專利名稱：用于鑒定能改變細(xì)胞蛋白表達(dá)的試劑的高通量分析系統(tǒng)及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于鑒定能改變細(xì)胞蛋白、尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的內(nèi)在膜蛋白(或整合膜蛋白)表達(dá)水平的試劑的高通量分析系統(tǒng)及方法。
背景技術(shù)：
對(duì)周圍環(huán)境產(chǎn)生反應(yīng)的能力以及控制分子進(jìn)出細(xì)胞膜是任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞基本的重要功能。這些功能在相當(dāng)程度上歸因于全部或部分駐留于細(xì)胞膜內(nèi)的多種蛋白。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞膜對(duì)水溶性物質(zhì)如離子、小無(wú)機(jī)分子、肽以及蛋白是相對(duì)不可滲透的。為了進(jìn)入和/或影響細(xì)胞，這樣的親水性物質(zhì)必須與至少一種蛋白(例如，受體、離子通道或者轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)相互作用，該蛋白駐留在細(xì)胞膜內(nèi)并且在細(xì)胞表面上至少部分暴露于胞外環(huán)境(extracellular milieu)中。相反，親脂性物質(zhì)如類固醇能夠直接通過(guò)細(xì)胞膜擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)中，然后在胞質(zhì)中親脂性物質(zhì)與一種或多種目的蛋白相互作用。
當(dāng)外部刺激分子(例如，肽或者有機(jī)或無(wú)機(jī)分子)與細(xì)胞表面蛋白相互作用時(shí)，存在兩種來(lái)自細(xì)胞的基本反應(yīng)(i)通過(guò)穿過(guò)脂質(zhì)雙層的傳輸，將離子或分子(或大分子)物質(zhì)借助載體從細(xì)胞膜的外部傳送到細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)，反之亦然；和/或(ii)通過(guò)膜蛋白的變化(例如，膜蛋白的構(gòu)造變化和/或/)膜蛋白聚集狀態(tài)的變化)將信號(hào)傳送至胞質(zhì)或其中的蛋白。
穿過(guò)細(xì)胞的信號(hào)傳輸(信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))起始于胞外物質(zhì)(離子、小分子、蛋白)結(jié)合至駐留在細(xì)胞膜中的蛋白的胞外區(qū)(或胞外結(jié)構(gòu)域)。該物質(zhì)結(jié)合到跨膜蛋白的胞外區(qū)使得該蛋白從非活性形式變?yōu)榛钚孕问健Ｈ缓?，這種活性形式激發(fā)催化活性，或者某種類似反應(yīng)，從而產(chǎn)生胞質(zhì)信號(hào)(有時(shí)該信號(hào)為細(xì)胞質(zhì)中的一種或多種第二信使物質(zhì)的形式)。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在兩種主要類型的這種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(i)跨膜蛋白的胞質(zhì)區(qū)可以具有蛋白激酶活性，當(dāng)胞外物質(zhì)結(jié)合到跨膜蛋白上時(shí)，跨膜蛋白的活性被激活(然后激酶將其自身的胞質(zhì)區(qū)磷酸化，這使跨膜蛋白能夠結(jié)合并激活另一蛋白，而后者又依次作用于細(xì)胞質(zhì)中的其它蛋白和物質(zhì))；以及(ii)跨膜蛋白可以和與細(xì)胞膜相連的G蛋白相互作用，使得結(jié)合到G蛋白上的GDP(二磷酸鳥(niǎo)嘌呤)被GTP取代，從而造成G蛋白解離成單體和二聚物片段，接著，單體和二聚物片段中兩者之一或兩者又作用于目的蛋白(該蛋白也常與細(xì)胞膜相連，同樣地，要求它隨后作用于細(xì)胞質(zhì)中其它目的蛋白)。
物質(zhì)穿過(guò)細(xì)胞膜的物理傳送允許寬范圍的物質(zhì)進(jìn)入和/或離開(kāi)細(xì)胞，包括離子、小分子(如糖和激素)以及大分子(如蛋白和酶)。這種物質(zhì)傳送存在三種主要途徑(i)駐留在細(xì)胞膜中的蛋白可以形成通道，使離子(如鈉、鉀和氯離子)從胞外環(huán)境穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，反之亦然；(ii)駐留在細(xì)胞膜中的蛋白能在細(xì)胞膜的一側(cè)結(jié)合小分子如糖，然后在細(xì)胞膜的相對(duì)側(cè)釋放該分子，從而起到運(yùn)載體的作用；以及(iii)駐留在細(xì)胞膜中的蛋白可以結(jié)合小分子并因此觸發(fā)內(nèi)化(internalization)過(guò)程，其中通過(guò)內(nèi)吞作用將已結(jié)合的蛋白分子對(duì)帶入細(xì)胞內(nèi)(在某些位點(diǎn)，蛋白分子對(duì)解離；然后蛋白返回到細(xì)胞表面與另一小分子相互作用或者被降解)。
所有這些蛋白的一般特性包括相對(duì)較大的大小、跨越細(xì)胞膜的多疏水區(qū)以及親水性的胞外區(qū)和/或胞內(nèi)區(qū)。
至于大分子物質(zhì)的通過(guò)或運(yùn)輸，蛋白啟動(dòng)了一個(gè)通路，通過(guò)共翻譯轉(zhuǎn)移使蛋白直接從核糖體分泌至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜。然后，這些蛋白轉(zhuǎn)移至高爾基體(Golgi apparatus)中，根據(jù)最終目的進(jìn)行分選，并朝細(xì)胞膜移動(dòng)。
更具體地，在合成過(guò)程中蛋白進(jìn)入ER，并至少部分折疊及糖基化。然后，該蛋白轉(zhuǎn)移到高爾基體的順式(cis)表面(此時(shí)，將要駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白返回到ER)。當(dāng)?shù)鞍讖捻樖?cis)到反式(trans)穿過(guò)高爾基堆疊體(stack)時(shí)，發(fā)生進(jìn)一步糖基化。特異信號(hào)使一些蛋白返回ER、一些蛋白保留在高爾基體中、一些蛋白傳送到核內(nèi)體和溶酶體、一些蛋白(細(xì)胞表面蛋白)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜并駐留其中。
那些運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜并駐留其中的蛋白經(jīng)歷最長(zhǎng)且最廣泛的運(yùn)輸路徑(trafficking pathway)，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜隨后穿過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)小泡(transition vesicle)、高爾基復(fù)合物和分泌小泡(secretory vesicle)的膜，然后才到達(dá)其最終目的地。這些蛋白包括主動(dòng)和被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及細(xì)胞表面受體。
為了說(shuō)明運(yùn)輸路徑的復(fù)雜性，內(nèi)襯于體腔的上皮細(xì)胞中，ER的分選和分布機(jī)理將不同的蛋白置于細(xì)胞膜的不同亞部(subpart)。例如，腸上皮細(xì)胞中運(yùn)輸糖和氨基酸的蛋白分布在細(xì)胞膜面向腸腔的區(qū)域。MHC分子和結(jié)合抗體的poly-Ig受體在面向體內(nèi)一側(cè)的相對(duì)側(cè)的上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜片段中卷攏(wind up)。
下表是一些已知的細(xì)胞表面分子、受體以及膜相關(guān)蛋白。



因此，對(duì)多種不同前景以及多個(gè)預(yù)定目標(biāo)來(lái)說(shuō)，鑒定能改變一種或多種這些蛋白的表達(dá)水平的化合物是非常重要的。例如，鑒定能改變特定蛋白表達(dá)水平的化合物可能導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)新的治療藥劑?？蛇x地，這樣的鑒定可能導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)缺陷或失調(diào)的原因或途徑。以這種方式，開(kāi)辟了全新的研究領(lǐng)域以及大量以前未知的可能用于治療干預(yù)的靶點(diǎn)。
另外，鑒定能改變一種或多種這些蛋白表達(dá)水平的化合物應(yīng)該包括直接或者間接影響蛋白表達(dá)水平的化合物。改變內(nèi)在膜蛋白(integral membrane protein)表達(dá)水平的化合物可以直接影響蛋白表達(dá)，例如，通過(guò)直接結(jié)合到蛋白上并抑制其運(yùn)輸(trafficking)?？蛇x地，化合物可以間接改變蛋白表達(dá)水平，例如通過(guò)作用于一種有助于細(xì)胞膜中膜蛋白運(yùn)輸和整合的伴侶蛋白，或者通過(guò)作用于降解目標(biāo)膜蛋白的蛋白。
因此，在本領(lǐng)域存在對(duì)鑒定能改變蛋白、尤其內(nèi)在膜蛋白表達(dá)水平的化合物的分析方法的需要，以及對(duì)改變蛋白水平的機(jī)理的需要。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供分析(法)和方法，用于鑒定能改變蛋白、尤其內(nèi)在膜蛋白如心臟離子通道的表達(dá)水平的試劑。這樣的試劑可以是來(lái)自化合物文庫(kù)的化合物或者來(lái)自DNA文庫(kù)的肽。
根據(jù)這些目的和其它目的，本發(fā)明的第一實(shí)施例針對(duì)用于鑒定(能)改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上蛋白表達(dá)水平的試劑的方法，包括a)制備培養(yǎng)基，其含有表達(dá)興趣蛋白(protein of interest)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；b)加入有效量的候選試劑；c)在候選試劑存在時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)足夠的時(shí)間；d)用固定劑(fixtive)處理細(xì)胞；e)加入至少一種有效量的能結(jié)合到蛋白上的抗體；以及f)測(cè)定結(jié)合水平，其中，結(jié)合水平的變化表明候選試劑能改變蛋白表達(dá)水平。
本發(fā)明的第二實(shí)施例針對(duì)用于鑒定能改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白總體表達(dá)水平的試劑的方法，包括a)制備培養(yǎng)基，其含有表達(dá)興趣蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；b)加入有效量的候選試劑；c)在候選試劑存在時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)足夠的時(shí)間；d)先用固定劑隨后用透化劑(permeabilizing agent)處理細(xì)胞；e)加入有效量的至少一種結(jié)合到蛋白上的抗體；以及f)測(cè)定結(jié)合水平，其中，結(jié)合水平的變化表明候選試劑改變了蛋白表達(dá)水平。
本發(fā)明的第三實(shí)施例針對(duì)用于鑒定封閉哺乳動(dòng)物細(xì)胞中離子通道的試劑的方法，包括(i)實(shí)施上述本發(fā)明的第一實(shí)施例的方法，以便確定該試劑是否改變離子通道的表達(dá)水平；(ii)采用蛋白印跡法(Western blot assay)以確定該試劑是否改變離子通道的成熟；以及(iii)采用尾電流分析法以便確定該試劑是否改變離子通道的功效(functional effect)。
本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目的和特征，部分將在下面的說(shuō)明中闡述，部分在查看下述內(nèi)容后對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)變得顯而易見(jiàn)，或者通過(guò)本發(fā)明的實(shí)施而被掌握。本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)可以實(shí)現(xiàn)并獲得，如所附權(quán)利要求所特別指出的。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例包括用于鑒定試劑的分析系統(tǒng)和方法，該試劑結(jié)合蛋白(如膜離子通道)，從而增加或減少其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。在某些特別優(yōu)選的實(shí)施例中，該分析法和系統(tǒng)測(cè)定試劑結(jié)合到蛋白上從而改變其表面表達(dá)的能力。表面表達(dá)的這種改變可以由結(jié)合蛋白特定位點(diǎn)的試劑產(chǎn)生，和/或由減少或者促進(jìn)蛋白的胞內(nèi)運(yùn)輸和/或加工的試劑產(chǎn)生。另外，這樣的改變還可以由結(jié)合到興趣蛋白以外的蛋白上從而間接改變蛋白表達(dá)水平的試劑產(chǎn)生。
現(xiàn)存在多種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知且可獲得的形式(format)用于恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)合分析。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，將一種或多種表達(dá)興趣蛋白的細(xì)胞在合適的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并使其暴露于一種或多種候選化合物，而在其它實(shí)施例中細(xì)胞則可以固定在表面上。類似地，根據(jù)本發(fā)明的其它一些實(shí)施例，可以將一種或多種候選化合物固定在表面上，并暴露于含有一種或多種表達(dá)興趣蛋白的細(xì)胞的液體培養(yǎng)基，或者將候選化合物包含在合適的液體培養(yǎng)基中，將一種或多種表達(dá)興趣蛋白的細(xì)胞加入到該培養(yǎng)基中。
在其中至少一種候選化合物和興趣蛋白被標(biāo)記(例如，用熒光、放射性、酶、抗體等，包括其組合，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的)的系統(tǒng)中通常更容易檢測(cè)結(jié)合。在將候選化合物暴露于表達(dá)蛋白的細(xì)胞并洗掉或者用別的方式除掉未結(jié)合的試劑之后，測(cè)定標(biāo)記部分的存在(即，結(jié)合到該測(cè)定系統(tǒng)的未標(biāo)記成分上)。
用于進(jìn)行多種結(jié)合分析的方法在本領(lǐng)域是為人熟知的，包括但不限于如在PCT申請(qǐng)US98/18368中所述的那些分析系統(tǒng)。多個(gè)參考文獻(xiàn)提供了對(duì)用于蛋白結(jié)合分析法的多種形式的一般性描述，包括競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析法和直接結(jié)合分析法(見(jiàn)例如，Stites and Terr，Basicand Clinical Immunology，7th ed.(1991)；Maggio，EnzymeImmunoassay，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1980)；and Tijssen，Practice and TheoLy of Enzyme Immunoassays，in LaboratoryTeelmiques in Biochemistry and Molecular Biology，Elsevier SciencePublishers，B.V.Amsterdam，(1985))。
本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施例涉及鑒定化合物的分析系統(tǒng)和方法，該化合物通過(guò)改變蛋白的活性和/或通過(guò)改變(封閉或促進(jìn))蛋白的胞內(nèi)運(yùn)輸和/或加工來(lái)增加或減少興趣蛋白的表達(dá)。
因此，根據(jù)某些特別優(yōu)選的實(shí)施例，提供了免疫測(cè)定法，其中，表達(dá)興趣蛋白的一種或多種細(xì)胞通常結(jié)合到合適的固相載體上(如微孔板的孔、微縮卡或者任何為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的類似形式)，并與候選試劑結(jié)合，觀察興趣蛋白表達(dá)水平的變化。因此，在這些優(yōu)選的實(shí)施例中，一種或多種分析成分附著到固體表面上。
根據(jù)某些實(shí)施例，例如當(dāng)興趣蛋白不在細(xì)胞表面表達(dá)時(shí)，可以使用透化劑。這樣的透化劑有助于抗體、尤其是標(biāo)記的抗體穿透進(jìn)入細(xì)胞中。
透化劑優(yōu)選包含洗滌劑(detergent)，更優(yōu)選陰離子洗滌劑。合適的洗滌劑對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知且可得到的。合適的陰離子洗滌劑的示例性實(shí)例包括例如二氧膽酸鈉、N-十二烷基肌氨酸鹽以及十二烷基硫酸鈉。
洗滌劑的濃度取決于例如所采用的具體洗滌劑，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。合適的濃度可以在0.001％至10％之間，例如在0.01％至5％之間。
透化劑還優(yōu)選包含寡糖，如海藻糖。透化劑中的寡糖濃度將取決于例如所采用的具體洗滌劑和寡糖，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。合適濃度的示例性實(shí)例在0.001M至1.0M的范圍，優(yōu)選在0.01M至0.1M的范圍。
透化劑的pH可以是適合于被研究的特定蛋白和所采用的細(xì)胞系(cell line)的任何水平，優(yōu)選通常在3至8之間。合適的pH(或pH范圍)可以通過(guò)加入本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知且可獲得的一種或合適的緩沖劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。
透化緩沖液(permeabilizing buffer)優(yōu)選大致等滲壓的，可以包含一種或多種用于調(diào)節(jié)其等滲壓性的合適試劑，如氯化鈉。
在一些實(shí)施例中，分析系統(tǒng)可以用于(如在本領(lǐng)域已知的)檢測(cè)由于候選試劑的結(jié)合而引起的興趣蛋白表面表達(dá)的變化。例如，如果興趣蛋白是膜離子通道，可以使用膜片鉗分析法(patch clampassay)檢測(cè)離子穿過(guò)膜的通量變化，其可指示離子通道的表面表達(dá)水平的提高。
在可選實(shí)施例中，使用了間接免疫分析系統(tǒng)，其中，通過(guò)加入一種或多種針對(duì)蛋白抗原決定簇的抗體對(duì)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，正如本領(lǐng)域中所知的。如果該蛋白不在細(xì)胞表面表達(dá)，可能需要加入透化劑以促進(jìn)抗體穿透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。
當(dāng)本發(fā)明的方法中使用固相載體時(shí)，幾乎任何固體表面均合適，只要表面材料與分析試劑相容并且可能將成分粘附到表面而不過(guò)度改變分析成分的反應(yīng)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到在固相分析中一些成分表現(xiàn)出活性降低，但是只要活性足以被檢測(cè)和/或定量，通常是可以接受的。
合適的固相載體包括但不限于材料或細(xì)胞可以粘附的任何固相表面，如玻璃珠、平面玻璃、可控孔徑玻璃、塑性多孔塑性金屬、或樹(shù)脂等。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到在一些實(shí)施例中，在本發(fā)明方法中的固相載體可以通過(guò)官能團(tuán)(例如，羥基、胺、羧基、酯、以及硫氫基)衍生以便為連接子(1inker)的粘附提供反應(yīng)位點(diǎn)，或者通過(guò)候選試劑或其它分析成分的直接粘附。
分析成分粘附到固相載體上可以是直接的(即，成分直接接觸固相表面)或者間接的(即，試劑和/或成分(例如抗體)結(jié)合到載體上，其它分析成分結(jié)合到該試劑或成分上而不是結(jié)合到固相載體上)。在一些實(shí)施例中，試劑或成分為共價(jià)固定的(例如，使用半胱氨酸的單反應(yīng)硫醇基團(tuán)用于錨定蛋白成分(見(jiàn)例如，Bioconjug.Chem.，4528-536(1993))、或者非共價(jià)但特定的(例如通過(guò)所固定的抗體或者其它特異結(jié)合蛋白(見(jiàn)例如，Adv.Mater.，3388-391(1991)；Anal.Chem.，6783-87(1995)))、生物素/抗生蛋白鏈菌素系統(tǒng)(見(jiàn)例如，Biophys.Biochem.Res.Commun.，23076-80(1997))、或者金屬螯合的Langmuir-Blodgett膜(見(jiàn)例如，Langmuir114048-4055(1995)；Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，35317-320(1996)；Proc.Natl.Acad Sci.USA934937-4941(1996)；and J.Struct.Biol.，113117-123(1994))、以及金屬螯合的自我組裝單層(見(jiàn)例如，Anal.Chem.，68490-497(1996))，用于聚組氨酸融合蛋白的結(jié)合。
在一些特別優(yōu)選的實(shí)施例中，本領(lǐng)域中通常為人熟知的標(biāo)準(zhǔn)的直接或間接ELISA、IFA、或RIA方法用來(lái)檢測(cè)候選試劑與興趣蛋白的結(jié)合。在一些實(shí)施例中，在樣品中檢測(cè)到蛋白的表面表達(dá)水平的提高，而在其它實(shí)施例中，檢測(cè)到表面表達(dá)水平的降低。因此，顯然，本發(fā)明的方法適于多種成分(multiple element)的檢測(cè)、鑒定和表征。
因此，本發(fā)明方法特別優(yōu)選的一些實(shí)施例中，可以使用夾心ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試法)，其采用用于捕獲的單克隆或多克隆抗體(Aa捕獲抗體@)以及用于檢測(cè)已結(jié)合的抗體-抗原復(fù)合物的第二抗體(Aa報(bào)告抗體(reporter anibody)@)。
在一些優(yōu)選的ELISA實(shí)施例中，使用堿性磷酸酶軛合物，而在其它優(yōu)選實(shí)施例中，使用辣根過(guò)氧物酶軛合物。另外，也可以使用抗生物素蛋白/生物素系統(tǒng)，尤其對(duì)于需要增強(qiáng)信號(hào)的分析系統(tǒng)。用于優(yōu)選實(shí)施例的合適的酶包括但不限于過(guò)氧化物酶、螢光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶及兩種或多種上述酶的混合物。
根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施例，可以在加入抗體前用固定劑處理細(xì)胞。為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并可獲得的這樣的合適的固定劑包括但不限于低聚甲醛、甲醛溶液(福爾馬林)、戊二醛、丙酮、乙醇以及丙烯醛。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No.4,857,300；美國(guó)專利No.5,104,640；美國(guó)專利No.5,422,277；美國(guó)專利No.5,597,688；美國(guó)專利No.5,824,495；以及美國(guó)專利No.6,194,165。
固定劑的濃度取決于例如所采用的具體試劑而變化，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。低聚甲醛的合適濃度的示例性實(shí)例是在合適緩沖液如磷酸緩沖鹽(PBS)中為4％。
固定劑的pH可以是適合被研究的具體蛋白和所采用的細(xì)胞系(cell line)的任何水平，優(yōu)選通常在6至8之間，例如在7左右，如約7.2。合適的pH(或pH范圍)可以通過(guò)加入為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知并可獲得的一種或多種合適的緩沖劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)示例性方法中，將在胞外抗原決定簇過(guò)表達(dá)具有HA標(biāo)簽的鉀通道hERG的細(xì)胞系接種(plate)到96孔微板中(～40000細(xì)胞/孔)。96孔微板(具有透明底部的黑色板)用聚-D-賴氨酸預(yù)涂，以促進(jìn)細(xì)胞粘附到孔的底部。將細(xì)胞接種到由含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12加抗生素組成的完全培養(yǎng)基中，接種約6小時(shí)后將培養(yǎng)基移出，用不含血清或抗生素的DMEM/F12漂洗孔，加入試驗(yàn)物(test article)(在不含血清和抗生素的DMEM/F12中稀釋)。試驗(yàn)物最常溶于DMSO中，在分析中DMSO終濃度為0.1％。載體對(duì)照也含有0.1％DMSO。在表面表達(dá)分析開(kāi)始之前，將板在37℃/5％CO2中孵育過(guò)夜(大約16小時(shí))。
表面表達(dá)分析優(yōu)選于室溫下在臺(tái)式操作臺(tái)(bench top)進(jìn)行。用PBS(磷酸緩沖鹽)將細(xì)胞漂洗三次，接著用新制冰冷4％低聚甲醛/PBS固定(pH7.2，20分鐘)。為了測(cè)定hERG表面表達(dá)，沒(méi)有透化細(xì)胞。將固定劑去除后，用PBS洗滌細(xì)胞。通過(guò)用1％羊血清/PBS(封閉緩沖液)孵育30分鐘而封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)。將封閉緩沖液去除，用在封閉緩沖液中稀釋的大鼠抗HA抗體(第一抗體)將細(xì)胞孵育2小時(shí)。將第一抗體移除后，用1％羊血清/PBS洗滌細(xì)胞3次(10min/洗滌)。將HRP軛合的羊抗大鼠抗體(第二抗體)在封閉緩沖液中稀釋，并孵育細(xì)胞1小時(shí)。第二抗體混合物也包含熒光DNA結(jié)合染料(SYBR Green)，以便實(shí)驗(yàn)流程結(jié)束時(shí)測(cè)定細(xì)胞數(shù)量。孵育后，用PBS洗滌細(xì)胞3次(10min/洗滌)。用微板熒光檢測(cè)儀(microplate fluorescence reader)測(cè)定熒光，信號(hào)比較于熒光與細(xì)胞數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以便確定試驗(yàn)物是否有毒(toxic)并校正試驗(yàn)流程過(guò)程中的細(xì)胞損失。用SuperSignal ELISA FemtoMaximum Sensitivity Substrate(Pierce Chemical Co.)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。將PBS從孔中移除，加入檢測(cè)試劑，立即用GloRunner光度計(jì)捕獲信號(hào)。
也可加入其它步驟以檢測(cè)內(nèi)在膜蛋白或任何胞內(nèi)蛋白的總體細(xì)胞表達(dá)。固定后，可以采用透化劑(例如，洗滌劑)促進(jìn)抗體到達(dá)胞內(nèi)蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的第一特別優(yōu)選實(shí)施例，提供用于鑒定試劑(諸如肽、蛋白、抗體或者化學(xué)試劑)的方法，該試劑改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的蛋白優(yōu)選內(nèi)在膜蛋白(如hERG)的表面表達(dá)水平。該方法包括a)制備第一培養(yǎng)基，其含有表達(dá)興趣蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；b)加入有效量的候選試劑；c)在候選試劑存在時(shí)將細(xì)胞培養(yǎng)足夠時(shí)間；d)加入有效量的至少一種抗體，其結(jié)合到蛋白的至少一種胞外抗原決定簇；以及e)將細(xì)胞與候選試劑一起孵育后，測(cè)定抗體結(jié)合到蛋白的胞外抗原決定簇的水平。
在候選試劑的存在時(shí)，結(jié)合水平相對(duì)于對(duì)照的任何變化(如升高或降低)表明候選試劑改變蛋白的表面表達(dá)水平。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，上文的步驟(d)包括加入有效量的至少一種第一抗體和有效量的至少一種第二抗體。根據(jù)該實(shí)施例，第一抗體優(yōu)選結(jié)合到興趣蛋白的至少一種胞外抗原決定簇上。根據(jù)該實(shí)施例，更優(yōu)選地，第二抗體結(jié)合到第一抗體上。
優(yōu)選地，將第一抗體和/或第二抗體偶聯(lián)到酶上，以便促進(jìn)結(jié)合水平的檢測(cè)和測(cè)定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，用于本發(fā)明方法的合適的酶是已知且可獲得的。合適酶的示例性實(shí)例包括但不限于過(guò)氧化物酶、螢光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶及兩種或多種上述酶的混合物。
可以使用對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)已知并且可以獲得的任何方法和技術(shù)，進(jìn)行興趣蛋白表面表達(dá)水平的測(cè)定。優(yōu)選地，通過(guò)熒光、發(fā)光(luminescence)、放射性、吸光度或者這些方法中兩種或多種的組合，測(cè)定結(jié)合水平。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，抗體結(jié)合的膜蛋白上的胞外抗原決定簇優(yōu)選是野生型抗原決定簇，即，胞外抗原決定簇通常存在于自然產(chǎn)生形式的興趣蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施例，膜蛋白上的胞外抗原決定簇具有標(biāo)簽(tag)。合適的標(biāo)簽對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知并且可以獲得的。用于本發(fā)明方法中特別優(yōu)選的標(biāo)簽為血凝素(HA)標(biāo)簽。標(biāo)簽可以插入到蛋白的胞外區(qū)(胞外結(jié)構(gòu)域)中，或者取代其胞外區(qū)的一部分。
為了說(shuō)明目的而不是為了限制，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，將離子通道(如hERG)改造成可表達(dá)胞外標(biāo)簽(如HA標(biāo)簽)，該標(biāo)簽位于跨膜區(qū)S1與S2之間的連接子(linker)內(nèi)(這樣的標(biāo)簽優(yōu)選不應(yīng)改變通道的功能特性)。將穩(wěn)定表達(dá)該標(biāo)簽蛋白的細(xì)胞(如HEK 293細(xì)胞)接種(plate)到合適的容器(如96孔微板)中，并用一種或多種候選試劑培養(yǎng)足夠時(shí)間，如過(guò)夜。然后，優(yōu)選將細(xì)胞固定，如用甲醛，但是優(yōu)選不透化，并加入識(shí)別HA標(biāo)簽的抗體。第二抗體，優(yōu)選為軛合到酶(如辣根過(guò)氧物酶)上的抗體，用于結(jié)合已結(jié)合到所固定細(xì)胞表面上的抗HA抗體。然后，用合適的方法(如化學(xué)發(fā)光反應(yīng)混合法)使細(xì)胞表面信號(hào)顯示出來(lái)(develop)，并在例如微盤冷光儀(microtiter plate luminometer)中測(cè)定其水平。對(duì)照細(xì)胞通常用水和/或任何液相載體結(jié)合候選試劑(如DMSO)來(lái)培養(yǎng)。
根據(jù)上述方法的更加特別優(yōu)選的實(shí)施例，從培養(yǎng)箱中取出微孔板并去除浸泡細(xì)胞的培養(yǎng)介質(zhì)，分析蛋白表面表達(dá)。用PBS(100μl)漂洗孔3次，然后用低聚甲醛(例如在PBS中濃度為4％，pH7.2，100μl)固定，然后用PBS漂洗。優(yōu)選將在細(xì)胞表面上的非特異性結(jié)合部位封閉，例如通過(guò)用1％羊血清/PBS(封閉緩沖液)孵育細(xì)胞。將封閉緩沖液去除之后，用第一抗體如在封閉緩沖液中的大鼠抗HA抗體孵育細(xì)胞。然后，將第一抗體移出，洗滌細(xì)胞(例如用封閉緩沖液洗滌3次)。加入第二抗體，如在封閉緩沖液中的辣根過(guò)氧物酶軛合的抗大鼠羊抗體。然后去除第二抗體，并優(yōu)選洗滌細(xì)胞。
根據(jù)該實(shí)施例，使用合適技術(shù)，如SuperSignal ELISA FemtoMaximum Sensitivity Substrate(Pierce Chemical Co.)可以將化學(xué)發(fā)光信號(hào)顯示出來(lái)。加入合適量的試劑(例如微孔板中的每孔50μl)，并用GloRunner光度計(jì)(luminometer)(Turner Designs)獲得數(shù)據(jù)。
可選地，加入熒光反應(yīng)以便監(jiān)控每孔中的細(xì)胞數(shù)量。
采用本發(fā)明的某些實(shí)施例，可以鑒定影響內(nèi)在膜蛋白表達(dá)的肽。例如，在MOI(感染復(fù)數(shù))約為1的條件下，由人心臟產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)文庫(kù)(retroviral epression library)可以用于將基因穩(wěn)定遞送至變異的hERG親代細(xì)胞系。在感染之后兩天，將活細(xì)胞用HA特異性第一抗體標(biāo)記，接著用FITC軛合的第二抗體標(biāo)記。用熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)對(duì)熒光細(xì)胞進(jìn)行分選，從而選出與親代細(xì)胞相比hERG蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)增加的細(xì)胞。將分選出的細(xì)胞群擴(kuò)增(expand)幾天，然后應(yīng)用上述選擇標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行再次分選。表面染色持久改變的細(xì)胞克隆用于捕獲轉(zhuǎn)化基因。使用克隆位點(diǎn)側(cè)面的載體特異性引物(vector specific primer)在基因組DNA上進(jìn)行PCR反應(yīng)。
為了尋找差異，從FACS分選出的表面表達(dá)增加的細(xì)胞及親代克隆(在PCR反應(yīng)中用作對(duì)照模板)中，將基因組DNA分離。將PCR產(chǎn)物亞克隆至PCR-II-TOPO載體并測(cè)序。使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，在電生理學(xué)和免疫印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)中對(duì)該篩選分離的克隆調(diào)節(jié)hERG蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)能力進(jìn)行測(cè)試。因此，可以鑒定對(duì)有運(yùn)輸能力的hERG蛋白的生物發(fā)生及翻譯后加工過(guò)程很關(guān)鍵的基因。
使用FACS對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行免疫染色的基本步驟描述于Ficker et.al.，Am J Physiol.2000；279H1748-H1756以及Ficker et.al.J MolCell Cardial.2000；322327-2337。為了生產(chǎn)病毒，將AmphoPack-293細(xì)胞(Clonetech)以5×106細(xì)胞的密度接種于100mm培養(yǎng)皿。48h后，如制造商(Roche Biochemicals)所推薦的，將10μg質(zhì)粒文庫(kù)DNA(Viraport人心臟逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)文庫(kù)(Viraport Human HeartRetroviral Expression Library)，Stratagene)與Fugene混合，在血清存在時(shí)加入培養(yǎng)皿中。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體DNA中無(wú)選擇標(biāo)記，通過(guò)監(jiān)控對(duì)照板上用表達(dá)增強(qiáng)綠色熒光蛋白EGFP(Clontech)的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的熒光細(xì)胞，確定轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和病毒效價(jià)(viral titer)。將表達(dá)中等水平帶HA標(biāo)簽的hERG WT S1HAS2通道蛋白的COS-7細(xì)胞(106)懸浮在5～10ml DMEM中，在MOI(感染復(fù)數(shù))約為1時(shí)用病毒上清液進(jìn)行感染，并接種到100mm培養(yǎng)皿中。幾小時(shí)后，用完全DMEM取代培養(yǎng)基。兩天后，將細(xì)胞用抗HA抗體標(biāo)記，接著用FITC軛合的第二抗體(見(jiàn)上文)標(biāo)記，并用熒光激活細(xì)胞分選儀進(jìn)行分選。當(dāng)與親代細(xì)胞系比較時(shí)，表面熒光顯示出明顯改變的細(xì)胞首先擴(kuò)增(expand)10天，然后進(jìn)行再次分選。從兩次分選出的細(xì)胞群中分離基因組DNA，使用載體特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)以捕獲文庫(kù)插入物(insert)。
現(xiàn)在，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了全面描述，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，應(yīng)當(dāng)理解，在不背離本發(fā)明或者其任何實(shí)施例的保護(hù)范圍的條件下，在廣泛而等價(jià)范圍的條件、配方、以及其它參數(shù)下能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。
將本文引用的所有專利和出版物以引用方式全文結(jié)合于此。任何出版物的引用是為了在提交目之前披露，而不應(yīng)解釋為承認(rèn)這些出版物是現(xiàn)有技術(shù)或者承認(rèn)本發(fā)明就先發(fā)明而言不早于這些出版物。
權(quán)利要求
1.一種鑒定改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白表面表達(dá)水平的試劑的方法，所述方法包括a)制備第一培養(yǎng)基，其含有表達(dá)所述蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；b)向含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所述第一培養(yǎng)基中加入有效量的候選試劑；c)在所述候選試劑存在的情況下將所述細(xì)胞培養(yǎng)足夠的時(shí)間；d)用有效量的固定劑處理所述細(xì)胞；e)向含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所述第一培養(yǎng)基中加入有效量的至少一種結(jié)合到所述蛋白上的抗體；以及f)測(cè)定所述抗體與和所述候選試劑一起的所述蛋白的結(jié)合水平，其中，所述結(jié)合水平相對(duì)于對(duì)照的變化表明所述候選試劑改變所述蛋白的表面表達(dá)水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(e)包括加入有效量的至少一種第一抗體，接著加入有效量的至少一種第二抗體，其中所述第一抗體結(jié)合到所述蛋白的至少一種胞外抗原決定簇上，所述第二抗體結(jié)合到所述第一抗體上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過(guò)熒光、發(fā)光、放射性、吸光度或者其兩種或多種的組合，測(cè)定所述結(jié)合水平。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述蛋白為內(nèi)在膜蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述至少一種胞外抗原決定簇包括野生型抗原決定簇。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述至少一種胞外抗原決定簇包含標(biāo)簽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述胞外標(biāo)簽取代所述蛋白的胞外區(qū)的至少一部分。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述胞外標(biāo)簽插入到所述蛋白的胞外區(qū)中。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述胞外標(biāo)簽包括血凝素(HA)標(biāo)簽。
10.一種鑒定改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平的試劑的方法，所述方法包括a)制備第一培養(yǎng)基，其含有表達(dá)所述蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；b)向含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所述第一培養(yǎng)基中加入有效量的候選試劑；c)在所述候選試劑存在下，將所述細(xì)胞培養(yǎng)足夠的時(shí)間；d)先用固定劑、隨后用透化劑處理所述細(xì)胞；e)向含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所述第一培養(yǎng)基中加入有效量的至少一種結(jié)合到所述蛋白上的抗體；以及f)測(cè)定所述抗體與和所述候選試劑一起的所述蛋白的結(jié)合水平，其中，相對(duì)于對(duì)照所述結(jié)合水平的變化表明所述候選試劑改變所述蛋白的表達(dá)水平。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，步驟(e)包括加入有效量的至少一種第一抗體，接著加入有效量的至少一種第二抗體，其中，所述第一抗體結(jié)合到所述蛋白的至少一種抗原決定簇上，所述第二抗體結(jié)合到所述第一抗體上。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，通過(guò)熒光、發(fā)光、放射性、吸光度或者其兩種或多種的組合，測(cè)定所述結(jié)合水平。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述蛋白為內(nèi)在膜蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述至少一種抗原決定簇包括野生型抗原決定簇。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，所述至少一種抗原決定簇包括標(biāo)簽。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述標(biāo)簽取代所述蛋白的結(jié)構(gòu)域的至少一部分。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述標(biāo)簽插入到所述蛋白的結(jié)構(gòu)域中。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述標(biāo)簽包括血凝素(HA)標(biāo)簽。
19.根據(jù)權(quán)利要求1或10所述的方法，其中，所述第一抗體和/或所述第二抗體偶聯(lián)到酶上。
20.根據(jù)權(quán)利要求1或10所述的方法，其中，所述酶選自由過(guò)氧化物酶、螢光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶及兩種或多種上述酶的混合物組成的組。
21.一種鑒定改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞中內(nèi)在膜蛋白表達(dá)水平的肽的方法，所述方法包括a)制備第一培養(yǎng)基，其含有表達(dá)所述蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；b)向含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所述第一培養(yǎng)基中加入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)文庫(kù)；c)向含有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的所述第一培養(yǎng)基中加入有效量的至少一種抗體，該抗體結(jié)合到所述蛋白的至少一種胞外抗原決定簇上；d)向所述培養(yǎng)基中加入熒光標(biāo)記的第二抗體；以及e)根據(jù)熒光將所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行分選。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述蛋白為離子通道。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述至少一種抗原決定簇包括野生型抗原決定簇。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述至少一種抗原決定簇包含標(biāo)簽。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述標(biāo)簽取代所述蛋白的結(jié)構(gòu)域的至少一部分。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述標(biāo)簽插入到所述蛋白的結(jié)構(gòu)域中。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述標(biāo)簽包括血凝素(HA)標(biāo)簽。
28.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，將所述第一抗體和/或所述第二抗體偶聯(lián)到酶上。
29.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述酶選自由過(guò)氧化物酶、熒光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶及兩種或多種上述酶的混合物組成的組。
30.根據(jù)權(quán)利要求6，15或24所述的方法，其中，在所述胞外抗原決定簇上的所述標(biāo)簽是所述蛋白上存在的唯一標(biāo)簽。
31.根據(jù)權(quán)利要求1或10所述的方法，其中，所述蛋白包含熒光標(biāo)簽。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述標(biāo)簽選自由綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白以及選擇性結(jié)合具有可檢測(cè)特性分子的氨基酸序列組成的組。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述標(biāo)簽取代所述蛋白胞內(nèi)區(qū)的至少一部分。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述標(biāo)簽插入到所述蛋白的胞內(nèi)區(qū)中。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的方法，其中，在所述胞內(nèi)區(qū)中的所述標(biāo)簽是所述蛋白上存在的唯一標(biāo)簽。
全文摘要
本發(fā)明披露了用于鑒定能改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白、尤其是內(nèi)在膜蛋白(整合膜蛋白)表達(dá)水平的試劑的高通量分析系統(tǒng)及方法。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1973203SQ200580014279
公開(kāi)日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2005年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月19日
發(fā)明者阿瑟·M·布朗, ?？斯隆し瓶藸? 芭芭拉·A·威布爾 申請(qǐng)人:成泰斯特公司