一種l-天冬氨酸制取工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種L-天冬氨酸制取工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]天冬氨酸又稱天門冬氨酸，是一種α -氨基酸，天冬氨酸的L-異構(gòu)物是20種蛋白胺基酸之一，即蛋白質(zhì)的構(gòu)造單位，天冬氨酸普遍存在于生物合成作用中。它是生物體內(nèi)賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶堿基的合成前體，它可作為K+、Mg+離子的載體向心肌輸送電解質(zhì)，從而改善心肌收縮功能，同時降低氧消耗，在冠狀動脈循環(huán)障礙缺氧時，對心肌有保護作用。它參與鳥氨酸循環(huán)，促進氧和二氧化碳生成尿素，降低血液中氮和二氧化碳的量，增強肝臟功能，消除疲勞，具有很好的醫(yī)藥價值，因此需求量很大，迫使其批量生產(chǎn)，申請?zhí)枮镃N200910033427.1 一種利用富馬酸發(fā)酵液制備天冬氨酸酶以及L-天冬氨酸的方法，方法包括，一是富馬酸發(fā)酵液的清液部分培養(yǎng)大腸桿菌生產(chǎn)天冬氨酸酶，二是利用發(fā)酵液的固體沉淀部分富馬酸鈣與硫酸銨反應(yīng)生成富馬酸銨，經(jīng)過濃縮后在天冬氨酸酶的作用下生成L-天冬氨酸，該種方法實現(xiàn)了以糖基路線生產(chǎn)L-天冬氨酸，實現(xiàn)了富馬酸發(fā)酵液全利用以至達到節(jié)能減排的目標(biāo)，有效的降低了 L-天冬氨酸的生產(chǎn)成本，減少了對環(huán)境的污染，使得L-天冬氨酸得到可持續(xù)的生產(chǎn)，具有較廣的工業(yè)化生產(chǎn)前景，但是該種生產(chǎn)天冬氨酸的方法生產(chǎn)量小，無法滿足大量需求，并且抗原性強，穩(wěn)定性弱，導(dǎo)致藥效差，限制了其使用范圍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為克服現(xiàn)有技術(shù)上的不足，本發(fā)明目的是提供一種L-天冬氨酸制取工藝。
[0004]為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0005]一種L-天冬氨酸制取工藝，其工藝步驟如下:
[0006](I)選育菌株:選用大腸桿菌作為天冬氨酸酶的來源，用肉汁培養(yǎng)基培養(yǎng)種子，接種與搖瓶培養(yǎng)基中，于32°C下振搖培養(yǎng)12h，逐級擴大培養(yǎng)至1000-2000L規(guī)模后，用Imol/L的HCl調(diào)pH至5.0，保溫42°C，2h后，冷卻至室溫，于轉(zhuǎn)筒式高速離心機內(nèi)離心，收集含有天冬氨酸酶的菌體；
[0007](2)細胞固定化:取大腸桿菌濕菌體15kg，懸浮于離心后的培養(yǎng)清液80L中或80L生理鹽水，保溫35°C再加入90L保溫35°C的18%明膠溶液和1.0%的戊二醛溶液，充分攪勻后，放置冷卻凝固，再放入0.25mol/L戊二醛溶液中浸泡，于5°C過夜后，再切成3 - 5mm3大小的小塊，并將其浸泡在0.25mol/L戊二醛溶液中5°C過夜，再取出以蒸餾水洗滌，濾干，得含天冬氨酸酶的固定化大腸桿菌，將其裝填到填充式生物反應(yīng)器中，備用；
[0008](3)轉(zhuǎn)化:取保溫32°C的lmol/L延胡索酸銨含lmmol/LMgC12，pH為8.5底物的溶液，以一定的空間速度連續(xù)流過生物反應(yīng)器，控制最大轉(zhuǎn)化率大于95%，得轉(zhuǎn)化液；
[0009](4)修飾:取Ig右旋糖苷溶于15ml蒸飽水，另取一定量Na104溶于1ml熱水中，將兩溶液混合，于4°C冰箱反應(yīng)18h，室溫下以蒸餾水透析4h后，再以5LpH7.4的0.lmol/L磷酸鈉緩沖液透析，將透析后的液體加入到步驟(3)的轉(zhuǎn)化液中，混合充分，得到混合液；
[0010](5)制取粗品:向步驟(4)得到的混合液漸加入lmol/L的HCl，調(diào)pH至2.8，在保持5°C下放置過夜結(jié)晶，濾取結(jié)晶，用水洗滌，濾干，于105°C干燥，得L-天冬氨酸粗品；
[0011](6)結(jié)晶:將粗品用稀氨水重結(jié)晶，先以氨水溶解成pH為5.0，濃度15%再加入1%活性炭，加熱70°C攪拌脫色2h后，趁熱過濾去渣，取濾液冷卻，保溫5°C過夜結(jié)晶，過濾取結(jié)晶，85°C真空干燥，即得L-天冬氨酸成品。
[0012]優(yōu)選的，所述步驟(I)中，所述培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基。
[0013]優(yōu)選的，所述步驟(4)中，所述修飾過程加入交聯(lián)劑。
[0014]有益效果:本發(fā)明通過選育菌株、細胞固定化、轉(zhuǎn)化、修飾、制取粗品、結(jié)晶六大步驟完成抗原性弱的L-天冬氨酸制取工藝，能夠在短時間內(nèi)大量生產(chǎn)，修飾之后，抗原性弱，不會引起人體的免疫反應(yīng)，藥效好，固定化生產(chǎn)，穩(wěn)定性好，整個制取過程嚴格控制pH和溫度，并且通過固定化生產(chǎn)，致使生產(chǎn)的L-天冬氨酸穩(wěn)定性好，循環(huán)有效批量生產(chǎn)，在修飾步驟中，選用Na104作為氧化劑，其氧化性強，指示性好，方便快捷地使L-天冬氨酸得到修飾，加入的交聯(lián)劑使修飾反應(yīng)更加容易地進行，制取粗品之后，通過結(jié)晶精制產(chǎn)品，保證了產(chǎn)品的純度，使其在發(fā)揮作用時，藥效更好，斜面培養(yǎng)基使大腸桿菌附著容易，而且便于提取工作，本工藝使L-天冬氨酸的短時間內(nèi)大量生產(chǎn)，極大滿足人們的需求，適于推廣使用。
【具體實施方式】
[0015]為使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合【具體實施方式】，進一步闡述本發(fā)明。
[0016]實施例1:
[0017]本實施例的一種L-天冬氨酸制取工藝，其工藝步驟如下:
[0018](I)選育菌株:選用大腸桿菌作為天冬氨酸酶的來源，用普通肉汁培養(yǎng)基培養(yǎng)種子，接種與搖瓶培養(yǎng)基中，于32°C下振搖培養(yǎng)12h，逐級擴大培養(yǎng)至1000-2000L規(guī)模后，用lmol/L的HCl調(diào)pH至5.0，保溫42°C，2h后，冷卻至室溫，于轉(zhuǎn)筒式高速離心機內(nèi)離心，收集含有天冬氨酸酶的菌體，所述培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基；
[0019](2)細胞固定化:取大腸桿菌濕菌體15kg，懸浮于離心后的培養(yǎng)清液80L中或80L生理鹽水，保溫35°C再加入90L保溫35°C的18 %明膠溶液和1.0 %的戊二醛溶液，充分攪勻后，放置冷卻凝固，再放入0.25mol/L戊二醛溶液中浸泡，于5°C過夜后，再切成3 - 5mm3大小的小塊，并將其浸泡在0.25mol/L戊二醛溶液中5°C過夜，再取出以蒸餾水洗滌，濾干，得含天冬氨酸酶的固定化大腸桿菌，將其裝填到填充式生物反應(yīng)器中，備用；
[0020](3)轉(zhuǎn)化:取保溫32°C的lmol/L延胡索酸銨含lmmol/LMgC12，pH為8.5底物的溶液，以一定的空間速度連續(xù)流過生物反應(yīng)器，控制最大轉(zhuǎn)化率大于95%，得轉(zhuǎn)化液；
[0021](4)修飾:取Ig右旋糖苷溶于15ml蒸飽水，另取一定量Na104溶于1ml熱水中，將兩溶液混合，于4°C冰箱反應(yīng)18h，室溫下以蒸餾水透析4h后，再以5LpH7.4的0.lmol/L磷酸鈉緩沖液透析，將透析后的液體加入到步驟(3)的轉(zhuǎn)化液中，混合充分，得到混合液，所述修飾過程加入交聯(lián)劑；
[0022](5)制取粗品:向步驟(4)得到的混合液漸加入lmol/L的HCl，調(diào)pH至2.8，在保持5°C下放置過夜結(jié)晶，濾取結(jié)晶，用水洗滌，濾干，于105°C干燥，得L-天冬氨酸粗品；
[0023](6)結(jié)晶:將粗品用稀氨水重結(jié)晶，先以氨水溶解成pH為5.0，濃度15%再加入1%活性炭，加熱70°C攪拌脫色2h后，趁熱過濾去渣，取濾液冷卻，保溫5°C過夜結(jié)晶，過濾取結(jié)晶，85°C真空干燥，即得L-天冬氨酸成品。
[0024]實施例2:其余與所述實施例1相同，不同之處在于，步驟(3)控制最大轉(zhuǎn)化率改為大于90 %，本實施例中，成本低，制取時間短，但純度低。
[0025]實施例3:其余與所述實施例1相同，不同之處在于，步驟(6)中趁熱過濾去渣之后，再進行一次重結(jié)晶，本實施例中，操作繁雜，耗時長，但制取產(chǎn)品純度高。
[0026]經(jīng)實際應(yīng)用中可知，通過選育菌株、細胞固定化、轉(zhuǎn)化、修飾、制取粗品、結(jié)晶六大步驟完成抗原性弱的L-天冬氨酸制取工藝，能夠在短時間內(nèi)大量生產(chǎn)，修飾之后，抗原性弱，不會引起人體的免疫反應(yīng)，藥效好，固定化生產(chǎn)，穩(wěn)定性好，整個制取過程嚴格控制PH和溫度，并且通過固定化生產(chǎn)，致使生產(chǎn)的L-天冬氨酸穩(wěn)定性好，循環(huán)有效批量生產(chǎn)，在修飾步驟中，選用Na104作為氧化劑，其氧化性強，指示性好，方便快捷地使L-天冬氨酸得到修飾，加入的交聯(lián)劑使修飾反應(yīng)更加容易地進行，制取粗品之后，通過結(jié)晶精制產(chǎn)品，保證了產(chǎn)品的純度，使其在發(fā)揮作用時，藥效更好，斜面培養(yǎng)基使大腸桿菌附著容易，而且便于提取工作，本工藝使L-天冬氨酸的短時間內(nèi)大量生產(chǎn)，極大滿足人們的需求，適于推廣使用。
[0027]以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種L-天冬氨酸制取工藝，其特征在于，其工藝步驟如下: (1)選育菌株:選用大腸桿菌作為天冬氨酸酶的來源，用肉汁培養(yǎng)基培養(yǎng)種子，接種與搖瓶培養(yǎng)基中，于32°C下振搖培養(yǎng)12h，逐級擴大培養(yǎng)至1000-2000L規(guī)模后，用lmol/L的HCl調(diào)pH至5.0，保溫42°C，2h后，冷卻至室溫，于轉(zhuǎn)筒式高速離心機內(nèi)離心，收集含有天冬氨酸酶的菌體； (2)細胞固定化:取大腸桿菌濕菌體15kg，懸浮于離心后的培養(yǎng)清液80L中或80L生理鹽水，保溫35°C再加入90L保溫35°C的18%明膠溶液和1.0%的戊二醛溶液，充分攪勻后，放置冷卻凝固，再放入0.25mol/L戊二醛溶液中浸泡，于5°C過夜后，再切成3 - 5mm3大小的小塊，并將其浸泡在0.25mol/L戊二醛溶液中5°C過夜，再取出以蒸餾水洗滌，濾干，得含天冬氨酸酶的固定化大腸桿菌，將其裝填到填充式生物反應(yīng)器中，備用； (3)轉(zhuǎn)化:取保溫32°C的lmol/L延胡索酸銨含lmmol/LMgC12，pH為8.5底物的溶液，以一定的空間速度連續(xù)流過生物反應(yīng)器，控制最大轉(zhuǎn)化率大于95%，得轉(zhuǎn)化液； (4)修飾:取Ig右旋糖苷溶于15ml蒸餾水，另取一定量Na104溶于1ml熱水中，將兩溶液混合，于4°C冰箱反應(yīng)18h，室溫下以蒸餾水透析4h后，再以5LpH7.4的0.lmol/L磷酸鈉緩沖液透析，將透析后的液體加入到步驟(3)的轉(zhuǎn)化液中，混合充分，得到混合液； (5)制取粗品:向步驟(4)得到的混合液漸加入lmol/L的HCl，調(diào)pH至2.8，在保持5°C下放置過夜結(jié)晶，濾取結(jié)晶，用水洗滌，濾干，于105°C干燥，得L-天冬氨酸粗品； (6)結(jié)晶:將粗品用稀氨水重結(jié)晶，先以氨水溶解成pH為5.0，濃度15%的溶液再加入1%活性炭，加熱70°C攪拌脫色2h后，趁熱過濾去渣，取濾液冷卻，保溫5°C過夜結(jié)晶，過濾取結(jié)晶，85°C真空干燥，即得L-天冬氨酸成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-天冬氨酸制取工藝，其特征在于，所述步驟(I)中，所述培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-天冬氨酸制取工藝，其特征在于，所述步驟(4)中，所述修飾過程加入交聯(lián)劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種L-天冬氨酸制取工藝，其工藝步驟為：(1)選育菌株；(2)細胞固定化；(3)轉(zhuǎn)化；(4)修飾：取1g右旋糖苷溶于15ml蒸餾水，另取一定量NaIO4溶于10ml熱水中，將兩溶液混合，于4℃冰箱反應(yīng)18h，室溫下以蒸餾水透析4h后，再以5LpH7.4的0.1mol/L磷酸鈉緩沖液透析，將透析后的液體加入到步驟(3)的轉(zhuǎn)化液中，混合充分，得到混合液；(5)制取粗品；(6)結(jié)晶，本發(fā)明的L-天冬氨酸能夠在短時間內(nèi)大量生產(chǎn)，修飾之后，抗原性弱，不會引起人體的免疫反應(yīng)，藥效好，固定化生產(chǎn)，穩(wěn)定性好，適于推廣應(yīng)用。
【IPC分類】C12N11-02, C12P13-20, C12R1-19
【公開號】CN104531797
【申請?zhí)枴緾N201410681746
【發(fā)明人】肖大年, 張政, 余煉
【申請人】廣西大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年11月24日