專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療糖尿病的調(diào)節(jié)mg29的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組核酸和多肽組合物以及使用它們調(diào)節(jié)肌肉功能和治療疾病的方法。參考資料的并入隨同本申請(qǐng)?zhí)峤涣擞?jì)算機(jī)可讀形式的序列表文件名稱(chēng)MG^v2_SeqliSt_ST25. txt,大小68KB,創(chuàng)建于2010年6月3日，使用PatentIn-3. 5和Checker4. 4. 0生成，該文件通過(guò)引用完整地合并在此。
背景技術(shù)：
骨骼肌三聯(lián)體(triad junction)是由陷入細(xì)胞質(zhì)中的質(zhì)膜的單個(gè)凹陷部分(橫管或T管)組成，該單個(gè)凹陷部分與肌質(zhì)網(wǎng)(SR)終池的兩個(gè)部分并置。通過(guò)免疫染色篩查集中于三聯(lián)體中的新蛋白質(zhì)的抗體文庫(kù)，鑒定出參與興奮-收縮(E-C)偶聯(lián)和骨骼肌中 Ca2+調(diào)控其它方面的蛋白質(zhì)。在篩查這個(gè)文庫(kù)期間鑒定的一種蛋白質(zhì)是新跨膜蛋白，稱(chēng)為 mitsugumin 29(MG29)。MG^幾乎僅表達(dá)于骨骼肌纖維上，在腎臟上觀(guān)察到輕微的表達(dá)，并包含使該蛋白質(zhì)集中于三聯(lián)體橫(T-)管膜和SR膜中的四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。這種亞細(xì)胞分布提示1 ^9可以介導(dǎo)T-管膜和連接SR膜之間的通訊。MG29蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與神經(jīng)遞質(zhì)釋放所必需的跨膜蛋白的突觸素(synaptophysin)家族成員的氨基酸序列同源，并與該突觸素家族成員具有共同的典型結(jié)構(gòu)特征。突觸素起初被鑒定為小突觸囊泡中豐富的高度免疫原性膜蛋白，也在致密核心的嗜鉻和神經(jīng)分泌顆粒中發(fā)現(xiàn)。突觸素及其同源物突觸孔蛋白(或突觸素II)和泛有小泡蛋白(pantophysin)與四個(gè)跨膜區(qū)具有共同的跨膜組織機(jī)構(gòu)(organization)，并具有共同的胞質(zhì)氨基和羧基末端。突觸素的獨(dú)特特征在于它具有低聚結(jié)構(gòu)，因此有人提出突觸素可能是在神經(jīng)遞質(zhì)釋放期間形成的融合孔成分。而且Aider等人已證明與突觸素mRNA互補(bǔ)的反義寡核苷酸可以降低通過(guò)注射全腦mRNA誘導(dǎo)的爪蟾卵母細(xì)胞的Ca2+-依賴(lài)性谷氨酸鹽分泌。顯微注射到運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的突觸素抗體阻斷了神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)。這些數(shù)據(jù)與突觸素是神經(jīng)遞質(zhì)分泌所必需的事實(shí)一致。然而，鑒定突觸素功能的遺傳途徑尚未成功；缺少突觸素的突變小鼠表現(xiàn)出正常的表型。這可以反映出突觸孔蛋白或其它突觸素家族成員的代償作用。事實(shí)上，突觸素和突觸孔蛋白(synaptogyrin)都有缺陷的小鼠的突觸可塑性存在缺陷。已提出突觸素在囊泡形成中起結(jié)構(gòu)作用。由于突觸素具有強(qiáng)的結(jié)合膽固醇的能力，因而它與突觸囊泡生物發(fā)生期間形成膜曲率有關(guān)。還已知突觸素可以與突觸囊泡膜的其它蛋白質(zhì)，即，小突觸囊泡蛋白(synaptobrevin)和液泡膜H+-ATPaSe緊密相互作用。據(jù)認(rèn)為，這些相互作用可以在SNARE復(fù)合物或融合孔形成的水平上調(diào)節(jié)胞吐膜融合 (exocytotic membrane fusion) 0酵母液泡融合的研究支持后者的觀(guān)點(diǎn)，該研究暗示液泡 ATPase直接參與膜融合。MG29和突觸素之間的相似性激起人們研究MG^是否對(duì)骨骼肌中膜結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)起著重要作用。骨骼肌在性質(zhì)上是最具可塑性的組織之一，并且正常肌肉生理需要形成和維持復(fù)合物膜結(jié)構(gòu)。在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中，老化和包括疲勞在內(nèi)的其它過(guò)程需要不斷地改變骨骼肌系統(tǒng)，因而與骨骼肌膜結(jié)構(gòu)可塑性相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)的鑒定和表征，是理解肌肉生理，以及治療和診斷與包括糖尿病在內(nèi)的肌肉功能障礙相關(guān)的病狀所必需的。骨骼肌是在軀體神經(jīng)系統(tǒng)的控制下存在的橫紋肌組織形式。它是三種主要肌肉類(lèi)型之一，其它兩種是心肌和平滑肌。對(duì)于人，骨骼肌占據(jù)胰島素敏感性葡萄糖代謝多達(dá) 80%，以及占據(jù)整體葡萄糖代謝的大部分。骨骼肌的胰島素抗性(IR)是代謝疾病的主要危險(xiǎn)因素，并且是2型糖尿病、肥胖癥和高血壓的特征。大量文獻(xiàn)認(rèn)同，葡萄糖代謝的近端步驟(proximal st印s)，葡萄糖遞送、轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸化那些為健康中胰島素作用的關(guān)鍵點(diǎn)以及為骨骼肌胰島素抗性的決定因素。因此，要確定代謝性疾病如肥胖癥和胰島素抗性糖尿病中存在的缺陷性質(zhì)，就必須理解肌肉葡萄糖利用的機(jī)制和調(diào)節(jié)過(guò)程。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，葡萄糖利用的起始步驟，通常被認(rèn)為是肌肉中葡萄糖利用的速率決定步驟。評(píng)估決定葡萄糖利用的轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸化平衡的一種途徑是確定這些過(guò)程是如何在細(xì)胞水平上偶聯(lián)的。糖尿病是代謝障礙，其特征是由于胰臟朗格漢斯島中生產(chǎn)胰島素的β細(xì)胞減少 (其導(dǎo)致胰島素缺乏(即，I型糖尿病))，和/或由于胰島素抗性(即，II型糖尿病或NIDD) 而無(wú)法控制血糖水平。I型糖尿病可以進(jìn)一步分為免疫介導(dǎo)性或特發(fā)性(idiopathic，先天性)。大多數(shù) I型糖尿病屬于免疫介導(dǎo)性，其中β細(xì)胞減少是T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫攻擊。目前還沒(méi)有對(duì)抗1型糖尿病的預(yù)防措施，導(dǎo)致北美和歐洲近10%的糖尿病病例。疾病發(fā)作時(shí)，大多數(shù)受感染者在其它方面是健康的并具有健康的體重。對(duì)胰島素的敏感性和反應(yīng)通常是正常的， 尤其是在早期階段。1型糖尿病可以感染兒童或成人，習(xí)慣上稱(chēng)為“青少年糖尿病”，它表示兒童糖尿病病例占多數(shù)。對(duì)于II型糖尿病，據(jù)認(rèn)為身體組織對(duì)胰島素的缺陷性反應(yīng)與胰島素受體有關(guān)。但目前還不清楚具體的缺陷。在II型糖尿病早期階段，突出的異常降低了胰島素敏感度。在這個(gè)階段，高血糖癥一般可以通過(guò)提高胰島素敏感度或降低肝臟產(chǎn)生的葡萄糖量的各種措施和藥物治療逆轉(zhuǎn)。隨著該疾病的進(jìn)展，胰島素分泌開(kāi)始受損，而且有時(shí)某些患者可能需要更換胰島素治療。如果可用的胰島素量不足，如果細(xì)胞對(duì)胰島素的反應(yīng)不佳(胰島素不敏感或胰島
4素抵抗)，或者如果胰島素本身有缺陷，那么葡萄糖將無(wú)法發(fā)揮平常的作用，致使葡萄糖不能被需要它的那些機(jī)體細(xì)胞適當(dāng)?shù)匚?，也不能適當(dāng)?shù)貎?chǔ)存在肝臟和肌肉中。所產(chǎn)生的結(jié)果就是血糖水平持續(xù)較高、蛋白質(zhì)合成不佳，以及其它代謝擾亂如酸中毒。當(dāng)血液中葡萄糖濃度升高到超出它的腎閾(renal threshold)(約lOmmol/L，但這個(gè)值在某些情況下可以變化，如懷孕時(shí))時(shí)，近端腎小管對(duì)葡萄糖的重吸收不完全，部分葡萄糖余留在尿(糖尿)中。這致使尿滲透壓增高，抑制腎臟對(duì)水的重吸收，導(dǎo)致產(chǎn)尿量增加(尿頻)、體液?jiǎn)适Я吭龆唷ｓw細(xì)胞和其它身體分區(qū)中保持水將滲透性地補(bǔ)償丟失的血容量，導(dǎo)致脫水和口渴增多。胰島素治療不充分可能會(huì)導(dǎo)致急性并發(fā)癥，包括低血糖、糖尿病酮癥酸中毒、非酮癥性高血糖，或非酮癥高滲性昏迷。嚴(yán)重的長(zhǎng)期并發(fā)癥包括心血管疾病，如心臟病發(fā)作、中風(fēng)、動(dòng)脈疾病(例如，冠狀動(dòng)脈疾病)，神經(jīng)病變，腎衰竭，視網(wǎng)膜損傷，勃起功能障礙，失明， 傷口愈合緩慢和截肢。截至2000年，全世界至少1.71億或2. 8%的人口罹患糖尿病。2型糖尿病目前為止是最常見(jiàn)的，影響美國(guó)糖尿病人口的90 95% (Wild S，Roglic G，Green A, Sicree R, King H(May 2004). " Global prevalence of diabetes :estimates for 2000and projections for 2030" . Diabetes Care 27(5) :1047-53)。因此，不斷地需要研制用于治療與包括糖尿病在內(nèi)的肌肉功能障礙相關(guān)的病癥的肌肉功能藥物調(diào)節(jié)劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及參與肌細(xì)胞葡萄糖代謝的基因、蛋白質(zhì)和過(guò)程的令人驚訝的意外發(fā)現(xiàn)。特別地，本發(fā)明提供了編碼MG^g肽及其生物活性部分的核酸(在此分別稱(chēng)為"MG^ 多肽”和"MG^核酸”)、與編碼MG^多肽及其生物活性部分的核酸互補(bǔ)的核酸、包含它們的載體和/或宿主細(xì)胞、MG^多肽和融合蛋白、對(duì)MG^表位具有特異性的抗體或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、內(nèi)源性MG^基因或外源性MG^轉(zhuǎn)基因的表達(dá)被調(diào)節(jié)的宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因生物。在另外的方面，本發(fā)明提供了篩選調(diào)節(jié)MG^的活性、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯(即，表達(dá)) 的化合物的診斷分析和方法，以及使用其的方法。在進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了用作治療和預(yù)防糖尿病的治療劑的組合物。本發(fā)明治療組合物包含MG^多肽和融合蛋白、編碼MG^多肽的核酸，以及與編碼MG^的核酸互補(bǔ)的核酸，包括含核糖的核酸。本發(fā)明的這個(gè)方面也包括MG^突變體、同源物、片段、截短體(截?cái)囿w，truncations)、假肽(擬肽，pseudopeptides)、肽類(lèi)似物，和模擬肽。在另一方面，本發(fā)明提供了可調(diào)節(jié)MG^的活性、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯(S卩，表達(dá))的化合物。如本文所述的，MG^是對(duì)包括葡萄糖代謝在內(nèi)的正常肌肉功能至關(guān)重要的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理過(guò)程的重要構(gòu)成部分。因此，靶向和調(diào)節(jié)MG^基因表達(dá)、多肽合成、活性或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是治療與包括例如糖尿病在內(nèi)的肌肉功能障礙相關(guān)的病狀的新治療干預(yù)。先前的研究結(jié)果表明，MG29功能和/或基因表達(dá)異常導(dǎo)致肌肉功能障礙和老化。 如本文所述的，我們已令人驚訝地意外發(fā)現(xiàn)，MG^可以用作血糖調(diào)節(jié)劑，因而它的調(diào)節(jié)對(duì)治療糖尿病有用。特別地，MG^蛋白與作為該過(guò)程重要參與者的其它因素相互作用從而將葡萄糖從血流吸收到骨骼肌中。因此，本發(fā)明也提供了可以調(diào)節(jié)MG^在骨骼肌中的表達(dá)和/或活性從而輔助治療糖尿病的組合物和方法。如本文所述的調(diào)節(jié)MG^基因表達(dá)控制機(jī)制提供了治療糖尿病和其它肌肉疾病的有效工具。在某些另外的方面，本發(fā)明提供了與糖尿病診斷、治療或改善相關(guān)的組合物和方法。在某些示例性實(shí)施方式中，本發(fā)明包括，例如，給予有效量的本發(fā)明治療組合物，用于預(yù)防和/或治療糖尿病。在某些實(shí)施方式中，該治療組合物包含核酸，包括調(diào)節(jié)MG^活性、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的抑制性核酸(例如，反義和/或干擾核酸)、重組MG^多肽，和/或能夠調(diào)節(jié)MG^活性、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的小分子。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及對(duì)診斷或監(jiān)測(cè)與肌肉功能相關(guān)的疾病或病癥有用的診斷組合物，該組合物包含與MG^編碼核酸如MG^基因或RNA的至少一部分互補(bǔ)或能夠與其雜交的核酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供了本文所述的任何發(fā)明。前面的一般實(shí)用領(lǐng)域僅用于舉例，并不限制本公開(kāi)內(nèi)容以及所附權(quán)利要求的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明權(quán)利要求、說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例，可以理解與本發(fā)明組合物、方法和工藝關(guān)聯(lián)的另外的目的和優(yōu)點(diǎn)。例如，本發(fā)明各個(gè)方面和實(shí)施方式可以許多組合形式利用，本說(shuō)明書(shū)明確地考慮了所有這些組合。這些另外的優(yōu)點(diǎn)、目的和實(shí)施方式明確地包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。本文為了闡明本發(fā)明背景，以及在特定情況下為了提供關(guān)于實(shí)施的另外的細(xì)節(jié)而使用的出版物和其它資料通過(guò)引用合并在此，并出于方便而列在所附文獻(xiàn)目錄中。


合并在本發(fā)明書(shū)中，并形成本說(shuō)明書(shū)的一部分，示出本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方式的附圖， 與本說(shuō)明書(shū)一起解釋本發(fā)明的原理。附圖僅用于說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，而不應(yīng)解讀為限制本發(fā)明。圖1.人的MG^蛋白僅表達(dá)在骨骼肌和腎臟上皮中。使用單克隆抗-MG^抗體 (底部)或?qū)φ瘴疵庖逫gG (頂部)對(duì)石蠟包埋的多組織微陣列(MTA)進(jìn)行染色。暗紫色信號(hào)表示MG^ (SEQ ID NO 3,4)的表達(dá)。雖然MG^大量地表達(dá)于骨骼肌(A)上，但它也出現(xiàn)在腎臟上皮層(印ithelial lining) (B、C)中。在心臟(D)和所測(cè)試的所有其它組織(包括肺、睪丸、肝、脾、腦等)中無(wú)表達(dá)。圖2. MG^主要表達(dá)在骨骼肌中。使用對(duì)MG^ (SEQ ID NO 1)具有特異性的探針對(duì)各種小鼠組織進(jìn)行Northern印跡分析(RNA印跡分析)。在腎臟中觀(guān)察到極小的表達(dá)，而在骨骼肌中觀(guān)察到豐富的表達(dá)。圖3.正常個(gè)體和2型糖尿病患者骨骼肌中的MG^增大。從正常個(gè)體(NGT)和2型糖尿病患者采集肌肉樣品。㈧執(zhí)行Western印跡(蛋白質(zhì)印跡)測(cè)量MG^和肌動(dòng)蛋白的表達(dá)水平從而使MG^表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化。(B)使用密度測(cè)定法(密度計(jì)量學(xué)，densitometry) 量化并使用ImageJ軟件分析蛋白質(zhì)表達(dá)。該條形圖表明更多的MG^顯著表達(dá)于糖尿病人患者骨骼肌中。結(jié)果表示為平均值士SEM. N = 6. * :P < 0. 05圖4.人糖尿病骨骼肌上的MG^定位模式發(fā)生改變。示出正常人骨骼肌(頂部) 和2型糖尿病患者骨骼肌(底部)中內(nèi)源性MG^的定位。用MG^抗體(左側(cè))對(duì)多聚甲醛固定石蠟包埋的切片進(jìn)行免疫染色，然后通過(guò)共聚焦顯微鏡檢查。利用亮視野顯微鏡 (右側(cè))確立肌纖維定位并確定組織切片質(zhì)量。
圖5. MG29缺失(mg29-/_)小鼠對(duì)葡萄糖負(fù)荷(葡萄糖挑戰(zhàn)，glucose challenge) 的反應(yīng)受損。在腹膜內(nèi)推注葡萄糖溶液后，測(cè)量小鼠的空腹血糖水平。(a)雄性mg29-/_小鼠在葡萄糖負(fù)荷后表現(xiàn)出顯著較高的血糖水平。時(shí)間0等于注射時(shí)間。(b)雌性mg^-/-小鼠在葡萄糖負(fù)荷后表現(xiàn)出顯著較高的血糖水平。(c)匯總來(lái)自雄雌小鼠的平均數(shù)據(jù)。通過(guò) ANOVA 分析，其中 * :P < 0. 05 ；** :P < 0. 01 ;_P < 0. 001。圖6. MG29缺失(mg29-/_)小鼠對(duì)胰島素負(fù)荷的反應(yīng)受損。在圖表中的時(shí)間0時(shí)腹膜內(nèi)推注胰島素后，測(cè)量小鼠的空腹血糖水平。MG^ (mg29-/_)小鼠的反應(yīng)達(dá)不到與野生型(WT)對(duì)照的反應(yīng)相同的水平。這表明，mg29-/_小鼠中骨骼肌攝取葡萄糖的能力受損。 示出平均值+SEM0利用ANOVA分析，其中** :P < 0. 01 ;_P < 0. 001。圖7.當(dāng)用高脂食物飼喂時(shí)MG^缺失(mg29-/_)小鼠罹患糖尿病的速度較快。用高脂食物飼喂幾組小鼠，然后測(cè)量它們的體重和血糖變化。(a)當(dāng)在圖表中的0周開(kāi)始用高脂食物飼喂時(shí)，MG^和野生型(WT)小鼠的體重以相同速率增加。(b)當(dāng)通過(guò)腹膜內(nèi)推注葡萄糖進(jìn)行負(fù)荷試驗(yàn)時(shí)，mg29-/_小鼠不能如WT小鼠那樣有效地清除葡萄糖，表明mg^-/-小鼠比WT小鼠更快地罹患糖尿病表型。利用ANOVA分析，其中* :P < 0. 05。圖8.在分離的小鼠肌肉中通過(guò)改變MG^表達(dá)水平調(diào)節(jié)葡萄糖攝取。從野生型 (WT)小鼠、mg29-/-(MG9I0)小鼠或由于用重組AAV(WT-MG29)處理而過(guò)表達(dá)MG^的wt 小鼠中切出比目魚(yú)肌(SOL)或趾長(zhǎng)伸肌(extensor digitorum longus，EDL)。測(cè)試這些肌肉在暴露于胰島素QOOnM)之前和之后攝取放射性標(biāo)記的2-脫氧葡萄糖Q-DG)的能力。 mg29-/"小鼠表現(xiàn)出較wt小鼠顯著減小的2-DG攝取能力，而MG^過(guò)表達(dá)小鼠表現(xiàn)出增大的葡萄糖攝取能力。這些研究結(jié)果表明，MG^是胰島素刺激的葡萄糖攝取所必需的，而且在肌細(xì)胞內(nèi)提供另外的MG^可以增大葡萄糖攝取。因而，提高M(jìn)G^表達(dá)是降低血糖水平治療糖尿病的可行途徑。值為5 10塊肌肉的平均值士 SEM。*P < 0. 05 ；< 0. 01。圖9. db/db肌肉中的Ca2+火花活性(spark activity)受損依賴(lài)于高血糖病癥。 (a)用載體(左側(cè))或GLPl (右側(cè))處理的db/db肌肉(頂部)或野生型肌肉(底部)中 Ca2+火花的代表性線(xiàn)掃描圖像。注意，通過(guò)使用GLPl可以逆轉(zhuǎn)db/db肌肉中Ca2+火花頻率的大幅降低。(b)GLPl對(duì)表現(xiàn)出高的高血糖病癥的db/db小鼠的發(fā)揮活性最大。結(jié)果為平均值士 SEM。ANOVA分析為t統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(ρ < 0. 01)。高血糖是指測(cè)得血糖> 330mg/dL 的動(dòng)物。低血糖是指測(cè)得血糖< ^Omg/dL的動(dòng)物。未經(jīng)處理的高血糖(HBG)組η = 534， 經(jīng)處理的高血糖(HBG)組η = 851，未經(jīng)處理的低血糖(LBG)組η = 730，經(jīng)處理的低血糖 (LBG)組 η = 555。圖10.糖尿病骨骼肌中的Ca2+火花信號(hào)降低。(a)用低滲沖擊(hypotonic shock) 處理分離的FDB肌纖維從而產(chǎn)生Ca2+火花反應(yīng)。示出滲透沖擊(左側(cè))后的糖尿病FDB 肌纖維的橫截面線(xiàn)掃描圖像。用GLPl迅速(急劇，acutely)處理的糖尿病(db/db)纖維表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的Ca2+火花活性(右側(cè))。(b)WT纖維表現(xiàn)出強(qiáng)大的Ca2+火花信號(hào)。(c) 使用定制的IDL數(shù)據(jù)處理軟件程序確立火花的定位。糖尿病骨骼肌纖維表現(xiàn)出降低的外周Ca2+火花頻率(左側(cè))。GLPl對(duì)db/db纖維的處理沒(méi)有改變外周肌膜下(肌纖維膜下， subsarcolemmal) Ca2+火花分布，暗示雖然糖尿病纖維中的Ca2+信號(hào)級(jí)聯(lián)發(fā)生改變，但負(fù)責(zé)維持該膜附近Ca2+火花定位的因素仍然是完整的(右側(cè))。偽彩色(pseudocolor)代表纖維內(nèi)每個(gè)點(diǎn)處Ca2+釋放事件的平均強(qiáng)度。
圖11. GLPl處理提高糖尿病EDL疲勞后的肌力。(a)示出對(duì)照(上部)和經(jīng)GLPl 處理的EDL的力量與頻率的關(guān)系的代表性跡線(xiàn)(trace)。首先以30s的間隔向糖尿病肌肉施加一系列電場(chǎng)刺激(5 140Hz)，然后以2ms的間隔用20Hz刺激誘導(dǎo)疲勞5分鐘。以Imin 的間隔用20Hz刺激使EDL糖尿病肌肉恢復(fù)，持續(xù)30分鐘，將IOOnM GLPl加入到浸浴溶液 (浴溶液，bathing solution)中1小時(shí)(該跡線(xiàn)截短部分)。緊接著，利用相同范圍的刺激執(zhí)行另一種力量與頻率。黑箭頭指定Tmax，空心箭頭指出疲勞、恢復(fù)和截短體的GLPl溫育部分。(b)計(jì)算用GLPl處理之前和之后的糖尿病和(C)WT疲勞后的TmaX(最大力)和顫搐力(twitch force)(在IHz下的力)與疲勞前的力的比率。空白條表示未經(jīng)處理的組， 填充條表示用GLPl處理的組。N = 5，*P < 0. 05。(d)該圖組總結(jié)了未經(jīng)處理組(左側(cè)) 和經(jīng)GLPl處理組(右側(cè))中每塊EDL肌肉的5對(duì)力量與頻率關(guān)系。實(shí)心正方形表示疲勞之前的力量與頻率關(guān)系，空心的正方形表示疲勞之后的力量與頻率關(guān)系。所有數(shù)據(jù)都表示為平均值士 S.E。圖12.糖尿病肌肉中的MG^表達(dá)發(fā)生改變，自噬(自體吞噬，autophagy)作用增強(qiáng)。Western印記分析表明，I型糖尿病小鼠(akita)或II型糖尿病小鼠(db/db)糖尿病肌肉中MG^蛋白水平增大。這種增大的發(fā)生與每只小鼠血糖中的葡萄糖濃度直接相關(guān)。 這可以構(gòu)成對(duì)糖尿病小鼠血糖水平增大的反應(yīng)而產(chǎn)生的糖尿病肌肉代償反應(yīng)，試圖提高骨骼肌攝取葡萄糖的能力。另外，如自噬標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC;3)轉(zhuǎn)換的增大所指示的，這兩種糖尿病模型肌肉中的自噬作用都增強(qiáng)。圖13. MG29和Glut4發(fā)現(xiàn)于同一細(xì)胞內(nèi)囊泡中。用GFP-MG^或RFP_Glut4熒光融合蛋白共轉(zhuǎn)染異源性Hela細(xì)胞(頂部)或同源C2C12細(xì)胞(底部)。用共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白質(zhì)出現(xiàn)在這兩種細(xì)胞類(lèi)型的同一細(xì)胞內(nèi)囊泡中。這揭示這兩種蛋白質(zhì)可以在體內(nèi)發(fā)生物理相互作用。圖14.用GLUT4-EGFP轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，然后用圖中指示的不同量的AAV病毒感染該細(xì)胞。隨機(jī)檢查每個(gè)器皿中的25個(gè)細(xì)胞，將具有GLUT4-EGFP膜分配模式的細(xì)胞記為陽(yáng)性細(xì)胞。然后，通過(guò)使用所檢查的所有器皿中的細(xì)胞裂解液(cell lyses)執(zhí)行western印跡檢測(cè)MG^水平。收集三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，對(duì)每組的共75個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)算。圖15.重組AAV可以在天然骨骼肌中產(chǎn)生MG^表達(dá)。(a)示出構(gòu)建重組AAV構(gòu)建體的原理圖，該構(gòu)建體設(shè)計(jì)用于產(chǎn)生肌肉特異性MG^表達(dá)。(b)用SSV9-FLAG-MG^感染C2C12肌管細(xì)胞或非肌肉HEK293細(xì)胞。Western印跡分析表明時(shí)間依賴(lài)性MG^表達(dá)局限于肌細(xì)胞。(c)向腓腸肌(gastronemius muscles)注射 SSV9_FLAG_MG^ 或 SSV9-空載體(對(duì)照)，并在5天后取出肌肉。Western印跡分析表明MG^表達(dá)與同一動(dòng)物對(duì)照肌肉相比增大，重組MG^的FLAG標(biāo)簽存在于所注射肌肉中。病毒滴度和溫育時(shí)間的優(yōu)化應(yīng)當(dāng)可以增大肌肉中的MG^表達(dá)水平。圖16.通過(guò)運(yùn)動(dòng)上調(diào)MG^蛋白表達(dá)。使小鼠經(jīng)受一次跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)(treadmill exercise)，然后解剖小鼠，檢查運(yùn)動(dòng)停止后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的MG^表達(dá)。MG^表達(dá)立即增大， 在運(yùn)動(dòng)后持續(xù)增大并在M小時(shí)達(dá)到峰值。隨著時(shí)間的推移MG^水平開(kāi)始回到基線(xiàn)。肌動(dòng)蛋白水平用作負(fù)載變化的對(duì)照。圖17. mg29mRNA的3’ UTR中特定成分是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)所必需的。(a)用 PFLAG-MG29 (僅 mg29cDNA 序列)或 pCDNA-MG^ (cDNA+3'UTR)轉(zhuǎn)染 C2Cl2 成肌細(xì)胞。全細(xì)
8胞提取物用于MG^* β-肌動(dòng)蛋白(左側(cè)Western印記分析。還對(duì)來(lái)自這些經(jīng)轉(zhuǎn)染的 C2C12細(xì)胞的樣品進(jìn)行半定量RTPCR(右側(cè))。重復(fù)孔來(lái)自不同的實(shí)驗(yàn)。所有細(xì)胞中都存在豐富的mg29mRNA，但僅在不存在3’ UTR( S卩，pFLAG_MG29)時(shí)才觀(guān)察到蛋白質(zhì)，表明MG^ 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)受3’ UTR控制。(b)組裝一系列全長(zhǎng)鼠類(lèi)mg^mRNA的3’ UTR的缺失構(gòu)建體。這些表達(dá)質(zhì)粒包含編碼MG^的序列和3’ UTR的各種缺失。(c)將這些缺失構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到C2C12成肌細(xì)胞中，3天后將該細(xì)胞裂解用于Western印跡分析。雖然編碼mg29的序列(Fg-MG29)容易表達(dá)于C2C12細(xì)胞中，但C2C12細(xì)胞中全長(zhǎng)(FL)mRNA沒(méi)有產(chǎn)生MG^蛋白。缺失構(gòu)建體Fl和F2沒(méi)有產(chǎn)生MG^蛋白，但F3和F4構(gòu)建體可以產(chǎn)生豐富的蛋白。這表明，mg^mRNA的UTR的3’端的特定區(qū)域是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)所需要的。
具體實(shí)施例方式下面將描述與所述的令人驚訝的出乎預(yù)料的發(fā)現(xiàn)(即，MG^是控制骨骼肌調(diào)節(jié)血糖的功能的過(guò)程中的重要結(jié)構(gòu)和功能成分)相關(guān)的組合物和方法。下面是本發(fā)明的詳細(xì)描述，為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明而提供。本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的精神或范圍的情況下可以對(duì)本文描述的實(shí)施方式作出各種修改和變更。除非另有限定，否則本文使用的所有科學(xué)技術(shù)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同的含義。本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定實(shí)施方式，而不是限制本發(fā)明。本文提及的所有出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利、圖和其它參考文獻(xiàn)都通過(guò)引用完整地明確合并在此。如果提供了值范圍，應(yīng)當(dāng)理解，除非在上下文中明確說(shuō)明，否則該范圍上下限之間的每個(gè)中間值均保留到下限單位的十分位(十分之一)，并且任何其它說(shuō)明的范圍或該所說(shuō)明范圍中的中間值均包括在本發(fā)明中。除非明確排除了所說(shuō)明范圍中的界限值，否則這些較小范圍的上下限可以獨(dú)立地包含在同樣涵蓋在本公開(kāi)范圍內(nèi)的這些較小范圍中。如果所說(shuō)明的范圍包含上下限中的一個(gè)或兩個(gè)，排除那些所包含的上下限中的一個(gè)或兩個(gè)的范圍也包含在本發(fā)明中。雖然本文描述了優(yōu)選的方法和材料，但也可以在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中使用與本文所述的方法和材料類(lèi)似或等價(jià)的任何方法和材料。本文所提到的所有出版物都通過(guò)引用合并在此從而公開(kāi)和描述與所引用的出版物有關(guān)的方法和/或材料。必須注意，如在本文和在所附權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式的〃 一個(gè)〃、‘‘一種〃 和"該"包括復(fù)數(shù)對(duì)象，除非上下文中另外明確說(shuō)明。本文使用的所有科學(xué)技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有相同的含義。除非另有限定，否則本文使用的所有科學(xué)技術(shù)術(shù)語(yǔ)的含義都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同。完整公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用合并在此的下列參考文獻(xiàn)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中使用的許多術(shù)語(yǔ)的一般定義Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994) ；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed. , 1988) ；The Glossary of Genetics, 5thEd. , R. Rieger 等人 (eds. ), Springer Verlag(1991)；禾口 Hale&Marham, the Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。除非另有說(shuō)明，否則如本文使用的下列術(shù)語(yǔ)可以具有賦予它們的下面含義。但是，應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或理解的其它含義也是可能的，并包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。本文提到的所有出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)和其它參考文獻(xiàn)都通過(guò)引用完整地合并在此。如有沖突，以包括定義的說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實(shí)例僅為了說(shuō)明，而不是限制。如本文使用的與數(shù)值或范圍有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“約”，反映了這樣一個(gè)事實(shí)，即，存在本領(lǐng)域公認(rèn)和容許的由實(shí)際和/或理論限制引起的一定水平的變化。例如，允許由某些設(shè)備運(yùn)行方式和/或所采取的測(cè)量方式的固有變化引起的較小變化。根據(jù)上面所述，術(shù)語(yǔ)“約”通常用于包括標(biāo)準(zhǔn)偏差或標(biāo)準(zhǔn)誤差范圍內(nèi)的值。如本文使用的“衍生物”是由天然化合物直接、通過(guò)修飾，或通過(guò)部分置換 (partial substitution)形成的組合物。如本文使用的“類(lèi)似物”是指具有與天然化合物相似但不相同的結(jié)構(gòu)的化合物。術(shù)語(yǔ)“MG^”以一般含義用于此處，分別指MG^多核苷酸或多肽，并包括它們的生物活性片段、部分、拼接變異體(splice variants)和同源物。參見(jiàn)SEQ ID NOs. :1-8,26 和 20-25。術(shù)語(yǔ)"MG^拮抗劑”或"MG^的拮抗劑” 一般用于指能夠直接或間接抑制MG^表達(dá)、翻譯和/或活性的試劑。術(shù)語(yǔ)"MG^激動(dòng)劑”或"MG^的激動(dòng)劑” 一般用于指能夠直接或間接增大MG^表達(dá)、翻譯和/或活性的試劑。術(shù)語(yǔ)“多肽”可以表示，但決不局限于，重組全長(zhǎng)的多肽前體(pro-polyp印tide) 或成熟多肽形式以及生物活性形式，包括源自全長(zhǎng)多肽的片段或拼接變異體，或重組產(chǎn)生的截短體或部分。此外，本發(fā)明多肽可以包括氨基酸模擬物，和類(lèi)似物。嵌合多肽的重組形式可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法和方案制得，該標(biāo)準(zhǔn)方法和方案包括，例如，在原核和/或真核細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白，接著執(zhí)行一個(gè)或多個(gè)分離和純化步驟，和/或使用肽合成器(P印tide sythesizer)化學(xué)合成細(xì)胞因子多肽或其部分。術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)活性的”或“生物活性的”可以表示，但決不局限于藥劑如本發(fā)明提供的多肽完成生理變化或反應(yīng)的能力。該反應(yīng)可以，例如在細(xì)胞水平上，例如作為基因表達(dá)、蛋白質(zhì)數(shù)量、蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)活性的變化，或其組合檢測(cè)到，也可以在組織水平上， 在系統(tǒng)水平上，或在生物體水平上檢測(cè)到。用于監(jiān)測(cè)這些表型變化的技術(shù)包括，例如，測(cè)量細(xì)胞中或細(xì)胞上配體與其受體的結(jié)合、細(xì)胞信號(hào)通路的活化、細(xì)胞反應(yīng)的刺激或活化、 細(xì)胞中生物活性分子的分泌或釋放、細(xì)胞增殖和/或分化，或其組合。在一個(gè)實(shí)例中，由本發(fā)明提供的嵌合多肽的生物活性可以通過(guò)檢測(cè)它調(diào)節(jié)本發(fā)明所述的血細(xì)胞生成(造血， hematopoiesis)、胸腺細(xì)胞生成(thymopoiesis)，和/或胸腺細(xì)胞發(fā)育的能力確定。術(shù)語(yǔ)“片段”可以表示，但決不局限于至少6個(gè)(連續(xù))核酸或至少4個(gè)(連續(xù)) 氨基酸的序列，該序列的長(zhǎng)度在核酸情況下足以允許特異性雜交，或在氨基酸的情況下足以允許特異性識(shí)別表位或保留期望生物活性，并且至多為小于全長(zhǎng)序列的一些部分。術(shù)語(yǔ)“有效量/劑量”、“藥學(xué)有效量/劑量”、“藥學(xué)有效量/劑量”或“治療有效量 /劑量”可以表示，但決不局限于足以預(yù)防、抑制病癥、障礙或疾病狀態(tài)的發(fā)生，改善、延緩或治療(將癥狀緩和至某種程度，優(yōu)選完全緩和)病癥、障礙或疾病狀態(tài)的癥狀的活性藥物成分的量/劑量。該有效量取決于疾病類(lèi)型、所使用的組合物、給予途徑、受治療哺乳動(dòng)物類(lèi)型、考慮中的特定哺乳動(dòng)物的身體特征、并行的藥物治療，和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員可以意識(shí)到的其它因素。一般地，根據(jù)該藥劑的效價(jià)，給予在0. lmg/kg和1000mg/kg體重/天之間的量的活性成分。此種化合物的毒性和治療功效可以通過(guò)例如確定LD50 (致使50%群體死亡的劑量)和ED50(對(duì)50%群體治療有效的劑量)的細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)藥物程序確定。毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數(shù)，它可以表示成LD50/ED50。優(yōu)選表現(xiàn)出較大治療指數(shù)的化合物。雖然可以使用表現(xiàn)出有毒副作用的化合物，但應(yīng)當(dāng)注意，要設(shè)計(jì)使此種化合物靶向受感染組織部位的遞送系統(tǒng)以便將對(duì)未感染細(xì)胞的潛在損害減到最小，從而降低副作用。從細(xì)胞培養(yǎng)物分析和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用于調(diào)配人用劑量的范圍。此種化合物的劑量?jī)?yōu)選在毒性很小或無(wú)毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)，包括ED50。該劑量在這個(gè)范圍內(nèi)隨所采用的劑型和所利用的給予途徑而變化。對(duì)于本發(fā)明方法中使用的任何化合物， 治療有效量初始可以由細(xì)胞培養(yǎng)物分析估計(jì)。可以在動(dòng)物模型中調(diào)配劑量從而獲得包括 IC50(即，對(duì)癥狀半數(shù)抑制所需的測(cè)試化合物濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍，如在細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)定的。此種信息可以用于更準(zhǔn)確地確定對(duì)人有用的劑量。血漿中的水平可以通過(guò)例如高效液相色譜測(cè)量。術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”、“治療組合物”、“治療制劑，，或“藥學(xué)可接受制劑”可以表示， 但決不局限于使本發(fā)明提供的藥劑能夠有效分布的組合物或制劑，該組合物或制劑為適合于給予到對(duì)其期望活性最有利的身體部位中，例如，適合于全身給予。適合于與例如本發(fā)明提供的核酸一起調(diào)配的藥劑非限制性實(shí)例包括PEG 結(jié)合(conjugated)的核酸、磷脂結(jié)合的核酸、含有親脂部分的核酸、硫代磷酸酯 (phosphorothioate)、P-糖蛋白抑制劑(如Pluronic P85)，其可以增強(qiáng)藥物進(jìn)入各種組織如 CNS 的能力(Jolliet-Riant and Tillement,1999，F(xiàn)undam. Clin. Pharmacol.，13， 16-26)；生物可降解聚合物如在植入后持續(xù)釋放遞送的聚(DL-丙交酯-共-乙交酯) 微球(Emerich，DF 等人，1999，Cell Transplant，8，47-58，Alkermes，Inc. Cambridge, Mass.)；以及負(fù)載納米顆粒，如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的那些，其可以遞送藥物穿過(guò)血腦屏障并可以改變神經(jīng)元攝取機(jī)制(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 23, 941-949,1999)。包括核酸分子CNS遞送在內(nèi)的遞送策略的其它非限制性實(shí)例，包括以下文獻(xiàn)中描述的材料:Boado 等人，1998，J. Pharm. Sci.，87，1308-1315 ；Tyler 等人，1999，F(xiàn)EBS Lett.，421，280-284 ；Pardridge 等人，1995，PNAS USA.，92，5592-5596 ；Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev.，15，73-107 ；Aldrian-Herrada 等人，1998，Nucleic Acids Res.，26， 4910-4916 ；和Tyler等人，1999，PNAS USA.，96，7053-7058。所有這些文獻(xiàn)都通過(guò)引用完整地合并在此。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的”或“藥理學(xué)可接受的”可以表示，但決不局限于，當(dāng)適當(dāng)?shù)亟o予于動(dòng)物，或人時(shí)不產(chǎn)生不利、過(guò)敏或其它不良反應(yīng)的實(shí)體(物質(zhì)，entities)和組合物。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受載體”或“藥理學(xué)可接受載體”可以表示，但決不局限于，與藥物給予相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌藥劑、等滲和吸收延緩藥劑等。合適的載體描述在本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)參考手冊(cè)《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington' s Pharmaceutical Sciences)最新版中，其通過(guò)引用合并在此。此種載體或稀釋劑的優(yōu)選實(shí)例包括，但不局限于，水、鹽水、林格氏溶液、葡萄糖溶液，和5%人血清白蛋白。也可以使用脂質(zhì)體和非水媒劑(vehicle)如不揮發(fā)油。此種介質(zhì)和試劑在藥學(xué)有效物質(zhì)中的應(yīng)用是本領(lǐng)域熟知的?？紤]了任何常規(guī)介質(zhì)或試劑在該組合物中的應(yīng)用，除了與該活性化合物不相容的那些。補(bǔ)充的(supplementary)活性化合物也可以摻入到該組合物中。術(shù)語(yǔ)“全身給予(系統(tǒng)給予)”是指給予途徑，例如腸道內(nèi)或腸道外給予途徑，該給予使藥劑全身分布，導(dǎo)致血流中的藥物全身吸收或積累，隨后遍及全身分布。合適的形式部分地取決于用途或進(jìn)入途徑，例如口服、透皮或通過(guò)注射。此種形式不應(yīng)阻止組合物或制劑到達(dá)靶細(xì)胞(即，帶負(fù)電荷的聚合物期望被遞送到的細(xì)胞)。例如，注射到血流中的藥物組合物應(yīng)當(dāng)是可溶的。其它因素在本領(lǐng)域中是已知的，包括阻止該組合物或制劑發(fā)揮其作用的考慮因素如毒性和形式。導(dǎo)致全身吸收的給予途徑包括，但不局限于靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、吸入、口服、肺內(nèi)和肌內(nèi)。已證明藥物進(jìn)入循環(huán)的速率是分子量或分子大小的函數(shù)。應(yīng)用包含本發(fā)明化合物的脂質(zhì)體或其它藥物載體可以潛在地使該藥物定位于例如某些組織類(lèi)型，如網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的組織中。能夠促進(jìn)藥物與細(xì)胞如淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面結(jié)合的脂質(zhì)體制劑也是有用的。術(shù)語(yǔ)“核苷酸”可以表示，但決不局限于含有磷酸化糖的N-糖苷鍵中的雜環(huán)含氮堿基。本領(lǐng)域中公認(rèn)的核苷酸包括天然堿基(標(biāo)準(zhǔn))，和本領(lǐng)域熟知的修飾堿基。此種堿基一般位于核苷酸糖部分的1'位置處。核苷酸一般包含堿基、糖和磷酸基團(tuán)。核苷酸中的糖、磷酸基團(tuán)和/或堿基部分可以是未修飾或修飾的，(也可互換地稱(chēng)作核苷酸類(lèi)似物、 修飾核苷酸、非天然核苷酸、非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸及其它；參見(jiàn)例如，Usman and McSwiggen,(出處同上)；Eckstein等人，國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)W092/07065 ；Usman等人，國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)W093/15187 ； Uhlman&Peyman,(出處同上)，它們都通過(guò)引用合并在此)。如Limbach等人，1994，Nucleic Acids Res. 22，2183概述的，本領(lǐng)域中已知數(shù)個(gè)修飾核酸堿基實(shí)例。可導(dǎo)入核酸中的化學(xué)修飾和其它天然核酸堿基的一些非限制性實(shí)例包括，例如，肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、批啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶(pseud0uracil)、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氫尿苷、 萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5_烷基尿苷(例如，核糖胸苷)、5_鹵尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮雜嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、丙炔、Q核苷 (quesosine)、2-硫代尿苷、4_硫代尿苷、懷丁苷(wybutosine)、wybutoxosine、4_ 乙酉先胞苷 G-acetyltidine)、5-(羧基羥甲基)尿苷、5'-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、β-D-半乳糖基Q核苷、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2，2_ 二甲基鳥(niǎo)苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥(niǎo)苷、Ν6-甲基腺苷、7-甲基鳥(niǎo)苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿苷、 5-甲基氨甲基尿苷、5-甲基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-甲基硫代-Ν6-異戊烯基腺苷、β -D-甘露糖基Q核苷、尿苷-5-氧乙酸、2-硫代胞苷、蘇氨酸衍生物及其它(Burgin 等人，1996，Biochemistry, 35,14090 ；Uhlman&Peyman，(出處同上))。術(shù)語(yǔ)“核酸”或“多核苷酸”可以表示，但決不局限于，具有多于一個(gè)的核苷酸的分子，旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)、RNA分子、DNA或RNA類(lèi)似物，包括鎖核酸和肽核酸，及其衍生物。該核酸可以是單鏈體、雙鏈體和多鏈體，并可以包含修飾或未修飾的核苷酸或非核苷酸或其各種混合物和組合物。本發(fā)明核酸可以直接加入，或可以與陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù)合，封裝在脂質(zhì)體中，或以其它方式遞送到靶細(xì)胞或組織中。該核酸或核酸復(fù)合物可以在摻入或不摻入到生物聚合物中的情況下，通過(guò)注射或輸液泵在體外、離體或體內(nèi)局部給予到相關(guān)組織中。多核苷酸可以是DNA分子、cDNA分子、基因組DNA分子，或RNA分子。多核苷酸如DNA或RNA可以包括這樣的序列，其中T(胸腺嘧啶)也可以是U(尿嘧啶)。如果多核苷酸某個(gè)位置處的核苷酸能夠形成與反平行DNA或RNA鏈中相同位置處的核苷酸形成 Watson-Crick配對(duì)，則該多核苷酸和DNA或RNA分子在那個(gè)位置處彼此互補(bǔ)。該多核苷酸和DNA或RNA分子在這樣的情況下彼此基本互補(bǔ)，即，每個(gè)分子中足夠多數(shù)目的相應(yīng)位置被可以彼此雜交從而實(shí)施期望過(guò)程的核苷酸占據(jù)時(shí)。術(shù)語(yǔ)“修飾堿基”可以表示，但決不局限于，不同于1’位置處的腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸堿基或其等效物；此種堿基可以用于在，例如，酶核酸分子催化核心內(nèi)和/或核酸分子底物結(jié)合區(qū)域中的任何位置處。本發(fā)明核酸分子可以廣泛地修飾，從而通過(guò)用抗核酸酶基團(tuán)，例如，2'-氨基、‘-C-烯丙基、2'-氟、2' -0-甲基、2' -H修飾來(lái)增強(qiáng)穩(wěn)定性(綜述參見(jiàn) Usman and Cedergren, 1992, TIBS 17，34 ;Usman 等人，1994， Nucleic Acids Symp. Ser. 31,163)。術(shù)語(yǔ)“衍生物”可以表示，但決不局限于，由天然化合物直接、通過(guò)修飾或通過(guò)部分置換形成的化學(xué)組合物，例如核酸、核苷酸、多肽或氨基酸。術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”可以表示，但決不局限于，具有與天然化合物相似但不相同的結(jié)構(gòu)的化學(xué)組合物，例如核酸、核苷酸、多肽
或氨基酸。術(shù)語(yǔ)“雜交”可以指，但決不局限于，分子僅在低等、中等或高等嚴(yán)格條件下與特定核苷酸序列結(jié)合、雙聯(lián)(duplexing)或雜交，包括當(dāng)該序列存在于復(fù)合物混合物(例如，總細(xì)胞)DNA或RNA中時(shí)發(fā)生的結(jié)合、雙聯(lián)或雜交。術(shù)語(yǔ)“保守性突變”是指在編碼序列中改變、添加或消除單個(gè)氨基酸或少量氨基酸的核酸置換、缺失或添加，其中該核酸變化導(dǎo)致化學(xué)上類(lèi)似的氨基酸發(fā)生置換。彼此可以保守性置換的氨基酸包括以下堿性氨基酸精氨酸(R)、賴(lài)氨酸(K)、組氨酸(H)；酸性氨基酸天門(mén)冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；親水性氨基酸甘氨酸(G)、 丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)；疏水性氨基酸苯丙氨酸(F)、酪氨酸 (Y)、色氨酸(W)；含硫氨基酸蛋氨酸(M)、半胱氨酸(C)。此外，彼此之間的差異在于保守性變化的序列一般是同源的。術(shù)語(yǔ)“下調(diào)”可以指，但決不局限于，基因的表達(dá)，或編碼一種或多種蛋白質(zhì)的RNA 或等效RNA的水平，或一種或多種蛋白質(zhì)如MG^多肽基因的活性降低到低于在不存在本發(fā)明提供的藥劑的情況下所觀(guān)察到的。例如，可以降低基因表達(dá)以便治療、預(yù)防、改善或調(diào)節(jié)高水平基因表達(dá)引起或加劇的病理學(xué)病癥。術(shù)語(yǔ)“上調(diào)”可以指，但決不局限于，基因的表達(dá)，或編碼一種或多種蛋白質(zhì)亞基的 RNA或等效RNA的水平，或一種或多種蛋白質(zhì)亞基如MG^的活性高于在不存在本發(fā)明提供的藥劑的情況下所觀(guān)察到的。例如，可以增大基因表達(dá)以便治療、預(yù)防、改善或調(diào)節(jié)由缺少基因表達(dá)或低水平基因表達(dá)引起或加劇的病理學(xué)病癥?！罢{(diào)節(jié)”是指基因的表達(dá)，或編碼一種或多種蛋白質(zhì)的RNA或等效RNA的水平，或一種或多種蛋白質(zhì)的活性被上調(diào)或下調(diào)，以便該表達(dá)、水平或活性高于或低于在不存在本發(fā)明提供的藥劑的情況下所觀(guān)察到的。術(shù)語(yǔ)“基因”可以表示，但決不局限于編碼RNA的核酸，例如核酸序列，包括但不局限于編碼多肽的節(jié)段。術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的”可以表示，但決不局限于核酸與另一個(gè)RNA序列通過(guò)傳統(tǒng) ffatson-Crick.Hoogsteen堿基配對(duì)或其它非傳統(tǒng)型堿基配對(duì)形成一個(gè)氫鍵(或多個(gè)氫鍵) 的能力。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”可以表示，但決不局限于兩個(gè)分子(例如，化合物、氨基酸、核苷酸、多肽或核酸)之間直接或間接的物理或化學(xué)相互作用。結(jié)合包括共價(jià)相互作用、氫鍵相互作用、離子相互作用、非離子相互作用、范德華相互作用、疏水性相互作用等。術(shù)語(yǔ)“等效的”或“同源的”可以指，但決不局限于，分別與MG^基因(SEQ ID NO 20-25)或蛋白質(zhì)(SEQ ID NO :1-8,26)具有同源性(部分或完全同源)的核酸或蛋白質(zhì)，包括那些天然存在的DNA、RNA或氨基酸分子，它們?cè)诎ㄈ祟?lèi)、嚙齒動(dòng)物、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、家兔、 豬、原生動(dòng)物、真菌、植物和其它微生物和寄生蟲(chóng)在內(nèi)的各種生物中的功能與MG^相似。該等效RNA序列除了包括編碼區(qū)之外，還可以包括諸如5'-非翻譯區(qū)、3'-非翻譯區(qū)、內(nèi)含子、內(nèi)含子-外顯子接合處(junction)等區(qū)域?！巴葱浴笔侵竷煞N或多種核酸分子的核苷酸序列，或者兩種或多種核酸或氨基酸序列部分或完全相同。在某些實(shí)施方式中，該同源的核酸或氨基酸序列分別與人MG^基因(SEQ ID N0:21或22)或蛋白質(zhì)(SEQ ID NO :3或 4)具有30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，或95%的序列相似性或同一性。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了與編碼選自SEQ ID NO. :1-8和沈的1 ^9多肽或其生物活性部分的核酸具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，或95%的序列相似性或同一性的核酸。在另外實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了與選自SEQ ID NO. :1-8和沈的1 ^9多肽或其生物活性部分具有30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，或95%的序列相似性或同一性的多肽?！巴次铩笨梢允翘烊淮嬖诘模蛘咄ㄟ^(guò)人工合成形成的一種或多種具有相關(guān)序列的核酸，或通過(guò)修飾一種或多種核酸制得的相關(guān)核酸。當(dāng)核酸天然或人工地源自共同祖先序列時(shí)，它們是同源的(例如直系同源物或旁系同源物)。如果兩種核酸之間的同源性沒(méi)有明確說(shuō)明，則可以通過(guò)兩個(gè)或多個(gè)序列之間的核酸比較推測(cè)出同源性。如果該序列在一級(jí)氨基酸序列結(jié)構(gòu)水平上表現(xiàn)出一定程度的序列相似性，例如，大于約30%的序列相似性，則可以推斷它們具有共同的祖先。對(duì)于本發(fā)明的目的，如果核酸序列相似到足以允許在低等嚴(yán)格條件下重組和/或雜交的程度，則基因是同源的。另外，如果多肽提供了與野生型MG^ 相當(dāng)?shù)幕钚?，則該多肽視為同源的。如本文使用的“雜交”可以指分子僅在低等、中等或高等嚴(yán)格條件下與特定核苷酸序列結(jié)合、雙聯(lián)或雜交，包括當(dāng)該序列存在于復(fù)合物混合物(例如，總細(xì)胞)DNA或RNA中時(shí)發(fā)生的結(jié)合、雙聯(lián)或雜交。術(shù)語(yǔ)“RNA”可以表示，但決不局限于，包含至少一個(gè)核糖核苷酸殘基的分子?！昂颂呛塑账帷被颉?' -0H"是指D-核-呋喃糖部分的2’位置上具有羥基的核苷酸。術(shù)語(yǔ)“載體”可以表示，但決不局限于，用于遞送期望核酸的任何核酸類(lèi)技術(shù)，例如，用于基因克隆、基因擴(kuò)增和/或基因表達(dá)的細(xì)菌質(zhì)粒、病毒核酸、HAC、BAC等。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”可以表示，但決不局限于，其通常的生物學(xué)意義，并不是指整個(gè)多細(xì)胞生物。該細(xì)胞可以是，例如，體內(nèi)、體外或離體的，例如在細(xì)胞培養(yǎng)物中，或存在于多細(xì)胞生物中，該多細(xì)胞生物包括例如，鳥(niǎo)類(lèi)、植物和哺乳動(dòng)物如人、牛、羊、猿、猴、豬、狗和貓。該細(xì)胞可以是原核細(xì)胞(例如，細(xì)菌細(xì)胞)或真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物或植物細(xì)胞)。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”可以表示，但決不局限于，可用于攜載異源性核酸或者表達(dá)異源性核酸編碼的肽或蛋白質(zhì)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以包含不能在該細(xì)胞天然(非重組)形式中找到的基因、在該細(xì)胞天然形式中找到的基因，其中該基因被修飾并由人工手段重導(dǎo)入到該細(xì)胞中，或者該細(xì)胞的內(nèi)源性核酸，該內(nèi)源性核酸已被人工修飾，但沒(méi)有從該細(xì)胞中除去。宿主細(xì)胞可以是真核或原核的。細(xì)菌培養(yǎng)所需的一般生長(zhǎng)條件可以在諸如BERGEY' S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, Vol.1，N. R. Krieg, ed.，Williams and ffilkins, Baltimore/London(1984)的文獻(xiàn)中找到。“宿主細(xì)胞”也可以是這樣的細(xì)胞，其中內(nèi)源性基因或啟動(dòng)子或者二者都已被修飾從而產(chǎn)生本發(fā)明復(fù)合物中的一種或多種多肽組分。提交于 2009 年 7 月 16 日，題為 Compositions comprising MG29Nucleic Acids, Polypeptides,and Associated Methods of Use 的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No. : 12/504，331 的主題通過(guò)弓I用完整地合并在此用于所有目的。糖尿病的主要標(biāo)志是受感染患者血液中葡萄糖水平升高。這個(gè)狀態(tài)可能是由于胰島素分泌減少引起的，如I型青少年糖尿病情況，或者是由于身體對(duì)胰島素的反應(yīng)受損引起的，如II型胰島素抵抗型糖尿病情況。骨骼肌是胰島素的主要靶，因?yàn)榧∪庳?fù)責(zé)身體中大部分的葡萄糖消耗，因而可以在胰島素的存在下吸收大量葡萄糖。為了使此能發(fā)生，含有葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4型(Glut4)的囊泡必須轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜中。如本文所述的，MG^不僅對(duì)骨骼肌中的膜融合起著重要作用，而且它也促進(jìn)對(duì)胰島素作出反應(yīng)而控制質(zhì)膜上Glut4增大的機(jī)制。在年輕mg^-/-小鼠的葡萄糖負(fù)荷實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在腹膜內(nèi)(IP)推注葡萄糖之后， 雄性和雌性mg29-/_動(dòng)物都無(wú)法有效地清除它們血流中的葡萄糖(圖幻。然而，其余的葡萄糖水平保持不變，表明缺少M(fèi)G^不影響肝臟在葡萄糖代謝中的作用。因?yàn)閙g29-/_葡萄糖水平保持長(zhǎng)時(shí)間較高，所以似乎mg^-/-肌肉攝取葡萄糖的能力存在缺陷，而不是胰島素分泌存在缺陷。這在對(duì)mg29-/_和對(duì)照動(dòng)物執(zhí)行的胰島素負(fù)荷的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。當(dāng)IP注射的胰島素可以誘導(dǎo)野生型對(duì)照動(dòng)物血糖顯著降低時(shí)，相同的胰島素注射對(duì) mg29-/_小鼠血糖水平的影響小得多(圖6)。這些研究結(jié)果表明，導(dǎo)致mg^-/-小鼠血糖升高的潛在缺陷是動(dòng)物清除葡萄糖的能力，而不是胰島素生產(chǎn)受損，與在II型糖尿病患者中觀(guān)察到的情況類(lèi)似。因而，骨骼肌中缺少M(fèi)G^可以使動(dòng)物容易患糖尿病癥狀。此外，通過(guò)用高脂食物飼喂mg29-/_動(dòng)物和年齡匹配的野生型對(duì)照小鼠，測(cè)試mg^-/-動(dòng)物是否更易于罹患糖尿病。已知這種途徑可以誘導(dǎo)小鼠患糖尿病。雖然 mg29-/"和對(duì)照小鼠體重增加的速率相似(圖7a)，但是mg29-/_小鼠在比對(duì)照小鼠小得多的年齡表現(xiàn)出對(duì)糖尿病負(fù)荷實(shí)驗(yàn)有易感性(圖7b)。這是骨骼肌從血流中吸收葡萄糖從而維持肌肉中的能量供應(yīng)和降低血糖水平從而阻止糖尿病需要MG^的另外證明。因?yàn)槿鄙?MG^可以誘導(dǎo)糖尿病，所以控制MG^表達(dá)(即，轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)可以提供治療I型和II 型糖尿病的有效方法。而且，如本文所述的，內(nèi)源性MG^mRNA的UTR序列包含用于轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的許多共有部位。實(shí)驗(yàn)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，MG^UTR序列(例如，SEQ ID N0:21、23或24)實(shí)際上是MG^基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)所需要的，揭示UTR是控制MG^表達(dá)的肌肉調(diào)節(jié)途徑的靶。因此，調(diào)制MG^mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)是診斷、治療和預(yù)防糖尿病的另一種治療干預(yù)方式。下面描述了本發(fā)明提供的各個(gè)示例方面和實(shí)施方式。如下面詳細(xì)描述的，本發(fā)明提供了組合物，例如多肽，編碼細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞膜結(jié)合和分泌的多肽的核酸；以及載體、抗體、重組蛋白、假肽、融合蛋白、化學(xué)化合物、宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，以及制造和使用它們的方法。核酸
下面描述的各個(gè)方面和實(shí)施方式包括編碼MG^多肽(SEQ ID NO. :1_8和26)和 /或其生物活性部分和片段的核酸，以及編碼包括人MG^蛋白同源物、直系同源物和旁系同源物在內(nèi)的MG^蛋白(例如，SEQ ID NO :20-15)的基因，包括所有同種型、拼接變異體 (例如，SEQ ID NO. :4)，和多態(tài)性?？梢允褂帽疚拿枋龅姆椒ǚ治鲞@些另外的基因的靶位。 因而，可以如本文描述的對(duì)抑制作用和此種抑制對(duì)其它基因的影響進(jìn)行分析。對(duì)實(shí)施本發(fā)明有用的，包括誘變、PCR和克隆等在內(nèi)的分子生物技術(shù)描述在以下文獻(xiàn)中，Berger and Kimmel, GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, METHODS IN ENZYM0L0GY,volume 152,Academic Press,Inc. ,San Diego,Calif. (Berger) ；Sambrook等人，MOLECULAR CLONING—A LABORATORY MANUAL (2nd Ed.), Vol. 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989,and CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, F. M. Ausubel 等人’ eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley&Sons, Inc. ；Berger, Sambrook, and Ausubel, as well as Mullis 等人，U. S. Pat. No. 4，683，202(1987) ；PCR PROTOCOLS A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS(Innis等人eds) ,Academic Press, Inc.，San Diego, Calif. (1990) (Innis) ；Arnheim&Levinson(Oct. 1，1990)C&EN36-47。本發(fā)明提供的核酸組合物在本文可互換地總稱(chēng)為“MG^核酸”或“MG^多核苷酸” 以及相應(yīng)的編碼的多肽稱(chēng)為"MG^多肽”或"MG^蛋白”。除非另有指明，否則這些術(shù)語(yǔ)都包括在氨基或羧基端或二者上的生物活性部分、片段、缺失或置換、截短體、基因融合，及其組合物。而且，除非另有指明，否則“MG^” 一般用來(lái)指任何MG^相關(guān)的和/或MG^衍生的生物聚合物，如本文明確描述地、暗示地或內(nèi)在地描述的。而且，如本文使用的，"MG^核酸”或"MG^基因”也可以指并包括該基因的5’ UTR,3' UTR、啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列、內(nèi)含子和外顯子DNA，以及mRNA或cDNA序列。如上所述，在某些方面本發(fā)明涉及核酸，和核酸編碼的本發(fā)明多肽，其可以單獨(dú)地或與其它組分結(jié)合調(diào)節(jié)肌肉生理，包括清除葡萄糖。在一方面，本發(fā)明提供了編碼MG^多肽的分離核酸，該核酸與SEQ ID NO :20-25 中公開(kāi)的任何一種核酸具有至少30%、40 %、50%、60 %、70%、80 %、90%或100%的同一性。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明分離核酸分子將在嚴(yán)格條件下與這樣的核酸序列雜交，所述的核酸序列與包括MG^核酸序列的蛋白質(zhì)編碼序列的核酸分子互補(bǔ)。本發(fā)明也包括編碼 MG29多肽，或其片段、同源物、類(lèi)似物、融合蛋白、假肽、模擬肽或衍生物的分離核酸。例如， 該核酸可以編碼與包含SEQ ID NO 1-8和沈的氨基酸序列的多肽具有至少30^^40%, 50%、60%、70%、80%、90%或100%同一性的多肽。該核酸可以是，例如，包括SEQ ID N0: 20-25中任何一個(gè)的核酸序列的基因組DNA片段或cDNA分子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括編碼如上所述或如SEQ ID NO :1-8或沈中給出的重組MG^多肽和/或其同源物或片段的分離或重組核酸，其中該多肽可以調(diào)節(jié)肌肉功能，例如，葡萄糖代謝。在另一方面，本發(fā)明提供了如SEQ ID NO :20-15中給出的本發(fā)明1 ^9核酸，和/或如SEQ ID NO 1-8和沈中給出的本發(fā)明MG^蛋白的衍生物和/或類(lèi)似物，包括但不局限于，包含與本發(fā)明核酸或蛋白質(zhì)基本同源的區(qū)域的分子，該區(qū)域在各種實(shí)施方式中，與相同尺寸的核酸或氨基酸序列具有，或者與通過(guò)本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)同源性程序完成比對(duì)的或者其編碼核酸能夠與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的序列補(bǔ)體在嚴(yán)格、中等嚴(yán)格或低等嚴(yán)格條件下雜交的比對(duì)序列相比具有，至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的同一性 (優(yōu)選 80-95% 的同一性)。參見(jiàn)，例如，Ausubel，等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John ffiley&Sons, New York，N. Y.，1993。核酸衍生物和修飾包括通過(guò)基因替換、 部位特異性突變、缺失、插入、重組、修復(fù)、改組(shuffling)、核酸內(nèi)切酶消化、PCR、亞克隆， 和相關(guān)技術(shù)獲得的那些。在另一方面，本發(fā)明提供了編碼MG^蛋白或其生物活性部分的分離和重組核酸， 所述的生物活性部分為，例如僅編碼突觸素結(jié)構(gòu)域或突觸素樣結(jié)構(gòu)域或其部分，和/或 marvel結(jié)構(gòu)域或marvel樣結(jié)構(gòu)域或其部分的截短部分。因此，本發(fā)明這個(gè)方面提供的核酸包括MG^缺失、置換、截短體、融合蛋白等。在示例實(shí)施方式中，提供了編碼重組MG^g 肽的重組核酸，所述的重組MG^多肽包含與人MG^ (SEQ ID N0:3或4)突觸素結(jié)構(gòu)域多肽 (“突觸素樣結(jié)構(gòu)域”)具有至少30%同源性的第一區(qū)(即，部分或結(jié)構(gòu)域)，和可選的，與人MG^marvel結(jié)構(gòu)域多肽(或marvel樣結(jié)構(gòu)域)具有至少30%同源性的第二區(qū)。在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括所得的重組MG^多肽。在另一方面，提供了編碼重組MG^多肽的重組核酸，其中突觸素結(jié)構(gòu)域或突觸素樣結(jié)構(gòu)域與marvel結(jié)構(gòu)域或marvel樣結(jié)構(gòu)域并置(juxtaposed)。因此，本發(fā)明包括重組多肽，其中突觸素或突觸素樣結(jié)構(gòu)域與marvel結(jié)構(gòu)域或marvel樣結(jié)構(gòu)域并置。在另外的方面，本發(fā)明包括編碼通過(guò)使基因表達(dá)形成的多肽，或cDNA構(gòu)建體的分離或重組核酸，所述的cDNA構(gòu)建體通過(guò)將編碼來(lái)自MG^家族其它成員的氨基酸或肽組分的多核苷酸結(jié)合而形成，所述的MG^家族其它成員為，例如，表1或2或者SEQ ID NO=U 2,5-19和沈中指定的那些。編碼各個(gè)氨基酸或肽結(jié)構(gòu)域的核酸可以由任何期望的親代基因克隆并可以利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)結(jié)合到單個(gè)連續(xù)(contiguous)核酸中。而且，因?yàn)橐话憧梢砸庾R(shí)到進(jìn)化上保守的氨基酸序列作用類(lèi)似，所以，本領(lǐng)域技術(shù)人員在其能力范圍內(nèi)， 可以根據(jù)本教導(dǎo)制取另外的蛋白質(zhì)，并可以按照本文所教導(dǎo)的評(píng)估重組蛋白促進(jìn)蛋白清除的能力，無(wú)需進(jìn)行過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。因此，明確考慮了由MG^家族成員結(jié)構(gòu)域組裝的重組蛋白， 例如上面鑒定的那些，它們包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。表1. UniProtKB/Swiss-Prot MG29基因/蛋白結(jié)構(gòu)同源性數(shù)據(jù)
1權(quán)利要求
1.一種調(diào)節(jié)MG^基因的表達(dá)、和/或調(diào)節(jié)MG^多肽的活性的藥劑，其用于調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取的方法中，所述方法包括制備用于給予的包含有效量的所述藥劑的藥物的步驟，其中，所述藥劑對(duì)于調(diào)節(jié)所述細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取有效。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥劑，其中，所述細(xì)胞是體外的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥劑，其中，所述細(xì)胞是體內(nèi)的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的藥劑，其中，所述細(xì)胞是肌細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的藥劑，其中，所述細(xì)胞是骨骼肌細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥劑，其中，所述藥劑與藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑結(jié)合 O
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥劑，其中，所述藥劑包含編碼多肽的核酸，所述多肽與選自由SEQ ID NO 1-8和沈所組成的組中的MG^多肽具有至少85%的序列同一性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥劑，其中，所述藥劑包含至少一種抑制性核酸，所述至少一種抑制性核酸與選自由編碼MG^多肽的核酸、編碼MG^多肽的核酸的UTR、以及編碼MG^ 基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑的核酸所組成的組中的成員雜交。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥劑，其中，所述抑制性核酸包括RNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9中任一項(xiàng)所述的藥劑，其中，所述抑制性核酸與編碼在SEQID NO 20-25中的至少一個(gè)中列出的MG^多肽的核酸的UTR雜交。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)所述的藥劑，其中，所述抑制性核酸是反義RNA、干擾 RNA、或二者的組合中的至少一種。
12.調(diào)節(jié)MG^基因的表達(dá)、和/或調(diào)節(jié)MG^多肽的活性的藥劑與藥學(xué)可接受的載體和 /或賦形劑結(jié)合用于制造藥物的用途，其中，所述藥物制備用于以0. lmg/kg至約1000mg/kg 的劑量給予，在1天至12個(gè)月的時(shí)間段內(nèi)至少給予一次。
13.—種調(diào)節(jié)MG^基因的表達(dá)、和/或調(diào)節(jié)MG^多肽的活性的藥劑，其與藥學(xué)可接受的載體和/或賦形劑結(jié)合，用于治療糖尿病的方法中。
14.調(diào)節(jié)MG^基因的表達(dá)、和/或調(diào)節(jié)MG^多肽的活性的藥劑與藥學(xué)可接受的載體和 /或賦形劑結(jié)合在制造用于治療糖尿病的藥物中的用途。根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中，所述藥劑是核酸。
全文摘要
本文公開(kāi)了治療包括糖尿病在內(nèi)的肌肉功能障礙的組合物和方法。另外，本發(fā)明涉及包含與藥學(xué)可接受的載體結(jié)合的本發(fā)明的核苷酸和/或多肽的治療組合物，其中該組合物促進(jìn)骨骼肌障礙的治療。而且，本發(fā)明涉及與在MG29表達(dá)水平降低時(shí)發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)變化和膜結(jié)構(gòu)破壞關(guān)聯(lián)的病理性病癥的治療和/或預(yù)防。
文檔編號(hào)A61K31/7105GK102481337SQ201080034612
公開(kāi)日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月5日
發(fā)明者朱驊, 林培惠, 諾厄·魏斯勒德, 麻建杰 申請(qǐng)人:新澤西醫(yī)科和牙科大學(xué)