專利名稱：一種馬鈴薯天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法
一種馬鈴薯天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法技術(shù)領(lǐng)域一種馬鈴薯天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法，具體的說是利用馬鈴薯勻 漿得馬鈴薯汁，經(jīng)高壓滅菌，高速離心，超濾濃縮，乙醇分級(jí)沉淀，獲得天冬 氨酸蛋白酶抑制劑制品，屬于植物提取生物活性產(chǎn)品技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景蛋白酶抑制劑泛指對(duì)蛋白酶有抑制作用的一類物質(zhì)，參與生物體內(nèi)蛋白酶 解活動(dòng)的控制，對(duì)維持正常的生命活動(dòng)具有重要意義。它的來源十分廣泛，在 各種動(dòng)植物的組織器官中都有存在。按其所抑制的目標(biāo)蛋白酶活性中心的不同， 可分為以下幾種絲氨酸蛋白酶抑制劑；半胱氨酸蛋白酶抑制劑；天冬氨酸蛋 白酶抑制劑；金屬蛋白酶抑制劑等。目前國內(nèi)外報(bào)道的蛋白酶抑制劑大多數(shù)都 是通過化學(xué)法合成的，這些蛋白酶抑制劑在應(yīng)用中受到相當(dāng)大的限制，因此從 天然產(chǎn)物中開發(fā)此類蛋白酶抑制劑日益受到人們的關(guān)注。蛋白酶抑制劑在食品、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域也有非常廣泛的應(yīng)用前景。例如， 增強(qiáng)小麥面筋性，提高啤酒泡沬穩(wěn)定性，治療胰腺炎和多功能衰竭、休克、心 臟外科手術(shù)中失血、中風(fēng)、老年癡呆癥等。其中，最令人矚目的是在HIV和腫瘤 治療中的應(yīng)用，蛋白酶抑制劑還可抑制昆蟲腸道內(nèi)蛋白水解酶的活性，在植物 防御昆蟲和病原體侵染時(shí)起著重要作用。天冬氨酸蛋白酶的活性中心一般是由兩個(gè)天冬氨酸殘基所組成，目前主 要包括胃蛋白酶、血管緊張肽原酶、蛋白酶A、組織蛋白酶D、天冬氨酸膜內(nèi) 裂解蛋白酶等。天冬氨酸蛋白酶是導(dǎo)致艾滋病、惡性腫瘤、高血壓等世界上幾 種難治疾病的發(fā)病因素之一，深入了解天冬氨酸蛋白酶抑制劑，對(duì)治療這些頑 固性疾病將有一定的幫助。天冬氨酸蛋白酶抑制劑在食品保健及醫(yī)藥行業(yè)中應(yīng)用非常廣泛，如抑制 腫瘤細(xì)胞增殖、增強(qiáng)免疫力和抗癌等，對(duì)胃潰瘍、降血壓、艾滋病、中風(fēng)、 老年癡呆癥等的治療具有明顯的療效。而化學(xué)法合成天冬氨酸蛋白酶抑制劑 往往因其藥理毒性和安全性得不到保證(如HIVPI沙奎那韋可導(dǎo)致脂代謝紊 亂綜合癥)，所以在食品及醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用受到很大的限制。將從馬鈴薯中提取的天冬氨酸蛋白酶抑制劑加入到小麥面粉中，對(duì)小麥蛋 白酶活性有抑制作用，這樣既可滿足小麥蛋白質(zhì)含量保持較高的水平，又可保 證小麥有較好的面團(tuán)流變性和良好的發(fā)酵耐力；蛋白酶A是一種天冬氨酸蛋白 酶，可導(dǎo)致啤酒泡沫穩(wěn)定性降低，加入天冬氨酸蛋白酶抑制劑，可抑制蛋白酶A活性提高啤酒泡沫穩(wěn)定性；胃潰瘍發(fā)病由多因素所致，目前認(rèn)為，胃潰瘍的發(fā) 生機(jī)制多與攻擊因子和防御因子的失衡有關(guān)，或"攻擊因子"[胃酸、胃蛋白酶、 幽門螺桿菌等]過強(qiáng)，或"防御因子"(胃黏膜、胃黏液、碳酸氫鹽等)減弱而形 成，有報(bào)道認(rèn)為馬鈴薯中優(yōu)質(zhì)纖維素對(duì)胃黏膜具有一定的保護(hù)作用，本課題組 研究發(fā)現(xiàn)其中天冬氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)胃蛋白酶具較強(qiáng)抑制作用，從而可減弱 "攻擊因子"的作用，揭示從馬鈴薯中提取的天冬氨酸蛋白酶抑制劑有治療胃漬瘍 的藥理活性。課題組進(jìn)一步的特性研究發(fā)現(xiàn)該馬鈴薯天冬氨酸蛋白酶抑制劑 溫度和pH穩(wěn)定性較好，直接從天然產(chǎn)物中提取使安全性有極大保證，可加 工成藥劑服用，在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用潛力較大。馬鈴薯是僅次于小麥、玉米、水稻而居第四位的糧食作物，營養(yǎng)豐富，含 大量的蛋白質(zhì)、糖類、維生素、優(yōu)質(zhì)纖維素等，素有"地下蘋果"和"第二面包"之 稱，祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，土豆性平，有和胃、調(diào)中、健脾、益氣之功效。馬鈴薯塊 莖中含有多種蛋白類蛋白酶抑制劑，含量占所含可溶性蛋白的50%以上。因此， 從馬鈴薯中提取天冬氨酸蛋白酶抑制劑具有取材易，成本低，雜質(zhì)相對(duì)較少， 應(yīng)用廣泛，不影響食品的安全性、感官及口味等眾多優(yōu)點(diǎn)。目前，馬鈴薯除食 用外多用于淀粉生產(chǎn)，其生產(chǎn)中產(chǎn)生的蛋白液一般當(dāng)作廢水排放，污染性很大。 因此，原料可選擇采用馬鈴薯淀粉加工廢水，對(duì)增加蛋白質(zhì)資源、避免環(huán)境污 染等具有潛在的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種馬鈴薯天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法，采用馬 鈴薯勻漿得馬鈴薯汁，高壓滅菌，高速離心，超濾濃縮得粗抑制劑，對(duì)胃蛋白酶比抑制活性約為3.98 5.19 U/mg，蛋白質(zhì)與糖的濃度比約為1.23 1.47，收 率約為81.9% 86.1%;再經(jīng)乙醇分級(jí)沉淀，得天冬氨酸蛋白酶抑制劑制品，對(duì) 胃蛋白酶比抑制活性為7.69 10.9U/mg，蛋白質(zhì)與糖的濃度比約為2.12 2.41， 整個(gè)工藝流程收率約為52.2% 58.3%，最適溫度4(TC左右，溫度穩(wěn)定范圍0 IOO'C， pH穩(wěn)定范圍3.0 7.5。本發(fā)明的技術(shù)方案 一種馬鈴薯天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法，采用 馬鈴薯去皮、切塊、勻漿，高速離心，上清液高壓滅菌，再高速離心，超濾濃 縮，乙醇分級(jí)沉淀，沉淀復(fù)溶后離心去不溶物，再經(jīng)真空冷凍千燥得天冬氨酸 蛋白酶抑制劑干粉。工藝為-A馬鈴薯汁制備(1) 馬鈴薯市售；(2) 勻漿馬鈴薯洗凈去皮切塊后，按0.5gNa2SO3/kg馬鈴薯加入Na2SO3 以阻止多酚氧化，勻漿，勻漿后以8000r/mim離心30min，取上清；(3) 高壓滅菌將上清液于12rC滅菌20min，冷卻，4°C、 14000r/mim離心20min，收集上清液，為處理后的馬鈴薯汁； B馬鈴薯汁超濾濃縮(1) 超濾膜處理截留分子量為10KDa的巻式超濾膜組件先用蒸餾水洗滌 30min,循環(huán)閥打開，再用pHll左右的NaOH溶液循環(huán)清洗30min，蒸餾水洗至中 性；(2) 超濾條件處理后的馬鈴薯汁用所述處理后的截留分子量為lOKDa 的超濾膜組件進(jìn)行濃縮，濃縮倍數(shù)3 5，壓力0.075MPa、室溫超濾10min，收 集截留液；C乙醇分級(jí)沉淀(1) 將步驟B所收集截留液，加入-2(TC乙醇，使乙醇終濃度為20%進(jìn)行 醇沉，4°C、以10000r/min離心10min后，棄沉淀，取上清液；(2) 取上清液加入-2(TC乙醇，使乙醇終濃度為60%進(jìn)行醇沉，4'C、以 10000r/min離心10min后，取沉淀，棄上清；(3) 沉淀加少量pH6.8的磷酸緩沖液溶解，4°C、以10000r/min離心10min 后，棄沉淀，取上清，即為天冬氨酸蛋白酶抑制劑液。(4) 干燥成粉采用真空冷凍干燥或噴霧干燥的方法將天冬氨酸蛋白酶抑 制劑液干燥成粉，即為天冬氨酸蛋白酶抑制劑粉體。天冬氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)胃蛋白酶抑制作用分析用上述(4)中得到的抑 制劑凍干粉配成lmg/mL的溶液，測其對(duì)胃蛋白酶有較強(qiáng)的抑制活性，比抑制 活性約為9.61U/mg。酶活測定方法采用常規(guī)蛋白酶活力測定法。酶活定義4CTC時(shí)，每分鐘分解血紅蛋白產(chǎn)lpmol酪氨酸所需酶量即為一 個(gè)酶活單位，單位用U表示。抑制單位定義依上述方法測定酶活，按抑制率=[(抑制前酶活-抑制后酶活)/抑制前酶活]xlOOy。計(jì)算抑制率，規(guī)定對(duì)蛋白酶A抑制率達(dá)10%的抑制劑 活性為一個(gè)抑制單位，單位用IU表示。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明原料馬鈴薯汁可考慮用馬鈴薯加工廢液代替，這樣既可消除馬鈴薯加工廠對(duì)周邊環(huán)境的污染，又可防止資源浪費(fèi)，變廢為寶。 本發(fā)明所制備的抑制劑對(duì)天冬氨酸蛋白酶有很高的抑制活性，直接從馬鈴薯中 提取具有取材易，成本低，雜質(zhì)相對(duì)較少，應(yīng)用廣泛，不影響食品的安全性、 感官及口味等眾多優(yōu)點(diǎn)，采用超濾與乙醇分級(jí)沉淀組合提取天冬氨酸蛋白酶抑 制劑不僅簡便、易操作、成本低、而且易于規(guī)?；糯蠛凸I(yè)化生產(chǎn)，在醫(yī)藥、 食品添加劑及病蟲害防治等領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。


圖1一種馬鈴薯天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備工藝示意圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l:將682.7g馬鈴薯洗凈、去皮、切塊后，按0.5gNa2SCVkg馬鈴薯 加入0.341gNa2SO3以阻止多酚氧化，勻漿后以8000 r/min、 4。C離心30min，得 上清510mL,將上清液于121。C高壓滅菌20min，冷卻至室溫后，14000r/min、 4°C 離心20mim，棄去沉淀，將收集到的432mL上清液用lOKDa超濾膜濃縮，在壓 力0.075MPa、室溫下超濾10min，得濃縮液112mL，對(duì)胃蛋白酶抑制率約為5.19 U/mg,蛋白質(zhì)與糖的濃度比約為1.47，收率約為86.1%;濃縮液中加入28mL -20。C乙醇，10000r/min、 4。C離心10min后，取上清液再加入160.5mL -20°。乙 醇，10000r/min、 4'C離心10min后，取沉淀；沉淀加40mL pH6.8的磷酸緩沖 液溶解，以10000r/min、 4'C離心10min后，得到上清約39mL，即為天冬氨酸 蛋白酶抑制劑液，冷凍干燥后得0.102g抑制劑干粉，對(duì)胃蛋白酶比抑制活性為 10.9IU/mg,蛋白質(zhì)與糖的濃度比約為2.12，收率約為58.3%。實(shí)施例2:將887.6g馬鈴薯洗凈、去皮、切塊后，按0.5gNa2SCVkg馬鈴薯 加入0.443gNa2SO3以阻止多酚氧化，勻漿后以8000 r/min、 4'C離心30min，得 上清562mL，將上清液于121'C高壓滅菌20min，冷卻至室溫后，14000r/min、 4°C 離心20mim，棄去沉淀，將收集到的480mL上清液用lOKDa超濾膜濃縮，在壓 力0.075MPa、室溫下超濾10min，得濃縮液95mL，對(duì)胃蛋白酶抑制率約為4.65 U/mg，蛋白質(zhì)與糖的濃度比約為1.23，收率約為84.6%;濃縮液中加入23.75mL -20。C乙醇，10000r/min、 4。C離心10min后，取上清液再加入142.5mL -20。C乙 醇，10000r/min、 4'C離心10min后，取沉淀；沉淀加40mL pH 6.8的磷酸緩沖 液溶解，以10000r/min、 4。C離心10min后，得到上清約40mL，即為天冬氨酸 蛋白酶抑制劑液，冷凍干燥后得0.11g抑制劑干粉，對(duì)胃蛋白酶比抑制活性約為 9.61U/mg，蛋白質(zhì)與糖的濃度比約為2.41,收率約為56.7%。實(shí)施例3:將507.3g馬鈴薯洗凈、去皮、切塊后，按0.5gNa2S(Vkg馬鈴薯 加入0.254gNa2SO3以阻止多酚氧化，勻漿后以8000 r/min、 4°。離心301^!1，得 上清321mL，將上清液于121。C高壓滅菌20min，冷卻至室溫后，14000r/min、 4°C 離心20mim，棄去沉淀，將收集到的250mL上清液用lOKDa超濾膜濃縮，在壓 力0.075MPa、室溫下超濾10min，得濃縮液87mL，對(duì)胃蛋白酶比抑制活性約為 3.98U/mg，蛋白質(zhì)與糖的濃度比約為1.36，收率約為81.9%;濃縮液中加入 21.75mL-20°。乙醇，10000r/min、 4。C離心10min后，取上清液再加入130.5mL -20。C乙醇，10000r/min、 4'C離心10min后，取沉淀；沉淀加40mL pH 6.8的磷 酸緩沖液溶解，以10000r/min、 4°。離心10min后，得到上清約40mL,即為天 冬氨酸蛋白酶抑制劑液，冷凍干燥后得0.09g抑制劑干粉，對(duì)胃蛋白酶比抑制活 性為7.69U/mg，蛋白質(zhì)與糖的濃度比約為2.24,收率約為52.2%。
權(quán)利要求
1、一種馬鈴薯天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法，其特征為采用馬鈴薯去皮、切塊、勻漿，高速離心，上清液高壓滅菌，再高速離心，超濾濃縮，乙醇分級(jí)沉淀，沉淀復(fù)溶后離心去不溶物，再經(jīng)真空冷凍干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制劑干粉；工藝為A馬鈴薯汁制備(1)馬鈴薯市售；(2)勻漿馬鈴薯洗凈去皮切塊后，按0.5g Na2SO3/kg馬鈴薯加入Na2SO3以阻止多酚氧化，勻漿，勻漿后以8000r/mim離心30min，取上清；(3)高壓滅菌將上清液于121℃滅菌20min，冷卻，4℃、14000r/mim離心20min，收集上清液，為處理后的馬鈴薯汁；B馬鈴薯汁超濾濃縮(1)超濾膜處理截留分子量為10KDa的卷式超濾膜組件先用蒸餾水洗滌30min，循環(huán)閥打開，再用pH 11的NaOH溶液循環(huán)清洗30min，蒸餾水洗至中性；(2)超濾條件處理后的馬鈴薯汁用所述處理后的截留分子量為10KDa的超濾膜組件進(jìn)行濃縮，濃縮倍數(shù)3～5，壓力0.075MPa、室溫超濾10min，收集截留液；C乙醇分級(jí)沉淀(1)將步驟B所收集截留液，加入-20℃乙醇，使乙醇終濃度為20％進(jìn)行醇沉，4℃、以10000r/min離心10min后，棄沉淀，取上清液；(2)取上清液加入-20℃乙醇，使乙醇終濃度為60％進(jìn)行醇沉，4℃、以10000r/min離心10min后，取沉淀，棄上清；(3)沉淀加少量pH 6.8的磷酸緩沖液溶解，4℃、以10000r/min離心10min后，棄沉淀，取上清，即為天冬氨酸蛋白酶抑制劑液；(4)干燥成粉采用真空冷凍干燥或噴霧干燥的方法將天冬氨酸蛋白酶抑制劑液干燥成粉，即為天冬氨酸蛋白酶抑制劑粉體。
全文摘要
一種馬鈴薯天冬氨酸蛋白酶抑制劑的制備方法，屬于植物提取生物活性產(chǎn)品技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及采用直接將馬鈴薯去皮、切塊、勻漿，高速離心，上清液高壓滅菌，再高速離心，超濾濃縮，乙醇分級(jí)沉淀，沉淀復(fù)溶后離心去不溶物，再經(jīng)真空冷凍干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制劑干粉。本發(fā)明所制備的天冬氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)胃蛋白酶有較高抑制活性，直接從馬鈴薯中提取不僅成本低、應(yīng)用安全且不會(huì)產(chǎn)生色素方面的影響，在食品、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有非常廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K1/36GK101597332SQ20091018212
公開日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2009年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月14日
發(fā)明者瑩 孫, 田亞平 申請(qǐng)人:江南大學(xué)