專利名稱：黃麻根系總蛋白雙向電泳方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黃麻的根系總蛋白雙向電泳方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。是能夠在
沿海灘涂大面積生長(zhǎng)的黃麻根系的蛋白質(zhì)組分離，該方法可直接應(yīng)用于能夠在沿海灘涂生 存的高耐鹽植物研究開發(fā)利用。
背景技術(shù)：
抗逆性是植物在系統(tǒng)進(jìn)化過(guò)程中，為適應(yīng)不良環(huán)境獲得的一種對(duì)策。在植物的生 存環(huán)境中一些非生物因子脅迫，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生存都會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，為了應(yīng)對(duì) 外界環(huán)境的不利影響，植物在進(jìn)化過(guò)程中形成了完整的防御機(jī)制。為了解析其防御機(jī)制就 勢(shì)必需要分離一些與逆境相關(guān)的蛋白質(zhì)。 黃麻(0rchorus olitorius L.)又稱絡(luò)麻、綠麻，是一種能在沿海灘涂地大面積 生長(zhǎng)的一年生草本韌皮纖維經(jīng)濟(jì)作物，在沿海灘涂開發(fā)熱的今天可作為灘涂改良的先鋒作 物。由于其能夠耐受沿海灘涂高鹽脅迫，因此成了耐鹽性研究中的一種優(yōu)秀的指示植物材 料。 但由于其植物體內(nèi)含有鹽漬化條件下產(chǎn)生的多種次生代謝物(色素、酚類、醌類
等)，眾多干擾使得作為蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)_雙向電泳成為挑戰(zhàn)，常規(guī)方法不能成功
制備純度高的蛋白，在電泳過(guò)程中，合理的參數(shù)設(shè)定可有效的除鹽，聚焦等。以黃麻植物根
系為材料，進(jìn)行根系總蛋白的制備，建立適用于黃麻根系蛋白質(zhì)組學(xué)分離的雙向電泳方法，
可為鹽漬化環(huán)境下植物材料耐鹽性蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和參考。 本發(fā)明的突破點(diǎn)就是建立鹽漬化環(huán)境下的高耐鹽植物黃麻的雙向電泳方法體系，
利用該方法可對(duì)黃麻進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題 本發(fā)明目的在于提供一種黃麻根系的總蛋白分離的雙向電泳方法，是針對(duì)能夠生
存在沿海灘涂的植物黃麻的根系總蛋白采用雙向電泳方法進(jìn)行分離，該技術(shù)經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證
明樣品制備全、分離蛋白點(diǎn)多、重復(fù)性好、圖譜清晰，是一套適用于黃麻根系總蛋白組分析
的雙向電泳技術(shù)。 技術(shù)方案 本發(fā)明所述的一種黃麻根系的總蛋白雙向電泳方法，按下列步驟進(jìn)行 1)采集黃麻根系，超純水清洗干凈，用液氮罐裝運(yùn)回，在實(shí)驗(yàn)室-7(TC以下保存?zhèn)?用； 2)將2g黃麻根系迅速放入冰浴的研缽中加入液氮研磨，研磨過(guò)程中加入0. 2g聚 乙烯吡咯烷酮，直到研磨成細(xì)粉，轉(zhuǎn)入預(yù)冷-2(TC的50ml離心管； 3)加入3倍體積-2(TC預(yù)冷的三氯乙酸提取液，充分混合后，放在-2(TC 1.5h，三 氯乙酸提取液配制質(zhì)量體積比10X三氯乙酸TCA，質(zhì)量體積比0. 07X二硫蘇糖醇DTT， lmM苯甲基磺酰氟PMSF，溶劑為丙酮； 4)35000g，4t:離心15min，取沉淀，加入25ml預(yù)冷的樣品洗滌液，充分混合后，放 在-20°C lh，期間間隔渦旋；樣品洗滌液配制質(zhì)量體積比0. 07% DTT， lmM PMSF，溶劑為丙 酮； 5)20000g，4t:離心15min，取沉淀，加入25ml預(yù)冷的樣品洗滌液，充分混合后，放 在-2(TC lh，期間間隔渦旋;
6)重復(fù)步驟5)—次； 7)20000g，4。C離心15min，去掉上清后，用濾紙封口 ，真空干燥；
8)將粗蛋白溶于裂解液，室溫1. 5h ;裂解液配制7M尿素、2M硫脲、質(zhì)量體積比 4% 3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-l-丙磺酸CHAPS、65mM DTT、lmM PMSF、體積比 0.2%載體兩性電解質(zhì)； 9)離心，得到上清液用3倍體積預(yù)冷的樣品洗滌液-2(TC沉淀0. 5h后再20000g、 4t:、15min離心，棄上清液； 10)沉淀再次溶解于步驟8)中的500 iU裂解液，充分溶解后，離心，取上清；
11)蛋白質(zhì)定量采用Bradford法測(cè)定其蛋白濃度； 12)第一向等電聚焦電泳按上樣量350iig，上樣體積330ia，對(duì)已定量好的蛋白 樣品進(jìn)行稀釋，上樣水化液同步驟8)中的裂解液，將樣品加入固相pH梯度IPG膠條聚焦 盤內(nèi)后，再將PH 4-7， 17cm的IPG膠條膠面向下放入盤中，除去膠面與樣品液間的氣泡，用 2. 5ml礦物油/條，覆蓋膠條，進(jìn)行等電聚焦； 13)膠條平衡將聚焦好后的固相pH梯度IPG膠條進(jìn)行平衡I、 II，每次平衡時(shí)間 為20min，平衡緩沖液配制如下 膠條平衡緩沖液母液6M尿素，質(zhì)量體積比2%十二烷基磺酸鈉SDS，O. 375MpH8. 8 的Tris-HCl，體積比20%甘油，溶劑為水。 膠條平衡緩沖液I :每10ml膠條平衡緩沖液母液加入0. 2g DTT ; 膠條平衡緩沖液II :每10ml膠條平衡緩沖液母液加入0. 25g碘乙酰胺； 14)第二向SDS-PAGE電泳將平衡好的膠條置于膠濃度為質(zhì)量體積比12 %的
SDS-PAGE膠上，用質(zhì)量體積比0. 5%、含有質(zhì)量體積比0. 002%溴酚藍(lán)的低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠
液封住頂部，按如下參數(shù)進(jìn)行電泳16t:恒溫下，恒功率，先用1瓦/條，1. 5h ;再用15瓦/
條，4 6h ; 15)染色方法采用硝酸銀法進(jìn)行染色。
整個(gè)過(guò)程的溶液配制均需用超純水。
整個(gè)過(guò)程的裂解液與上樣水化液均需現(xiàn)用現(xiàn)配。
整個(gè)過(guò)程所需的DTT均需現(xiàn)用現(xiàn)加。 步驟12)中的等電聚焦參數(shù)設(shè)置如下50V水化，13h ;250V慢速，lh ;500V慢速， lh ;2000V線性，lh ;8000V線性，4h ;8000V快速，60000V. h ;500V快速，保持。
步驟14)中膠濃度質(zhì)量體積比12 %的SDS PAGE凝膠所用的溶液體積比 含量為，水質(zhì)量體積比30%丙烯酰胺0. 375M pH8. 8的Tris-HCl :質(zhì)量體積
比10%十二烷基硫酸鈉質(zhì)量體積比10%過(guò)硫酸銨體積比10%四甲基乙二胺= 33 : 40 : 25 : i : i : o. 15。
步驟14)電極緩沖液配制如下按質(zhì)量體積比0. 1 %十二烷基硫酸鈉，0. 025mol/L 三羥甲基氨基甲烷和0. 192mol/L甘氨酸進(jìn)行配制，溶劑為水，并調(diào)制pH值為8. 3。
步驟15)中的染色方法程序如下 步驟1 :取50ml冰乙酸、200ml無(wú)水乙醇、加水至500ml固定，1. 5h ; 步驟2 :取lg硫代硫酸鈉，56. 36g三水合乙酸鈉，150ml無(wú)水乙醇，加水至500ml敏
化，30min ; 步驟3 :500ml水漂洗三遍，5min/次； 步驟4 :1. 25g硝酸銀溶于500ml水，避光銀染，20min ; 步驟5 :500ml水漂洗二遍，lmin/次； 步驟6 :12. 5g碳酸鈉，0. 2ml甲醛，加水至500ml，顯色共2次；第一次待溶液變黃
后倒掉，第二次顯色到理想的背景和清晰度； 步驟7 :7. 3g Na2EDTA溶于500ml水終止，10min。 有益效果 本發(fā)明針對(duì)黃麻體內(nèi)含有鹽漬化條件下產(chǎn)生的多種次生代謝物(色素、酚類、醌 類等)，眾多干擾使得作為蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)_雙向電泳成為挑戰(zhàn)，首次建立了一套 適合黃麻根系蛋白質(zhì)組學(xué)研究的雙向電泳方法。 本套方法首次將黃麻根系總蛋白樣品進(jìn)行制備，采用雙向電泳方法對(duì)其進(jìn)行分 離，分離得到蛋白點(diǎn)多，經(jīng)PDQuest軟件檢測(cè)，蛋白點(diǎn)多于IIOO個(gè)，圖譜清晰，無(wú)橫縱紋現(xiàn) 象，蛋白點(diǎn)圓，重復(fù)性好?？稍邳S麻根系蛋白組學(xué)中直接運(yùn)用。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
圖1黃麻室內(nèi)水培根系總蛋白雙向電泳圖譜。
1為乙醇脫氫酶2為黃酮醇合成酶；3為RBAP2蛋白。
圖2沿海灘涂生長(zhǎng)的黃麻根系總蛋白雙向電泳圖譜。
1為乙醇脫氫酶；2為黃酮醇合成酶；3為RBAP2蛋白。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 采用美國(guó)Beckmen高速低溫離心機(jī)、雙向電泳PROTEAN IIXi/XL Cell(美國(guó) BIO-膽) 1)采集室內(nèi)水培黃麻根系，超純水清洗干凈，用過(guò)濾紙吸干根系表面水份，立即放
入液氮罐迅速冷凍，然后在實(shí)驗(yàn)室-701:以下冰箱保存?zhèn)溆茫?2)將2g黃麻根系樣品迅速放入冰浴的研缽中加入液氮研磨，研磨過(guò)程中加入 0. 2g聚乙烯吡咯烷酮，直到研磨成細(xì)粉，轉(zhuǎn)入預(yù)冷-2(TC的50ml離心管；
3)加入3倍體積-2(TC預(yù)冷的三氯乙酸提取液，充分混合后，放在-2(TC 1.5h，三 氯乙酸提取液配制質(zhì)量體積比10X三氯乙酸TCA，質(zhì)量體積比0. 07X二硫蘇糖醇DTT， lmM 苯甲基磺酰氟PMSF，溶劑為丙酮；4)35000g，4t:離心15min，取沉淀，加入25ml預(yù)冷的樣品洗滌液，充分混合后，放在-20°C lh，期間間隔渦旋；樣品洗滌液配制質(zhì)量體積比0. 07% DTT， ImM PMSF，溶劑為丙 酮； 5)20000g，4。C離心15min，取沉淀，加入25ml預(yù)冷的樣品洗滌液，充分混合后，放 在-2(TC lh，期間間隔渦旋;
6)重復(fù)步驟5) —次； 7)20000g，4。C離心15min，去掉上清后，用濾紙封口 ，真空干燥；
8)將粗蛋白溶于裂解液，室溫1. 5h ;裂解液配制7M尿素、2M硫脲、質(zhì)量體積比 4% 3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-l-丙磺酸CHAPS、65mM DTT、lmM PMSF、體積比 0.2%載體兩性電解質(zhì)； 9)離心，得到上清液用3倍體積預(yù)冷的樣品洗滌液-2(TC沉淀0. 5h后再20000g、 4t:、15min離心，棄上清液； 10)沉淀再次溶解于步驟8)中的500 iU裂解液，充分溶解后，離心，取上清；
11)蛋白質(zhì)定量采用Bradford法測(cè)定其蛋白濃度將蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)梯度稀釋 后用考馬斯亮藍(lán)G-250染色，在波長(zhǎng)595nm下測(cè)定吸光值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出蛋白質(zhì)含 12)第一向等電聚焦電泳按上樣量350iig，上樣體積330iil，對(duì)已定量好的蛋白 樣品進(jìn)行稀釋，上樣水化液同步驟8)中的裂解液，將樣品加入固相pH梯度IPG膠條聚焦 盤內(nèi)后，再將PH 4-7， 17cm的IPG膠條膠面向下放入盤中，除去膠面與樣品液間的氣泡，用 2. 5ml礦物油/條，覆蓋膠條，進(jìn)行等電聚焦，等電聚焦程序設(shè)置如下50V水化，13h ;250V 慢速，lh ;500V慢速，lh ;2000V線性，lh ;8000V線性，4h ;8000V快速，60000V. h ;500V快速， 保持。 13)膠條平衡將聚焦好后的固相pH梯度IPG膠條進(jìn)行平衡I、 II，每次平衡時(shí)間 為20min，平衡緩沖液配制如下 膠條平衡緩沖液母液6M尿素，質(zhì)量體積比2%十二烷基磺酸鈉SDS，O. 375MpH8. 8 的Tris-HCl，體積比20%甘油，溶劑為水。 膠條平衡緩沖液I :每10ml膠條平衡緩沖液母液加入0. 2g DTT ; 膠條平衡緩沖液II :每10ml膠條平衡緩沖液母液加入0. 25g碘乙酰胺； 14)第二向SDS-PAGE電泳將平衡好的膠條置于膠濃度為質(zhì)量體積比12 %的
SDS-PAGE膠上，用質(zhì)量體積比0. 5%、含有質(zhì)量體積比0. 002%溴酚藍(lán)的低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠
液封住頂部，按如下參數(shù)進(jìn)行電泳16t:恒溫下，恒功率，先用1瓦/條，1. 5h ;再用15瓦/
條，4 6h ; 膠濃度質(zhì)量體積比12 %的SDS-PAGE凝膠所用的溶液體積比含量為，水質(zhì)量體 積比30%丙烯酰胺0. 375M pH8. 8的Tris-HCl :質(zhì)量體積比10%十二烷基硫酸鈉質(zhì)
量體積比10%過(guò)硫酸銨體積比10%四甲基乙二胺=33 : 40 : 25 : i : i : o. 15。 電極緩沖液配制如下按質(zhì)量體積比0. 1%十二烷基硫酸鈉，0. 025mol/L三羥甲 基氨基甲烷和0. 192mol/L甘氨酸進(jìn)行配制，溶劑為水，并調(diào)制pH值為8. 3。
15)中的染色方法程序如下 步驟1 :取50ml冰乙酸、200ml無(wú)水乙醇、加水至500ml固定，1. 5h ; 步驟2 :取lg硫代硫酸鈉，56. 36g三水合乙酸鈉，150ml無(wú)水乙醇，加水至500ml敏化，30min ; 步驟3 :500ml水漂洗三遍，5min/次； 步驟4 :1. 25g硝酸銀溶于500ml水，避光銀染，20min ; 步驟5 :500ml水漂洗二遍，lmin/次； 步驟6 :12. 5g碳酸鈉，0. 2ml甲醛，加水至500ml，顯色共2次；第一次待溶液變黃
后倒掉，第二次顯色到理想的背景和清晰度； 步驟7 :7. 3g Na2EDTA溶于500ml水終止，10min。 通過(guò)上述雙向電泳整個(gè)流程對(duì)室內(nèi)培養(yǎng)的黃麻根系總蛋白進(jìn)行分離，結(jié)果如圖1 所示，結(jié)果表明該黃麻根系總蛋白樣品分離效果較好，圖譜清晰，蛋白點(diǎn)圓且多，經(jīng)PDQuest 軟件檢測(cè)，蛋白點(diǎn)多于1100個(gè)。圖l中橫向?yàn)榈入娋劢梗v向?yàn)镾DS-PAGE，縱向數(shù)字為蛋白 質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，單位是kD。舉例蛋白點(diǎn)1、2、3經(jīng)質(zhì)譜鑒定后分別為乙醇脫氫酶；黃酮醇合 成酶；RBAP2蛋白。
實(shí)施例2 采用美國(guó)Beckmen高速低溫離心機(jī)、雙向電泳PROTEAN IIXi/XL Cell(美國(guó) BIO-膽) 1)采集江蘇省大豐市沿海灘涂所種植的黃麻根系，用超純水清洗干凈，用過(guò)濾紙 吸干根系表面水份，放入液氮罐迅速冷凍，運(yùn)回，然后在實(shí)驗(yàn)室-70°C以下冰箱保存?zhèn)溆茫?
2)將2g黃麻根系樣品迅速放入冰浴的研缽中加入液氮研磨，研磨過(guò)程中加入 0. 2g聚乙烯吡咯烷酮，直到研磨成細(xì)粉，轉(zhuǎn)入預(yù)冷-2(TC的50ml離心管；
3)加入3倍體積-2(TC預(yù)冷的三氯乙酸提取液，充分混合后，放在-2(TC 1.5h，三 氯乙酸提取液配制質(zhì)量體積比10X三氯乙酸TCA，質(zhì)量體積比0. 07X二硫蘇糖醇DTT， lmM 苯甲基磺酰氟PMSF，溶劑為丙酮； 4)35000g，4t:離心15min，取沉淀，加入25ml預(yù)冷的樣品洗滌液，充分混合后，放 在-20°C lh，期間間隔渦旋；樣品洗滌液配制質(zhì)量體積比0. 07% DTT， lmM PMSF，溶劑為丙 酮； 5)20000g，4t:離心15min，取沉淀，加入25ml預(yù)冷的樣品洗滌液，充分混合后，放 在-2(TC lh，期間間隔渦旋;
6)重復(fù)步驟5) —次； 7)20000g，4。C離心15min，去掉上清后，用濾紙封口 ，真空干燥；
8)將粗蛋白溶于裂解液，室溫1. 5h ;裂解液配制7M尿素、2M硫脲、質(zhì)量體積比 4% 3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-l-丙磺酸CHAPS、65mM DTT、lmM PMSF、體積比 0.2%載體兩性電解質(zhì)； 9)離心，得到上清液用3倍體積預(yù)冷的樣品洗滌液-2(TC沉淀0. 5h后再20000g、 4t:、15min離心，棄上清液； 10)沉淀再次溶解于步驟8)中的500 iU裂解液，充分溶解后，離心，取上清；
11)蛋白質(zhì)定量采用Bradford法測(cè)定其蛋白濃度將蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)梯度稀釋 后用考馬斯亮藍(lán)G-250染色，在波長(zhǎng)595nm下測(cè)定吸光值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出蛋白質(zhì)含 12)第一向等電聚焦電泳按上樣量350iig，上樣體積330iil，對(duì)已定量好的蛋白
8樣品進(jìn)行稀釋，上樣水化液同步驟8)中的裂解液，將樣品加入固相pH梯度IPG膠條聚焦 盤內(nèi)后，再將PH 4-7， 17cm的IPG膠條膠面向下放入盤中，除去膠面與樣品液間的氣泡，用 2. 5ml礦物油/條，覆蓋膠條，進(jìn)行等電聚焦，等電聚焦程序設(shè)置如下50V水化，13h ;250V 慢速，lh ;500V慢速，lh ;2000V線性，lh ;8000V線性，4h ;8000V快速，60000V. h ;500V快速，保持。 13)膠條平衡將聚焦好后的固相pH梯度IPG膠條進(jìn)行平衡I、 II，每次平衡時(shí)間 為20min，平衡緩沖液配制如下 膠條平衡緩沖液母液6M尿素，質(zhì)量體積比2%十二烷基磺酸鈉SDS，O. 375MpH8. 8 的Tris-HCl，體積比20%甘油，溶劑為水。 膠條平衡緩沖液I :每10ml膠條平衡緩沖液母液加入0. 2g DTT ; 膠條平衡緩沖液II :每10ml膠條平衡緩沖液母液加入0. 25g碘乙酰胺； 14)第二向SDS-PAGE電泳將平衡好的膠條置于膠濃度為質(zhì)量體積比12 %的
SDS-PAGE膠上，用質(zhì)量體積比0. 5%、含有質(zhì)量體積比0. 002%溴酚藍(lán)的低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠
液封住頂部，按如下參數(shù)進(jìn)行電泳16t:恒溫下，恒功率，先用1瓦/條，1. 5h ;再用15瓦/
條，4 6h ; 膠濃度質(zhì)量體積比12 %的SDS-PAGE凝膠所用的溶液體積比含量為，水質(zhì)量體 積比30%丙烯酰胺0. 375M pH8. 8的Tris-HCl :質(zhì)量體積比10%十二烷基硫酸鈉質(zhì)
量體積比10%過(guò)硫酸銨體積比10%四甲基乙二胺=33 : 40 : 25 : i : i : o. 15。 電極緩沖液配制如下按質(zhì)量體積比0. 1%十二烷基硫酸鈉，0. 025mol/L三羥甲 基氨基甲烷和0. 192mol/L甘氨酸進(jìn)行配制，溶劑為水，并調(diào)制pH值為8. 3。
15)中的染色方法程序如下 步驟1 :取50ml冰乙酸、200ml無(wú)水乙醇、加水至500ml固定，1. 5h ; 步驟2 :取lg硫代硫酸鈉，56. 36g三水合乙酸鈉，150ml無(wú)水乙醇，加水至500ml敏
化，30min ; 步驟3 :500ml水漂洗三遍，5min/次； 步驟4 :1. 25g硝酸銀溶于500ml水，避光銀染，20min ; 步驟5 :500ml水漂洗二遍，lmin/次； 步驟6 :12. 5g碳酸鈉，0. 2ml甲醛，加水至500ml，顯色共2次；第一次待溶液變黃
后倒掉，第二次顯色到理想的背景和清晰度； 步驟7 :7. 3g Na2EDTA溶于500ml水終止，10min。 通過(guò)上述雙向電泳整個(gè)流程對(duì)江蘇省大豐市沿海灘涂地采集的黃麻根系總蛋白 進(jìn)行分離，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明該黃麻根系總蛋白樣品分離效果較好，圖譜清晰，蛋 白點(diǎn)圓且多，經(jīng)PDQuest軟件檢測(cè)，蛋白點(diǎn)多于1100個(gè)。圖2中橫向?yàn)榈入娋劢?，縱向?yàn)?SDS-PAGE，縱向數(shù)字為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，單位是kD。舉例蛋白點(diǎn)1、2、3經(jīng)質(zhì)譜鑒定后分別 為乙醇脫氫酶；黃酮醇合成酶；RBAP2蛋白。
權(quán)利要求
一種黃麻根系總蛋白雙向電泳方法，其特征在于按下列步驟進(jìn)行1)采集黃麻根系，超純水清洗干凈，用液氮罐裝運(yùn)回，在實(shí)驗(yàn)室-70℃以下保存?zhèn)溆茫?)將2g黃麻根系迅速放入冰浴的研缽中加入液氮研磨，研磨過(guò)程中加入0.2g聚乙烯吡咯烷酮，直到研磨成細(xì)粉，轉(zhuǎn)入預(yù)冷-20℃的50ml離心管；3)加入3倍體積-20℃預(yù)冷的三氯乙酸提取液，充分混合后，放在-20℃1.5h，三氯乙酸提取液配制質(zhì)量體積比10％三氯乙酸TCA，質(zhì)量體積比0.07％二硫蘇糖醇DTT，1mM苯甲基磺酰氟PMSF，溶劑為丙酮；4)35000g，4℃離心15min，取沉淀，加入25ml預(yù)冷的樣品洗滌液，充分混合后，放在-20℃1h，期間間隔渦旋；樣品洗滌液配制質(zhì)量體積比0.07％DTT，1mMPMSF，溶劑為丙酮；5)20000g，4℃離心15min，取沉淀，加入25ml預(yù)冷的樣品洗滌液，充分混合后，放在-20℃1h，期間間隔渦旋；6)重復(fù)步驟5)一次；7)20000g，4℃離心15min，去掉上清后，用濾紙封口，真空干燥；8)將粗蛋白溶于裂解液，室溫1.5h；裂解液配制7M尿素、2M硫脲、質(zhì)量體積比4％3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸CHAPS、65mM DTT、1mM PMSF、體積比0.2％載體兩性電解質(zhì)；9)離心，得到上清液用3倍體積預(yù)冷的樣品洗滌液-20℃沉淀0.5h后再20000g、4℃、15min離心，棄上清液；10)沉淀再次溶解于步驟8)中的500μl裂解液，充分溶解后，離心，取上清；11)蛋白質(zhì)定量采用Bradford法測(cè)定其蛋白濃度；12)第一向等電聚焦電泳按上樣量350μg，上樣體積330μl，對(duì)已定量好的蛋白樣品進(jìn)行稀釋，上樣水化液同步驟8)中的裂解液，將樣品加入固相pH梯度IPG膠條聚焦盤內(nèi)后，再將pH 4-7，17cm的IPG膠條膠面向下放入盤中，除去膠面與樣品液間的氣泡，用2.5ml礦物油/條，覆蓋膠條，進(jìn)行等電聚焦；13)膠條平衡將聚焦好后的固相pH梯度IPG膠條進(jìn)行平衡I、II，每次平衡時(shí)間為20min，平衡緩沖液配制如下膠條平衡緩沖液母液6M尿素，質(zhì)量體積比2％十二烷基磺酸鈉SDS，0.375MpH8.8的Tris-HCl，體積比20％甘油，溶劑為水。膠條平衡緩沖液I每10ml膠條平衡緩沖液母液加入0.2g DTT；膠條平衡緩沖液II每10ml膠條平衡緩沖液母液加入0.25g碘乙酰胺；14)第二向SDS-PAGE電泳將平衡好的膠條置于膠濃度為質(zhì)量體積比12％的SDS-PAGE膠上，用質(zhì)量體積比0.5％、含有質(zhì)量體積比0.002％溴酚藍(lán)的低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液封住頂部，按如下參數(shù)進(jìn)行電泳16℃恒溫下，恒功率，先用1瓦/條，1.5h；再用15瓦/條，4～6h；15)染色方法采用硝酸銀法進(jìn)行染色。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，整個(gè)過(guò)程的溶液配制均需用超純水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，裂解液與上樣水化液均需現(xiàn)用現(xiàn)配。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，整個(gè)過(guò)程所需的DTT均需現(xiàn)用現(xiàn)加。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟12)中的等電聚焦參數(shù)設(shè)置如下50V水化，13h ;250V慢速，lh ;500V慢速，lh ;2000V線性，lh ;8000V線性，4h ;8000V快速， 60000V. h ; 500V快速，保持。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟14)中膠濃度質(zhì)量體積比12%的 SDS-PAGE凝膠所用的溶液體積比含量為，水質(zhì)量體積比30%丙烯酰胺0.375M pH8. 8的Tris-HCi :質(zhì)量體積比10%十二烷基硫酸鈉質(zhì)量體積比10%過(guò)硫酸銨體積比10% 四甲基乙二胺=33 : 40 : 25 : i : i : o. 15。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟14)中電極緩沖液配制如下按質(zhì)量體積比O. 1%十二烷基硫酸鈉，0. 025mol/L三羥甲基氨基甲烷和0. 192mol/L甘氨酸進(jìn)行配 制，溶劑為水，并調(diào)制pH值為8.3。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟15)中的染色方法程序如下 步驟1 :取50ml冰乙酸、200ml無(wú)水乙醇、加水至500ml固定，1. 5h ;步驟2 :取lg硫代硫酸鈉，56. 36g三水合乙酸鈉，150ml無(wú)水乙醇，加水至500ml敏化， 30min ;步驟3 :500ml水漂洗三遍，5min/次；步驟4 :1. 25g硝酸銀溶于500ml水，避光銀染，20min ;步驟5 :500ml水漂洗二遍，lmin/次；步驟6 :12. 5g無(wú)水碳酸鈉，0. 2ml甲醛，加水至500ml，顯色共2次；第一次待溶液變黃后倒掉，第二次顯色到理想的背景和清晰度；步驟7 :7. 3g Na2EDTA溶于500ml水終止，10min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種黃麻的總蛋白質(zhì)雙向電泳方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。是針對(duì)能夠生存在沿海灘涂的黃麻根系總蛋白采用雙向電泳技術(shù)進(jìn)行分離，采用本技術(shù)方案對(duì)生長(zhǎng)在沿海灘涂地的黃麻根系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)取得了很好的效果。目前，經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證明，采用雙向電泳方法對(duì)其進(jìn)行分離，分離得到蛋白點(diǎn)多，經(jīng)PDQuest軟件檢測(cè)，蛋白點(diǎn)多于1100個(gè)，圖譜清晰，無(wú)橫縱紋現(xiàn)象，蛋白點(diǎn)圓，重復(fù)性好，是一套適用于黃麻根系總蛋白組分析的雙向電泳方法。
文檔編號(hào)G01N1/28GK101718745SQ20091023252
公開日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月7日
發(fā)明者何小玲, 王顯生, 馬洪雨, 麻浩 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)