本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種采用分子生物學(xué)手段鑒定中藥的方法，具體為一種用于鑒定中藥黨參的引物對及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黨參為桔梗科植物黨參、素花黨參或川黨參的干燥根，是我國常用的藥食兩用中藥。具有健脾益肺，養(yǎng)血生津的功效。現(xiàn)代藥理研究表明黨參具有抗腫瘤作用，增強免疫力，延緩衰老的作用，對胃粘膜損傷具有保護(hù)作用，能改善記憶障礙，調(diào)節(jié)血糖的作用等。近年來，由于黨參在治療冠心病、高血脂癥、低血壓和功能性子宮出血等病癥方面取得了新的進(jìn)展，并將黨參用于保健食品的研制與開發(fā)，其用量迅速增長。我國是黨參的主要產(chǎn)區(qū)和分布中心，全世界有黨參屬植物40余種，我國有39種之多，黨參同屬近源植物地上部分外觀相近，盡管利用傳統(tǒng)鑒別方法可將各個種加以區(qū)分，但鑒定需要很豐富的經(jīng)驗，同時也存在一定的主觀性。

由于受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使和物種鑒別水平的限制，目前黨參藥材的地方習(xí)用品較多，如同屬的輪葉黨參、脈花黨參、管花黨參、新疆黨參等，還有桔?？平疱X豹屬金錢豹(土黨參)、傘形科防風(fēng)屬防風(fēng)等與黨參藥材性狀相似的偽品入藥，嚴(yán)重影響了黨參藥材的質(zhì)量和臨床用藥安全，因此黨參藥材的基原鑒定十分重要，迫切需要快速準(zhǔn)確鑒定黨參藥材的有效方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種穩(wěn)定、準(zhǔn)確的鑒別黨參及其混偽品，以達(dá)到保障黨參臨床療效的目的，本發(fā)明提供了一種用于鑒定黨參的引物對及其應(yīng)用。

技術(shù)方案：一種用于鑒定中藥黨參的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

優(yōu)選的，所述引物對p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.7。

表1引物對及發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列

所述引物對在制備鑒定中藥黨參試劑盒中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。

優(yōu)選的，所述試劑盒鑒定中藥黨參的步驟包括：

(1)提取黨參樣品的基因組dna；

(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴增；

(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋100～1000倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴增；

(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋10～100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴增；

(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

優(yōu)選的，所述黨參樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。

優(yōu)選的，所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。

有益效果：(1)本發(fā)明所述引物對準(zhǔn)確性高、通用性好，可數(shù)字化，可重復(fù)利用；(2)本發(fā)明所述引物對的應(yīng)用中樣品處理簡單，實用性好。

附圖說明

圖1是實施例1～3pcr鑒定結(jié)果電泳圖；

其中m為分子量為2000的maker；b1為實施例1pcr產(chǎn)物鑒定結(jié)果；b2為實施例2pcr產(chǎn)物鑒定結(jié)果；b3為實施例3pcr產(chǎn)物鑒定結(jié)果。

具體實施方式

實施例1

一種用于鑒定中藥黨參的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

所述引物對p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.7。

所述引物對在制備鑒定中藥黨參試劑盒中的應(yīng)用。

所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。

所述試劑盒鑒定中藥黨參的步驟包括：

(1)提取黨參樣品的基因組dna；

(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴增；

(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋1000倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴增；

(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋10倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴增；

(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

所述黨參樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。

所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。

實施例2

一種用于鑒定中藥黨參的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

所述引物對p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.7。

所述引物對在制備鑒定中藥黨參試劑盒中的應(yīng)用。

所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。

所述試劑盒鑒定中藥黨參的步驟包括：

(1)提取黨參樣品的基因組dna；

(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴增；

(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴增；

(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋100倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴增；

(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

所述黨參樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。

所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。

實施例3

一種用于鑒定中藥黨參的引物對，所述引物對及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

所述引物對p1、p2和p3的上游引物的5，端加上特異性的gc發(fā)卡結(jié)構(gòu)，所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)的長度為40bp，序列為seqidno.7。

所述引物對在制備鑒定中藥黨參試劑盒中的應(yīng)用。

所述試劑盒的組分包括：引物對、dntp、dna聚合酶、lcgreen、反應(yīng)緩沖液。

所述試劑盒鑒定中藥黨參的步驟包括：

(1)提取黨參樣品的基因組dna；

(2)以步驟(1)提取的基因組dna為模板，以p1為特異性引物，進(jìn)行第一輪pcr擴增；

(3)取步驟(2)的擴增產(chǎn)物，稀釋550倍后作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進(jìn)行第二輪pcr擴增；

(4)取第二輪pcr擴增的產(chǎn)物，稀釋55倍后作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進(jìn)行第三輪pcr擴增；

(5)收集第三輪pcr擴增的產(chǎn)物，并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

所述黨參樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。

所述pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環(huán)；72℃，7min。

如圖1所示，將實施例1～3的擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，條帶清晰可見，產(chǎn)物單一。

sequencelisting

<110>蘇州市李良濟(jì)健康產(chǎn)業(yè)有限公司

<120>一種用于鑒定中藥黨參的引物對及其應(yīng)用

<130>

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