專利名稱：從博代氏桿菌提取細(xì)胞結(jié)合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的可用作成分疫苗或無(wú)細(xì)胞疫苗中抗原因子的細(xì)胞蛋白質(zhì)的提取方法。特別是，本發(fā)明涉及一種新的細(xì)菌微生物的外膜蛋白質(zhì)的提取方法，例如百日咳博代氏桿菌(Bordetellapertussis)的外膜蛋白，其分子量約為69,000道爾頓，一般稱為百日咳桿菌的69kD蛋白，或稱“Pertactin”。
百日咳是一種主要侵襲兒童的高度傳染性疾病。除了引起呼吸并發(fā)癥，還可導(dǎo)致神經(jīng)損傷和高的死亡發(fā)生率，特別是在來(lái)自社會(huì)經(jīng)濟(jì)低階層的孩子中以及不具有母親抗-百日咳抗體的新生兒中。百日咳的病原體是革蘭氏陰性球桿菌屬，百日咳桿菌。人們確信這種細(xì)菌侵入呼吸道并引起一種毒性狀態(tài)，這種毒性狀態(tài)甚至能持續(xù)至細(xì)菌消失數(shù)天之后。
對(duì)這種疾病的控制通常是通過(guò)“全細(xì)胞”疫苗免疫。這種“全細(xì)胞”疫苗是通過(guò)在發(fā)酵罐中培養(yǎng)百日咳桿菌并經(jīng)熱處理和/或加入化學(xué)試劑對(duì)所得細(xì)胞進(jìn)行滅活處理而得。雖然目前世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦對(duì)嬰兒進(jìn)行免疫以防止百日咳的發(fā)生和漫延，但所報(bào)道的由各種不同的疫苗配方所造成的一些不良事件已引起了人們的關(guān)注。隨之而減少的對(duì)常規(guī)百日咳疫苗的使用已導(dǎo)致百日咳感染發(fā)病率的增加。因此，人們意識(shí)到需要一種百日咳疫苗，它能夠避免所報(bào)道的由全細(xì)胞疫苗引起的不良事件。因而，已投入了相當(dāng)大的研究力量，以期研制出一種有效的包含少數(shù)幾個(gè)高度純化了的抗原性蛋白組分的無(wú)細(xì)胞疫苗。
已有幾種抗原被提儀作為無(wú)細(xì)胞疫苗成分，例如淋巴細(xì)胞增多激刺因子(lymphocytosis promoting factor，LPF)(亦稱為組胺敏感因子(histamine sensitising factor)、島激活蛋白(isletactivating protein)、一般稱為百日咳毒素(pertussis toxin，PT))，絲狀血凝素(filamentous hemagglutinin，F(xiàn)HA)以及菌毛凝集素(fimbrial agglutinogens)。
一種更有潛力的抗原是一種細(xì)菌的外膜蛋白，分子量約為69000道爾頓(稱為pertactin)，發(fā)現(xiàn)于百日咳桿菌的所有有毒株中。這種百日咳桿菌69kD蛋白與電泳遷移率稍有差異的人類病原體副百日咳博代氏桿菌及動(dòng)物病原體支氣管敗血性博代氏桿菌所產(chǎn)生的類似蛋白質(zhì)有免疫學(xué)相關(guān)性。雖然在百日咳桿菌培養(yǎng)過(guò)程中，只有相當(dāng)少量的69kD蛋白分泌到發(fā)酵液中，但發(fā)現(xiàn)大部分的69kD蛋白結(jié)合在細(xì)胞膜上，很容易從中提取出來(lái)。然而，已發(fā)表的69kD蛋白的提取和純化程序均不能用于大規(guī)模的工業(yè)性生產(chǎn)高度純化的和穩(wěn)定的抗原。
EP-0162639描述的程序是，將細(xì)胞進(jìn)行酸-甘氨酸提取后，進(jìn)行幾步純化步驟，最后利用一種特異的單克隆抗體進(jìn)行親和層析分離。不過(guò)，業(yè)已報(bào)道，所獲得的蛋白質(zhì)不僅穩(wěn)定性差而且有腺苷酸環(huán)化酶活性，而且這種下游的純化程序不適合于大規(guī)模生產(chǎn)。
Brennan等人(Infection and Immunity 56，3189-3195，1988)描述了一種更進(jìn)一步的方法，通過(guò)熱處理使蛋白質(zhì)從細(xì)胞上釋放下來(lái)，得到一種蛋白質(zhì)提取液，然后通過(guò)胎球蛋白-Sepharose(瓊脂糖)層析和一種單克隆抗體親和層析進(jìn)行純化。
美國(guó)專利號(hào)(US Setial No.7/308864)描述的提取和純化程序包括熱處理和離心，隨后是進(jìn)行DEAE(二乙氨乙基)-Sepharose離子交換層析和蛋白質(zhì)-特異的，染料-配體凝膠層析。這一方法避免了昂貴的單克隆抗體的使用，但仍被認(rèn)為不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。已經(jīng)查出的一個(gè)特殊問(wèn)題是，如果按占熱處理后釋放的總蛋白的百分率計(jì)算，釋放到溶液中的69kD蛋白量很少。EP-A-0437687通過(guò)一個(gè)涉及許多步提取步驟的重復(fù)提取過(guò)程，使從培養(yǎng)液中釋放69kD蛋白的效率有了改善。
本發(fā)明提供一個(gè)處理過(guò)程，經(jīng)過(guò)單一提取步驟后，可增強(qiáng)從微生物細(xì)胞釋放的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，從而克服了蛋白回收效率低的問(wèn)題。本發(fā)明也免除了隨后的離心去除細(xì)胞“碎片”的需要。此外，本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它有效地去掉了大部分的大分子內(nèi)毒素(脂多糖)。這些內(nèi)毒素存在于發(fā)酵后的液體培養(yǎng)基中，當(dāng)利用熱處理提取膜蛋白時(shí)，又進(jìn)一步釋放到溶液中。
發(fā)酵后對(duì)微生物懸液的熱處理，是對(duì)那些在發(fā)酵過(guò)程中很少被微生物分泌到液體培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)(如外膜蛋白質(zhì))的分離過(guò)程中的一個(gè)重要步驟。百日咳桿菌69kD蛋白即是這種典型的外膜蛋白質(zhì)，它的分泌量不足以保證能以生產(chǎn)規(guī)模從液體培養(yǎng)基的上清液中直接分離出來(lái)。在這一點(diǎn)上，它不同于無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗其它的候選抗原百日咳毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)。
熱處理過(guò)程包括，在例如60℃下加熱緩沖液中的細(xì)胞懸液約1小時(shí)，在此期間，外膜蛋白質(zhì)從細(xì)胞膜脫落進(jìn)入溶液中。然而這種溶液并不是一種能自由流動(dòng)的液體，而主要是一種粘性的膠狀物質(zhì)，由死細(xì)胞及其內(nèi)含物組成，這種膠狀物質(zhì)雖然能小規(guī)模(5-10ml等份試樣)地從自由流動(dòng)的液體中分離出去(如通過(guò)過(guò)濾或離心)，但很困難。這種高度水合的膠狀物常含有高于50％體積的原液，如果棄掉，將明顯地降低69kD蛋白的產(chǎn)率。而且粗濾也不盡人意，因?yàn)槟z狀物會(huì)很快堵塞濾器，有效地阻止液體的通過(guò)。
本發(fā)明提供了一種可在熱處理過(guò)程中免除膠狀團(tuán)塊形成的有效方法。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在熱處理之前向細(xì)胞懸液中加入一種絮凝劑可使細(xì)胞發(fā)生強(qiáng)烈的絮凝作用。可很容易地把這種絮凝了的細(xì)胞塊從懸浮液體培養(yǎng)基中分離出來(lái)，并可在熱處理之前進(jìn)行洗滌以除去非必需的液體培養(yǎng)基成分。熱處理后，將死細(xì)胞進(jìn)行再絮凝，從而留下一種實(shí)際上是無(wú)細(xì)胞的上清液，內(nèi)含極大部分的可溶性蛋白。通過(guò)這一程序可獲得高回收率的目的蛋白溶液，用于隨后的純化。
本發(fā)明另外的優(yōu)點(diǎn)是，由于在熱處理后，大多數(shù)高分子量的內(nèi)毒素已隨同死細(xì)胞絮凝塊從含蛋白溶液中清除出去，所以它所提供的回收蛋白可允許其只需進(jìn)行較不嚴(yán)格的隨后的純化。因此，有可能減少為達(dá)到預(yù)防和治療目的所要求的蛋白純度標(biāo)準(zhǔn)所需的隨后純化步驟。
本發(fā)明因此提供了一種細(xì)菌來(lái)源的細(xì)胞結(jié)合蛋白的提取方法，包括把細(xì)胞結(jié)合蛋白懸液與一種絮凝劑接觸。
本領(lǐng)域中熟知的多種絮凝劑均可用于本發(fā)明的方法中，以改善熱處理后細(xì)胞懸液的處理質(zhì)量。用于本發(fā)明的優(yōu)選絮凝劑是那些具有二價(jià)陽(yáng)離子的物質(zhì)。用于本發(fā)明的合適的二價(jià)陽(yáng)離子可來(lái)自鋇鹽、鈣鹽和鍶鹽，例如鹵化鹽氯化鋇、氯化鈣、或氯化鍶，優(yōu)選氯化鋇。
這種絮凝劑適合于在pH控制的條件下加入到細(xì)胞懸液中，加入適當(dāng)?shù)木彌_液以調(diào)整液體體積?；靹蚝?，將絮凝的細(xì)胞靜置。將絮凝細(xì)胞用適當(dāng)?shù)某两捣椒?或離心)來(lái)收集，并在進(jìn)行熱處理之前可用鹽水或緩沖液洗滌。
本發(fā)明的提取方法，如果結(jié)合隨后的進(jìn)一步處理，可從百日咳桿菌獲得純度很高的69kD蛋白。例如，它不含有可檢出水平的PT或熱不穩(wěn)定毒素，并且內(nèi)毒素水平降至每毫克蛋白幾毫微克的水平。此外，此蛋白沒(méi)有酶活性，尤其是沒(méi)有以前的生產(chǎn)方法帶來(lái)的腺苷酸環(huán)化酶活性。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，69kD蛋白是從百日咳桿菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中制備而來(lái)。并對(duì)用于本發(fā)明的合適菌株作了描述，這些菌株可從一些商業(yè)性的保藏單位獲得，如美國(guó)馬里蘭州洛克費(fèi)勒市的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(the American Type Culture Col-lection，Rockville Maryland，USA)。優(yōu)選的菌株是那些能在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并具有高產(chǎn)量的69kD蛋白的菌株。
可使用的菌株包括(但不限于)百日咳桿菌工期(B.pertus-sis phase I)、百日咳桿菌II期、百日咳桿菌I期CS(B.pertussisphase I CS)、百日咳桿菌Tohama株、百日咳桿菌185-30株、百日咳桿菌18323株、百日咳桿菌134株、百日咳桿菌509株、百日咳桿菌Wellcome 28株、以及生物制劑辦公室(Office of Biologics)百日咳桿菌165株。本發(fā)明中使用的優(yōu)選菌株是百日咳桿菌I期，Tohama，可從日本大阪的發(fā)酵研究所獲得，登記號(hào)為IFO-14073。
為了用于本發(fā)明，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的各種不同方式培養(yǎng)所選擇的百日咳桿菌菌株。已知有各種不同的培養(yǎng)方法，根據(jù)種子培養(yǎng)物的數(shù)量、來(lái)源或保存方法，可采用不同的培養(yǎng)步驟以及液體或固體培養(yǎng)基。不過(guò)，只要能提供用于大規(guī)模生產(chǎn)常規(guī)所能接受的種菌量，已知的任何一種方法都可用于本發(fā)明。
本領(lǐng)域的任何-個(gè)技術(shù)人員都能選擇出一種用于百日咳桿菌種菌培養(yǎng)的合適培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基包括(并不限于)Gengou培養(yǎng)基(EP-A-0077646)；N.Andorn等人所描述的培養(yǎng)基(Appi.Micro-biol.Biotechnol.，28,356-360,1988)以及其所引文獻(xiàn)中的培養(yǎng)基；Stainer-Scholte培養(yǎng)基(J.Gen.Microbiol.，63,211-220，1971)；A.Imaizumi等人所描述的改良的Stainer-Scholte培養(yǎng)基(Infect.Immun.，41，3，1138-1143，1983及J.Microbiol.Methods，2，339-347，1984)；Verway培養(yǎng)基(US4784589)；合成培養(yǎng)基B2(P.Van Hemert；Prog.Indust.Microbiol.；(Bull，M.J.ed.)，Vol 13，p.151，Elsevier Sci.，Amsterdam(1977))或其所描述的改良培養(yǎng)基。
為了培養(yǎng)本發(fā)明的起始材料百日咳桿菌，把種菌加到一合適的液體培養(yǎng)基中，并用本領(lǐng)域所知的常規(guī)發(fā)酵方法和發(fā)酵裝置進(jìn)行發(fā)酵。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員懂得，基于所選擇的常規(guī)發(fā)酵裝置、發(fā)酵培養(yǎng)基、方法及參數(shù)的不同組合，會(huì)獲得不同的結(jié)果。用于本發(fā)明的優(yōu)選組合是那些適用于大規(guī)模生產(chǎn)的組合。關(guān)于方法、裝置及培養(yǎng)基的這種組合的例子示于EP-A-0077646，更好的例子是在EP-A-0121249及EP-A-0239504中。
發(fā)酵完成后，對(duì)這種百日咳桿菌發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚硪猿ブ苯臃置诘揭后w培養(yǎng)基中的抗原性因子PT和FHA，例如，用EP-A-0427462中所描述的方法，使抗原性因子吸附到羥基磷灰石上，其方法引入本文作為參考。
余下的含有69kD細(xì)胞結(jié)合蛋白的微生物懸液，在進(jìn)行熱處理以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)釋放之前，先按照本發(fā)明用一種絮凝劑處理。
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)控制上清液的pH值，可使殘留的內(nèi)毒素含量降到最小值。通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)，即可選擇出任一所選絮凝劑的最適pH。因此，在加入例如鋇、鈣或鍶的鹵化鹽(優(yōu)選氯化鋇)水溶液之前或之后，用堿把上清液的pH調(diào)整至pH4-10之間，最好是在pH8.5-9.5之間。液體體積可通過(guò)加入緩沖液進(jìn)行調(diào)整，如用TRIS緩沖液。適當(dāng)混勻約5分鐘后，讓所得的懸浮液絮凝約1小時(shí)。然后分離并棄掉上清液，此上清液中含有未用完的生長(zhǎng)培養(yǎng)基成分(鹽、氨基酸、礦物質(zhì)等)、以及在培養(yǎng)過(guò)程中釋放到液體培養(yǎng)基中的其它蛋白物質(zhì)和內(nèi)毒素，所獲絮凝物可進(jìn)一步用緩沖液或鹽水洗滌。或在洗滌之前離心把絮凝細(xì)胞分離出來(lái)。
由于存在于發(fā)酵液中的高濃度的鹽、氨基酸和礦物質(zhì)會(huì)干擾隨后的純化步驟，所以這種絮凝/洗滌處理過(guò)程可能需要重復(fù)多次，直至所獲得的絮凝細(xì)胞懸浮液中鹵化鹽含量降低至一個(gè)可接受的水平(如約0.02％w/v)。
然后把絮凝細(xì)胞懸浮液于約60℃下熱處理15-60分鐘，在此期間，69kD蛋白被釋放到液體懸液中，細(xì)菌被殺死。冷卻(如在約4℃下)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(最好過(guò)夜)后，把死細(xì)胞去掉(如用傾析或離心)，上清液過(guò)濾后，于無(wú)菌狀態(tài)下低溫(如約4℃下)保存。
然后用在此領(lǐng)域已知的適當(dāng)技術(shù)，把69kD蛋白進(jìn)行下游純化。優(yōu)選采用離子交換、疏水作用和分子阻隔層析三者的組合，對(duì)69KD蛋白進(jìn)行純化。合適的層析載體包括陰離子交換，如DEAE-Se-pharose、Q-Sepharose、SP-Sepharose、CM-Sepharose；疏水作用，如Butyl-(丁基-)、Phenyl-(苯基-)、Octyl-(辛基-)Sepharose、TSK；以及凝膠過(guò)濾，如Sephacryl、Sepharose、Sephadex(交聯(lián)葡聚糖)、Superose、Superdex等等。
這種高度純化了的69kD蛋白可采用過(guò)濾除菌，如有必要，可進(jìn)行雙過(guò)濾(diafiltration)。
對(duì)以上所描述的方法分離而得的純化的69kD外膜蛋白抗原，可用此領(lǐng)域內(nèi)熟知的技術(shù)來(lái)鑒定，例如用SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)并用單克隆抗體進(jìn)行Western印跡(Western blot)分析而確定。其純度可用SDS-PAGE進(jìn)行定性分析，定量分析則可用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))或HPLC(高壓液相層析)方法。
按照本發(fā)明所生產(chǎn)的純化的69kD蛋白，ELISA檢測(cè)表明其PT和FHA含量低于檢出靈敏度極限值。沒(méi)有可檢出的PT活性(CHO細(xì)胞)。用LAL-CS(鱟屬變形細(xì)胞溶解產(chǎn)物-生色底物，Limulus AmoebocyteLysate-Chromogenic Substrate)檢測(cè)表明內(nèi)毒素含量低于0.1單位/mcg(μg)蛋白。該69kD蛋白沒(méi)有可檢出的腺苷酸環(huán)化酶活性。用Western印跡方法分析其腺苷酸環(huán)化酶為陰性。
所得的69KD蛋白可用作一種無(wú)細(xì)胞疫苗的抗原成分，注射這種疫苗可激發(fā)對(duì)百日咳桿菌感染的一種保護(hù)性抗體反應(yīng)。這樣的疫苗可用常規(guī)方法制備，如，可制備一種疫苗，其水溶液中含有一些抗原因子和一種合適的常規(guī)載體，并把其pH緩沖至生理pH值，以便可直接使用。另一種方法是，也可把抗原因子吸附到一個(gè)常規(guī)的佐劑上，如氫氧化鋁或磷酸鋁。此外，也可以把一種或多種百日咳桿菌抗原(包括69kD蛋白)與其它免疫原組合起來(lái)制備成多價(jià)疫苗，可誘導(dǎo)對(duì)多于一種病原體的保護(hù)作用。
本發(fā)明還有其特殊的用途，它可作為從單一的百日咳桿菌發(fā)酵液中分離和純化幾種無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗候選蛋白抗原的整個(gè)處理過(guò)程的一部分。因此，可以從同一份發(fā)酵液中分別分離獲得純化形式的PT、FHA和69kD蛋白，用于共同組成一個(gè)單一的百日咳疫苗?？砂凑誆P-A-0427466中所描述的方法對(duì)百日咳桿菌發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)處理以分離出PT和FHA，余下的上清液則用本發(fā)明所描述的方法進(jìn)行處理以獲得69kD蛋白。百日咳毒素可按照WO91/12020中所述的方法進(jìn)行類毒素化，其方法引入本文作為參考。已分別純化的抗原成分可被分別佐劑化，然后合并起來(lái)。
通過(guò)加入一種絮凝劑(優(yōu)選的是一種二價(jià)陽(yáng)離子)，從溶液中提取細(xì)胞結(jié)合蛋白并去除內(nèi)毒素的方法并不僅限于從致病的百日咳微生物(如百日咳桿菌)中分離外膜蛋白(如Pertactin)。本發(fā)明的方法在任何涉及預(yù)防的或治療的外膜蛋白的生物學(xué)生產(chǎn)過(guò)程中都有其實(shí)用性。可以從本發(fā)明受益的其它生物學(xué)處理過(guò)程的典型例子有a)從腦膜炎屬(Meningitidis)菌種如腦膜炎雙球菌(Neisseriameningitidis)中生產(chǎn)外膜蛋白；b)從大腸桿菌(E.Coli)中生產(chǎn)菌毛(Pili)和凝集素；c)從嗜血桿菌屬菌種如流感嗜血桿菌(Haemophilus influen-zae)中生產(chǎn)外膜蛋白；d)從包柔氏螺旋體屬菌種如Borrelia burgdorferi中生產(chǎn)外膜蛋白；e)從鏈球菌屬菌種如甲型和乙型鏈球菌(Streptococcus)菌株中生產(chǎn)外膜蛋白。
可根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的生物學(xué)產(chǎn)品并不僅局限于用于人類的蛋白質(zhì)?？墒芤娴牧硪恍┓椒ǖ牡湫屠邮?，分離外膜蛋白用于f)鼻炎疫苗的生產(chǎn)，此病可侵襲豬，是由支氣管敗血性博代氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)和Haemophilus Pleuropneumo-niae引起的；q)大腸桿菌病(Colibacillosis)疫苗的生產(chǎn)，此病可侵襲豬，是由大腸桿菌(E.Coli)引起的；h)一種用于鉤端螺旋體病(Leptospirosis)ELISA檢測(cè)的抗原的生產(chǎn)(此病的侵襲對(duì)象是家畜、牛犢和人類)。
通過(guò)下面關(guān)于從百日咳桿菌中提取69kD外膜蛋白的實(shí)施例，舉例說(shuō)明了(但不是限定了)本發(fā)明的方法。
在附圖中

圖1顯示實(shí)施例1中所檢測(cè)的4種絮凝劑對(duì)純化的69kD蛋白絮凝試驗(yàn)的SDS-PAGE結(jié)果；圖2顯示實(shí)施例1中所檢測(cè)的4種絮凝劑對(duì)純化的69kD蛋白絮凝試驗(yàn)的Western印跡結(jié)果；圖3顯示實(shí)施例2中所檢測(cè)的3種絮凝劑對(duì)純化的69kD蛋白絮凝試驗(yàn)的SDS-PAGE結(jié)果及一個(gè)非絮凝化對(duì)照；圖4顯示實(shí)施例2中所檢測(cè)的3種絮凝劑對(duì)純化的69kD蛋白絮凝試驗(yàn)的Western印跡結(jié)果及一個(gè)非絮凝化對(duì)照；圖5顯示實(shí)施例3中所描述的氯化鋇絮凝試驗(yàn)的SDS-PAGE結(jié)果；
圖6顯示實(shí)施例3中所描述的氯化鋇絮凝試驗(yàn)的Western印跡結(jié)果。
實(shí)施例1絮凝試驗(yàn)在控制的發(fā)酵條件下培養(yǎng)百日咳桿菌Tohama株，使獲得的細(xì)胞懸液量足以用羥基磷灰石凝膠吸附方法從上清液中提取PT和FHA。剩余的細(xì)胞懸液用下列步驟處理1)使懸液冷卻至4℃，并分成50ml的等份樣品。
2)每份樣品中分別加入下列絮凝劑之一使其達(dá)到所標(biāo)明的終濃度葡聚糖T500(10g/L)，氯化鈣(10g/L)，甲醇(20％)，及聚乙二醇50000(10g/L)。
3)在充分混勻下，將每份樣品的pH調(diào)整至事先決定的pH值(葡聚糖T500，pH5；氯化鈣，pH4和9；甲醇，pH6；聚乙二醇50000，pH5)。然后將樣品于4℃下靜置使其絮凝。
4)傾析掉上清液，并代之以等體積的125mM TRIS緩沖液。重新懸浮后，將樣品置水浴中加熱至60℃并在60℃保持1小時(shí)。為保證均勻的溫度分布，定期(每隔5分鐘)振搖每份樣品。
5)在不搖動(dòng)的情況下冷卻至4℃后，死細(xì)胞重新絮凝。離心后，對(duì)每份樣品的上清液進(jìn)行以下測(cè)試不僅用SDS-PAGE、Westernblot和ELISA檢測(cè)69kD蛋白的存在，也用LAL-CS試驗(yàn)檢測(cè)所污染的內(nèi)毒素的存在。
SDS-PAGE和Western blot的結(jié)果分別見(jiàn)圖1和圖2。每份樣品(對(duì)應(yīng)于一種絮凝劑)被點(diǎn)到凝膠和濾膜的兩個(gè)相鄰的樣品槽上，點(diǎn)樣量分別為15μl和45μl。其余的3個(gè)樣品槽被點(diǎn)上點(diǎn)樣量連續(xù)增加(6.8μl、13.6μl和27.2μl)的純化的69kD蛋白溶液，其濃度為55mg/L。關(guān)于在凝膠中和Western blot中的樣品槽說(shuō)明可見(jiàn)下表表1槽號(hào) 樣品號(hào) 絮凝劑 濃度 pH 點(diǎn)樣量(μL)1 1葡聚糖 10g/L 5152 453 2 CaCl210g/L 4154 455 3 CaCl210g/L 9156 457 4 甲醇20％ 6158 459 5 聚乙二醇 10g/L 51510 4511 69kD蛋白液6.812 13.613 27.2ELISA和LAL-CS檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)下表
表2樣品號(hào) 絮凝劑 濃度 pH ELISA 內(nèi)毒素(mg/L)(mg/L)1 葡聚糖 10g/L 5 24.3 ＞152 CaCl210g/L 4 22.8 ＞153 CaCl210g/L 9 20.3 ＜154甲醇 20％ 6 27.5 ＞155 聚乙二醇10g/L 5 31.1 ＞15圖1和圖2表明，69kD蛋白存在于極大多數(shù)樣品中，并顯示其所在位置。列于上表2的ELISA檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了69kD蛋白的存在。
盡管在pH4和pH9下，CaCl2均可引起絮凝作用，但凝膠上的槽5和6(圖1)顯示了一個(gè)特別顯著的例子，即用CaCl2在pH9下處理后，上清液中所存在的內(nèi)毒素含量顯著降低。這已被列于上面表2中的LAL-CS檢測(cè)結(jié)果所證實(shí)。
實(shí)施例2二價(jià)陽(yáng)離子的選擇采用實(shí)施例1中所述的方法進(jìn)行絮凝試驗(yàn)，使用濃度為10g/L、pH值為9的以下鹵化鹽氯化鈣、氯化鋇及氯化鍶。
SDS-PAGE和Western blot結(jié)果分別示于圖3和圖4。前3個(gè)樣品槽加的是濃度為55mg/L的純化69kD蛋白溶液，點(diǎn)樣量連續(xù)增加(6.8μl、13.6μl和27.2μl)，最后1個(gè)樣品槽加的是細(xì)胞懸液的非絮凝化對(duì)照樣品。關(guān)于凝膠中和Western blot中的樣品槽說(shuō)明如下表所示表3槽號(hào)樣品號(hào) 絮凝劑 點(diǎn)樣量(μL)1 69kD蛋白液 6.82 13.63 27.241 CaCl24552 BaCl24563 SrCl24574對(duì)照 45ELISA檢測(cè)結(jié)果示于下表表4樣品號(hào)絮凝劑 ELISA(mg/L)1 CaCl215.12 BaCl215.83 SrCl28.64對(duì)照 13.5
圖3和圖4顯示了69kD蛋白存在于所有樣品中及其所在位置。在對(duì)照樣品中(條帶7)觀察到的69kD蛋白帶的密度明顯低于被二價(jià)陽(yáng)離子絮凝過(guò)的樣品中的69kD蛋白帶(條帶4、5和6)，表明在非絮凝化樣品的上清液中，69kD蛋白的濃度明顯偏低。
表4中ELISA檢測(cè)得出的低濃度69kD蛋白結(jié)果給人的印象是鍶不如鈣或鋇有效。但這一觀察結(jié)果并未反映在凝膠中(圖3)或印跡中(圖4)。
然而，用鈣或鋇絮凝的樣品，在其上清液中觀察到的69kD蛋白的濃度，在ELISA檢測(cè)中兩者大致相等；在凝膠和印跡中得出的69kD蛋白帶兩者密度相似。
肉眼觀察絮凝過(guò)程，根據(jù)絮凝作用的速度和浮塊的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)用鋇比用鈣和鍶稍有效些。
實(shí)施例3絮凝和洗滌程序采用下列程序進(jìn)行絮凝和洗滌1)把提取PT和FHA后剩下的細(xì)胞懸液冷卻至4℃，并分成4等份樣品，每份50ml。留出一份作為對(duì)照。
2)其余3份樣品中均加入氯化鋇，使其終濃度為10g/L。在充分混勻下，用一合適的堿把細(xì)胞懸液的pH值調(diào)整至pH9。
3)懸液于4℃下靜置使其絮凝。
4)把沉淀物上的上清液傾析除去后，分別向沉淀物中加入3種不同濃度的TRIS緩沖液(125、50或20mM)(每份沉淀物加入一種濃度)，使其最終體積為50ml。
5)重新懸浮后，把3份樣品于4℃下靜置，進(jìn)行第二次絮凝。
6)重復(fù)上述4)和5)的程序多次，直至把氯化鋇的濃度稀釋至約0.2g/L。
7)將對(duì)照樣品于10,000g離心1小時(shí)，棄去上清液，并代之以等體積的125mM TRIS緩沖液。
8)最后一次把樣品重懸于所要求濃度的TRIS緩沖液中后，把所有樣品(包括對(duì)照)置于水浴中加熱至60℃，并維持1小時(shí)。定期(每隔5分鐘)振搖每份樣品，以保證有一個(gè)均勻的溫度分布。
9)在不搖動(dòng)下把所有樣品冷卻至4℃后，含氯化鋇的樣品中的死細(xì)胞發(fā)生重新絮凝并將對(duì)照樣品中的死細(xì)胞于10,000g下重新離心1小時(shí)。
10)用SDS-PAGE、Western blot和ELISA方法檢測(cè)來(lái)自每份樣品(包括對(duì)照)的上清液中的69kD蛋白。
SDS-PAGE及Western blot的結(jié)果分別示于圖5和圖6。每份樣品被點(diǎn)到凝膠和濾膜的兩個(gè)相鄰的樣品槽上，點(diǎn)樣量分別為15μl和45μl。關(guān)于凝膠中和Western blot中的樣品槽說(shuō)明可見(jiàn)下表
表5槽號(hào) 樣品 點(diǎn)樣量(μL)1 對(duì)照 152 453 TRIS 125mM154 455 TRIS 50mM 156 457 TRIS 20mM 158 45ELISA檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)下表
表6樣品 ELISA(mg/L)對(duì)照 30TRIS 125mM 22TRIS 50mM 24TRIS 20mM 33圖5和圖6顯示出所有樣品中均存在69kD蛋白及其所在位置。上面表6顯示的ELISA檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了69kD蛋白的存在。
經(jīng)過(guò)如上所述的反復(fù)絮凝和洗滌步驟后，細(xì)胞懸液的上清液中仍存在69kD蛋白而且其濃度相似，表明應(yīng)用這一技術(shù)，可大大降低懸浮液體培養(yǎng)基的離子強(qiáng)度，而不會(huì)對(duì)從百日咳桿菌中69kD蛋白的提取及其產(chǎn)量產(chǎn)生不良的影響。
此外，氯化鋇作為一種絮凝劑，即使它在上清液中的濃度低至0.2g/L，其有效性亦得到證實(shí)。
權(quán)利要求
1.一種可提高細(xì)菌來(lái)源的細(xì)胞外膜結(jié)合蛋白分離效果的方法，包括用熱處理使這種蛋白質(zhì)從宿主細(xì)胞中釋放出來(lái)，其特征是，在熱處理前，把這種細(xì)胞結(jié)合蛋白的懸浮液與一種絮凝劑相接觸。
2.一種如權(quán)利要求1中所述的方法，其中，該細(xì)胞結(jié)合蛋白是一種博代氏桿菌屬(Bordetella)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、鏈球菌屬(Streptococcus)或包柔氏螺旋體屬(Borrelia)菌種的外膜蛋白。
3.一種如權(quán)利要求2中所述的方法，其中，該外膜蛋白質(zhì)是百日咳桿菌(Bordetella pertussis)的69kD蛋白。
4.一種如權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，該絮凝劑是一種含有一個(gè)二價(jià)陽(yáng)離子的物質(zhì)。
5.一種如權(quán)利要求4所述的方法，其中，該絮凝劑是鋇鹽、鈣鹽或鍶鹽。
6.一種如權(quán)利要求5所述的方法，其中的鹽是一種鹵化物。
7.一種如權(quán)利要求6所述的方法，其中的鹽是一種氯化物。
8.一種如權(quán)利要求7所述的方法，其中的鹽是氯化鋇。
9.一種如權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述的方法，其中，該細(xì)胞結(jié)合蛋白懸浮于pH值在pH4-10范圍的上清液中。
10.一種無(wú)細(xì)胞疫苗，包括一種細(xì)菌來(lái)源的細(xì)胞結(jié)合外膜蛋白，這種蛋白是在把宿主細(xì)胞懸液與一種絮凝劑接觸后再進(jìn)行熱處理時(shí)從宿主細(xì)胞釋放出來(lái)。
全文摘要
提取細(xì)菌來(lái)源的細(xì)胞結(jié)合蛋白的方法，包括，在熱處理前，將細(xì)胞結(jié)合蛋白懸液與絮凝劑接觸。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1121724SQ94191888
公開(kāi)日1996年5月1日 申請(qǐng)日期1994年2月28日 優(yōu)先權(quán)日1993年3月4日
發(fā)明者卡林·卡佩烏, 馬丁·庫(kù)默貝奇, 皮特·羅蘭特斯, 讓·彼得 申請(qǐng)人:史密斯克萊·比奇曼生物公司