一種奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種動物組織蛋白的提取方法，具體是涉及一種奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法。將奶牛瘤胃上皮組織樣品置于預(yù)冷的研缽中，添加液氮并研磨至粉末，加入預(yù)冷三氯乙酸的丙酮溶液，振蕩渦旋混勻放置過夜，離心收集沉淀；凍干該組織沉淀，再加入裂解液，孵育并間隔渦旋，離心收集上清液，即奶牛瘤胃上皮組織總蛋白。本發(fā)明的方法所提取的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白可采用二維凝膠電泳技術(shù)將總蛋白混合物依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量分離，同時獲取了蛋白質(zhì)的相對豐度，可在凝膠圖譜中清楚直觀的呈現(xiàn)每個蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量以及相對表達(dá)量，具有比高效液相色譜分離方法、酶聯(lián)免疫法和免疫印跡等傳統(tǒng)技術(shù)更明顯的整體性和可視化的優(yōu)勢。
【專利說明】一種奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及ー種動物組織蛋白的提取方法，具體是ー種奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]瘤胃是反芻動物特有的消化器官，是其進(jìn)行微生物消化和物理消化的主要場所。瘤胃上皮的發(fā)育和功能完善直接影響到反芻動物的生產(chǎn)性能，并有“健康瘤胃，健康奶?！钡膶W(xué)術(shù)觀點(diǎn)。
[0003]瘤胃上皮由復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞組成，共分為四層，從漿膜層向粘膜層方向依次為:基底層、棘層、顆粒層和角質(zhì)層。蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展為深入了解瘤胃上皮組織在日糧營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收中發(fā)揮的作用提供了ー種有力的研究工具。蛋白質(zhì)組學(xué)是全面整體性的掲示ー個生物樣本表達(dá)的全部蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)間相互作用的科學(xué)領(lǐng)域。
[0004]雙向凝膠電泳因其能夠在凝膠中直觀的呈現(xiàn)ー個復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中每個蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量和相對表達(dá)量信息，以及蛋白質(zhì)存在的翻譯后修飾。目前仍在蛋白質(zhì)組研究中得到廣泛應(yīng)用。
[0005]然而，因瘤胃上皮組織的復(fù)雜性，導(dǎo)致對于瘤胃上皮組織相關(guān)的蛋白質(zhì)組研究相對滯后。蛋白質(zhì)組學(xué)研究中蛋白質(zhì)樣品的制備最為關(guān)鍵。適合雙向凝膠電泳分離的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法在瘤胃上皮功能研究中具有重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法，該方法所提取的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白可采用二維凝膠電泳技術(shù)將總蛋白混合物依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量分離，同時獲取了蛋白質(zhì)的相對豐度，可在凝膠圖譜中清楚直觀的呈現(xiàn)每個蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量以及相對表達(dá)量，具有比高效液相色譜分離方法、酶聯(lián)免疫法和免疫印跡等傳統(tǒng)技術(shù)更明顯的整體性和可視化的優(yōu)勢。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法，包括如下步驟:
[0008]I)、將奶牛瘤胃上皮組織樣品置于預(yù)冷的研缽中，添加液氮并研磨至粉末，將該組織粉末移至離心管中；
[0009]2)、在離心管中加入預(yù)冷的3~5倍組織粉末體積的10%三氯こ酸的丙酮溶液，振蕩渦旋混勻后_20°C放置過夜，離心棄去液相部分，收集沉淀A ；
[0010]3)、向該組織沉淀A中加入其3~5倍體積的80%冷丙酮溶液，充分渦旋振蕩，-20°C放置0.5~2h，然后離心棄去液相部分，收集沉淀B ；
[0011]4)、凍干該組織沉淀B，再加入等體積的裂解液，于4°C孵育并間隔渦旋20~40min，離心收集上清液，即奶牛瘤胃上皮組織總蛋白。
[0012]優(yōu)選的，所述的離心處理均是經(jīng)1000OXg離心15min。[0013]優(yōu)選的，所述步驟4)中的裂解液中含有8mol / L尿素、2mol / L硫脲、4% CHAPS、IOOmmol / L Triton X-100 和 65mmol / L 二硫蘇糖醇。
[0014]一種如上述提取方法所提取的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的應(yīng)用，可采用二維凝膠電泳技術(shù)將總蛋白混合物依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量分離。
[0015]進(jìn)一步的，具體包括如下步驟:
[0016]①、等電聚焦電泳分離
[0017]取580~620 U g瘤胃上皮組織總蛋白樣品與水化上樣緩沖液混合均勻，使蛋白溶液的終體積為340~360 ii L ;
[0018]離心并將蛋白溶液緩慢的加入到等電聚焦的電泳槽內(nèi)，同時將預(yù)制的170mmPH3-10膠條室溫放置5~15min，剝離膠條表明覆蓋的保護(hù)層，將膠條膠面朝下置入等電聚焦的電泳槽中，滴加礦物油后置于等電聚焦電泳儀中進(jìn)行第一向等電聚焦；
[0019]②、膠條平衡
[0020]等電聚焦電泳結(jié)束后，用超純水反復(fù)沖洗膠條，用濾紙吸干，然后將膠條面朝上置于膠條平衡緩沖液I中，搖床輕微振蕩10~20min，然后置膠條于平衡緩沖液II中，搖床輕微振蕩10~20min，平衡結(jié)束后用超純水反復(fù)沖洗膠條，用濾紙吸干；
[0021]③、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離
[0022]灌制12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，室溫放置3~5h，將膠條支持膜貼在長玻璃板上，并置于SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，在凝膠上方加入0.5%的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，輕推膠條使膠條與聚丙烯酰胺凝膠膠面緊密 結(jié)合，且無氣泡；進(jìn)行第二向電泳分離，起始電壓50V電泳0.5h，之后200V電泳至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠底部時停止電泳，切角標(biāo)記；
[0023]④、凝膠染色及圖像掃描
[0024]聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠放置在含40%乙醇和10%乙酸的固定液中固定2.5~3.5h，用去離子水漂洗凝膠；將凝膠置于考馬斯亮藍(lán)G-250溶液中染色15~20h，凝膠用蒸餾水漂洗至背景清晰，再用掃描儀掃描。
[0025]優(yōu)選的，所述水化上樣緩沖液中8mol / L尿素、2mol / L硫脲、4% CHAPS、65mmol / L 二硫蘇糖醇、0.5%兩性電解質(zhì)溶液和痕量溴酚藍(lán)。
[0026]優(yōu)選的，所述等電聚焦電泳的條件為:水化和等電聚焦溫度均為20°C，主動水化12h，250V快速電泳lh、1000V線性電泳lh、9000V線性電泳5h，至電壓升至9000V時穩(wěn)壓聚焦 80000Vh。
[0027]優(yōu)選的，所述膠條平衡緩沖液I中含有6mol / L尿素、2 % SDS、0.375mol /LpH8.8Tris-HCl緩沖液、20%甘油和2.0%二硫蘇糖醇；所述膠條平衡緩沖液II中含有6mol / L尿素、2%SDS、0.375mol / L pH8.8Tris_HCl 緩沖液、20%甘油和 2.5%碘乙酰胺。
[0028]本發(fā)明的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白提取的方法，是從上皮組織樣品總蛋白的制備入手，增加了樣品制備過程中脂類物質(zhì)除去(通過三氯乙酸的丙酮溶液除去脂類物質(zhì))等步驟，使提取的總蛋白質(zhì)樣品在其后的等電聚焦電泳過程中減少了非蛋白質(zhì)類物質(zhì)的干擾，有利于瘤胃組織上皮組織總蛋白在等電聚焦和聚丙烯酰胺凝膠電泳過程中有效分離。同時，本發(fā)明采用雙向凝膠電泳技術(shù)將瘤胃上皮組織總蛋白混合物依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量分離，并獲取了蛋白質(zhì)的相對豐度，可在凝膠圖譜中清楚直觀的呈現(xiàn)每個蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量以及相對表達(dá)量，具有比高效液相色譜分離方法、酶聯(lián)免疫法和免疫印跡等傳統(tǒng)技術(shù)更明顯的整體性和可視化的優(yōu)勢。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1是奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的凝膠圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0030]為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，下面結(jié)合附圖以及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步的說明。
[0031]實(shí)施例1
[0032]一、瘤胃上皮組織總蛋白樣品的提取
[0033]I)、分離奶牛瘤胃上皮組織，用無菌手木刀切成小塊，置于預(yù)冷的研缽中，添加液氮并研磨至粉末，將該組織粉末移至離心管中。
[0034]2)、在離心管中加入預(yù)冷的4倍組織粉末體積的10%三氯こ酸的丙酮溶液(每IL丙酮中含有0.1kg三氯こ酸)，振蕩渦旋混勻后-20°C放置過夜，然后經(jīng)1000OXg離心15min,棄去液相部分,收集沉淀A。
[0035]3)、向該組織沉淀A中加入其4倍體積的80%冷丙酮溶液(每IL溶液中含有0.8L丙酮、0.2L水)，充分渦旋振蕩，-20°C放置lh，然后經(jīng)10000 Xg離心15min，棄去液相部分，收集沉淀B。
[0036]4)、凍干該組織沉淀B，加入等體積的裂解液，裂解液中含有8mol / L尿素、2mol / L硫脲、4% (重量比)CHAPS(3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽)、IOOmmol / L Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)和65mmol / L 二硫蘇糖醇。
[0037]于4°C孵育并間隔渦旋30min，經(jīng)15000 X g離心15min，收集上清液，即奶牛瘤胃上皮組織總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定組織總蛋白濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。
[0038]二、雙向凝膠電泳分離
[0039]I)、等電聚焦電泳分離
[0040]取600 U g瘤胃上皮組織總蛋白樣品與水化上樣緩沖液混合均勻，使蛋白溶液的終體積為350iiL，水化上樣緩沖液中8mol / L尿素、2mol / L硫脲、4% CHAPS、65mmol /L 二硫蘇糖醇、0.5%兩性電解質(zhì)溶液和痕量溴酚藍(lán)。
[0041]離心并將蛋白溶液緩慢的加入到等電聚焦的電泳槽內(nèi)，同時將預(yù)制的170mmPH3-10膠條室溫放置lOmin，剝離膠條表明覆蓋的保護(hù)層，將膠條膠面朝下置入等電聚焦的電泳槽中，滴加礦物油后置于等電聚焦電泳儀中進(jìn)行第一向等電聚焦。
[0042]設(shè)置水化和等電聚焦溫度均為20°C，主動水化12h，250V快速電泳lh、1000V線性電泳lh、9000V線性電泳5h，至電壓升至9000V時穩(wěn)壓聚焦80000Vh。
[0043]2)、膠條平衡
[0044]等電聚焦電泳結(jié)束后，用超純水反復(fù)沖洗膠條，用濾紙吸干，然后將膠條面朝上置于膠條平衡緩沖液I中，搖床輕微振蕩15min，然后置膠條于平衡緩沖液II中，搖床輕微振蕩15min，平衡結(jié)束后用超純水反復(fù)沖洗膠條，用濾紙吸干。
[0045]膠條平衡緩沖液I中含有6mol / L尿素、2% SDS (十二烷基硫酸鈉)、0.375mol /L pH8.8Tris-HCl緩沖液、20%甘油和2.0%二硫蘇糖醇。
[0046]膠條平衡緩沖液II 中含有 6mol / L 尿素、2% SDS,0.375mol / L pH8.8Tris-HCl緩沖液、20%甘油和2.5%碘乙酰胺。
[0047]3)、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離
[0048]灌制12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，室溫放置4h，將膠條支持膜貼在長玻璃板上，并置于SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，在凝膠上方加入0.5% (重量比)的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，輕推膠條使膠條與聚丙烯酰胺凝膠膠面緊密結(jié)合，且無氣泡。
[0049]進(jìn)行第二向電泳分離，起始電壓50V電泳0.5h，之后200V電泳至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠底部時停止電泳，切角標(biāo)記。
[0050]三、凝膠染色及圖像掃描
[0051]聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠放置在含40%乙醇(體積比)和10%乙酸(體積比)的固定液中固定3h，用去離子水漂洗凝膠2次，每次5min。
[0052]將凝膠置于考馬斯亮藍(lán)G-250溶液(0.12%考馬斯亮藍(lán)G-250、10%硫酸銨、10%磷酸和20%甲醇)中染色16h以上。凝膠用蒸餾水漂洗4次，至背景清晰，選用256階灰度掃描方式，分辨率300dpi條件下透射掃描，凝膠經(jīng)雙向電泳圖像軟件分析表明，凝膠中蛋白點(diǎn)形態(tài)良好、輪廓清晰(如圖1所示)。
[0053]實(shí)施例2
[0054]一、瘤胃上·皮組織總蛋白樣品的提取
[0055]I)、分離奶牛瘤胃上皮組織，用無菌手術(shù)刀切成小塊，置于預(yù)冷的研缽中，添加液氮并研磨至粉末，將該組織粉末移至離心管中。
[0056]2)、在離心管中加入預(yù)冷的5倍組織粉末體積的10%三氯乙酸的丙酮溶液，振蕩渦旋混勻后_20°C放置過夜，然后經(jīng)1000OXg離心15min，棄去液相部分，收集沉淀A。
[0057]3)、向該組織沉淀A中加入其5倍體積的80%冷丙酮溶液，充分渦旋振蕩，-20°C放置2h，然后經(jīng)10000 Xg離心15min，棄去液相部分，收集沉淀B。
[0058]4)、凍干該組織沉淀B，加入等體積的裂解液，裂解液中含有8mol / L尿素、2mol / L 硫服、4% CHAPS、IOOmmol / L Triton X-100 和 65mmol / L 二硫蘇糖醇。
[0059]于4°C孵育并間隔渦旋40min，經(jīng)15000 X g離心15min，收集上清液，即奶牛瘤胃上皮組織總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定組織總蛋白濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。
[0060]二、雙向凝膠電泳分離
[0061]I)、等電聚焦電泳分離
[0062]取620 U g瘤胃上皮組織總蛋白樣品與水化上樣緩沖液混合均勻，使蛋白溶液的終體積為360iiL，水化上樣緩沖液中8mol / L尿素、2mol / L硫脲、4% CHAPS、65mmol /L 二硫蘇糖醇、0.5%兩性電解質(zhì)溶液和痕量溴酚藍(lán)。
[0063]離心并將蛋白溶液緩慢的加入到等電聚焦的電泳槽內(nèi)，同時將預(yù)制的170mmPH3-10膠條室溫放置15min，剝離膠條表明覆蓋的保護(hù)層，將膠條膠面朝下置入等電聚焦的電泳槽中，滴加礦物油后置于等電聚焦電泳儀中進(jìn)行第一向等電聚焦。
[0064]設(shè)置水化和等電聚焦溫度均為20°C，主動水化12h，250V快速電泳lh、1000V線性電泳lh、9000V線性電泳5h，至電壓升至9000V時穩(wěn)壓聚焦80000Vh。[0065]2)、膠條平衡
[0066]等電聚焦電泳結(jié)束后，用超純水反復(fù)沖洗膠條，用濾紙吸干，然后將膠條面朝上置于膠條平衡緩沖液I中，搖床輕微振蕩20min，然后置膠條于平衡緩沖液II中，搖床輕微振蕩20min，平衡結(jié)束后用超純水反復(fù)沖洗膠條，用濾紙吸干。
[0067]膠條平衡緩沖液I 中含有 6mol / L 尿素、2% SDS、0.375mol / L pH8.8Tris_HCl緩沖液、20%甘油和2.0%二硫蘇糖醇。
[0068]膠條平衡緩沖液II 中含有 6mol / L 尿素、2% SDS,0.375mol / L pH8.8Tris_HCl緩沖液、20%甘油和2.5%碘こ酰胺。
[0069]3)、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離
[0070]灌制12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，室溫放置5h，將膠條支持膜貼在長玻璃板上，并置于SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，在凝膠上方加入0.5 %的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，輕推膠條使膠條與聚丙烯酰胺凝膠膠面緊密結(jié)合，且無氣泡。
[0071]進(jìn)行第二向電泳分離，起始電壓50V電泳0.5h，之后200V電泳至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠底部時停止電泳，切角標(biāo)記。
[0072]三、凝膠染色及圖像掃描
[0073]聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠放置在含40%こ醇和10%こ酸的固定液中固定3.5h，用去離子水漂洗凝膠2次，每次5min。
[0074]將凝膠置于考馬斯亮藍(lán)G-250溶液中染色20h。凝膠用蒸餾水漂洗3次，至背景清晰，選用256階灰度掃描方式，分辨率300dpi條件下透射掃描，凝膠經(jīng)雙向電泳圖像軟件分析表明，凝膠中蛋白點(diǎn)形態(tài)良好、輪廓清晰(近似于圖1所示)。
[0075]實(shí)施例3
[0076]一、瘤胃上皮組織總蛋白樣品的提取
[0077]I)、分離奶牛瘤胃上皮組織，用無菌手木刀切成小塊，置于預(yù)冷的研缽中，添加液氮并研磨至粉末，將該組織粉末移至離心管中。
[0078]2)、在離心管中加入預(yù)冷的3倍組織粉末體積的10%三氯こ酸的丙酮溶液，振蕩渦旋混勻后_20°C放置過夜，然后經(jīng)1000OXg離心15min，棄去液相部分，收集沉淀A。
[0079]3)、向該組織沉淀A中加入其3倍體積的80%冷丙酮溶液，充分渦旋振蕩，-20 °C放置0.5h，然后經(jīng)10000 Xg離心15min，棄去液相部分，收集沉淀B。
[0080]4)、凍干該組織沉淀B，加入等體積的裂解液，裂解液中含有8mol / L尿素、2mol / L 硫服、4% CHAPS、IOOmmol / L Triton X-100 和 65mmol / L 二硫蘇糖醇。
[0081]于4°C孵育并間隔渦旋20min，經(jīng)15000Xg離心15min，收集上清液，即奶牛瘤胃上皮組織總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定組織總蛋白濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。
[0082]二、雙向凝膠電泳分離
[0083]I)、等電聚焦電泳分離
[0084]取580 U g瘤胃上皮組織總蛋白樣品與水化上樣緩沖液混合均勻，使蛋白溶液的終體積為340ii tL，水化上樣緩沖液中8mol / L尿素、2mol / L硫脲、4% CHAPS、65mmol /L 二硫蘇糖醇、0.5%兩性電解質(zhì)溶液和痕量溴酚藍(lán)。
[0085]離心并將蛋白溶液緩慢的加入到等電聚焦的電泳槽內(nèi)，同時將預(yù)制的170mmPH3-10膠條室溫放置5min，剝離膠條表明覆蓋的保護(hù)層，將膠條膠面朝下置入等電聚焦的電泳槽中，滴加礦物油后置于等電聚焦電泳儀中進(jìn)行第一向等電聚焦。
[0086]設(shè)置水化和等電聚焦溫度均為20°C，主動水化12h，250V快速電泳lh、1000V線性電泳lh、9000V線性電泳5h，至電壓升至9000V時穩(wěn)壓聚焦80000Vh。
[0087]2)、膠條平衡
[0088]等電聚焦電泳結(jié)束后，用超純水反復(fù)沖洗膠條，用濾紙吸干，然后將膠條面朝上置于膠條平衡緩沖液I中，搖床輕微振蕩lOmin，然后置膠條于平衡緩沖液II中，搖床輕微振蕩lOmin，平衡結(jié)束后用超純水反復(fù)沖洗膠條，用濾紙吸干。
[0089]膠條平衡緩沖液I 中含有 6mol / L 尿素、2% SDS、0.375mol / L pH8.8Tris-HCl緩沖液、20%甘油和2.0%二硫蘇糖醇。
[0090]膠條平衡緩沖液II 中含有 6mol / L 尿素、2% SDS,0.375mol / L pH8.8Tris-HCl緩沖液、20%甘油和2.5%碘乙酰胺。
[0091]3)、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離
[0092]灌制12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，室溫放置3h，將膠條支持膜貼在長玻璃板上，并置于SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，在凝膠上方加入0.5 %的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，輕推膠條使膠條與聚丙烯酰胺凝膠膠面緊密結(jié)合，且無氣泡。
[0093]進(jìn)行第二向電泳分離，起始電壓50V電泳0.5h，之后200V電泳至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠底部時停止電泳， 切角標(biāo)記。
[0094]三、凝膠染色及圖像掃描
[0095]聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠放置在含40%乙醇和10%乙酸的固定液中固定2.5h，用去離子水漂洗凝膠2次，每次5min。
[0096]將凝膠置于考馬斯亮藍(lán)G-250溶液中染色15h。凝膠用蒸餾水漂洗3次，至背景清晰，選用256階灰度掃描方式，分辨率300dpi條件下透射掃描，凝膠經(jīng)雙向電泳圖像軟件分析表明，凝膠中蛋白點(diǎn)形態(tài)良好、輪廓清晰(近似于圖1所示)。
[0097]以上內(nèi)容僅僅是對本發(fā)明的構(gòu)思所作的舉例和說明，所屬本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員對所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，只要不偏離發(fā)明的構(gòu)思或者超越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步驟： 1)、將奶牛瘤胃上皮組織樣品置于預(yù)冷的研缽中，添加液氮并研磨至粉末，將該組織粉末移至離心管中； 2)、在離心管中加入預(yù)冷的3~5倍組織粉末體積的10%三氯乙酸的丙酮溶液，振蕩渦旋混勻后_20°C放置過夜，離心棄去液相部分，收集沉淀A ； 3)、向該組織沉淀A中加入其3~5倍體積的80%冷丙酮溶液，充分渦旋振蕩，-200C放置0. 5~2h，然后離心棄去液相部分，收集沉淀B ； 4)、凍干該組織沉淀B，再加入等體積的裂解液，于4°C孵育并間隔渦旋20~40min，離心收集上清液，即奶牛瘤胃上皮組織總蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法，其特征在于，所述的離心處理均是經(jīng)1000OXg離心15min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法，其特征在于，所述步驟4)中的裂解液中含有8mol / L尿素、2mol / L硫脲、4% CHAPS、IOOmmol / L TritonX-100和65mmol / L 二硫蘇糖醇。
4.一種如權(quán)利要求1或2或3所述提取方法所提取的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的應(yīng)用，其特征在于：可采用二維凝膠電泳技術(shù)將總蛋白混合物依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量分離。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的應(yīng)用，其特征在于：具體包括如下步驟： ①、等電聚焦電泳分離 取580~620 u g瘤胃上皮組織總蛋白樣品與水化上樣緩沖液混合均勻，使蛋白溶液的終體積為340~360 ii L ; 離心并將蛋白溶液緩慢的加入到等電聚焦的電泳槽內(nèi)，同時將預(yù)制的170mm pH3-10膠條室溫放置5~15min，剝離膠條表明覆蓋的保護(hù)層，將膠條膠面朝下置入等電聚焦的電泳槽中，滴加礦物油后置于等電聚焦電泳儀中進(jìn)行第一向等電聚焦； ②、膠條平衡 等電聚焦電泳結(jié)束后，用超純水反復(fù)沖洗膠條，用濾紙吸干，然后將膠條面朝上置于膠條平衡緩沖液I中，搖床輕微振蕩10~20min，然后置膠條于平衡緩沖液II中，搖床輕微振蕩10~20min，平衡結(jié)束后用超純水反復(fù)沖洗膠條，用濾紙吸干； ③、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 灌制12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，室溫放置3~5h，將膠條支持膜貼在長玻璃板上，并置于SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，在凝膠上方加入0. 5%的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，輕推膠條使膠條與聚丙烯酰胺凝膠膠面緊密結(jié)合，且無氣泡；進(jìn)行第二向電泳分離，起始電壓50V電泳0. 5h，之后200V電泳至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠底部時停止電泳，切角標(biāo)記； ④、凝膠染色及圖像掃描 聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠放置在含40%乙醇和10%乙酸的固定液中固定2.5~3. 5h，用去離子水漂洗凝膠；將凝膠置于考馬斯亮藍(lán)G-250溶液中染色15~20h，凝膠用蒸餾水漂洗至背景清晰，再用掃描儀掃描。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的應(yīng)用，其特征在于，所述水化上樣緩沖液中8mol / L尿素、2mol / L硫脲、4% CHAPS、65mmol / L 二硫蘇糖醇、0.5%兩性電解質(zhì)溶液和痕量溴酚藍(lán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的應(yīng)用，其特征在于，所述等電聚焦電泳的條件為:水化和等電聚焦溫度均為20°C，主動水化12h，250V快速電泳IhUOOOV線性電泳lh、9000V線性電泳5h，至電壓升至9000V時穩(wěn)壓聚焦80000Vh。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的應(yīng)用，其特征在于，所述膠條平衡緩沖液I中含有6mol / L尿素、2% SDS、0.375mol / L pH8.8Tris_HCl緩沖液、20%甘油和2.0%二硫蘇糖醇；所述膠條平衡緩沖液II中含有6m01 / L尿素、2% SDS,0.375mol /LpH8.8Tris-HCl緩沖液、20%甘油和2.5%碘こ酰胺。
【文檔編號】C07K1/30GK103570801SQ201310586576
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】楊永新, 趙小偉, 程廣龍, 黃冬維, 趙輝玲 申請人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所