用吸量管將各份與目標(biāo)板上的芥子酸基質(zhì)移吸到一起。自動(dòng)化定位后使用多重解吸作用和電離作用將每個(gè)單一斑點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS。
所考慮的目的質(zhì)量范圍覆蓋1-大約60,000。根據(jù)使用單一m/z信號(hào)定量的Peptidomics技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)程序可以可視化該范圍。將m/z基礎(chǔ)與相應(yīng)組分和最初層析圖一起建立文件。
表A從2D-GE中鑒定點(diǎn)的NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的登錄號(hào)(參見圖1)
表A續(xù)表
表B第1批胰酶的點(diǎn)強(qiáng)度(t＝0和16天)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差點(diǎn)對(duì)t0天的調(diào)節(jié)
10＝在研究中沒(méi)有變化，+＝增加，-＝強(qiáng)度降低
表C第1批胰酶的點(diǎn)強(qiáng)度(t＝0和16天)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差點(diǎn)對(duì)t0天的調(diào)節(jié)
20＝在研究中沒(méi)有變化，+＝增加，-＝強(qiáng)度降低
表D第1批胰酶的點(diǎn)強(qiáng)度(32天)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差點(diǎn)對(duì)t0天的調(diào)節(jié)
30＝在研究中沒(méi)有變化，+＝增加，-＝強(qiáng)度降低
表E第1批胰酶的點(diǎn)強(qiáng)度(t＝32天)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差點(diǎn)對(duì)t0天的調(diào)節(jié)
40＝在研究中沒(méi)有變化，+＝增加，-＝強(qiáng)度降低
表F第2批胰酶的點(diǎn)強(qiáng)度(t＝0和15天)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差點(diǎn)對(duì)t0天的調(diào)節(jié)
5降解0＝在研究中沒(méi)有變化，+＝增加，-＝強(qiáng)度降低
表G第2批胰酶的點(diǎn)強(qiáng)度(t＝0和15天)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差點(diǎn)對(duì)t0天的調(diào)節(jié)
6降解0＝在研究中沒(méi)有變化，+＝增加，-＝強(qiáng)度降低
表H第2批胰酶的點(diǎn)強(qiáng)度(t＝32天)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差點(diǎn)對(duì)t0天的調(diào)節(jié)
70＝在研究中沒(méi)有變化，+＝增加，-＝強(qiáng)度降低
表I第2批胰酶的點(diǎn)強(qiáng)度(t＝32天)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差點(diǎn)對(duì)t0天的調(diào)節(jié)
80＝在研究中沒(méi)有變化，+＝增加，-＝強(qiáng)度降低
表J胰酶鑒定的資料(參見圖11)鑒定20+
表K胰酶鑒定的資料(參見圖11)鑒定20+X
權(quán)利要求
1.用于包含生理可按受的具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的消化酶混合物的蛋白質(zhì)樣品的特征和/或技術(shù)指標(biāo)的分析方法，其中該方法通過(guò)二維凝膠電泳使用于用于治療疾病和/或失調(diào)的藥物制劑的制造，所述方法包括
(a)通過(guò)將酶混合物樣品溶解于用于凝膠電泳的溶劑組合物中進(jìn)行樣品分離，其中溶劑組合物包含適于溶解蛋白質(zhì)材料的特定的溶劑、用于定量蛋白質(zhì)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)和蛋白酶抑制試劑；
(b)使用等電聚焦步驟界定第一維凝膠電泳并且應(yīng)用梯度分離蛋白質(zhì)級(jí)分；
(c)隨后的包含重新溶于緩沖液的預(yù)處理步驟；
(d)轉(zhuǎn)移至第二維并且通過(guò)SDS-PAGE分離；
(e)對(duì)來(lái)自步驟(d)的凝膠進(jìn)行固定和染色；和
(f)通過(guò)熒光掃描進(jìn)行光密度測(cè)量法評(píng)價(jià)。
2.依照權(quán)利要求1的分析方法，其中微生物合成的脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶的混合物用作酶混合物。
3.依照權(quán)利要求1的分析方法，其中胰酶制劑和/或胰酶制劑樣混合物酶用作酶混合物。
4.依照權(quán)利要求3的分析方法，其中該方法應(yīng)用于胰酶制劑樣品，所述的胰酶制劑樣品是脫溶的胰酶制劑或胰酶制劑微小微球體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的分析方法，其中在步驟(a)中使用的溶解樣品的溶劑是7M尿素、2M硫脲、4％(w/v)CHAPS、1％(w/v)DTT和0.5％Pharmalyte，pH3-10的裂解緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的分析方法，其中在步驟(a)中使用的用于蛋白質(zhì)定量的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)是磷酸化酶B，優(yōu)選兔磷酸化B或者碳酸酐酶，優(yōu)選牛碳酸酐酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的分析方法，其中蛋白酶抑制試劑是MiniComplete和/或Pefabloc。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的分析方法，其中在步驟(a)中使用的溶解樣品的溶劑是由溶解于2ml的7M尿素、2M硫脲、4％(w/v)CHAPS、1％(w/v)DTT和0.5％Pharmalyte，pH3-10的裂解緩沖液中的1.5mgMini Complete的Lp3和溶解于2ml裂解緩沖液中的1mg的Pefabloc以1∶1v/v的比率組成。
9.依照權(quán)利要求1的分析方法，其中所述方法應(yīng)用于對(duì)具有分子量大于大約8kD的蛋白質(zhì)和/或肽組分進(jìn)行表征和定量。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的分析方法，其包括鑒定胰酶制劑，優(yōu)選脫溶胰酶制劑樣品或胰酶制劑微小微球體樣品的同一性和/或蛋白質(zhì)和/或肽模式。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的分析方法，其包括使用MALDI-TOF-MS鑒定蛋白質(zhì)和/或肽的斑點(diǎn)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-10任意一項(xiàng)所述的分析方法，其中所述方法作為確定胰酶制劑，優(yōu)選脫溶胰酶制劑樣品或胰酶制劑微小微球體樣品的同一性和/或蛋白質(zhì)和/或肽模式以及雜質(zhì)和/或降解物存在的應(yīng)激或穩(wěn)定性測(cè)試來(lái)進(jìn)行，并且任選地還包括所述蛋白質(zhì)、肽、雜質(zhì)和/或降解物的定量。
13.依照權(quán)利要求9的分析方法，該方法還包括通過(guò)RP-HPLC表征和定量具有分子量小于大約8kD的低分子量蛋白質(zhì)和/或肽級(jí)分。
14.溶劑組合物，其中溶劑組合物適于包含生理可接受的具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的消化酶混合物的蛋白質(zhì)的特征和/或技術(shù)指標(biāo)，其中該溶劑組合物在通過(guò)二維凝膠電泳制造用于治療疾病和/或失調(diào)的藥物制劑中使用，所述溶劑組合物包含
(a)適于凝膠電泳和溶解蛋白質(zhì)材料的溶劑，其為7M尿素、2M硫脲、4％(w/v)CHAPS、1％(w/v)DTT和0.5％Pharmalyte，pH3-10的裂解緩沖液；
(b)用于定量蛋白質(zhì)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)；和
(c)蛋白酶抑制試劑。
15.如權(quán)利要求14所述的溶劑組合物，其中溶解樣品的溶劑是由溶解于2ml的7M尿素、2M硫脲、4％(w/v)CHAPS、1％(w/v)DTT和0.5％Pharmalyte，pH3-10的裂解緩沖液中的1.5mg MiniComplete的Lp3和溶解于2ml裂解緩沖液中的1mg的Pefabloc以1∶1v/v的比率組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及分析樣品同一性、蛋白質(zhì)和/或肽模式以及穩(wěn)定性的新方法，樣品含有具有脂肪水解、蛋白水解和淀粉分解活性的生理可接受酶混合物，但特別是消化酶如胰酶制劑的混合物，特別是在包含所述酶混合物的藥用產(chǎn)品的制造方面，例如脫溶胰酶制劑或者胰酶制劑微小微球體。
文檔編號(hào)C12N9/94GK1809753SQ200480017430
公開日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2004年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月29日
發(fā)明者A·波特霍夫, A·克爾納, B·圖姆貝克 申請(qǐng)人:索爾瓦藥物有限公司