用于治療1型糖尿病的組合物和方法
【專利說明】用于治療1型糖尿病的組合物和方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2013年5月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/818, 671號(hào)的優(yōu)先權(quán)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及用于治療對(duì)象中的胰島素依賴型糖尿病的組合物和方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 1型糖尿?。═lD)的標(biāo)志之一是最終破壞胰腺β細(xì)胞的炎癥應(yīng)答（被稱為胰島炎 的過程）。在患有TlD的個(gè)體的血液和胰島中已經(jīng)檢測(cè)到針對(duì)多種胰島抗原的CD8T細(xì)胞， 所述胰島抗原包括前胰島素原（PPI)、谷氨酸脫羧酶（GAD)、酪氨酸磷酸酶樣胰島素瘤抗原 (ΙΑ2,也被稱作ICA512)、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ΖηΤ8以及胰島特異的葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基相關(guān) 蛋白（IGRP) (1-3)。因此，試圖利用抗原特異的療法來延緩T1D，包括腸胃外施用和經(jīng)鼻施 用胰島素（4-6)。然而，盡管在具有高水平的胰島素自身抗體的患者子集中存在延緩的證 據(jù)，但口服胰島素的試驗(yàn)不能延緩TlD (6, 7)。其它用明礬靶向GAD的臨床試驗(yàn)在3期在降 低C-肽（β細(xì)胞功能的標(biāo)志物）的丟失方面未成功，可能由于使用了在TlD小鼠模型中未 能顯示效果的佐劑（8)。相比之下，近期的熱休克肽（DiaPep277)的3期試驗(yàn)報(bào)道了 C-肽 保留、胰島素使用和HgbAlc的成功結(jié)果（9)。重要的是，這些涉及注射自身分子的試驗(yàn)具有 已被證明的安全性，迄今為止未報(bào)道嚴(yán)重的不良事件。
[0006] 在TlD小鼠模型的臨床前實(shí)驗(yàn)中成功的一種方法為利用編碼包含C-肽、胰島素 A鏈和B鏈的整個(gè)胰島素原分子的工程化的DNA疫苗（10-12)。在高血糖非肥胖型糖尿病 (NOD)小鼠中，對(duì)胰島素原的耐受阻止并逆轉(zhuǎn)了活性胰島炎，高血糖非肥胖型糖尿病小鼠模 型是被廣泛研究的TlD小鼠模型（12)。
[0007] 已經(jīng)在TlD中鑒定了對(duì)胰島相關(guān)抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。從TlD患者中獲得的胰 腺樣本顯示了胰島中的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（其主要由CD8+T細(xì)胞組成），伴隨著HLA I類分子上 調(diào)（1，14)。這些發(fā)現(xiàn)顯示了 TlD中，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的主要病理生理性作用。在TlD 的發(fā)病機(jī)制中也可能涉及CD4+T細(xì)胞，其由TlD中的易感性與某些HLA II類單倍型的強(qiáng)相 關(guān)性進(jìn)一步支持（14)。最后，已經(jīng)在絕大多數(shù)的TlD患者和具有發(fā)展為該疾病的遺傳風(fēng)險(xiǎn) 的那些個(gè)體中發(fā)現(xiàn)了胰島抗原的自身抗體。在95%的糖尿病前期或新發(fā)病的TlD患者中存 在針對(duì)GAD、IA2或胰島素的抗體；在80%的患者中，這些抗體中的兩種或更多種為陽(yáng)性，并 且在25%的患者中這三種抗體都為陽(yáng)性。多種TlD相關(guān)的自身抗體較少存在于健康對(duì)照對(duì) 象的血清中（3)。
[0008] 胰島素是原代β細(xì)胞特異的自身抗原，并且胰島素自身抗體通常首先出現(xiàn)于患 有TlD的幼兒中（3, 15)。此外，從患有TlD的患者的胰腺引流淋巴結(jié)中分離到的一半的T 細(xì)胞識(shí)別胰島素 A鏈的表位，而未觀察到識(shí)別該表位的來自健康對(duì)象的T細(xì)胞（16)。最后， 已經(jīng)證實(shí)來自TlD患者的胰島素反應(yīng)性T細(xì)胞顯示出活化的炎性Thl細(xì)胞表型，而來自健 康對(duì)照的胰島素反應(yīng)性T細(xì)胞顯示出保護(hù)性T調(diào)節(jié)表型（17)。
[0009] 在例如國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)?TO 00/53019、TO 2003/045316 和 TO 2004/047734 中，描 述了通過施用編碼一種或多種自身抗原的核酸治療自身免疫病的方法。這些方法雖然已經(jīng) 成功，但是仍需進(jìn)一步改善。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本發(fā)明提供了用于治療對(duì)象中胰島素依賴型糖尿病的組合物和方法，其包括施用 編碼且能夠表達(dá)人胰島素原的自身載體（self-vector)。
[0012] 因此，一方面，本發(fā)明提供了 SEQ ID N0:1的自身載體（BHT-3021)。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO: 1的自身載體（BHT-3021)和藥 學(xué)可接受的載體或賦形劑的組合物。
[0014] 在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了治療、預(yù)防對(duì)象中胰島素依賴型糖尿?。↖DDM)，減輕其 嚴(yán)重性和/或緩解其癥狀的方法，其包括向?qū)ο笫┯肧EQ ID NO: 1的自身載體（BHT-3021)。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，以藥學(xué)可接受的載體或賦形劑施用自身載體。
[0016] 通過下述詳細(xì)描述和附圖，本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)勢(shì)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員 而言將是顯而易見的。
[0017] 附圖簡(jiǎn)要描述
[0018] 圖1為BHT-3021的結(jié)構(gòu)圖。BHT-3021是包含人胰島素原（hINS)基因的編碼序 列的3. 3Kb的細(xì)菌質(zhì)粒表達(dá)載體。BHT-3021的重要的功能和控制特征包括人巨細(xì)胞病毒 (CMV)介導(dǎo)的早期基因啟動(dòng)子和增強(qiáng)子、牛生長(zhǎng)激素基因聚腺苷酸化信號(hào)、卡那霉素抗性基 因以及在大腸桿菌中用于載體增殖的PUC復(fù)制起點(diǎn)。對(duì)BHT-3021的骨架進(jìn)行修飾以減少 免疫刺激性CpG序列的數(shù)量并取代免疫抑制序列。
[0019] 圖2顯示了研究試驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理圖。在該研究中登記了 80個(gè)對(duì)象。對(duì)四種 BHT-3021劑量水平進(jìn)行了評(píng)估：0. 3mg、l. 0mg、3. Omg和6. Omg。完成研究的劑量探索階段 (劑量遞增階段）之后，登記其它對(duì)象以擴(kuò)展選擇劑量組，從而獲得另外的安全性和效力數(shù) 據(jù)（擴(kuò)展階段）。研究的劑量遞增部分將對(duì)象順序登記為Img組，然后為3mg組（隨機(jī)化的 活性組：安慰劑組為2:1);然后同時(shí)登記0.3mg和6mg劑量水平的組。完成劑量遞增登記 之后，將對(duì)象隨機(jī)分為（活性組：安慰劑組為2:1)擴(kuò)展組，以接受劑量為0. 3mg、Img或3mg 的BHT-3021或者BHT-安慰劑。
[0020] 圖3顯示了 C-肽從基線的平均百分比變化。對(duì)C-肽進(jìn)行評(píng)估，以確定在12次每 周劑量期間及其后，在該β細(xì)胞功能的測(cè)量中是否不存在急劇降低。如方法中所述的對(duì) C-肽進(jìn)行測(cè)量（18-20)。對(duì)于0· 3mg劑量，η = 14 ;對(duì)于1.0 mg劑量，η = 15 ;對(duì)于3. Omg 劑量，η = 13 ;對(duì)于6. Omg劑量，η = 8 ;對(duì)于安慰劑組，η = 23。顯示了從基線的平均百分 比變化+/-CI。W指在0時(shí)開始12次的每周劑量之后的周，而M指在0時(shí)開始12次的每周 劑量之后的月。
[0021] 圖4顯示了用利用載有多種抗原21-24的I類HLA多聚體的Qdot-多聚體技術(shù)對(duì) 抗原特異的CD8T細(xì)胞進(jìn)行計(jì)算。每張圖都顯示了抗原和HLA單體型。CTL頻率被定義為抗 原特異的⑶8T細(xì)胞的百分比。y軸上顯示了 CTL從基線至第15周的變化，且X軸上顯示了 C-肽從基線至第15周的％變化。通過將第15周的值減去基線值來計(jì)算CTL的變化。對(duì) HLA-A2、-A3和/或-B7(A)以及對(duì)照抗原⑶為陽(yáng)性的所有治療患者（0. 3mg :菱形，Img : 三角形，3mg:正方形，6mg:圓形）和安慰劑患者進(jìn)行分析。利用線性回歸分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
[0022] 圖5㈧顯示了 24個(gè)月中C-肽從基線的平均百分比變化。如方法中所述的對(duì)C-肽 進(jìn)行測(cè)量（18-20)。在12個(gè)月中，對(duì)于0· 3mg劑量，η = 14 ;對(duì)于1.0 mg劑量，η = 15 ;對(duì)于 3. Omg劑量，η = 13 ;對(duì)于6. Omg劑量，η = 8 ;對(duì)于安慰劑組，η = 23。對(duì)于0· 3mg，在M18， N = 14,且在 M24, N = 7 ;對(duì)于 1.0 mg，在 M18, N = 13,且在 M24, N = 7 ;對(duì)于 3mg，在 M18, N =12,在 M24, N = 9 ;對(duì)于 6. Omg，在 M18, N = 7,且在 M24, η = 6 ;對(duì)于安慰劑組，在 M18, η =3,且在Μ24, N= 1。顯示了從基線的平均百分比變化+/-CI。圖5(B)為將在第15周， 單個(gè)患者在所有劑量時(shí)的C-肽水平的平均變化可視化的散點(diǎn)圖。
[0023] 圖6顯示了不同劑量的ΒΗΤ-3021與BHT-安慰劑的HgbAlc和平均總胰島素使用。 (A) y軸上顯示了血紅蛋白A1C，并且X軸上顯示了以月計(jì)的時(shí)間（M)。（B)y軸上描述了以 IU/mg/kg計(jì)的平均總胰島素使用，并且X軸上描述了以周計(jì)的時(shí)間。104周的數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì) 學(xué)上不顯著，并且現(xiàn)在在文本中提到了。此外，如圖5A的圖例中所提到的，在104周，N = 3〇
[0024] 圖7顯示了疫苗相關(guān)表位和病毒相關(guān)表位的抗原特異的T細(xì)胞隨時(shí)間的變化。在 基線和第8、15、24、36和52周，用肽-HLA多聚體計(jì)算針對(duì)疫苗相關(guān)表位（胰島素原和胰島 素）和病毒特異的表位（EBV、CMV和麻疹）或（B)單獨(dú)的胰島素原的抗原特異的CD8T細(xì) 胞。通過將每一時(shí)間點(diǎn)的值減去基線值來計(jì)算Δ。
[0025] 圖8顯示了在第0周，治療組（實(shí)心圓）和安慰劑組（空心圓）患者的抗原特異 的CD8T細(xì)胞的頻率。用利用載有多種抗原21-24的I類HLA多聚體的Qdot-聚合體技術(shù) 計(jì)算抗原特異的⑶8T細(xì)胞。CTL頻率被定義為抗原特異的⑶8T細(xì)胞的百分比。PI :胰島 素原；Ins :Insulin ;PPI :前胰島素原。
[0026] 圖9顯示了與4種不同的抗原特異的T細(xì)胞亞群的基線相比，IL-IO和干擾素 -γ 陽(yáng)性的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)的數(shù)量。在y軸上測(cè)量IL-IO(A)和干擾素 γ (B)特異的斑點(diǎn)的數(shù)量 的變化，比較BHT-安慰劑組和ΒΗΤ-3021治療組對(duì)象在0周至15周的變化。
[0027] 發(fā)明詳述
[0028] 在1型糖尿病中，存在破壞胰腺中的胰島β細(xì)胞的強(qiáng)烈炎癥應(yīng)答，位點(diǎn)為胰島素 產(chǎn)生和釋放的位點(diǎn)。在1型糖尿?。═lD)中，胰島素原是適應(yīng)性免疫應(yīng)答的主要靶標(biāo)。本 發(fā)明提供了編碼胰島素原的工程化的DNA質(zhì)粒（ΒΗΤ-3021)，其通過減少胰島素特異的⑶8Τ 細(xì)胞保留了 TlD患者中β細(xì)胞的功能。設(shè)計(jì)ΒΗΤ-3021以減少TlD中針對(duì)胰島素原的抗 原特異的自身免疫應(yīng)答，設(shè)計(jì)的質(zhì)粒具有數(shù)量減少的被稱為CpG基序的促炎性六核苷酸基 序。CpG六核苷酸序列通過與Toll樣受體9 (TLR9)和其它DNA感受器結(jié)合來激活固有免 疫應(yīng)答（13)。用GpG基序替換與CpG基序競(jìng)爭(zhēng)的所有非必需的CpG序列。該抗原特異的 質(zhì)粒疫苗方法具有降低自身免疫應(yīng)答的理論優(yōu)勢(shì)，同時(shí)保留了免疫系統(tǒng)的完整的其它重要 的、期望的生理作用，如針對(duì)胰島素原的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答、針對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視以及針對(duì)感染 劑的免疫應(yīng)答。
[0029] 本發(fā)明提供了通過施用編碼和能夠表達(dá)人胰島素原的自身載體來治療、減輕、預(yù) 防和抑制胰島素依賴型糖尿?。↖DDM)的組合物和方法。如上文所述，在IDDM中，在顯性糖 尿病發(fā)病之前，存在很長(zhǎng)的癥狀發(fā)生前階段，在該階段胰腺β細(xì)胞功能逐漸喪失?？梢赃M(jìn) 行評(píng)估的標(biāo)志物包括但不限于：作為胰腺β細(xì)胞功能的指示的C肽的血液或血清水平，胰 腺中胰島炎的存在，胰島細(xì)胞抗體、胰島細(xì)胞表面抗體的水平和頻率，針對(duì)IDDM中靶向的 自身抗原的自身抗體的存在和濃度，胰腺β細(xì)胞上II類MHC分子的異常表達(dá)，血液中的葡 萄糖濃度以及胰島素的血漿濃度。胰腺中T淋巴細(xì)胞數(shù)目、胰島細(xì)胞抗體和血糖的增加是 疾病的指示，胰島素濃度的降低同樣也是。
[0030] 非肥胖型糖尿?。∟OD)小鼠是具有與人IDDM相同的多種臨床、免疫學(xué)和組織病理 學(xué)特征的動(dòng)物模型。NOD小鼠自發(fā)產(chǎn)生導(dǎo)致高血糖癥和顯性糖尿病的胰島的炎癥和β細(xì) 胞的破壞。糖尿病的發(fā)展需要CD4 +和CD8+T細(xì)胞，盡管每種的功能還不清楚。已經(jīng)顯示，在 NOD小鼠耐受的條件下，作為蛋白施用胰島素或GAD，預(yù)防了疾病并下調(diào)了針對(duì)其它自身抗 原的應(yīng)答。
[0031] 血清中自身抗體與各種特異性的組合的存在對(duì)于人I型糖尿病是高度靈敏且特 異的。例如，針對(duì)GAD和/或IA-2的自身抗體的存在對(duì)于從對(duì)照血清中鑒定I型糖尿病具 有大約98%的靈敏性和99%的特異性。在I型糖尿病患者的非糖尿病的一級(jí)親屬中，針對(duì) 包括GAD、胰島素和IA-2的三種自身抗原中的兩種特異的自身抗體的存在為5年內(nèi)發(fā)展為 I型DM提供了 >90%的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。
[0032] 在人胰島素依賴型糖尿病中，靶向的自身抗原包括，例如胰島素自身抗原，包 括胰島素、胰島素 B鏈、胰島素原和前胰島素原；酪氨酸磷酸酶ΙΑ-2 ;ΙΑ-2β ;65kDa和 67kDa形式的谷氨酸脫羧酶（GAD);羧肽酶Η;熱休克蛋白（HSP) ;glima 38;胰島細(xì)胞抗原 69KDa(ICA69) ;p52;兩種神經(jīng)節(jié)苷脂抗原（GT3和GM2-1);胰島特異的葡萄糖-6-磷酸酶相 關(guān)蛋白（IGRP);以及胰島細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT 2)。
[0033] 相應(yīng)地，本發(fā)明提供了用于治療、預(yù)防、降低、抑制和/或延遲例如對(duì)象中的IDDM 的癥狀或嚴(yán)重性的組合物和方法，其包括施用編碼且能夠表達(dá)人胰島素原的修飾的自身載 體，具體為自身載體BHT-3021 (SEQ ID N0:1)。向?qū)ο笫┯弥委熁蝾A(yù)防有效量的修飾的自身 載體，引起針對(duì)與IDDM相關(guān)的自身抗原的免疫應(yīng)答的抑制，從而治療或預(yù)防該疾病。所述 自身載體可以與以高于生理濃度存在的一種或多種二價(jià)陽(yáng)離子共同施用或共同配制。令人 驚奇的是，與存在總濃度等于或低于生理水平的一種或多種二價(jià)陽(yáng)離子的情況下共同施用 自身載體相比，與總濃度高于生理水平的一種或多種二價(jià)陽(yáng)離子共同施用所述自身載體提 高了下述中的一種或多種：編碼的自身抗原的轉(zhuǎn)染率、表達(dá)（即轉(zhuǎn)錄和翻譯），和對(duì)非期望 的免疫應(yīng)答的治療抑制。
[0034] II.定義
[0035] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有如本發(fā)明所屬 領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。下述參考文獻(xiàn)為技術(shù)人員提供了許多 本文所用術(shù)語(yǔ)的一般定義：Hale and Margham, The Harper Collins Dictionary of Biology (HarperPerennial, 1991) ；King and StansfieId,A Dictionary of Genetics(Oxford University Press,4th ed. 1990) ;Stedman' s Med