NMDA(對(duì)于N-甲基天冬氨酸)受體/通道是神經(jīng)元細(xì)胞的質(zhì)膜分子實(shí)體。這些受體是釋放入突觸和突觸外間隙的谷氨酸分子的靶標(biāo)，谷氨酸是提供從一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞到另一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞的溝通的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。

一些神經(jīng)變性疾病、特別是帕金森病的特征在于腦干的多巴胺能神經(jīng)元死亡，并且在臨床上表現(xiàn)為自主運(yùn)動(dòng)控制缺失、搖動(dòng)、運(yùn)動(dòng)遲緩和僵硬。

帕金森病中的神經(jīng)元變性牽涉興奮性中毒，即與由細(xì)胞外隙中谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)過量導(dǎo)致的NMDA受體過度刺激相關(guān)的機(jī)制(Metha等人，Eur.J.Pharmacol，2013)。

實(shí)際上，已經(jīng)證實(shí)在模擬帕金森病的細(xì)胞和動(dòng)物模型中，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元攜帶的興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(EAATs)功能障礙導(dǎo)致多巴胺能細(xì)胞死亡(Nafia等人，J Neurochem，2008；Swanson等人，Ann Neurol，2011)。

此外，培養(yǎng)物中的多巴胺能神經(jīng)元在它們經(jīng)歷外源性谷氨酸導(dǎo)致的應(yīng)激時(shí)最特別地易損(Douhou等人，J Neurochem，2001)。

此外，在大鼠和猴子中的多巴胺能系統(tǒng)損害后，存在丘腦下神經(jīng)元活性的增加，所述丘腦下神經(jīng)元負(fù)責(zé)多巴胺能神經(jīng)元的谷氨酸能興奮性神經(jīng)支配(Wallace等人，Brain，2007)。

此外，已經(jīng)確立，多巴胺(DA)防止谷氨酸誘導(dǎo)的毒性(Vaarmann等人，Cell Death and Disease，2013)。因此，多巴胺能損害導(dǎo)致的DA耗盡自身可以促使多巴胺能神經(jīng)元易損性至興奮性毒素應(yīng)激。

然而，從治療觀點(diǎn)來看，目前沒有實(shí)際有效的和令人滿意以及能夠治療、緩解和/或預(yù)防人類中的神經(jīng)變性疾病、特別是帕金森病后神經(jīng)退化的藥物。

鑒于此，產(chǎn)生的問題在于提供能夠治療、緩解和/或預(yù)防人類中的神經(jīng)變性疾病、特別是帕金森病后神經(jīng)退化的藥物。

本發(fā)明的解決方案在于藥物組合，其包含氙氣體和至少一種液體或固體形式的抗氧化劑，該藥物組合用于治療、緩解和/或預(yù)防人類中的神經(jīng)變性疾病后的神經(jīng)退化。

換句話說，本發(fā)明涉及氣體組合物，即可吸入的氣態(tài)藥物，其基于氙，該氣體組合物與至少一種液體或固體形式的抗氧化劑組合使用，該氣體組合物用于治療、緩解和/或預(yù)防人類中的神經(jīng)變性疾病后的神經(jīng)退化。

如果適合，本發(fā)明的藥物組合或組合物可以包含如下技術(shù)特征的一個(gè)或多個(gè)：

-它包含10％-80％體積的氙；

-所述抗氧化劑是維生素E、維生素E的化學(xué)類似物或維生素E的化學(xué)衍生物；

-所述抗氧化劑是水溶性維生素E，即6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸，其為維生素E的水溶性化學(xué)類似物(Davies等人，Biochem J.，1988)；

-液體形式的抗氧化劑；

-所述抗氧化劑是液體形式的水溶性維生素E；

-所述神經(jīng)變性疾病是帕金森病或與帕金森病相關(guān)的疾病，優(yōu)選帕金森病；

-將氙氣體與施用抗氧化劑的同時(shí)或在施用抗氧化劑之后施用于患者，優(yōu)選在施用抗氧化劑之后；

-與Ca²⁺離子過量進(jìn)入待治療的患者或人類的易損神經(jīng)元的一個(gè)或多個(gè)群體相關(guān)的神經(jīng)退化；

-氙是與氧和/或氮的混合物；

-氧的比例至少為21％體積；

-它由氙和氧或氙、氮和氧組成；

-所述人類大于30歲，優(yōu)選至少40歲，特別是至少50歲；

-氙的比例至少為20％體積；

-氙的比例至少為75％體積，優(yōu)選氙的比例至少為60％體積；

-通過吸入將氙施用于患者；

-被治療或待治療的人類、即患者是男性或女性；

-以有效量或比例使用、即施用氙；

-藥物包含非麻醉量的氙，即亞麻醉量；

-將氙在被患者吸入之前或吸入時(shí)與氧混合，或氙為“隨時(shí)可用的”作為與氧的預(yù)混合物的氣體混合物形式且任選地包含另一種氣體化合物，例如氮；

-藥物由氧和氮形成的氣體混合物組成；

-每日將所述氣體施用于患者一次或多次；

-將所述氣體施用于患者幾分鐘至幾小時(shí)的吸入時(shí)間，典型地15分鐘至6小時(shí)，優(yōu)選少于4小時(shí)；

-氙和/或抗氧化劑的施用期限、劑量方案和頻率取決于在考量下患者神經(jīng)學(xué)病情的進(jìn)展，且這些參數(shù)優(yōu)先由臨床醫(yī)師或護(hù)理人員設(shè)定，視考量下患者的神經(jīng)學(xué)病情的不同而定；

-將氙(或包含氙的氣體混合物)包裝在貯氣筒中，該貯氣筒具有至多50升的體積(水當(dāng)量)，典型地約0.5-15升；和/或小于或等于350巴絕對(duì)值的壓力，典型地約2-300巴的壓力。優(yōu)選地，該貯氣筒由不銹鋼、鋁或復(fù)合材料制成且安裝有集成的閥門或調(diào)壓器，從而能夠控制所遞送氣體的流速和任選地控制所遞送的氣體的壓力；

-在治療過程中，通過經(jīng)面罩或鼻罩或鼻護(hù)鏡(nasal goggles)經(jīng)任意其它用于施用可吸入氣體的系統(tǒng)吸入將氙(或包含氙的氣體混合物)施用于患者。

更具體地，在本發(fā)明的上下文中，已經(jīng)證實(shí)，氙和抗氧化劑、特別是水溶性維生素E或維生素E的組合使得這些化合物產(chǎn)生協(xié)同作用，且這類組合可以構(gòu)成用于因帕金森病類的神經(jīng)變性疾病導(dǎo)致的神經(jīng)退化的富有希望的治療方法。

特別地，已經(jīng)通過氙與水溶性維生素E或6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸組合得到了良好的結(jié)果，所述水溶性維生素E或6-羥基-2，5，7，8-四甲基色滿-2-甲酸為可溶性維生素E類似物，其通過抑制氧化性應(yīng)激且更具體地通過抑制脂質(zhì)過氧化作用起作用。

實(shí)際上，通過制備這類組合，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)了氙與水溶性維生素E類抗氧化劑的組合的協(xié)同作用，如下文詳細(xì)描述和示例。

這類Xe/抗氧化劑組合特別地基于這些類型的化合物或分子的作用模式。

因此，氙通過其對(duì)NMDA受體的拮抗作用、還有對(duì)構(gòu)成谷氨酸離子型受體的α-氨基-3-羥基-5-甲基異噁唑-4-丙酸酯(AMPA)受體以及對(duì)鉀鹽鎂礬受體具有興奮性谷氨酸能信號(hào)傳導(dǎo)途徑-抑制特性(Dinse等人，Br J Anaesth，2005)。

此外，正如所述的，水溶性維生素E通過抑制與脂質(zhì)過氧化作用相關(guān)的氧化性應(yīng)激起作用(Guerreiro等人，J Neurochem，2009)。

因此，通過制備氙和抗氧化劑、特別是水溶性維生素E或維生素E類型或其衍生物的組合，發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)了通過氙和水溶性維生素E、維生素E或其衍生物的胞內(nèi)抗氧化劑作用阻斷谷氨酸能受體導(dǎo)致的協(xié)同作用。換句話說，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)注意到，氙能夠通過協(xié)同作用展示出或強(qiáng)化抗氧化劑的有益作用。

根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及用于治療、緩解或預(yù)防人體患者、即人類中的神經(jīng)變性疾病后的至少一種神經(jīng)退化的方法，其中：

i)鑒定患有神經(jīng)變性疾病或傾向于患有這類神經(jīng)變性疾病的人體患者；

ii)通過吸入將包含氙的氣態(tài)藥物施用于所述患者；和

iii)將液體或固體形式的、特別是水溶性維生素E、維生素E或其衍生物至少一種抗氧化劑施用于所述患者，以便得到神經(jīng)元保護(hù)，且由此治療、緩解或預(yù)防因所述患者的神經(jīng)變性疾病導(dǎo)致的至少一種神經(jīng)退化。

優(yōu)選地，在步驟i)中：

-所述人體患者是男性或女性；

-所述人體患者超過30歲，優(yōu)選至少40歲，特別是至少50歲；

-由臨床醫(yī)師等鑒定所述患者；

-通過技術(shù)篩選檢查鑒定所述患者；

-所述神經(jīng)變性疾病能夠?qū)е轮辽僖环N帕金森病類、優(yōu)選帕金森病的神經(jīng)退化；

-所述神經(jīng)退化包含Ca²⁺離子過量進(jìn)入患者的易損神經(jīng)元的一個(gè)或多個(gè)群體。

優(yōu)選地，在步驟ii)中：

-以液體形式施用所述抗氧化劑；

-經(jīng)腸、即通過口服施用至少一種抗氧化劑；

-將水溶性維生素E(維生素E類似物)、維生素E或其衍生物作為抗氧化劑施用于所述患者；

-將液體形式的水溶性維生素E施用于所述患者；

-在患者吸入氙之前、同時(shí)或在患者吸入氙之后將至少一種抗氧化劑施用于所述患者。

優(yōu)選地，在步驟iii)中：

-根據(jù)在考量下患者的神經(jīng)學(xué)病情的進(jìn)展選擇和/或設(shè)定氙的施用期限、劑量方案和頻率；

-施用有效量的氙；

-施用非麻醉量的氙；

-施用10％-80％體積的氙、優(yōu)選20％-50％體積的氙；

-將氙在被患者吸入之前或吸入時(shí)與氧、優(yōu)選與至少21％體積的氧混合；

-施用由氙和氧(二元混合物)或氙、氧和氮(三元混合物)組成的隨時(shí)可用的氣體混合物；

-每日將氙氣體施用于患者一次或多次；

-將氙氣體施用于患者幾分鐘至幾小時(shí)的吸入時(shí)間，典型地15分鐘至6小時(shí)，優(yōu)選少于4小時(shí)；

-通過面罩或鼻罩或鼻護(hù)鏡或經(jīng)任意其它用于施用可吸入氣體的系統(tǒng)或裝置將氙氣體施用于患者。

現(xiàn)在通過下列實(shí)施例和附圖更清楚地理解本發(fā)明，給出的實(shí)施例作為示例，而非限定，所述附圖顯示氙和水溶性維生素E在模擬慢性帕金森病患者的細(xì)胞模型中的協(xié)同保護(hù)作用。

實(shí)施例

為了證實(shí)本發(fā)明氙和抗氧化劑組合的效能，設(shè)置多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞模型，在該模型中，通過用L-反式-吡咯烷-2，4-二甲酸(PDC)延長(zhǎng)處理阻斷谷氨酸(GLU)再攝取系統(tǒng)觸發(fā)神經(jīng)元死亡，L-反式-吡咯烷-2，4-二甲酸(PDC)為合成化合物，其作用機(jī)制預(yù)先由Zuiderwijk等人(Europ J Pharmacol，1994)描述。

實(shí)施的技術(shù)如下所述且得到的結(jié)果示例在附圖中。

用于得到中腦初級(jí)培養(yǎng)物的方案

由取自妊娠15.5天的妊娠雌性Wistar大鼠的大鼠胚胎中腦制備培養(yǎng)物。

用于得到中腦培養(yǎng)物的方法包含通過機(jī)械解離即非酶解離胚胎組織、使用Leibovitz L15培養(yǎng)基(Sigma Aldrich)得到均勻的細(xì)胞混懸液。

將該混懸液的等分部分加入到Nunc 48-孔板中，該板用聚乙烯亞胺(1mg/ml，硼酸鹽緩沖液，pH 8.3)薄層預(yù)涂敷，以便能夠粘附神經(jīng)元細(xì)胞(參見Toulorge等人，F(xiàn)aseb J，2011)。

接種密度約為80 000-100 000細(xì)胞/cm²。

將中腦培養(yǎng)物維持在神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，其包含不含抗氧化劑的B27混合物、N2補(bǔ)充劑、谷氨酰胺(2mM)和青霉素/鏈霉素混合物(參見Nafia等人，J Neurochem，2008)。該培養(yǎng)基及其補(bǔ)充劑購(gòu)自Life Technologies。

直到評(píng)價(jià)所關(guān)注的氣體作用時(shí)，將培養(yǎng)物放入常規(guī)的在37℃下恒溫控制的包封物，其中將CO₂維持在5％體積，且其中用水飽和氣氛。

在培養(yǎng)期的至始至終不改變培養(yǎng)基。

培養(yǎng)物的藥理學(xué)處理

通過應(yīng)用谷氨酸再攝取系統(tǒng)阻滯劑L-反式-吡咯烷-2，4-二甲酸或PDC觸發(fā)變性過程(Zuiderwijk等人，Europ J Pharmacol，1994)。

將抗氧化劑、即水溶性維生素E加入到培養(yǎng)物中，然后應(yīng)用PDC。

這兩種產(chǎn)品即PDC和水溶性維生素E分別購(gòu)自RD Systems和Sigma Aldrich公司。

在受控氣體氣氛中培養(yǎng)物的維持

一旦進(jìn)行藥理學(xué)處理，則將包含培養(yǎng)物中的細(xì)胞的多孔板和用于加濕室內(nèi)部隔室的板置于接收樹脂玻璃溫育室的金屬基板上。兩部分(基板和樹脂玻璃室)通過旋緊彼此對(duì)接。

然后將包含測(cè)試的(％體積)：20％O₂、5％CO₂和75％氣體的所關(guān)注的氣體混合物注入帶有開放的進(jìn)閥和排出閥的溫育室，同時(shí)通過流量計(jì)控制輸出流速。

測(cè)試氣體是氮和氙。

根據(jù)所用的混合物密度校正參比輸出流速，將空氣設(shè)定在10升/min。

當(dāng)排出閥的CO₂測(cè)量值達(dá)到5％時(shí)，停止注射氣體混合物，并且通過封閉進(jìn)閥和排出閥完全氣密所述的室。

然后在本實(shí)驗(yàn)方案的至始至終，在37℃下，將暴露室放入包封物。

酪氨酸羥化酶(TH)的免疫檢測(cè)和細(xì)胞計(jì)數(shù)

在通過打開進(jìn)閥和排出閥并且從它的底部打開室中斷氣密后，用4％甲醛的PBS溶液將培養(yǎng)物固定12min，且然后在4℃與抗-TH單克隆抗體(稀釋度1/5000)一起溫育2天。

使用IR DYE800抗-小鼠二次抗體(Euromedex，1/10 000inPBS)顯示出該抗體。使用Odyssey型(Li-COR Biosciences)紅外成像儀進(jìn)行圖像采集并且通過ICY軟件(Institut Pasteur)進(jìn)行神經(jīng)元定量。

通過用PDC長(zhǎng)期處理的中腦變性模型中得到的結(jié)果揭示出氙與水溶性維生素E之間的累加保護(hù)效應(yīng)，將它們概括在下表中并且用圖表示。

表：對(duì)中腦培養(yǎng)物的體外研究的主要結(jié)果的總結(jié)

在上表中：

-有利的響應(yīng)，即與在所關(guān)注的處理的存在下神經(jīng)元細(xì)胞死亡水平降低同義表示為“+”、“++”或“+++”符號(hào)(+++＝參比水平)；

-相反，不利的響應(yīng)表示為“-”符號(hào)，與神經(jīng)元死亡增加同義。

水溶性維生素E作為脂質(zhì)過氧化抑制劑起作用且氙通過阻斷NMDA受體起作用。

PDC(其部分)通過防止培養(yǎng)物中神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生和釋放的谷氨酸再攝取誘導(dǎo)變性過程，由此導(dǎo)致神經(jīng)元NMDA受體過度活化和刺激氧自由基種類胞內(nèi)產(chǎn)生。

鑒于附圖1中示例的結(jié)果，注意到氙和抗氧化劑、即在這種情況中是水溶性維生素E的組合與分別攝取每個(gè)分子的作用相比產(chǎn)生協(xié)同神經(jīng)保護(hù)作用。

實(shí)際上，提出氙/水溶性維生素E組合的實(shí)際協(xié)同作用是完全預(yù)料不到的。

首先，這些試驗(yàn)顯示PDC在100μM濃度下、在包含75vol％氮的氣氛中導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞大量缺失。然而，這些PDC的有害作用在用氙替代氮時(shí)得到部分預(yù)防，因?yàn)榇婊盥孰S后從25.4％達(dá)到57.7％。

顯著地，在以0.1-0.3μM、在包含75％氮的氣氛中單獨(dú)應(yīng)用時(shí)在這種細(xì)胞模型中沒有顯著作用的水溶性維生素E在氙、即在這種情況中是75％的氙的存在下變成有效的，從而能夠在這些條件下實(shí)現(xiàn)約90％的存活率。

當(dāng)水溶性維生素E濃度≥1μM時(shí)還觀察到氙的作用增強(qiáng)，這是當(dāng)以75％的氮應(yīng)用它們時(shí)發(fā)揮的保護(hù)作用。

有關(guān)附圖中記錄的結(jié)果示例氙和水溶性維生素E在模擬慢性帕金森病變性的細(xì)胞模型中的協(xié)同保護(hù)效應(yīng)。這些結(jié)果在大鼠中腦培養(yǎng)物得到，所述大鼠中腦培養(yǎng)物在體外第12天結(jié)束時(shí)用谷氨酸再攝取抑制劑PDC(100μM)處理，并且在接下來的4天，用谷氨酸再攝取抑制劑PDC(100μM)在包含75％氮(N₂ 75)或75％氙(Xe 75)的氣氛中、在0.1-10μM測(cè)試的水溶性維生素E的存在下或沒有它存在下處理。

然后使培養(yǎng)物恢復(fù)用于固定和分析。在各種測(cè)試的實(shí)驗(yàn)條件下，通過計(jì)數(shù)用于多巴胺能標(biāo)記TH免疫陽(yáng)性的細(xì)胞體數(shù)量對(duì)神經(jīng)元存活率進(jìn)行定量。

將結(jié)果表示為維持在75％氮(對(duì)照條件)下未用PDC處理的培養(yǎng)物的平均值的％(±SEM)。

因此，在兩組之間的單一比較的情況中通過斯氏t檢驗(yàn)、或通過單向方差分析(ANOVA)、然后進(jìn)行相對(duì)于參比組進(jìn)行的多重比較的Dunnett檢驗(yàn)(對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，n＝9)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)研究，其顯示：

-在包含75％氙(與對(duì)照條件中75％的氮比較)的氣氛中，觀察到使用PDC處理的多巴胺能神經(jīng)元的存活率增加，無論水溶性維生素E是否存在于培養(yǎng)基中(#p＜0.05，與相應(yīng)的在75％氮?dú)夥罩械谋┞队赑DC的、在水溶性維生素E的存在下或沒有其存在下的培養(yǎng)物相比)；

-在包含75％的氮的氣氛中，水溶性維生素E產(chǎn)生從1μM開始的并且在包含75％氙的氣氛中從0.1μM開始的顯著的保護(hù)效應(yīng)(＊p＜0.05，與僅暴露于100μM的PDC的在相同氣態(tài)氣氛中相比)。

因此，氙在與抗氧化劑、特別是水溶性維生素E類或維生素E或其衍生物組合時(shí)，在治療、緩解或預(yù)防帕金森類、特別是帕金森病的神經(jīng)變性疾病后的神經(jīng)退化方面產(chǎn)生協(xié)同作用。