豬microRNA-378種子序列的多態(tài)性及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種豬microRNA-378的種子序列，本發(fā)明鑒定出了豬microRNA-378種子序列中第五位A-G的突變。本發(fā)明還通過(guò)關(guān)聯(lián)分析明確了microRNA-378種子序列A-G突變對(duì)豬背膘厚度產(chǎn)生影響的遺傳效應(yīng)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】豬microRNA-378種子序列的多態(tài)性及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及豬miciORNA-378種子序列的多態(tài)性及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]miRNAs是一類(lèi)長(zhǎng)度為19_22nt的短片段非編碼RNAs，參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miRNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄降解及基因沉默是生物性狀表觀(guān)遺傳調(diào)控的重要方式。miRNAs通過(guò)與mRNA的特異性位點(diǎn)互補(bǔ)配對(duì)抑制轉(zhuǎn)錄，從而引起靶基因的剪切，脫腺苷化和降解。miRNA的第二至八位核苷酸為miRNA識(shí)別靶基因位點(diǎn)的關(guān)鍵序列，被稱(chēng)為種子序列，種子序列中的任一氨基酸的改變，都會(huì)顯著影響該miRNA的功能。近年來(lái)，越來(lái)越多的報(bào)道表明miRNA及其識(shí)別位點(diǎn)的序列圖突變對(duì)農(nóng)業(yè)動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀有重要影響。
[0003]miciORNA-378是一個(gè)與脂肪生成、肌肉生長(zhǎng)和性激素分泌密切相關(guān)的表觀(guān)遺傳調(diào)控因子，敲掉microRNA-378的小鼠會(huì)出現(xiàn)脂肪沉積的大幅降低。目前尚無(wú)豬成熟miRNA的遺傳變異對(duì)表型性狀影響的相關(guān)報(bào)道，豬microRNA-378中的遺傳變異也未見(jiàn)報(bào)道。由于豬基因組注釋程度較差，位于miRNA中的突變往往被注釋基因間和內(nèi)含子中的調(diào)控性突變，其突變效應(yīng)及表型相關(guān)均較模糊，無(wú)法用于標(biāo)記輔助選擇的育種實(shí)踐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一個(gè)與豬脂肪沉積表型相關(guān)的miCToRNA種子序列多態(tài)性位點(diǎn)及其基因型檢測(cè)方法。
`[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0006]本發(fā)明利用克隆測(cè)序的方法在12號(hào)染色體上的microRNA-378種子序列的第五位鑒定出一個(gè)A-G的突變。野生型microRNA-378成熟體的序列為ACTGGACTTGGAGTCAGAAGGC，突變型序列為ACTGGGCTTGGAGTCAGAAGGC，突變發(fā)生在種子序列的第五位，直接導(dǎo)致microRNA種子序列識(shí)別的改變，從而影響整個(gè)microRNA-378參與的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
[0007]本發(fā)明利用microRNA-378種子序列多態(tài)性與表型的相關(guān)性分析鑒定了該突變對(duì)豬背膘厚度性狀的遺傳效應(yīng)，提供了一個(gè)可以用于種豬選育的分子標(biāo)記。
[0008]本發(fā)明還提供了一套利用豬的血液、組織樣品鑒定出豬microRNA-378種子序列第五位基因型檢測(cè)方法。
[0009]上述基因型檢測(cè)方法包括以下步驟:
[0010]I)基因組DNA的提??；
[0011]2) microRNA-378 基因的擴(kuò)增；
[0012]3)純化擴(kuò)增產(chǎn)物，用基因序列分析儀以下游引物進(jìn)行反向測(cè)序。
[0013]4)將測(cè)序峰圖文件比對(duì)到基因組參考序列中，根據(jù)峰圖結(jié)果判斷該位置基因型，如果為G堿基單峰則基因型為GG型；如果為A/G雙峰同時(shí)出現(xiàn)則基因型為AG型；如果為A堿基單峰則基因型為AA型。[0014]本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，能利用豬的血液、組織樣品快速、準(zhǔn)確的在豬microRNA-378種子序列的第五位鑒定出一個(gè)A-G的突變。這個(gè)突變?cè)谥袊?guó)地方豬種及其雜交后代群體中以中等基因頻率存在，關(guān)聯(lián)分析表明這個(gè)位點(diǎn)的基因型與豬背膘厚性狀顯著相關(guān)，可以作為生長(zhǎng)、胴體形狀選育的分子標(biāo)記應(yīng)用。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1是基因組DNA序列峰圖及序列對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，但不應(yīng)該理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的前提下，對(duì)本發(fā)明所做的修飾或者替換，均屬于本發(fā)明的范疇。
[0017]實(shí)施例1基因組DNA的提取
[0018]用基因組DNA提取試劑從豬血液或者組織中提取豬的基因組DNA，具體操作參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。
[0019]實(shí)施例2microRNA_378基因的擴(kuò)增
[0020]在ensembl 豬基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ensembl.0rg/Sus_scrofa/Info/Index)中獲取位于十二號(hào)染色體38.39M處的microRNA-378_2基因序列。采用Primer3軟件在線(xiàn)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(見(jiàn)下表)，并采用ABI3900基因合成儀合成相應(yīng)寡核苷酸引物。
[0021]表1 mir-378基因PCR引物序列、產(chǎn)物大小及擴(kuò)增區(qū)域
[0022]
mir-378-2__引物序列_|產(chǎn)物謂區(qū)域_
H詞物δ , - TAACCCCTAGGTGGGTCT | 345bp mir-378-2前體編碼書(shū)
__GAG -3，_
"F游雜5, - TCAGATGAGCAGGACAGT
TCH
[0023]用Takara公司rTaq酶配置如下PCR反應(yīng)體系配置:10 X PCR buffer (不含MgC1215mmol)2.5μ I ;MgC12 (15mmol )1.5 μ I ；4 XdNTPs (2.5mM)2.0 μ I ；Primers (IOpmol/μ I each) 0.42 μ I ；Template DNA (25ng/ μ I) 4.0 μ I ；Taq DNA polymerase (5U/ μ I)
0.25 μ I ;加水至 25 μ 1
[0024]隨后用PCR儀以如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，預(yù)變性94°C 5分鐘；隨后進(jìn)入循環(huán)--變性94°C 30秒，退火60°C 30秒，延伸72°C 30秒，循環(huán)35次；終延伸72°C 7分鐘后結(jié)束反映。PCR反應(yīng)產(chǎn)物由1.2%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)檢測(cè)。取3~4 μ I PCR反應(yīng)產(chǎn)物，加入
2μ 16Χ IV型凝膠加樣緩沖液混合均勻，用點(diǎn)樣槍將樣品點(diǎn)入凝膠點(diǎn)樣孔中，同時(shí)在一點(diǎn)樣孔中點(diǎn)入Takara公司Marker DL2000,80伏電泳大約30分鐘(溴酹蘭指示劑電泳到凝膠板的2/3)，即可取下凝膠板在紫外燈下檢察。根據(jù)Marker，若相應(yīng)位置附近可見(jiàn)一條明亮的條帶，則是擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0025]實(shí)例3microRNA_378種子序列第五位基因型的判定
[0026]首先采用上海生工凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。隨后采用ABI公司3730基因序列分析儀以下游PCR引物(5’ -TCA GAT GAG CAG GAC AGT TCA G-3’ )進(jìn)行反向測(cè)序。將測(cè)序峰圖文件比對(duì)到基因組參考序列中，根據(jù)峰圖結(jié)果判斷該位置基因型，如果為G堿基單峰則基因型為GG型；如果為A/G雙峰同時(shí)出現(xiàn)則基因型為AG型；如果為A堿基單峰基因型為AA型，具體見(jiàn)圖1。
[0027]實(shí)例4microRNA_378種子序列多態(tài)性與表型的相關(guān)性分析
[0028]收集基因分型群體的生長(zhǎng)、胴體性狀指標(biāo)并與基因型和個(gè)體編號(hào)一一對(duì)應(yīng)，建立如下的固定效應(yīng)模型，采用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件包的常規(guī)線(xiàn)形模型過(guò)程(PRO-GLM)進(jìn)行重復(fù)數(shù)不等資料的方差分析和多重比較。
[0029]Yijk=U +bi+hj+gk+ei jk
[0030]Yijk:個(gè)體胴體肉質(zhì)性狀的觀(guān)測(cè)值；
[0031]μ:胴體及肉質(zhì)性狀的群體均值；
[0032]b1:第i個(gè)品種(種群)效應(yīng)(i的不同數(shù)值代表不同的豬種或雜交組合);
[0033]hj:第j個(gè)場(chǎng)效應(yīng)值(j的不同數(shù)值代表不同的采樣豬場(chǎng));
[0034]gk:第k個(gè)基因型效應(yīng)(k=l、2、3，分別對(duì)應(yīng)AA、AG、GG基因型)；
[0035]eijk:隨機(jī)殘差效應(yīng)。
[0036]對(duì)三種基因型在群體中的個(gè)體數(shù)及與背膘厚性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，見(jiàn)表1.[0037]表2三種基因型在群體中的個(gè)體數(shù)及與背膘厚性狀之間的關(guān)系
【權(quán)利要求】
1.豬microRNA-378的種子序列，其特征在于，豬microRNA-378種子序列的第5位為A或G。
2.一種檢測(cè)權(quán)利要求1所述的豬microRNA-378種子序列的多態(tài)性的方法，包括以下步驟: 1)基因組DNA的提??； 2)microRNA-378基因的擴(kuò)增； 3)純化擴(kuò)增產(chǎn)物，用基因序列分析儀以下游引物進(jìn)行反向測(cè)序； 4)將測(cè)序峰圖文件比對(duì)到基因組參考序列中，根據(jù)峰圖結(jié)果判斷該位置基因型，如果為G堿基單峰則基因型為GG型；如果為A/G雙峰同時(shí)出現(xiàn)則基因型為AG型；如果為A堿基單峰則基因型為AA型。
3.權(quán)利要求1所述的 豬microRNA-378種子序列的多態(tài)性在種豬選育上的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103555723SQ201310499928
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月21日
【發(fā)明者】陳磊, 藍(lán)靜, 趙久剛, 張亮, 潘紅梅, 王可甜, 王金勇 申請(qǐng)人:重慶市畜牧科學(xué)院