專利名稱：Rna序列擴(kuò)增的方法和組合物的制作方法
相關(guān)申請的相互參照本申請要求美國臨時(shí)專利申請(系列號60/274,550，2001年3月9日申請)的優(yōu)先權(quán)，所述專利申請的全部內(nèi)容在此引用作為參考。
背景領(lǐng)域擴(kuò)增核糖核酸(RNA)的能力是致力于闡明生物過程的一個(gè)重要方面。到目前為止，RNA(通常為mRNA)擴(kuò)增最常見的是利用反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及其變化方法來進(jìn)行。這些方法基于利用反轉(zhuǎn)錄酶來復(fù)制RNA以形成互補(bǔ)于RNA的單鏈DNA(cDNA)，其后是利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增以產(chǎn)生多拷貝雙鏈DNA。盡管這些方法最常使用，但它們具有一些明顯的弊端a)反應(yīng)需要熱循環(huán)；b)產(chǎn)物為雙鏈，因此使得它們不易與探針結(jié)合；c)反應(yīng)易于為前擴(kuò)增產(chǎn)物所污染，因此反應(yīng)混合物需要嚴(yán)格的防范措施；以及d)這些方法擴(kuò)增的指數(shù)性質(zhì)使得它們易于產(chǎn)生并不能真實(shí)反映輸入的總RNA樣品中代表不同RNA序列的產(chǎn)物池，這由于不同序列擴(kuò)增效率的不同以及基于擴(kuò)增產(chǎn)物的復(fù)制而不是基于輸入靶RNA的連續(xù)復(fù)制的指數(shù)性擴(kuò)增性質(zhì)。
細(xì)胞內(nèi)總mRNA代表某一特定時(shí)期基因表達(dá)活性?；虮磉_(dá)受細(xì)胞周期進(jìn)程、發(fā)育調(diào)節(jié)、對內(nèi)外刺激的反應(yīng)等的影響。有機(jī)體中任何細(xì)胞類型的表達(dá)基因譜都反映了正?；蚣膊顟B(tài)、對不同刺激的反應(yīng)、發(fā)育時(shí)期、細(xì)胞分化等。
近年來已經(jīng)發(fā)展了多種分析基因表達(dá)的方法。參見例如美國專利號5,774,308；6,143,495；5,824,517；5,829,547；5,888,779；5,545,522；5,716,785；5,409,818；EP0971039A2；EP0878553A2。這些包括了特定mRNA的定量和多種mRNA的同時(shí)定量，以及已知和未知基因表達(dá)模式的檢測與定量。基因表達(dá)譜分析是目前在不同有機(jī)體、特別是在人的細(xì)胞分化和細(xì)胞發(fā)育研究以及正常或疾病狀態(tài)的研究中最為有力的工具之一。這種分析對基因發(fā)現(xiàn)、分子藥物和藥物發(fā)現(xiàn)過程極其重要。
對基因表達(dá)譜而言，擴(kuò)增制備自任一細(xì)胞或組織的細(xì)胞內(nèi)總mRNA通常極其重要。盡管分析非擴(kuò)增mRNA也是可行的，但這需要顯著量的起始mRNA。然而，可得到的樣品mRNA的總量經(jīng)常由于其來源的生物樣品的量有限而受限。生物學(xué)樣品經(jīng)常在量上有限而且是寶貴的。此外，不同種mRNA的量也不相等；一些種類的mRNA較其他拷貝更為豐富，且前者就更可能和更易于分析。擴(kuò)增mRNA序列的能力使得較低豐度、稀有mRNA的分析成為可能。通過核酸擴(kuò)增來分析小量樣品的能力也有利于設(shè)計(jì)參數(shù)，大量篩選效應(yīng)子分子文庫，對此而言，進(jìn)行很大規(guī)模篩選或超高通量篩選的能力以及鑒于文庫組分的有限量來說，主要的考慮是減少樣品體積。
因此，這就需要有克服現(xiàn)有方法弊端的改良RNA擴(kuò)增方法。于此提供的本發(fā)明滿足此項(xiàng)需要，并提供其它的好處。
于此引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利申請和出版物全文引用作為參考。
本發(fā)明的公開本發(fā)明提供了用于RNA擴(kuò)增的方法、組合物和試劑盒，以及本擴(kuò)增方法的應(yīng)用。
因此，一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生多拷貝與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列的方法，所述方法包括下列步驟(a)利用RNA-依賴的DNA聚合酶延伸與靶RNA雜交的第一引物，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物，由此產(chǎn)生了包含第一引物延伸產(chǎn)物和靶RNA的復(fù)合體；(b)應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割步驟(a)中的復(fù)合體上的RNA；(c)利用DNA-依賴的DNA聚合酶延伸與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的第二引物，由此產(chǎn)生了第二引物延伸產(chǎn)物，從而形成第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體；(d)應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體中復(fù)合引物的RNA，以使復(fù)合引物與第二引物延伸產(chǎn)物雜交，其中復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分；(e)利用DNA-依賴的DNA聚合酶延伸與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物；由此上述第一引物延伸產(chǎn)物被置換，并且由此多拷貝與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列得以產(chǎn)生。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生多拷貝與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列的方法，所述方法包括下列步驟(a)利用DNA-依賴的DNA聚合酶延伸與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的第二引物，其中第一引物延伸產(chǎn)物在其5’端包含RNA部分，所述第一引物延伸產(chǎn)物包含與RNA序列互補(bǔ)的序列，由此產(chǎn)生第二引物延伸產(chǎn)物，從而形成第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體；(b)應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體中的RNA，以使復(fù)合引物與第二引物延伸產(chǎn)物雜交，其中復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分；(c)利用DNA-依賴的DNA聚合酶延伸與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物；由此上述第一引物延伸產(chǎn)物被置換，并且由此與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝得以產(chǎn)生。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，第一引物延伸產(chǎn)物通過利用RNA依賴的DNA聚合酶延伸與靶RNA雜交的第一引物產(chǎn)生，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝的方法，所述方法包括下列步驟(a)應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體上的RNA，以使復(fù)合引物與第二引物延伸產(chǎn)物雜交，其中復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分，其中第一引物延伸產(chǎn)物通過利用RNA依賴的DNA聚合酶延伸與靶RNA雜交的第一引物產(chǎn)生，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；(b)將復(fù)合引物與第二引物延伸產(chǎn)物雜交并且利用DNA依賴的DNA聚合酶延伸該復(fù)合引物；由此所述第一引物延伸產(chǎn)物被置換，并且由此與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列的多拷貝得以產(chǎn)生。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝的方法，所述方法包括下列步驟延伸復(fù)合體中的復(fù)合引物，所述復(fù)合體包含(i)第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體，其中第一引物延伸產(chǎn)物通過利用RNA依賴的DNA聚合酶延伸與靶RNA雜交的第一引物產(chǎn)生，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物，其中第二引物延伸產(chǎn)物通過延伸與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的第二引物產(chǎn)生，并且其中第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體中的RNA應(yīng)用從RNA/DNA雜合體中切割RNA的酶切割；以及(ii)復(fù)合引物，所述復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分，其中復(fù)合引物與第二引物延伸產(chǎn)物雜交，并且其中復(fù)合引物可以與第一引物相同或不同；由此所述第一引物延伸產(chǎn)物被置換，并且由此與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝得以產(chǎn)生。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝的方法，所述方法包括下列步驟(a)延伸與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物，其中所述引物延伸產(chǎn)物(i)包含由延伸與模板RNA雜交的第一引物產(chǎn)生的第一引物延伸產(chǎn)物序列或其互補(bǔ)序列，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；并且(ii)與第二引物延伸產(chǎn)物雜交，所述第二延伸產(chǎn)物通過延伸與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的第二引物產(chǎn)生，并應(yīng)用從RNA/DNA雜合體中切割RNA的酶從第一引物中切割RNA；由此上述第一引物延伸產(chǎn)物被置換，并且由此與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝得以產(chǎn)生。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生目的RNA序列多拷貝的方法，所述方法包括下列步驟在允許RNA聚合酶發(fā)生轉(zhuǎn)錄的條件下，將包含前啟動(dòng)子和可與被置換第一引物延伸產(chǎn)物雜交區(qū)域的多核苷酸與被置換的第一引物延伸產(chǎn)物雜交，以使產(chǎn)生包含與被置換的第一引物延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的序列的RNA轉(zhuǎn)錄本，上述被置換的第一引物延伸產(chǎn)物來自任一此處所述的產(chǎn)生與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝的方法，由此目的RNA序列多拷貝得以產(chǎn)生。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生目的RNA序列多拷貝的方法，所述方法包括下列步驟在允許RNA聚合酶發(fā)生轉(zhuǎn)錄的條件下，將包含前啟動(dòng)子和可與被置換第一引物延伸產(chǎn)物雜交區(qū)域的多核苷酸與第一引物延伸產(chǎn)物雜交，以使產(chǎn)生包含與被置換的第一引物延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的序列的RNA轉(zhuǎn)錄本，上述第一引物延伸產(chǎn)物來自任一此處所述的產(chǎn)生與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝的方法，其中引物延伸產(chǎn)物為被置換的引物延伸產(chǎn)物，其由下述產(chǎn)生(a)利用RNA依賴的DNA聚合酶延伸與靶RNA雜交的第一引物，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物，由此產(chǎn)生了包含第一引物延伸產(chǎn)物和靶RNA的復(fù)合體；(b)應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割步驟(a)復(fù)合體中的RNA；(c)利用DNA-依賴的DNA聚合酶延伸與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的第二引物，由此產(chǎn)生了第二引物延伸產(chǎn)物，從而形成第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體；(d)應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體中復(fù)合引物上的RNA，以使復(fù)合引物與第二引物延伸產(chǎn)物雜交，其中復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分；(e)利用DNA-依賴的DNA聚合酶延伸與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的上述復(fù)合引物，由此上述第一引物延伸產(chǎn)物被置換；并且由此多拷貝目的RNA序列得以產(chǎn)生。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝(擴(kuò)增)的方法，所述方法包括下列步驟(a)第一引物與靶RNA雜交，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；(b)利用RNA-依賴的DNA聚合酶延伸第一引物，由此產(chǎn)生了包含第一引物延伸產(chǎn)物和靶RNA的復(fù)合體；(c)應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的試劑(比如酶)切割步驟(b)中的復(fù)合體上的RNA；(d)將第二引物與第一引物延伸產(chǎn)物雜交；(e)利用DNA-依賴的DNA聚合酶延伸第二引物，由此產(chǎn)生了第二引物延伸產(chǎn)物，從而形成第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體；(f)應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的試劑(比如酶)切割第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體中復(fù)合引物上的RNA，以使復(fù)合引物(其可以與第一引物相同或不同)可與第二引物延伸產(chǎn)物雜交，其中上述復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分；(g)利用DNA-依賴的DNA聚合酶延伸上述步驟(f)中的復(fù)合引物，由此上述第一引物延伸產(chǎn)物被置換，并且由此與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝得以產(chǎn)生。
在一些方面中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝的方法，所述方法包括下列步驟組合并反應(yīng)上述步驟(e)中第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體；可與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物(其與第一引物可以相同或不同)，其中所述復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分；DNA依賴的DNA聚合酶；從RNA/DNA雜合體上切割RNA的試劑(比如酶)；其中混合物在一定條件(包括必要的底物和緩沖條件)下孵育，所述孵育條件為允許引物雜交、RNA切割和當(dāng)上述步驟(e)復(fù)合體的RNA被切割且復(fù)合引物結(jié)合到復(fù)合體的第二引物延伸產(chǎn)物上后步驟(e)復(fù)合體中第一引物延伸產(chǎn)物的置換。
對本領(lǐng)域熟練人員而言顯而易見的是，所指產(chǎn)生目的RNA序列多拷貝或與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝是指包括、包含或由這些序列組成的產(chǎn)物。對本領(lǐng)域熟練人員而言顯而易見的是，所指所得混合物的組合與孵育方面也包括含有孵育多種混合物(以多種組合和/或亞組合)的方法實(shí)施方案，從而形成所期望的產(chǎn)物。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝的方法，所述方法包括孵育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含(a)靶RNA；(b)可與靶RNA雜交的第一引物，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；(c)可與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的第二引物；(d)RNA依賴的DNA聚合酶；(e)DNA依賴的DNA聚合酶；(f)從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶；其中孵育條件為允許引物雜交、第一和第二引物延伸以形成包含第一和第二引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合體、RNA切割，以及當(dāng)復(fù)合體中的RNA被切割且復(fù)合引物結(jié)合到復(fù)合體中第二延伸產(chǎn)物上并延伸時(shí)第一引物延伸產(chǎn)物的置換，由此與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝得以產(chǎn)生。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生目的RNA序列多拷貝(擴(kuò)增)的方法，所述方法包括下列步驟(a)第一引物與靶RNA雜交，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；(b)利用RNA依賴的DNA聚合酶延伸第一引物，由此產(chǎn)成包含第一引物延伸產(chǎn)物和靶RNA的復(fù)合體；(c)應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的試劑(比如酶)切割步驟(b)復(fù)合體上的RNA；(d)將第二引物與第一引物延伸產(chǎn)物雜交；(e)利用DNA-依賴的DNA聚合酶延伸第二引物，由此產(chǎn)生第二引物延伸產(chǎn)物，從而形成第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體；(f)應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的試劑(如酶)切割第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體中復(fù)合引物上的RNA，以使復(fù)合引物(其可以與第一引物相同或不同)與第二引物延伸產(chǎn)物雜交，其中所述復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分；(g)利用DNA-依賴的DNA聚合酶延伸上述步驟(f)中復(fù)合引物，由此上述第一引物延伸產(chǎn)物被置換；(h)在允許RNA聚合酶發(fā)生轉(zhuǎn)錄的條件下，將包含前啟動(dòng)子和可與被置換第一引物延伸產(chǎn)物雜交區(qū)域的多核苷酸與被置換的第一引物延伸產(chǎn)物雜交，以使產(chǎn)生包含與被置換的引物延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的序列的RNA轉(zhuǎn)錄本，由此目的RNA序列多拷貝得以產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生目的RNA序列多拷貝的方法，所述方法包括下列步驟(a)組合第一復(fù)合體，其中第一復(fù)合體為本段中上述步驟(e)中第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體；可與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物(其與第一引物相同或不相同)，其中所述復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分；DNA依賴的DNA聚合酶；RNA聚合酶；包含前啟動(dòng)子和與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的區(qū)域的前啟動(dòng)子多核苷酸；以及從RNA/DNA雜合體上切割RNA的試劑(如酶)；和(b)孵育步驟(a)的混合物，孵育條件(包括必需的底物與緩沖條件)為允許引物雜交、RNA切割、當(dāng)?shù)谝粡?fù)合體中的RNA被切割且復(fù)合引物結(jié)合到第一復(fù)合體中第二延伸產(chǎn)物上時(shí)第一復(fù)合體中第一引物延伸產(chǎn)物的置換、前啟動(dòng)子多核苷酸與被置換的第一引物延伸產(chǎn)物雜交以形成包含被置換的引物延伸產(chǎn)物和前啟動(dòng)子多核苷酸的第二復(fù)合體以及從上述第二復(fù)合體上進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生目的RNA序列多拷貝的方法，所述方法包括孵育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含(a)靶RNA；(b)可與靶RNA雜交的第一引物，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；(c)可與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的第二引物；(d)RNA依賴的DNA聚合酶；(e)DNA依賴的DNA聚合酶；(f)RNA聚合酶；(g)包含前啟動(dòng)子和可與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的區(qū)域的前啟動(dòng)子多核苷酸；和(h)從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶；其中孵育條件為允許引物雜交、第一和第二引物延伸以形成包含第一和第二引物延伸產(chǎn)物的第一復(fù)合體、RNA切割、當(dāng)?shù)谝粡?fù)合體中的RNA被切割且復(fù)合引物結(jié)合到第一復(fù)合體中第二延伸產(chǎn)物上時(shí)第一引物延伸產(chǎn)物從第一復(fù)合體的置換、前啟動(dòng)子多核苷酸與被置換的第一引物延伸產(chǎn)物雜交以形成包含被置換的引物延伸產(chǎn)物和前啟動(dòng)子多核苷酸第二復(fù)合體、以及從上述第二復(fù)合體上RNA的轉(zhuǎn)錄，由此目的RNA序列多拷貝得以產(chǎn)生。
又一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生目的RNA序列多拷貝(擴(kuò)增)的方法，所述方法包括孵育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含(a)靶RNA；(b)可與靶RNA雜交的第一引物，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；(c)可與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的第二引物；(d)RNA依賴的DNA聚合酶；(e)DNA依賴的DNA聚合酶；和(f)從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶；其中孵育是在一定條件下進(jìn)行的，所述條件(包括必需的底物與緩沖條件)為允許引物雜交、從第一引物和第二引物延伸以形成包含第一和第二引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合體、RNA切割、以及當(dāng)復(fù)合體中的RNA被切割且另一第一引物結(jié)合到復(fù)合體中的第二引物延伸產(chǎn)物上時(shí)復(fù)合體中第一引物延伸產(chǎn)物的置換，由此與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝得以產(chǎn)生。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生目的RNA序列多拷貝(擴(kuò)增)的方法，所述方法包括下列步驟(a)孵育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含(i)靶RNA；和(ii)可與靶RNA雜交的第一引物，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；以及(iii)RNA依賴的DNA聚合酶；其中孵育條件為允許引物雜交和包含第一引物延伸產(chǎn)物和靶RNA的復(fù)合體的形成；(b)孵育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含(i)包含第一引物延伸產(chǎn)物和靶RNA的復(fù)合體；以及(ii)可從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶；其中孵育條件為允許在包含第一引物延伸產(chǎn)物和靶RNA的復(fù)合體上切割RNA；(c)孵育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含(i)第一引物延伸產(chǎn)物；(ii)可與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的第二引物；以及(iii)DNA依賴的DNA聚合酶；其中孵育條件為允許引物雜交和包含第一引物延伸產(chǎn)物和第二引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合體的形成；(d)孵育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含(i)含有第一引物延伸產(chǎn)物和第二引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合體；(ii)可從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶；其中孵育條件為允許在包含第一引物延伸產(chǎn)物和第二引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合體上切割RNA；(e)孵育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含(i)復(fù)合引物，其中復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分；(ii)切割過的包含第一引物延伸產(chǎn)物和第二引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合體；和(iii)DNA依賴的DNA聚合酶；其中孵育條件為允許復(fù)合引物雜交、包含第一引物延伸產(chǎn)物和第二引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合體上第一引物延伸產(chǎn)物的置換；由此與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝得以產(chǎn)生。
反應(yīng)混合物可以與一種或多種上述組合的反應(yīng)混合物以任何方式組合(因此減少孵育的數(shù)目)。因此，在一些實(shí)施方案中，步驟(a)和(b)的反應(yīng)混合物為同一反應(yīng)混合物(四步孵育或孵育步驟)。在另一實(shí)施方案中，步驟(d)和(e)的反應(yīng)混合物為同一反應(yīng)混合物(四步孵育或孵育步驟)。又在另一實(shí)施方案中，步驟(a)和(b)的反應(yīng)混合物為同一反應(yīng)混合物且步驟(d)和(e)的反應(yīng)混合物為同一反應(yīng)混合物(三步孵育或孵育步驟)。又在另一實(shí)施方案中步驟(a)-(c)的反應(yīng)混合物為同一反應(yīng)混合物(三步孵育或孵育步驟)。又在另一實(shí)施方案中，步驟(a)-(c)的反應(yīng)混合物為同一反應(yīng)混合物并且步驟(d)和(e)的反應(yīng)混合物為同一反應(yīng)混合物(兩步孵育或孵育步驟)。在另一實(shí)施方案中，步驟(a)-(d)的反應(yīng)混合物為同一反應(yīng)混合物(兩步孵育或孵育步驟)。在另一實(shí)施方案中，步驟(b)和(c)的反應(yīng)混合物為同一反應(yīng)混合物(四步孵育或孵育步驟)。在另一實(shí)施方案中，步驟(c)和(d)的反應(yīng)混合物為同一反應(yīng)混合物(四步孵育或孵育步驟)。又在另一實(shí)施方案中，步驟(a)-(e)的反應(yīng)混合物為同一反應(yīng)混合物(一步孵育)?？梢岳斫猓@些孵育步驟的任意組合和任何單獨(dú)孵育步驟，及至對孵育的擴(kuò)展均作為此處所述任一方法的一部分而進(jìn)行的，都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的另一方面，產(chǎn)生目的RNA序列多拷貝(擴(kuò)增)的方法還包括(a)孵育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含(i)與目的RNA互補(bǔ)的多核苷酸序列的拷貝；和(ii)包含前啟動(dòng)子和與目的RNA互補(bǔ)的多核苷酸序列拷貝雜交的區(qū)域的前啟動(dòng)子多核苷酸；以及RNA聚合酶；并且孵育條件為允許前啟動(dòng)子多核苷酸和與目的RNA互補(bǔ)的多核苷酸序列的拷貝雜交從而形成包含與目的RNA互補(bǔ)的多核苷酸序列拷貝和前啟動(dòng)子多核苷酸的第二復(fù)合體，以及從上述第二復(fù)合體上RNA的轉(zhuǎn)錄。
又一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生目的RNA序列多拷貝(擴(kuò)增)的方法。所述方法包括下列步驟(a)組合靶RNA；可與靶RNA雜交的第一引物，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的第二引物；RNA依賴的DNA聚合酶；DNA依賴的DNA聚合酶；RNA聚合酶；包含前啟動(dòng)子和可與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的區(qū)域的前啟動(dòng)子多核苷酸；以及從RNA/DNA雜合體上切割RNA的試劑(如酶)；和(b)孵育步驟(a)的反應(yīng)混合物，孵育條件(包括必需的底物和緩沖條件)為允許引物雜交、第一引物和第二引物的延伸以形成包含第一和第二引物延伸產(chǎn)物的第一復(fù)合體、RNA切割、當(dāng)?shù)谝粡?fù)合體中的RNA被切割且另一第一引物結(jié)合到第一復(fù)合體中第二延伸產(chǎn)物上時(shí)第一復(fù)合體中第一引物延伸產(chǎn)物的置換、前啟動(dòng)子多核苷酸與被置換的第一引物延伸產(chǎn)物雜交以形成包含被置換的引物延伸產(chǎn)物和前啟動(dòng)子多核苷酸的第二復(fù)合體，以及從上述第二復(fù)合體上RNA轉(zhuǎn)錄，由此目的RNA序列的多拷貝得以產(chǎn)生。
又一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生與目的RNA互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝(擴(kuò)增)的方法，所述方法包括下列步驟(a)引物與靶RNA雜交，其中引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；(b)利用RNA依賴的DNA聚合酶延伸引物，由此產(chǎn)生包含第一引物延伸產(chǎn)物和靶RNA的復(fù)合體；(c)應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的試劑(比如酶)切割步驟(b)復(fù)合體上的RNA，以使至少一個(gè)靶RNA片段仍與引物延伸產(chǎn)物雜交；(d)利用DNA依賴的DNA聚合酶延伸至少一個(gè)靶RNA片段，由此產(chǎn)生包含目的序列的片段延伸產(chǎn)物，形成引物和片段延伸產(chǎn)物復(fù)合體；(e)應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的試劑(比如酶)切割引物和片段延伸產(chǎn)物的復(fù)合體中復(fù)合引物上的RNA，以使包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物(其與第一引物可以相同或不相同)與片段延伸產(chǎn)物雜交，并且通過鏈置換重復(fù)引物延伸；由此產(chǎn)生與目的RNA互補(bǔ)多核苷酸的多拷貝。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生與目的RNA互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝的方法，所述方法包括下列步驟(a)組合本段上述步驟(d)中的引物和片段延伸產(chǎn)物復(fù)合體；可與片段延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物(其與第一引物可以相同或不相同)，其中所述復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分；DNA依賴的DNA聚合酶；以及從RNA/DNA雜合體上切割RNA的試劑(比如酶)；并且(b)孵育步驟(a)的反應(yīng)混合物，孵育條件(包括必需的底物和緩沖條件)為允許引物雜交、RNA切割以及當(dāng)本段中上述步驟(d)所述復(fù)合體中RNA被切割且復(fù)合引物結(jié)合到片段延伸產(chǎn)物上時(shí)復(fù)合體中引物延伸產(chǎn)物的置換。
又一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生目的RNA序列多拷貝(擴(kuò)增)的方法，所述方法包括下列步驟(a)將第一引物與靶RNA雜交，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；(b)利用RNA依賴的DNA聚合酶延伸第一引物，由此產(chǎn)生包含第一引物延伸產(chǎn)物和靶RNA的復(fù)合體；(c)應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的試劑(比如酶)切割步驟(a)復(fù)合體上的靶RNA，這樣殘留的靶RNA片段仍與第一引物延伸產(chǎn)物雜交；(d)利用DNA依賴的DNA聚合酶延伸靶RNA的至少一個(gè)片段，由此產(chǎn)生了包含目的序列的片段延伸產(chǎn)物，以形成引物和片段延伸產(chǎn)物的復(fù)合體；(e)應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的試劑(比如酶)切割引物和片段延伸產(chǎn)物復(fù)合體中復(fù)合引物上的RNA，以使復(fù)合引物(其與第一引物可以相同或不相同)與片段延伸產(chǎn)物雜交并通過鏈置換重復(fù)引物延伸，其中所述復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分；(f)在允許利用RNA聚合酶發(fā)生轉(zhuǎn)錄的條件下，用包含前啟動(dòng)子和可與被置換引物延伸產(chǎn)物雜交的區(qū)域的前啟動(dòng)子多核苷酸與被置換引物延伸產(chǎn)物雜交，以使產(chǎn)生包含與被置換引物延伸產(chǎn)物具互補(bǔ)序列的RNA轉(zhuǎn)錄本，由此目的RNA序列的多拷貝得以產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生目的RNA序列多拷貝的方法，所述方法包括下列步驟(a)組合第一復(fù)合體，其中第一復(fù)合體為本段步驟(d)所述引物和片段延伸產(chǎn)物復(fù)合體；可與片段延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物(其與第一引物可以相同或不相同)，其中復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分；DNA依賴的DNA聚合酶；RNA聚合酶；包含前啟動(dòng)子和與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的區(qū)域的前啟動(dòng)子多核苷酸；以及從RNA/DNA雜合體上切割RNA的試劑(比如酶)；和(b)孵育步驟(a)混合物，孵育條件(其包括必需的底物和緩沖條件)為允許引物雜交、RNA切割、當(dāng)?shù)谝粡?fù)合體的RNA被切割和復(fù)合引物結(jié)合到第一復(fù)合體的片段延伸產(chǎn)物時(shí)從第一復(fù)合體置換引物延伸產(chǎn)物、前啟動(dòng)子多核苷酸與置換的引物延伸產(chǎn)物雜交以形成包含置換的引物延伸產(chǎn)物和前啟動(dòng)子多核苷酸的第二復(fù)合體，并從上述第二復(fù)合體上進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄。
又一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝(擴(kuò)增)的方法，所述方法包括下列步驟(a)組合靶RNA；可與靶RNA雜交的引物，其中引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；RNA依賴的DNA聚合酶；DNA依賴的DNA聚合酶；以及從RNA/DNA雜合體上切割RNA的試劑(比如酶)，和(b)孵育步驟(a)混合物，孵育條件(其包括必需的底物和緩沖條件)為允許引物雜交、RNA切割(其中包含靶RNA和引物延伸產(chǎn)物的第一復(fù)合體的RNA切割為使殘留的靶RNA片段仍與引物延伸產(chǎn)物雜交)、從引物和靶RNA的片段上進(jìn)行引物延伸以形成包含引物延伸產(chǎn)物和片段延伸產(chǎn)物的第二復(fù)合體(上述片段延伸產(chǎn)物包含目的序列)以及當(dāng)?shù)诙?fù)合體的RNA被切割且另一引物結(jié)合至第二復(fù)合體的片段延伸產(chǎn)物時(shí)從第二復(fù)合體上置換引物延伸產(chǎn)物，由此與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列的多拷貝得以產(chǎn)生。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生目的RNA序列多拷貝(擴(kuò)增)的方法，所述方法包括下列步驟(a)組合靶RNA；可與靶RNA雜交的引物，其中引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；RNA依賴的DNA聚合酶；DNA依賴的DNA聚合酶；RNA聚合酶；前啟動(dòng)子多核苷酸；以及從RNA/DNA雜合體上切割RNA的試劑(比如酶)，和(b)孵育步驟(a)混合物，孵育條件(其包括必需的底物和緩沖條件)為允許引物雜交、RNA切割(其中包含靶RNA和引物延伸產(chǎn)物的第一復(fù)合體的RNA切割為使殘留的靶RNA片段仍與引物延伸產(chǎn)物雜交)、從引物和靶RNA片段上引物延伸以形成包含引物延伸產(chǎn)物和片段延伸產(chǎn)物的第二復(fù)合體(上述片段延伸產(chǎn)物包含目的序列)以及當(dāng)?shù)诙?fù)合體的RNA被切割且另一引物與第二復(fù)合體結(jié)合時(shí)從第二復(fù)合體上置換引物延伸產(chǎn)物、前啟動(dòng)子多核苷酸與置換的引物延伸產(chǎn)物雜交以形成包含前啟動(dòng)子多核苷酸與置換的引物延伸產(chǎn)物的第三復(fù)合體，以及從上述第三復(fù)合體上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，由此目的RNA序列的多拷貝得以產(chǎn)生。
在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生多拷貝存在于靶RNA上的目的RNA序列的方法，所述方法包括根據(jù)任一此處所述方法形成包含3′單鏈部分的第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體；(c)將前啟動(dòng)子寡核苷酸與步驟(b)的3′單鏈部分雜交；和(d)用DNA依賴的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，由此產(chǎn)生多拷貝的正義DNA產(chǎn)物。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生與存在于靶RNA上的目的RNA序列的互補(bǔ)序列多拷貝的方法和產(chǎn)生存在于靶RNA序列上目的RNA序列多拷貝的方法，所述方法包括下列步驟(a)利用RNA依賴的DNA聚合酶延伸與靶RNA雜交的第一引物，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物，由此產(chǎn)生包含第一引物延伸產(chǎn)物和靶RNA的復(fù)合體；(b)應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割步驟(a)復(fù)合體上的RNA；(c)利用DNA依賴的DNA聚合酶延伸與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的第二引物，其中第二引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物，由此產(chǎn)生第二引物延伸產(chǎn)物，以形成第一和第二引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合體；(d)應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體上第一和第二復(fù)合引物上的RNA，以使另一復(fù)合引物與第二引物延伸產(chǎn)物雜交以及另一復(fù)合引物與第一引物延伸產(chǎn)物雜交；(e)利用DNA依賴的DNA聚合酶延伸上述步驟(d)中的復(fù)合引物；由此上述第一引物延伸產(chǎn)物被置換，且由此與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝得以產(chǎn)生；并由此上述第二引物延伸產(chǎn)物被置換，且由此目的RNA序列的多拷貝得以產(chǎn)生。
另一方面，產(chǎn)生與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝的方法包括產(chǎn)生與兩個(gè)或更多不同目的序列互補(bǔ)的多核苷酸序列多拷貝。
在另一方面，產(chǎn)生目的RNA序列多拷貝的方法包括產(chǎn)生兩個(gè)或更多不同目的序列的多拷貝。
此處描述了本發(fā)明方法中所用復(fù)合引物和第二引物的多個(gè)實(shí)施方案。例如，在一些實(shí)施方案中，復(fù)合引物的RNA部分相對于其3’DNA部分為5’。又在其它實(shí)施方案中，5’RNA與3’DNA毗鄰。在一些實(shí)施方案中，在復(fù)合引物與靶RNA雜交的條件下，復(fù)合引物包含不可與靶RNA雜交的5’部分(例如5’RNA部分)。又在其它實(shí)施方案中，復(fù)合引物包含含有隨機(jī)序列的3’部分(例如3’DNA部分)。在一些靶RNA為mRNA的實(shí)施方案中，復(fù)合引物可以包含多聚序列。在另外的實(shí)施方案中，復(fù)合引物為隨機(jī)引物。又在另外的實(shí)施方案中，多種復(fù)合引物用于與靶RNA雜交。在一些實(shí)施方案中，與靶RNA雜交的復(fù)合引物和與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物相同。在一些實(shí)施方案中，與靶RNA雜交的復(fù)合引物和與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物不相同。
又在另外的實(shí)施方案中，第二引物為包含DNA的引物(在一些實(shí)施方案中，其由DNA組成)。在另外的實(shí)施方案中，第二引物包含與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的一個(gè)或多個(gè)靶RNA片段，上述一個(gè)或多個(gè)靶RNA片段應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割靶RNA與第一引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體上的RNA而產(chǎn)生。在另外的實(shí)施方案中，第二引物包含含有隨機(jī)序列的部分(例如3’部分)。又在另一實(shí)施方案中，第二引物為隨機(jī)引物。在一些實(shí)施方案中，第二引物包含不可與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的5’部分。對于此處描述的方法，可以使用一個(gè)或多個(gè)復(fù)合引物或第二引物。
此處描述了可在方法和組合物中使用的酶。例如切割RNA的試劑(如酶)可以是RNaseH，以及RNA依賴的DNA聚合酶可以是反轉(zhuǎn)錄酶。RNA依賴的DNA聚合酶可包含RNaseH酶活性，或可使用單獨(dú)的酶。相似地，DNA聚合酶可包含RNA依賴的和DNA依賴的DNA聚合酶活性，或可使用單獨(dú)的酶。DNA依賴的DNA聚合酶和切割RNA的酶也可以是同一種酶。DNA依賴的DNA聚合酶、RNA依賴的DNA聚合酶和切割RNA的酶也可以是同一種酶。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法用于產(chǎn)生標(biāo)記的多核苷酸產(chǎn)物(通常是DNA或RNA產(chǎn)物)。在用于產(chǎn)生標(biāo)記DNA產(chǎn)物的方法的一些實(shí)施方案中，至少一種類型的dNTP為標(biāo)記的dNTP。在用于產(chǎn)生標(biāo)記RNA產(chǎn)物的方法的一些實(shí)施方案中，至少一種類型的rNTP為標(biāo)記的rNTP。在另外的用于產(chǎn)生標(biāo)記DNA產(chǎn)物的方法的實(shí)施方案中，使用標(biāo)記的復(fù)合引物。
在一些方面中，前啟動(dòng)子多核苷酸(例如PTO)在3’末端包含與置換的引物延伸產(chǎn)物雜交的區(qū)域，由此DNA聚合酶延伸置換的延伸產(chǎn)物產(chǎn)生雙鏈的啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄從上述雙鏈啟動(dòng)子發(fā)生。
本方法適用于擴(kuò)增任何RNA靶，包括例如mRNA和核糖體RNA。一步或多步步驟可以組合和/或順次進(jìn)行(通常以任何次序，只要所要求的產(chǎn)物可以形成)，并且顯而易見的是，本發(fā)明包括此描述步驟的多種組合。同樣顯而易見并此處描述的是，本發(fā)明包括其中起始步驟為此處描述的任何步驟的方法。例如，本發(fā)明的方法不需要第一步為從RNA模板上產(chǎn)生第一引物延伸產(chǎn)物。本發(fā)明方法包括其中較后的“下游”步驟為起始步驟的實(shí)施方案。
此外，在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)理解第一引物延伸產(chǎn)物包含(a)與RNA序列互補(bǔ)的序列和(b)5’部分(優(yōu)選地5’末端)為RNA。正如所述，此產(chǎn)物一般是由具RNA部分的復(fù)合引物沿RNA模板進(jìn)行引物延伸產(chǎn)生。正因如此，提及第一引物延伸產(chǎn)物指包含上述(a)和(b)的產(chǎn)物。
本發(fā)明也提供了應(yīng)用(通常為分析)本發(fā)明擴(kuò)增方法的產(chǎn)物的方法，如測序，序列變化的檢測(例如基因分型或核苷酸突變檢測)；確定目的序列的存在與否；基因表達(dá)譜；消減雜交(subtractive hybridization)；消減雜交探針的制備；差異擴(kuò)增；文庫(包括cDNA文庫和差異表達(dá)文庫)制備；固定化核酸(其可以是固定于微陣列上的核酸)的制備，以及鑒定(包括檢測與/或定量)由本發(fā)明方法產(chǎn)生的擴(kuò)增核酸產(chǎn)物。
在一些方面中，本發(fā)明提供了目的RNA的測序方法，所述方法包括在dNTP和dNTP類似物(其可被標(biāo)記或未被標(biāo)記)混合物存在時(shí)利用本發(fā)明擴(kuò)增方法擴(kuò)增包含目的序列的靶RNA，于是由于摻入標(biāo)記或未標(biāo)記的dNTP類似物引物延伸被終止，并分析擴(kuò)增引物來確定序列。在其中擴(kuò)增產(chǎn)物為RNA轉(zhuǎn)錄本的實(shí)施方案中，方法可以包括(a)在rNTP和rNTP類似物(其可被標(biāo)記或未被標(biāo)記)混合物存在時(shí)，利用本發(fā)明擴(kuò)增方法擴(kuò)增包含目的序列的靶RNA，于是由于摻入的標(biāo)記或未標(biāo)記的rNTP類似物，RNA轉(zhuǎn)錄被終止，并且(b)通過分析擴(kuò)增產(chǎn)物來確定序列。
一方面，本發(fā)明提供了在靶RNA中檢測突變(或者，在一些方面中為鑒定序列)的方法，其包括(a)通過此所述的方法擴(kuò)增靶RNA；和(b)分析本方法擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈構(gòu)象，其中與參考單鏈RNA相比較，不同的構(gòu)象就顯示出靶RNA的突變。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在靶RNA中檢測突變(或者，在一些方面中為鑒定序列)的方法，其包括分析此處描述的任何方法的擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈構(gòu)象，其中與參考單鏈RNA相比較，不同的構(gòu)象就顯示出靶RNA的突變(或者，在一些方面中為鑒定靶序列)。
另一方面，本發(fā)明提供了確定目的序列存在與否的方法，所述方法包括(i)擴(kuò)增包含目的序列的靶RNA，所述擴(kuò)增包括延伸復(fù)合引物，其中所述復(fù)合引物與通過任一此處所述方法制備的被切割第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體雜交，其中復(fù)合引物的RNA部分的序列已知，和(ii)將從步驟(i)中的擴(kuò)增產(chǎn)物(其如果存在)與從參考模板擴(kuò)增產(chǎn)物的量相比；其中(1)和從包含可與復(fù)合引物的RNA部分雜交的區(qū)域的參考模板擴(kuò)增的產(chǎn)物量相比從該模板產(chǎn)生更少量擴(kuò)增產(chǎn)物顯示出第二引物延伸產(chǎn)物不包含可與復(fù)合引物的RNA部分雜交的序列，并顯示出第二引物延伸產(chǎn)物為與復(fù)合引物RNA部分雜交的序列的序列變體；或(2)和從不包含可與復(fù)合引物的RNA部分雜交的區(qū)域的參考模板擴(kuò)增的產(chǎn)物量相比從該模板產(chǎn)生更多量擴(kuò)增產(chǎn)物顯示出第二引物延伸產(chǎn)物包含可與復(fù)合引物的RNA部分雜交的序列，并顯示出第二引物延伸產(chǎn)物不是與復(fù)合引物RNA部分雜交的序列的序列變體。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生固定于基片上的核酸的方法(其包括產(chǎn)生微陣列的方法)，包括(a)通過此處描述的任一方法擴(kuò)增靶RNA；和(b)將擴(kuò)增產(chǎn)物固定到基片上。擴(kuò)增產(chǎn)物可為標(biāo)記或未標(biāo)記的。另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生微陣列的方法，包括(a)通過此處描述的任一方法擴(kuò)增靶RNA；和(b)將擴(kuò)增產(chǎn)物固定到基片上(其可以是固體或半固體)。在一些實(shí)施方案中，微陣列通過固定擴(kuò)增產(chǎn)物到基片上形成擴(kuò)增產(chǎn)物的微矩陣而產(chǎn)生。微陣列可以包括至少一種固定到固體或半固體基片上的擴(kuò)增產(chǎn)物，上述基片制備材料選自紙、玻璃、陶瓷、塑料、聚苯乙烯、聚丙烯、尼龍、聚丙烯酰胺、硝化纖維、硅和其他金屬、以及光纖。擴(kuò)增產(chǎn)物固定在二維結(jié)構(gòu)或三維結(jié)構(gòu)的基片上，其中二維或三維結(jié)構(gòu)包括針、棒、纖維、帶、細(xì)線、珠、顆粒、微量滴定孔、毛細(xì)管和圓柱體。
本發(fā)明的任一方法可以用于產(chǎn)生多核苷酸產(chǎn)物(一般是DNA或RNA)，其適于鑒定樣品中目的RNA序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒定目的RNA序列(例如檢測(存在與否)和/或定量)的方法，包括(a)通過此處所述的任一方法擴(kuò)增靶RNA；和(b)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。步驟(b)的分析擴(kuò)增產(chǎn)物可以利用本領(lǐng)域已知或此處描述的任一方法來進(jìn)行，例如通過檢測和/或定量與探針雜交的擴(kuò)增產(chǎn)物。這些擴(kuò)增產(chǎn)物可以標(biāo)記或未標(biāo)記。本發(fā)明的任一方法均可用于產(chǎn)生標(biāo)記的DNA或RNA產(chǎn)物，上述標(biāo)記的DNA或RNA產(chǎn)物通過在本方法中合適的步驟摻入標(biāo)記的核苷酸和/或標(biāo)記的復(fù)合引物而被標(biāo)記。這些標(biāo)記產(chǎn)物尤其適用于通過本領(lǐng)域已知的方法定量和/或鑒定，其包括使用陣列，比如cDNA陣列和寡核苷酸陣列。一方面，本發(fā)明提供了鑒定目的RNA序列的方法，包括(a)通過此處所述的方法擴(kuò)增靶RNA以產(chǎn)生標(biāo)記的DNA產(chǎn)物；和(b)分析標(biāo)記的DNA產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，分析DNA產(chǎn)物的步驟包括對上述產(chǎn)物的定量，由此確定樣品中存在的目的RNA序列的量。
另一方面，本發(fā)明提供了鑒定目的RNA的方法，包括(a)通過此處所述的方法擴(kuò)增靶RNA以產(chǎn)生標(biāo)記的RNA產(chǎn)物；和(b)分析標(biāo)記的RNA產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，分析RNA產(chǎn)物的步驟包括對上述產(chǎn)物的定量，由此確定樣品中存在的目的RNA序列的量。例如DNA或RNA產(chǎn)物可以通過接觸至少一種探針來分析。在一些實(shí)施方案中，至少一種探針以微陣列形式提供。微陣列可以包括固定在固體或半固體基片上的至少一種探針，上述基片可由選自以下材料紙、玻璃、陶瓷、塑料、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龍、聚丙烯酰胺、硝化纖維、硅和其他金屬、以及光纖。探針固定在二維結(jié)構(gòu)或三維結(jié)構(gòu)的基片上，其中二維或三維結(jié)構(gòu)包括針、棒、纖維、帶、細(xì)線、珠、顆粒、微量滴定孔、毛細(xì)管和圓柱體。
另一方面，本發(fā)明提供了確定樣品中基因表達(dá)譜的方法，所述方法包括(a)利用此處所述的任一方法擴(kuò)增樣品中至少一種目的RNA序列；和(b)確定每一目的RNA序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的量，其中每一所述量是樣品中每一目的RNA序列量的指示，由此樣品的基因表達(dá)譜被確定。
另一方面，本發(fā)明提供了制備文庫(包括cDNA和消減雜交文庫)的方法，上述方法包括利用此處所述的任一方法擴(kuò)增至少一種目的RNA序列以產(chǎn)生單鏈或雙鏈核酸產(chǎn)物。
另一方面，本發(fā)明提供了制備消減雜交探針的方法，所述方法包括利用此處所述的任一方法從第一RNA群體中產(chǎn)生與至少一種目的RNA序列互補(bǔ)的單鏈多核苷酸(優(yōu)選DNA)的多拷貝。
另一方面，本發(fā)明提供了進(jìn)行消減雜交的方法，所述方法包括(a)用此處所述的任一方法從第一RNA群體中產(chǎn)生與至少一種目的RNA序列互補(bǔ)的單鏈多核苷酸的多拷貝；和(b)將多拷貝與第二mRNA群體雜交，由此第二mRNA群體的亞群體與DNA拷貝的復(fù)合體。在一些實(shí)施方案中，方法還包括(c)應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割步驟(b)復(fù)合體上的RNA；和(d)擴(kuò)增第二mRNA群體雜交的未雜交亞群體(利用任何方法，包括此處所述的方法)，由此產(chǎn)生第二mRNA群體的未雜交亞群體的互補(bǔ)的單鏈DNA多拷貝。
另一方面，本發(fā)明提供了差異擴(kuò)增的方法，方法包括(a)利用此處所述的任一方法產(chǎn)生第一RNA群體的至少一種目的RNA序列的互補(bǔ)核酸序列(一般為DNA)的多拷貝；(b)將多拷貝與第二mRNA群體雜交，由此第二mRNA群體的亞群體形成了與DNA拷貝的復(fù)合體；(c)應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割步驟(b)中復(fù)合體上的RNA；和(d)利用任一方法包括此處所述的方法擴(kuò)增第二mRNA群體的未雜交亞群體，由此產(chǎn)生第二mRNA群體的未雜交亞群體的互補(bǔ)的單鏈DNA的多拷貝。
另一方面，本發(fā)明提供制備文庫的方法，所述方法包括如此處所述制備消減雜交探針或如此處所述進(jìn)行差異擴(kuò)增。
這些應(yīng)用的任何一項(xiàng)可以使用此處所述的擴(kuò)增方法(包括多種組分和任一組分的多種實(shí)施方案)。例如，使用的復(fù)合引物可以具有5’RNA部分，其可以和3’DNA部分毗鄰。
本發(fā)明也提供用于此處所述擴(kuò)增方法的組合物、試劑盒、復(fù)合體、反應(yīng)混合物和包含多種組分的體系(以及組分的多種組合)。一方面例如，本發(fā)明提供了包含復(fù)合引物和第二引物的組合物，其中復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分，其中第二引物為隨機(jī)引物。在一些實(shí)施方案中，這些組合物還包含RNA依賴的DNA聚合酶(其可以是反轉(zhuǎn)錄酶)。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含復(fù)合引物和第二引物的組合物，所述第二引物包含不可與復(fù)合引物延伸產(chǎn)物雜交(在引物的一個(gè)區(qū)域可以雜交的條件下)的序列(通常但并非必需的是使用這種引物產(chǎn)生前啟動(dòng)子多核苷酸可與之雜交的引物延伸產(chǎn)物)。在一些實(shí)施方案中，復(fù)合引物的5’RNA部分與它的3’DNA部分毗鄰。又在另外的實(shí)施方案中，復(fù)合引物的5’RNA部分為約5到約20個(gè)核苷酸且3’DNA部分為約5到約15個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，前啟動(dòng)子多核苷酸為前啟動(dòng)子模板寡核苷酸(PTO)。又在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了組合物，其包含(a)復(fù)合引物；(b)第二引物(其可以為隨機(jī)引物)；以及(c)前啟動(dòng)子多核苷酸(在一些實(shí)施方案中，其為PTO)。
另一方面，本發(fā)明提供包含此處所述任何一種復(fù)合體(其一般被認(rèn)為是相對于最終擴(kuò)增產(chǎn)物的中間產(chǎn)物)的組合物(也參見于這些不同復(fù)合體的例示性示意圖)。例如，本發(fā)明提供了包含以下復(fù)合體的組合物，上述復(fù)合體為(a)第一引物延伸鏈，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；和(b)靶RNA鏈。又在另一方面，本發(fā)明提供了包含復(fù)合體的組合物，上述復(fù)合體為(a)第一引物延伸產(chǎn)物，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；和(b)第二引物(或片段)延伸產(chǎn)物。又在另一方面，本發(fā)明提供了包含(a)切割的引物延伸產(chǎn)物，其中引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；和(b)第二引物(或片段)延伸產(chǎn)物；以及(c)復(fù)合引物的復(fù)合體。
另一方面，本發(fā)明包括任何一種或多種產(chǎn)物(包括中間產(chǎn)物)和包含產(chǎn)物(包括中間產(chǎn)物)的組合物，上述產(chǎn)物和組合物由本發(fā)明方法的任何一方面產(chǎn)生。產(chǎn)物包括文庫和產(chǎn)生的任何其他群體，其一般基于此處所述方法中所用引物的特性。
另一方面，本發(fā)明提供了反應(yīng)混合物(或包含反應(yīng)混合物的組合物)，其包含此處所述組分的多種組合。例如，本發(fā)明提供了這樣的反應(yīng)混合物，其包括(a)靶RNA；(b)包含3’DNA部分和RNA部分的復(fù)合引物；(c)第二引物；和(d)DNA聚合酶。正如此處所述，任何復(fù)合引物可以存在于反應(yīng)混合物中(或多種復(fù)合引物)，包括含有與3’DNA部分毗鄰的5’RNA部分的復(fù)合引物。反應(yīng)混合物也可還包含從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶，比如RNaseH。本發(fā)明的反應(yīng)混合物也可包括前啟動(dòng)子多核苷酸(在一些實(shí)施方案中，其為PTO)，和/或RNA聚合酶。本發(fā)明反應(yīng)混合物也可包括(a)置換的引物延伸產(chǎn)物(其含有與復(fù)合引物3’DNA部分互補(bǔ)的5’末端序列，而不含有與復(fù)合引物RNA部分互補(bǔ)的序列)；(b)前啟動(dòng)子多核苷酸(比如PTO)；和(c)RNA聚合酶。
另一方面，本發(fā)明提供進(jìn)行此處所述方法的試劑盒。這些試劑盒包含用于擴(kuò)增方法的一個(gè)或多個(gè)的組分，所述試劑盒以合適的包裝和通常(但并非必需)包含適當(dāng)?shù)恼f明書。例如，本發(fā)明提供了包含復(fù)合引物和第二引物的試劑盒(其可以單獨(dú)包裝或不單獨(dú)包裝)，所述復(fù)合引物包含3’DNA部分和RNA部分(其可以在5’端并還可以與3’DNA部分毗鄰)。在一些實(shí)施方案中，這些試劑盒還包含利用引物來擴(kuò)增RNA的說明書。試劑盒中的復(fù)合引物可以是此處所述的任何一種。試劑盒可以包含更多的組分，比如任意下述(a)前啟動(dòng)子多核苷酸(比如PTO)；和(b)此處所述的任一種酶，比如從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶(例如RNaseH)、DNA聚合酶(RNA依賴的或DNA依賴的)和RNA聚合酶。任何這些試劑盒還可以包含使用組分?jǐn)U增RNA的說明書。
另一方面，本發(fā)明提供了實(shí)現(xiàn)此處所述擴(kuò)增方法的體系。例如，本發(fā)明提供了擴(kuò)增靶RNA的體系，包含(a)含有3’DNA部分和RNA部分的復(fù)合引物；(b)第二引物；(c)RNA依賴的DNA聚合酶；(d)DNA依賴的DNA聚合酶；和(e)一種從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶(比如RNaseH)。復(fù)合引物可以是任一(一種或多種)此處所述的復(fù)合引物，包括含有與3’DNA毗鄰的5’RNA部分的復(fù)合引物。體系還可以包含前啟動(dòng)子多核苷酸(比如PTO)和/或RNA聚合酶。正如此處所述，本發(fā)明的體系一般包含一種或多種適于實(shí)施本發(fā)明方法的設(shè)備。
圖2A-C顯示增強(qiáng)的線性等溫RNA擴(kuò)增過程的圖解，上述擴(kuò)增過程使用復(fù)合引物、第二引物、鏈置換和轉(zhuǎn)錄來產(chǎn)生多拷貝靶RNA。
圖3A-B顯示線性等溫RNA擴(kuò)增過程的圖解，上述擴(kuò)增過程使用單復(fù)合引物和鏈置換來產(chǎn)生包含與靶RNA互補(bǔ)的序列的多拷貝單鏈DNA產(chǎn)物。
圖4A-B顯示增強(qiáng)的線性等溫RNA擴(kuò)增過程的圖解，上述擴(kuò)增過程使用單復(fù)合引物、鏈置換和轉(zhuǎn)錄來產(chǎn)生多拷貝靶RNA。
圖5顯示線性等溫RNA擴(kuò)增過程的圖解，上述擴(kuò)增過程使用含有多聚序列的單復(fù)合引物和鏈置換來產(chǎn)生包含與靶RNA互補(bǔ)的序列的多拷貝單鏈DNA產(chǎn)物。
圖6顯示線性等溫RNA擴(kuò)增過程的圖解，上述擴(kuò)增過程使用含有隨機(jī)序列的單復(fù)合引物和鏈置換來產(chǎn)生包含與靶RNA互補(bǔ)的序列的多拷貝單鏈DNA產(chǎn)物。
圖7顯示增強(qiáng)的等溫RNA擴(kuò)增過程的圖解，上述擴(kuò)增過程使用單復(fù)合引物和轉(zhuǎn)錄來產(chǎn)生包含與靶RNA互補(bǔ)的序列的多拷貝單鏈RNA產(chǎn)物。
圖8A-E顯示線性等溫RNA擴(kuò)增過程的圖解，上述擴(kuò)增過程使用兩個(gè)復(fù)合引物和鏈置換來產(chǎn)生包含與靶RNA互補(bǔ)的序列以及與靶RNA相同序列的多拷貝單鏈DNA產(chǎn)物。
圖9顯示凝膠照片，其顯示擴(kuò)增自在第二鏈cDNA上包含特定附加序列的雙鏈cDNA(其利用線性等溫RNA擴(kuò)增制備)的PCR產(chǎn)物。


圖10顯示利用實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)定量利用線性等溫RNA擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物的結(jié)果圖。
本發(fā)明的實(shí)施模式本發(fā)明及其優(yōu)勢概述本發(fā)明公開了擴(kuò)增RNA序列的新方法、組合物和試劑盒。本方法提供單個(gè)RNA樣本或RNA樣本庫的等溫?cái)U(kuò)增。提供了一些方法用于產(chǎn)生包含與目的RNA互補(bǔ)的序列的多拷貝DNA。另一些方法提供了用于產(chǎn)生目的RNA序列多拷貝。這些方法適用于例如產(chǎn)生cDNA文庫和消減雜交探針。它們產(chǎn)生單鏈DNA或RNA產(chǎn)物，上述產(chǎn)物易用于多種用途，包括表達(dá)譜(例如通過使用微陣列技術(shù)的多元分析)以及建立在電泳上的技術(shù)比如差異顯示。本方法可以自動(dòng)化并且不需要熱循環(huán)。
本發(fā)明的方法涉及一個(gè)或更多RNA樣本的擴(kuò)增，如RNA序列庫，并且本發(fā)明方法尤其適用于對生物樣本中總RNA的制備物中所有RNA(比如mRNA)序列的擴(kuò)增。因此，本發(fā)明方法的主要優(yōu)點(diǎn)之一是擴(kuò)增全部序列庫的能力，這種能力對分析細(xì)胞(如目的生物樣本中的細(xì)胞)的基因表達(dá)譜極其重要。本發(fā)明方法也用于擴(kuò)增特異目的RNA序列或多個(gè)RNA(例如相關(guān)RNA家族的成員)。本方法也適用于擴(kuò)增樣品中大量，且最優(yōu)選地所有RNA(比如mRNA)序列。
由于許多mRNA具有特有的多聚A3’末端，對制備cDNA文庫和其后為確定基因表達(dá)譜的序列分析或其它應(yīng)用而言，擴(kuò)增一般是從mRNA的3’末端序列起始。本發(fā)明方法同樣適用于mRNA3’部分?jǐn)U增的文庫的制備。本發(fā)明方法中使用的復(fù)合引物可以通過使用隨機(jī)引物設(shè)計(jì)其可與多種或全部種類的mRNA雜交(按照本領(lǐng)域已知方法)。另外，如果欲擴(kuò)增選擇的RNA或相關(guān)RNA，復(fù)合引物可以包含與選擇的RNA或相關(guān)的RNA雜交的序列。
本方法通常包括使用特異設(shè)計(jì)的引物(通常一種或多種RNA/DNA復(fù)合引物)來產(chǎn)生第一和第二鏈cDNA復(fù)合體，其包含具有特別性質(zhì)(例如可被酶切割)的部分。應(yīng)當(dāng)理解，于此所用的cDNA是指多核苷酸引物延伸產(chǎn)物。通常，復(fù)合體在雙鏈cDNA復(fù)合體的末端包含RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體。雙鏈cDNA復(fù)合體末端的RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體可以包含特定末端序列，其通常通過復(fù)合引物RNA部分引入。本發(fā)明方法的復(fù)合引物包含通常設(shè)計(jì)用來與靶RNA雜交的3’DNA部分。復(fù)合引物的剩余部分(如5’RNA部分)通常但并非必需包含不與靶RNA雜交的序列(當(dāng)引物結(jié)合到靶RNA上時(shí)，其構(gòu)成尾部)。因此，正如于此所闡明，談到與序列(或雜交模板)雜交的引物包含其中引物的至少一部分雜交的實(shí)施方案以及整個(gè)引物雜交的實(shí)施方案。
雙鏈cDNA復(fù)合體作為如下所述的線性擴(kuò)增的底物從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶(如RNaseH)切割雜合體上的RNA，使第二鏈cDNA的3’DNA序列可被復(fù)合引物結(jié)合，其中所述復(fù)合引物可與第一復(fù)合引物相同或不相同。利用DNA聚合酶延伸結(jié)合的復(fù)合引物產(chǎn)生引物延伸產(chǎn)物，其置換以前結(jié)合的被切割的第一引物延伸產(chǎn)物，由此單鏈DNA產(chǎn)物積聚。單鏈DNA產(chǎn)物為靶RNA的互補(bǔ)鏈的拷貝(或反義DNA)。這種線性擴(kuò)增稱為“SPIA”(Single Primer Linear Amplification，單引物線性擴(kuò)增)，且見Kurn等人在美國專利號6,251,639B1中描述。
一方面，本發(fā)明按如下所述進(jìn)行復(fù)合RNA/DNA引物形成了模板RNA復(fù)制的基礎(chǔ)。復(fù)合引物(于此也稱為第一引物)與包含目的RNA序列的模板RNA雜交，且通過利用RNA依賴的DNA聚合酶延伸復(fù)合引物以形成第一引物延伸產(chǎn)物(可互換稱為“復(fù)合引物延伸產(chǎn)物”或“第一鏈cDNA”)。經(jīng)過模板RNA的切割，第二引物延伸產(chǎn)物(可互換稱為“第二鏈cDNA”)以與第一引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體的形式形成(如下所述)。由于第一引物延伸產(chǎn)物中存在復(fù)合引物，第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體在其一端由RNA/DNA雜合體組成。應(yīng)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的試劑如酶(如RNaseH)切割雜合體上的RNA序列，使第二引物延伸產(chǎn)物可與另一復(fù)合引物結(jié)合，上述復(fù)合引物可與第一復(fù)合引物相同或不相同。利用DNA聚合酶產(chǎn)生另一第一(復(fù)合)引物延伸產(chǎn)物，其置換以前結(jié)合的被切割的第一引物延伸產(chǎn)物，由此產(chǎn)生置換的切割第一引物延伸產(chǎn)物。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，第二引物延伸產(chǎn)物的形成如下所述RNA模板切割后，將第二引物與第一引物延伸產(chǎn)物雜交并且延伸形成第二引物延伸產(chǎn)物，其與第一引物延伸產(chǎn)物形成復(fù)合體。由于第一引物延伸產(chǎn)物中存在復(fù)合引物，第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體在其一端由RNA/DNA雜合體組成。第二引物為可與第一DNA鏈雜交的任何序列，因此其可通過利用DNA聚合酶沿第一引物延伸產(chǎn)物延伸形成第二引物延伸產(chǎn)物。因此，在一些實(shí)施方案中，第二引物為可以包含或不包含隨機(jī)序列的寡核苷酸(即設(shè)計(jì)用來與樣品中一種或多種序列雜交(在一組給定的條件下)的序列)。在另外的實(shí)施方案中，它包含第一DNA鏈的序列(一般在3’端)，上述序列可以與第一DNA鏈中的序列雜交(例如發(fā)卡或自身退火結(jié)構(gòu))。
在本擴(kuò)增方法的另一方面，靶RNA的一個(gè)或多個(gè)片段作為第二引物延伸產(chǎn)物的引物。包含靶RNA和第一引物延伸產(chǎn)物的起始復(fù)合體中的靶RNA被一種試劑(比如RNaseH)切割，以使模板RNA的至少一個(gè)片段仍與第一引物延伸產(chǎn)物雜交。在本發(fā)明的這一方面，一個(gè)(或多個(gè))模板RNA片段以上述方式作為第二“引物”以產(chǎn)生片段延伸產(chǎn)物，上述片段延伸產(chǎn)物具有上文所述擴(kuò)增方法中第二延伸產(chǎn)物相同的功能。本發(fā)明方法中合適RNA片段的長度足以使其不至于從第一鏈cDNA上解離，優(yōu)選地從約3到約30，更優(yōu)選地從約5到約25，甚至更優(yōu)選地從約10到約20，并且最優(yōu)選地從約12到約17個(gè)核苷酸長度。
在涉及轉(zhuǎn)錄(于此稱為“增強(qiáng)的”方法)的實(shí)施方案中，第二引物還可以包含一段序列，以使置換的第一引物延伸產(chǎn)物(而不是最先的復(fù)合引物延伸產(chǎn)物)含有包含前啟動(dòng)子的多核苷酸(于此也稱為“前啟動(dòng)子多核苷酸”)可與之雜交的序列。前啟動(dòng)子多核苷酸與置換的引物延伸產(chǎn)物雜交，并延伸置換的第一引物延伸產(chǎn)物的3’末端(如果有突出端的話)，這樣產(chǎn)生雙鏈的啟動(dòng)子區(qū)域，其推動(dòng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生正義RNA產(chǎn)物。這種“增強(qiáng)的”方法在Kurn等人美國專利號6,251,639B1中描述。
因此，本發(fā)明提供了產(chǎn)生至少一個(gè)拷貝的與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列的方法，其包括如下所述組分的組合和反應(yīng)(a)包含目的RNA序列的靶RNA；(b)包含RNA部分和3’DNA部分的第一(復(fù)合)引物；(c)可與復(fù)合引物延伸產(chǎn)物雜交的第二引物；(d)RNA依賴的DNA聚合酶；(e)DNA依賴的DNA聚合酶；(f)從RNA/DNA雜合體上切割RNA的試劑(比如酶)；以及(g)脫氧核糖核苷三磷酸或合適的類似物(其可被標(biāo)記或未被標(biāo)記)。在包括轉(zhuǎn)錄的實(shí)施方案(即增強(qiáng)的方法)中，擴(kuò)增反應(yīng)中還包括如下所述組分(與以上列出的組分同時(shí)加入或單獨(dú)加入)(h)包含前啟動(dòng)子和可與第一引物延伸產(chǎn)物(置換的引物延伸產(chǎn)物)雜交的區(qū)域的前啟動(dòng)子多核苷酸；(i)RNA聚合酶；以及(j)核糖核苷三磷酸或合適的類似物(其可被標(biāo)記或未被標(biāo)記)。此組合物在合適的條件下進(jìn)行引物雜交、引物延伸、RNA切割、以及當(dāng)?shù)谝灰镅由飚a(chǎn)物上的RNA被切割且另一第一引物結(jié)合到切割的RNA空出的位點(diǎn)時(shí)第一引物延伸產(chǎn)物的置換。在包括轉(zhuǎn)錄的實(shí)施方案中，使用的條件也適合前啟動(dòng)子多核苷酸與置換的切割過的第一引物延伸產(chǎn)物雜交、延伸切割過的第一引物延伸產(chǎn)物3’末端(如果需要的話)，以形成雙鏈啟動(dòng)子區(qū)域，以及啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的RNA轉(zhuǎn)錄。正如此處描述和舉例闡述的，上述反應(yīng)混合物可進(jìn)一步分成兩個(gè)或更多的反應(yīng)混合物，用于與擴(kuò)增過程的不同方面相對應(yīng)的單獨(dú)的通常為順次的孵育過程(參見如實(shí)施例1)。
在擴(kuò)增方法的另一方面，靶RNA片段作為第二DNA鏈合成的引物。在包含靶RNA和復(fù)合引物延伸產(chǎn)物的起始復(fù)合體中的靶RNA被一種酶(比如RNaseH)切割，以使模板RNA的至少一個(gè)片段仍保持與復(fù)合引物延伸產(chǎn)物雜交。在本發(fā)明的這一方面，一個(gè)(或多個(gè))模板RNA片段以上述方式作為第二“引物”，以產(chǎn)生片段延伸產(chǎn)物，上述片段延伸產(chǎn)物具有上文所述擴(kuò)增方法中第二延伸產(chǎn)物相同的功能。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生至少一個(gè)拷貝的與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列的方法，所述方法包括組合和反應(yīng)如下組分(a)第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體；(b)包含RNA部分和3’DNA部分的第一(復(fù)合)引物；(c)DNA依賴的DNA聚合酶；(d)從RNA/DNA條合體上切割RNA的試劑(如酶)；以及(e)脫氧核糖核苷三磷酸或合適的類似物(其可被標(biāo)記或未被標(biāo)記)。在包括轉(zhuǎn)錄的實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)中還包括如下組分(與以上列出組分同時(shí)加入或單獨(dú)加入)(f)包含前啟動(dòng)子和與第一引物延伸產(chǎn)物(置換的引物延伸產(chǎn)物)雜交的區(qū)域的前啟動(dòng)子多核苷酸；(g)RNA聚合酶；以及(h)核糖核苷三磷酸或合適的類似物(其可被標(biāo)記或未被標(biāo)記)。此組合物在合適的條件下對引物雜交、引物延伸、RNA切割、以及當(dāng)?shù)谝灰镅由飚a(chǎn)物上的RNA被切割且另一第一引物結(jié)合到切割的RNA空出的位點(diǎn)時(shí)第一引物延伸產(chǎn)物的置換。在包括轉(zhuǎn)錄的實(shí)施方案中，使用的條件也適合前啟動(dòng)子多核苷酸與置換的第一引物延伸產(chǎn)物雜交、延伸切割過的第一引物延伸產(chǎn)物3’末端(如果需要的話)以形成雙鏈啟動(dòng)子區(qū)域、以及啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的RNA轉(zhuǎn)錄。
另一方面，本發(fā)明提供了利用第一復(fù)合引物、第二復(fù)合引物(稱為“反向復(fù)合”引物)和靶RNA片段產(chǎn)生目的RNA序列的單鏈反義和正義DNA拷貝的方法。方法涉及(a)雙鏈cDNA的形成，所述雙鏈cDNA在雙鏈cDNA的每一末端包含RNA-DNA異質(zhì)雙鏈體；和(b)第一鏈(正義)和第二鏈(反義)cDNA的線性擴(kuò)增，上述線性擴(kuò)增通過延伸兩個(gè)復(fù)合引物和鏈置換進(jìn)行。由此產(chǎn)生單鏈第一和第二鏈cDNA產(chǎn)物。這種產(chǎn)物在例如產(chǎn)生cDNA文庫上有用。在本發(fā)明的這一方面，顯而易見第二引物延伸產(chǎn)物由復(fù)合引物起始。
本發(fā)明方法包括使用擴(kuò)增產(chǎn)物的方法(稱為“應(yīng)用”)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了RNA序列測序的方法。當(dāng)測序方法基于此處描述的其中擴(kuò)增產(chǎn)物為DNA的方法時(shí)，使用了適當(dāng)?shù)膁NTP或其類似物(可被標(biāo)記或未被標(biāo)記)。當(dāng)測序方法基于此處描述的其中擴(kuò)增產(chǎn)物為RNA的方法時(shí)，使用適當(dāng)?shù)膔NTP或其類似物(可以標(biāo)記或未標(biāo)記)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了測定核酸序列突變的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物用于測定和/或鑒定靶多核苷酸中的單鏈構(gòu)象多態(tài)性。
本發(fā)明提供鑒定(例如檢測存在與否和/或定量)目的RNA的方法，所述方法系指通過利用本發(fā)明擴(kuò)增方法產(chǎn)生DNA或RNA產(chǎn)物并通過利用檢測/定量方法來分析產(chǎn)物，其中所述檢測/定量方法如基于陣列的技術(shù)或液相技術(shù)。這些擴(kuò)增產(chǎn)物可以標(biāo)記或未標(biāo)記。
又在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了固定核酸的方法，包括利用本發(fā)明擴(kuò)增方法的擴(kuò)增產(chǎn)物來產(chǎn)生核酸(DNA或RNA)微陣列的方法。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生cDNA文庫、消減雜交探針和消減雜交文庫的方法。
近年來已研發(fā)了檢測和定量基因表達(dá)水平的多種方法。例如微陣列使給定樣品中多基因表達(dá)的檢測和/或定量成為可能，以上所述的微陣列是在如固體或半固體基片上的分立位點(diǎn)處固定特定的cDNA或寡核苷酸。
利用這些以前已知的方法來檢測樣品多種mRNA存在與否和/或定量，其接下來用作基因表達(dá)譜的定量，它一般要求cDNA的直接標(biāo)記，這需要大量的總RNA的輸入，這部分是因?yàn)閙RNA僅僅代表總RNA庫的一小部分。因此，當(dāng)使用來自一個(gè)給定的細(xì)胞或組織樣品中的總RNA制備物時(shí)，利用比如陣列的方法分析樣品中的基因表達(dá)就需要相當(dāng)大量的輸入RNA，其一般從50到200μg。相似地，利用陣列技術(shù)進(jìn)行基因表達(dá)譜的單次分析一般需要2到5μg純化自總RNA制備物的mRNA。這是比如那些基于陣列的方法的明顯局限，因?yàn)樾枰募?xì)胞數(shù)或組織樣品的大小非常大，并且這些細(xì)胞或組織樣品對試驗(yàn)而言經(jīng)常很難得到或它們太寶貴。這種局限在臨床樣品的研究和效應(yīng)分子文庫的高通量篩選上尤其嚴(yán)重，上述臨床樣品的研究中被研究的細(xì)胞稀少并且/或者在體外很難培養(yǎng)。而且，以前基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增mRNA的方法為DNA依賴的RNA聚合酶的擴(kuò)增效率所限制(所述方法描述在例如Lockhart等人，自然生物技術(shù)(NatureBiotechnology)(1996)，14,1675-1680；van Gelder等人，美國專利號5,716,785)，并且一些這類方法需要多個(gè)步驟。而且，聚合酶啟動(dòng)子序列摻入的過程易于產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。
本發(fā)明方法在提供靶擴(kuò)增的高特異性的條件下提供有效擴(kuò)增mRNA的能力，上述擴(kuò)增的mRNA一般反映其在輸入RNA中的分布。因此，一些可以利用本發(fā)明擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測/定量方法的使用得到很大的增強(qiáng)，上述方法如那些基于有力的陣列技術(shù)、實(shí)時(shí)PCR、定量TaqMan、利用分子信號定量PCR等的方法。
本發(fā)明擴(kuò)增方法的線性特征極大地增加了靶擴(kuò)增的特異性。由于產(chǎn)生目的序列的多拷貝既不依賴于也不基于擴(kuò)增產(chǎn)物的循環(huán)、指數(shù)擴(kuò)增，因此極大地增強(qiáng)了所得產(chǎn)物的特異性。多種擴(kuò)增產(chǎn)物的分布通常反映其在輸入RNA中的分布。
盡管不同的步驟可以在不同的溫度下進(jìn)行，但本發(fā)明方法不需要熱循環(huán)，并且所有步驟可以等溫進(jìn)行。該性質(zhì)提供很多的優(yōu)勢，包括利于自動(dòng)化和適應(yīng)高通量方法。等溫反應(yīng)要較熱循環(huán)快，并且使本發(fā)明方法適于在小型的設(shè)備進(jìn)行。
包含RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體的中間雙鏈cDNA復(fù)合體提供了線性擴(kuò)增的底物。RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體中RNA部分的切割允許在不需要雙鏈cDNA中間復(fù)合體變性條件下進(jìn)一步的擴(kuò)增。而且，由于切割的雙鏈cDNA復(fù)合體主要還是雙鏈，單鏈模板的二級結(jié)構(gòu)更不太可能影響隨后的擴(kuò)增。
最后，大多數(shù)的本發(fā)明方法產(chǎn)生單鏈產(chǎn)物，因此使得它們更容易結(jié)合以均一方式(即在溶液中)的探針或結(jié)合固定于固體支持物上的探針。本發(fā)明方法的雙鏈產(chǎn)物在例如產(chǎn)生cDNA文庫中有用。
在提供靶擴(kuò)增的高特異性的條件下有效擴(kuò)增mRNA(或任何其它目的RNA種類或群體)并且上述有效擴(kuò)增一般不會(huì)改變在制備物中多種mRNA的表現(xiàn)的能力會(huì)極大地增強(qiáng)使用例如那些基于有力的陣列技術(shù)的檢測/定量方法。一般技術(shù)除非另外指明，本發(fā)明的實(shí)施采用了常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)，上述技術(shù)均包括在本領(lǐng)域的技術(shù)范疇內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中詳細(xì)闡明，所述文獻(xiàn)如“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊”，第二版(Sambrook等人，1989)；“寡核苷酸合成”(M.J.Gait編輯，1984)；“動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)”(R.I.Freshney編輯，1987)；“酶學(xué)方法”(學(xué)院出版社)；“分子生物學(xué)最新方法”(F.M.Ausubel等人編輯(1987)及其更新期刊)；“PCR聚合酶鏈反應(yīng)”(Mullis等人編輯，1994)。
本發(fā)明使用的引物、寡核苷酸和多核苷酸利用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生。定義此處所用的“靶序列”、“靶核酸”或“靶RNA”是指包含目的序列的多核苷酸，其為需要擴(kuò)增的多核苷酸。至于其實(shí)際序列可以是已知或未知。在一些實(shí)施例中，術(shù)語“靶”、“模板”及其變化的說法可以交換使用。
此處所用的“擴(kuò)增反應(yīng)”或“擴(kuò)增”通常是指產(chǎn)生多拷貝目的序列的過程。“多拷貝”指至少2個(gè)拷貝?！翱截悺辈⒉槐仨毰c模板序列完全互補(bǔ)或相同。例如，拷貝可以包含核苷類似物(如脫氧肌苷)、特意進(jìn)行的序列改變(例如通過由包含可雜交但并非與模板互補(bǔ)的序列的引物引入的序列改變)，和/或擴(kuò)增過程中發(fā)生的序列錯(cuò)誤?！皵U(kuò)增”一段序列通常指制備一段序列或其互補(bǔ)鏈的拷貝，正如上述，所謂拷貝并不必須與模板序列完全互補(bǔ)或相同。
“多核苷酸”或“核酸”此處可互用，系指任何長度的核苷酸聚合物，且包括DNA和RNA。核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或堿基和/或它們的類似物，或可由DNA或RNA聚合酶摻入聚合物的任一底物。多核苷酸可包含修飾的核苷酸，如甲基化核苷酸及它們的類似物。如果存在修飾的話，對核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可在多聚體裝配之前或之后進(jìn)行。核苷酸的序列可由非核苷酸組分打斷。多核苷酸可在聚合后進(jìn)一步修飾，例如與標(biāo)記組分連接。其它類型的修飾包括如“加帽”、將一種或多種天然存在的核苷酸置換為其類似物、核苷酸間修飾，例如那些帶有無電荷鍵(如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)的多核苷酸和那些帶電荷鍵(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的多核苷酸，那些包含懸掛部分的多核苷酸，其中所述懸掛部分如蛋白質(zhì)(如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨酸等)，那些帶有嵌入劑(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的多核苷酸，那些包含螯合劑(如金屬、放射活性金屬、硼、氧化金屬等)的多核苷酸，那些包含烷化劑的多核苷酸，那些具已改變鍵的多核苷酸(如α-端基異構(gòu)核酸等)，以及多核苷酸的未改變形式。此外，任何通常存在于糖中的羥基可被膦酸基、磷酸基置換，可用標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，或可被活化以制備與其它核苷酸連接的其它鍵，或可被連接至固相載體。5′和3′末端的OH可被磷酸化或用胺或1-20個(gè)碳原子的有機(jī)加帽基團(tuán)取代。其它羥基也可被衍生為標(biāo)準(zhǔn)的保護(hù)基團(tuán)。多核苷酸也可包含通常在領(lǐng)域內(nèi)已知的核糖或脫氧核糖的類似物形式，包括如2′--O-甲基-、2′-O-烯丙基、2′-氟-或2′-疊氮基-核糖、碳環(huán)形糖類似物、α-端基異構(gòu)糖、差向異構(gòu)糖(如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環(huán)類似物和無堿基核苷類似物(如甲基核苷)。一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯鍵可由其它連接基取代。這些其它連接基包括但不限于以下實(shí)施方案，在實(shí)施方案中磷酸酯被P(O)S(“硫酯”)、P(S)S(“二硫酯”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“formacetal”)取代，其中每一R或R′獨(dú)立地為H或者為取代或未取代烷基(1-20C)，取代或未取代烷基任選地包含醚(-O-)鍵、芳基、鏈烯基、環(huán)烷基、環(huán)鏈烯基或芳烷基。多核苷酸中并非所有的鍵都需要相同。前面的描述適用于所有此處提及的多核苷酸，包括RNA和DNA。
此處所用的“標(biāo)記的dNTP”或“標(biāo)記的rNTP”分別是指直接或間接與標(biāo)記相連的dNTP或rNTP，或它們的類似物。例如，標(biāo)記的dNTP或rNTP可為直接用如染料和/或可檢測部分標(biāo)記的dNTP或rNTP，其中所述可檢測部分如特異結(jié)合對(如生物素-親合素)。標(biāo)記的dNTP或rNTP也可以通過將其結(jié)合到如標(biāo)記可結(jié)合的部分而進(jìn)行間接標(biāo)記。dNTP或rNTP可以包含這樣一個(gè)部分(例如氨基)，其可以在dNTP或rNTP摻入延伸產(chǎn)物后該部分結(jié)合標(biāo)記。本發(fā)明中有用的標(biāo)記包括熒光染料(如異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅、羅丹明、綠色熒光蛋白等)、放射性同位素(如3H、35S、32P、33P、125I或14C)、酶(如LacZ、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶)、地高辛配基和顯色標(biāo)記如膠體金或有色玻璃或塑料(聚苯乙烯，聚丙烯，乳膠)珠?？蓱?yīng)用多種抗配基與配基(標(biāo)記標(biāo)記本身或用作結(jié)合標(biāo)記的物質(zhì))。當(dāng)配基具有天然抗配基(例如生物素、甲狀腺素和氫化可的松)時(shí)，該配基可用于連接標(biāo)記的抗配基。
此處所用的dNTP或rNTP的“類型”是指核苷中的特定堿基，即腺嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，尿嘧啶或?yàn)踵堰省?br> 此處所用的“寡核苷酸”通常指短的、通常為單鏈、通常為合成的多核苷酸，其長度通常但并非必需少于約200個(gè)核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸包括復(fù)合引物和前啟動(dòng)子多核苷酸(如PTO)。術(shù)語“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不相互排斥。以上所述關(guān)于多核苷酸的描述同樣完全適用于寡核苷酸。
“引物”通常是指帶有游離3′-OH基團(tuán)的核苷酸序列，其可與模板序列(如靶RNA或引物延伸產(chǎn)物)雜交，且可啟動(dòng)與模板互補(bǔ)的多核苷酸的聚合?！耙铩笨蔀槿缫欢喂押塑账帷Ｋ部蔀槿缗c模板自身序列雜交(例如作為發(fā)卡環(huán))的一段模板序列(如引物延伸產(chǎn)物或在模板-DNA復(fù)合體被RNase切割后產(chǎn)生的模板片段)，且可啟動(dòng)核苷酸的聚合。因此引物可以是外源(如加入)引物或內(nèi)源(如模板片段)引物。
此處所用的“隨機(jī)引物”是指引物包含的序列并非基于特定或具體的模板序列而設(shè)計(jì)，而是基于可與模板中的一段或多段序列雜交(在特定條件下)的統(tǒng)計(jì)學(xué)預(yù)期序列(隨機(jī)引物的序列)。隨機(jī)引物的序列(或其互補(bǔ)序列)可為或不為天然存在的序列，或存在于目的樣本的序列池中。在單一反應(yīng)混合物中擴(kuò)增多種RNA樣本，通常需利用隨機(jī)引物的多重性(優(yōu)選地為大的多重性)。如本領(lǐng)域已經(jīng)熟知，“隨機(jī)引物”也可指設(shè)計(jì)為與所需和/或大量的靶序列雜交的引物群(大量的隨機(jī)引物)中的一員。隨機(jī)引物可在核酸序列的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行雜交。隨機(jī)引物的使用提供了不需預(yù)先了解靶的確切序列而通過聚合酶產(chǎn)生與靶核苷酸互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的方法。
此處應(yīng)用的“原啟動(dòng)子序列”和“前啟動(dòng)子序列”是指單鏈DNA序列區(qū)域，其雙鏈形式可介導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄。在一些情況下，“原啟動(dòng)子序列”、“原啟動(dòng)子”、“前啟動(dòng)子序列”、“前啟動(dòng)子”、“啟動(dòng)子序列”和“啟動(dòng)子”可以互用。
此處所用的“前啟動(dòng)子多核苷酸”是指包含前啟動(dòng)子序列的多核苷酸。前啟動(dòng)子多核苷酸的實(shí)例有前啟動(dòng)子模板寡核苷酸(PTO)。
此處所用的“前啟動(dòng)子模板寡核苷酸”(PTO)和“啟動(dòng)子模板寡核苷酸”(PTO)是指包含前啟動(dòng)子序列和可與引物延伸產(chǎn)物的3’區(qū)域雜交(在給定的條件下)部分(通常為3’區(qū)域)的寡核苷酸。前啟動(dòng)子序列與可雜交的部分可以相同、不同或重疊核苷酸。
“抑制”是指與參考相比活性、功能和/或量的降低或減少。
“復(fù)合體”是組分的裝配。復(fù)合體可穩(wěn)定或不穩(wěn)定，且可被直接或間接檢測到。例如，如此處所述，如果給定反應(yīng)的組分以及反應(yīng)產(chǎn)物的類型，可推知復(fù)合體的存在。對本發(fā)明而言，復(fù)合體相對于最終擴(kuò)增產(chǎn)物而言通常為一個(gè)中間產(chǎn)物。復(fù)合體的一個(gè)實(shí)例是包含第一引物延伸產(chǎn)物和第二引物延伸產(chǎn)物的核酸雙鏈體。
于此可互換使用的多核苷酸或寡核苷酸的“部分”或“區(qū)域”為2個(gè)或更多堿基的相鄰序列。在另它實(shí)施方案中，區(qū)域和部分至少為約3、5、10、15、20、25個(gè)相鄰核苷酸中的任一種。
與另一序列“相鄰的”區(qū)域、部分或序列直接毗鄰該另一區(qū)域、部分或序列。例如，與復(fù)合引物的的5’DNA部分相鄰的RNA部分直接與5’DNA區(qū)域毗鄰。此實(shí)例的闡述見圖1A和2A。
反應(yīng)混合物是指組分的集合，所述組分在合適的條件下反應(yīng)并形成復(fù)合體(可為中間體)和/或產(chǎn)物。
“A”、“an”和“the”等除非特別指出均表明包括復(fù)數(shù)形式。
“包含”指包括。
“允許”事件發(fā)生的條件或“適于”事件發(fā)生的條件(如雜交、鏈延伸等)或“合適的”條件為不阻止此類事件發(fā)生的條件。因此，這些條件允許、增強(qiáng)、促進(jìn)和/或有利于事件的發(fā)生。本領(lǐng)域內(nèi)并在此描述的這些條件取決于諸如核苷酸序列的性質(zhì)、溫度和緩沖液。這些條件也取決于所需進(jìn)行的事件如雜交、切割、鏈延伸或轉(zhuǎn)錄。
此處使用的序列“突變”是指目的序列中與參考序列相比的任何序列改變。參考序列可為野生型序列或希望與目的序列進(jìn)行對比的序列。序列突變包括由于置換、缺失或插入機(jī)制引起的序列中單核苷酸改變或多于一個(gè)核苷酸的變化。單核苷酸多態(tài)性(SNP)也為此處描述的序列突變。
此處所用的“單鏈構(gòu)象多態(tài)性”和“SSCP”通常指單鏈核酸受其特定核酸序列影響的特定構(gòu)象，單鏈多核苷酸序列的改變?nèi)鐔魏塑账岬闹脫Q、缺失或插入導(dǎo)致單鏈多核苷酸構(gòu)象的改變或多態(tài)性。多核苷酸的構(gòu)象通常可用本領(lǐng)域已知的方法(如通過凝膠電泳、毛細(xì)管電泳測定電泳遷移率和/或?qū)怂醿?nèi)切酶消化的易感性)進(jìn)行檢測、鑒定和/或區(qū)別。
此處可互用的“微陣列”和“陣列”包括帶有生化樣本(靶，通常具有未確定的特性)推斷的結(jié)合(如通過雜交)位點(diǎn)的陣列(優(yōu)選地為規(guī)則陣列)的表面。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，微陣列指固定在基片特定部位的不同的多核苷酸或寡核苷酸探針的集合。陣列在基片上形成，其中制作基片的材料如紙、玻璃、塑料(如聚丙烯、尼龍、聚苯乙烯)、聚丙烯酰胺、硝酸纖維、硅、光纖或任何其它合適的固體或半固體支持物，并制成二維(如玻璃片、硅芯片)或三維(例如針、纖維、珠、微粒、微滴定孔、毛細(xì)管)形狀。構(gòu)成陣列的探針可通過多種方式固定到基片上，包括(i)用照相平版印刷技術(shù)進(jìn)行原位合成(如高密度寡核苷酸陣列)(見Fodor等，科學(xué)(1991)，251767-773；Pease等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(1994)，915022-5026；Lockhart等，自然生物技術(shù)(1996)，141675；美國專利號5,578,832；5,556,752和5,510,270)；(ii)以中到低密度點(diǎn)樣/印制(如cDNA探針)到玻璃、尼龍或硝酸纖維上(Schena等，科學(xué)(1995)，270467-470，DeRisi等，自然遺傳學(xué)(1996)，14457-460；Shalon等，基因組研究(1996)，6639-645；和Schena等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(1995)，9310539-11286)；(iii)通過掩模(Maskos和Southern，核酸研究(1992)，201679-1684)和(iv)通過在尼龍或硝酸纖維雜交膜上斑點(diǎn)印跡(見例如Sambrook等編輯，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版，1-3卷，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(冷泉港，紐約))。探針也可通過與錨雜交、通過磁珠或如在微滴定板或毛細(xì)管的液相中非共價(jià)固定片上。探針分子通常為核酸如DNA、RNA、PNA和cDNA，但也可包括蛋白質(zhì)、多肽、寡糖、細(xì)胞、組織和其任一可特異結(jié)合靶分子的變化形式。
術(shù)語“3’”通常指這樣的區(qū)域或位置，其在同一多核苷酸或寡核苷酸中為另一區(qū)域或位置的3’(下游)。
術(shù)語“5’”通常指這樣的區(qū)域或位置，其在同一多核苷酸或寡核苷酸中為另一區(qū)域或位置的5’(上游)。
術(shù)語“3’-DNA部分”、“3’-DNA區(qū)域”、“3′-RNA部分”和“3′-RNA區(qū)域”是指位于朝向多核苷酸或寡核苷酸3’末端的多核苷酸或寡核苷酸部分或區(qū)域，可包括或不包括同一多核苷酸或寡核苷酸的3’最末端核苷酸或與3’最末端核苷酸連接的部分。3’最末端核苷酸優(yōu)選地為從約1到約50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地為從約10到約40個(gè)核苷酸，且更優(yōu)選地為從約20到約30個(gè)核苷酸。
術(shù)語“5′DNA部分”、“5′DNA區(qū)域”、“5′RNA部分”和“5′RNA區(qū)域”是指位于朝向多核苷酸或寡核苷酸5’末端的核苷酸或寡核苷酸的部分或區(qū)域，可包括或不包括同一多核苷酸或寡核苷酸的5’最末端核苷酸或與5’最末端核苷酸連接的部分。5’最末端核苷酸優(yōu)選地為從約1到約50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地為從約10到約40個(gè)核苷酸，且更優(yōu)選地為從約20到約30個(gè)核苷酸。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所完全理解的，引物的“尾部”序列是指在引物的其它區(qū)域或部分與靶雜交的情況下不與靶序列雜交的序列。
此處所用的產(chǎn)物的“缺少”或“缺乏”以及“無檢測產(chǎn)物”包括由于經(jīng)過循環(huán)而缺少產(chǎn)物的顯著的聚集，而以可忽略的或極低水平產(chǎn)生。本發(fā)明擴(kuò)增方法以下是本發(fā)明的擴(kuò)增方法的實(shí)例。應(yīng)當(dāng)理解即使提供了一般性的描述，也可應(yīng)用多種其它實(shí)施方案。例如，談到使用復(fù)合引物意指可使用此處描述的任何復(fù)合引物。
一方面，本發(fā)明提供了利用復(fù)合引物和第二引物產(chǎn)生與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸(DNA)序列多拷貝的方法。在這種方法中，利用兩種引物(復(fù)合引物和第二引物)和鏈置換來達(dá)到等溫線性核酸序列擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中包括轉(zhuǎn)錄步驟(即“增強(qiáng)”的方法)，并且產(chǎn)生正義RNA形式的擴(kuò)增產(chǎn)物。
另一方面，本發(fā)明提供利用單引物(其為復(fù)合引物)產(chǎn)生與目的RNA序列互補(bǔ)的DNA序列多拷貝(擴(kuò)增)的方法。在這種方法中，利用單復(fù)合引物、靶RNA片段(其作為內(nèi)源引物)和鏈置換來達(dá)到等溫線性核酸序列擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中包括轉(zhuǎn)錄步驟(即“增強(qiáng)”的方法)，并且產(chǎn)生正義RNA形式的擴(kuò)增產(chǎn)物。
正如此處所述，本發(fā)明擴(kuò)增方法還可以包括轉(zhuǎn)錄步驟。如果待轉(zhuǎn)錄的引物延伸產(chǎn)物包含前啟動(dòng)子序列，通常利用包含前啟動(dòng)子的多核苷酸(于此也稱做“前啟動(dòng)子多核苷酸”)與引物延伸產(chǎn)物雜交來產(chǎn)生雙鏈啟動(dòng)子區(qū)域。如果引物延伸產(chǎn)物不包含所需的前啟動(dòng)子序列，轉(zhuǎn)錄步驟通常依賴于RNA聚合酶前啟動(dòng)子序列的摻入，通過使用前啟動(dòng)子多核苷酸諸如啟動(dòng)子序列寡核苷酸(PTO)來進(jìn)行。前啟動(dòng)子多核苷酸如PTO作為單鏈引物延伸產(chǎn)物延伸和部分雙鏈體形成的模板，上述部分雙鏈體在其一端包含雙鏈啟動(dòng)子。單鏈產(chǎn)物與前啟動(dòng)子多核苷酸(如PTO)雜交的能力一般通過產(chǎn)生具有特定3’末端序列的引物延伸產(chǎn)物來獲得，上述特定3’末端序列與前啟動(dòng)子多核苷酸3’末端序列互補(bǔ)。
本發(fā)明方法一方面包括可與RNA序列(如多種RNA序列)雜交的引物的設(shè)計(jì)，上述引物的設(shè)計(jì)是為了啟動(dòng)引物延伸起始以及產(chǎn)生擴(kuò)增底物和產(chǎn)物。利用復(fù)合引物和第二引物的線性核酸序列擴(kuò)增本發(fā)明提供通過使用復(fù)合引物和第二引物以及鏈置換擴(kuò)增目的RNA序列的方法。使用這些方法的擴(kuò)增為線性擴(kuò)增，而且可以等溫進(jìn)行。在不包括轉(zhuǎn)錄步驟的實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物為包含與靶RNA中目的RNA序列具互補(bǔ)序列的單鏈DNA。在包括轉(zhuǎn)錄步驟的實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物為靶RNA中目的RNA序列的正義RNA拷貝。
基于復(fù)合引物、第二引物和鏈置換的本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖在圖1A-B和2A-C中給出。圖1A-B圖解了非增強(qiáng)線性方法。圖2A-C圖解了增強(qiáng)(即包括轉(zhuǎn)錄步驟)方法。方法包括下述步驟(a)形成與輸入RNA同義的第二鏈cDNA；(b)第二鏈cDNA的互補(bǔ)鏈的線性擴(kuò)增，其通過沿第二鏈cDNA進(jìn)行引物延伸(從復(fù)合引物)和鏈置換實(shí)現(xiàn)；以及，在增強(qiáng)方法中(c)線性擴(kuò)增步驟產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄，以產(chǎn)生多拷貝正義RNA產(chǎn)物。如圖所示，盡管每一步驟的溫度可以相同或不相同，所有步驟可以等溫進(jìn)行。
圖1A-B圖示的實(shí)施方案使用兩種寡核苷酸用于擴(kuò)增的復(fù)合引物(標(biāo)為1)；和用于正義互補(bǔ)鏈DNA(cDNA)(可互換地稱做“第二引物延伸產(chǎn)物”或“第二鏈cDNA”)形成的第二引物(標(biāo)為2)。圖2A-C圖示的實(shí)施方案使用三種寡核苷酸用于擴(kuò)增的復(fù)合引物(標(biāo)為1)；用于第二鏈(正義)cDNA形成的第二引物(標(biāo)為2)；和包含DNA依賴的RNA聚合酶的前啟動(dòng)子序列的多核苷酸，即前啟動(dòng)子模板寡核苷酸(PTO)(標(biāo)為3)。
根據(jù)想要擴(kuò)增的RNA的類型、分類、群體和/或種類，復(fù)合引物的3’部分可以設(shè)計(jì)為許多方法的任何一種(根據(jù)序列來設(shè)計(jì))。在一些實(shí)施方案中，如圖1和2中所示，復(fù)合引物1的3’部分包含與mRNA的多聚A尾互補(bǔ)的序列，并且在3’部分的3’末端還可以包含額外的隨機(jī)序列(通常不與多聚A序列互補(bǔ))。在另外的實(shí)施方案中，復(fù)合引物1的3’部分為包含可與多種RNA(其可以從2或更多到許多成百上千或更多)雜交的序列的隨機(jī)引物。隨機(jī)引物為本領(lǐng)域公知，例如，它們廣泛用于基于PCR方法的cDNA文庫的制備。正如本領(lǐng)域所充分理解的那樣，“隨機(jī)引物”可以指一個(gè)引物群(多種隨機(jī)引物)中的一種，上述引物群為與一個(gè)想要的和/或大量的靶序列雜交而共同被設(shè)計(jì)。隨機(jī)引物可以與核酸序列的多個(gè)位點(diǎn)雜交。
在另外的實(shí)施方案中，復(fù)合引物1的3’部分可以包含與一個(gè)特異RNA或RNA家族(或其部分)互補(bǔ)或雜交的序列。
在如圖1和2所示的一些實(shí)施方案中，復(fù)合引物1的5’部分可以是不可與靶序列雜交(在3’部分與靶RNA雜交的條件下)的序列，如在引物與靶雜交時(shí)形成“尾”的序列。這個(gè)“尾”序列通常摻入第一引物延伸產(chǎn)物(第一鏈cDNA)，并且這個(gè)尾的互補(bǔ)序列摻入第二引物延伸產(chǎn)物(第二鏈cDNA)的3’末端。因此，在一些實(shí)施方案中，復(fù)合引物1為包含相同5’RNA部分和多種3’DNA部分的復(fù)合引物的混合物，選擇用以擴(kuò)增多種(其可以是很小到很大)目的RNA序列。在另外的實(shí)施方案中，復(fù)合引物1的5’部分可以與靶RNA雜交。盡管圖1和2描繪的與靶序列雜交的3’部分為DNA部分，并且不與靶雜交的5’部分為RNA部分，應(yīng)理解DNA部分可以包含“尾”的一部分，并且反過來RNA部分可以和靶RNA雜交。例如，復(fù)合引物的5’RNA部分可部分雜交而部分不雜交，或復(fù)合引物的DNA部分可部分雜交而部分不雜交，或兩者都是。
正如這些圖解闡明的，復(fù)合引物1在其3’末端包含DNA部分A和在其5’末端包含RNA部分B。正如于此所討論，也可能使用這樣一種復(fù)合引物，所述復(fù)合引物3’DNA后在其5’方向上是RNA部分，其后是DNA部分。每一這些部分的長度一般由最大擴(kuò)增效率來確定。在圖1A-B和圖2A-C中顯示的復(fù)合引物只有兩部分(即3’-DNA-RNA-5’)。
如圖1A-B和圖2A-C所示，引物2可由但并非必需由DNA組成，并且可以包含2個(gè)部分(可互換地稱為“部分”或“區(qū)域”)。引物2的3’部分F可以選擇用以隨機(jī)引發(fā)生物樣品中許多、大部分和/或所有可能的mRNA序列。隨機(jī)引物為本領(lǐng)域公知，例如，它們廣泛用于基于PCR方法的cDNA文庫制備。引物2的5’部分E可以為不與特異靶序列互補(bǔ)且基本上不可雜交的序列，即其不發(fā)生雜交(在3’部分與靶RNA雜交的情況下)，并且形成尾?！拔病毙蛄型ǔ饺氲诙镅由飚a(chǎn)物，并且在線性擴(kuò)增步驟的DNA產(chǎn)物的3’末端序列中通常包含該序列的互補(bǔ)序列。在另外的實(shí)施方案中，如果不需要進(jìn)行增強(qiáng)的擴(kuò)增(如下所述)，引物2的5’末端部分E可以與第一引物延伸產(chǎn)物中的靶序列雜交。
正如圖2A-C所示，啟動(dòng)子模板寡核苷酸3(PTO)可以按如下設(shè)計(jì)3’部分與引物2的E部分相同。這種設(shè)計(jì)使PTO與線性擴(kuò)增產(chǎn)物的3’末端雜交成為可能。PTO的5’最末端部分為DNA依賴的RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列，其如前所述用于本發(fā)明擴(kuò)增方法的某些(即增強(qiáng)方法)的實(shí)施方案中。一般地，這兩個(gè)部分之間的序列設(shè)計(jì)用以實(shí)現(xiàn)所選的聚合酶的最佳轉(zhuǎn)錄。這種序列的選擇和設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)本領(lǐng)域公知。
為方便起見，圖1和2中僅描述和圖解一種第一引物延伸產(chǎn)物(第一鏈cDNA)和第二引物延伸產(chǎn)物(第二鏈cDNA)。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明方法不僅對于產(chǎn)生大量的一種特異核酸序列有用，而且可以用于同時(shí)擴(kuò)增位于相同或不同靶核酸分子上的多于一種的不同特異核酸序列。例如，本發(fā)明方法用于擴(kuò)增樣品中所有的mRNA，或用于擴(kuò)增樣品中多種特異的RNA或RNA家族。
正如圖1A-B所示，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明擴(kuò)增方法的過程如下所述，所述過程導(dǎo)致產(chǎn)生基于RNA的包含與目的RNA序列具互補(bǔ)序列的DNA產(chǎn)物A)線性擴(kuò)增的雙鏈cDNA底物的形成1.通過隨機(jī)序列A部分(其可以至少部分基于mRNA的多聚A序列)的雜交，引物1結(jié)合到樣品中的RNA上，形成復(fù)合體I(圖1A)。
2.反轉(zhuǎn)錄酶(表示為RT)沿引物1雜交的靶RNA鏈延伸雜交的引物1，形成RNA/DNA雙鏈體。RNaseH降解雜合雙鏈體的靶RNA鏈產(chǎn)生單鏈第一鏈cDNA(標(biāo)為II)。II的5’末端為引物1。
3.通過序列F的雜交，引物2結(jié)合到第一鏈cDNA上形成復(fù)合體III。
4.引物2通過DNA聚合酶沿cDNA鏈II延伸形成雙鏈產(chǎn)物(標(biāo)為IV)。利用RNA依賴的DNA聚合酶比如反轉(zhuǎn)錄酶沿II的5’RNA部分的引物延伸導(dǎo)致在復(fù)合體IV的一個(gè)末端產(chǎn)生RNA/DNA雜合體。
5.RNaseH降解在復(fù)合體IV的一個(gè)末端的RNA/DNA雜合體上的RNA部分，產(chǎn)生具有3’DNA單鏈末端的部分雙鏈復(fù)合體(標(biāo)為V)，所述3’DNA單鏈末端具有復(fù)合引物1B部分的互補(bǔ)序列。RNaseH活性可以由RNA依賴的DNA聚合酶(如反轉(zhuǎn)錄酶)提供或者可以由單獨(dú)的酶提供。用于本方法的反轉(zhuǎn)錄酶可以具有或不具有RNaseH活性。
B)等溫線性擴(kuò)增1.通過RNA B部分和與其互補(bǔ)的單鏈DNA末端的雜交，引物1結(jié)合到復(fù)合體V上形成復(fù)合體VI。引物1的3’DNA序列并不雜交。
2.復(fù)合體VI上結(jié)合的引物1的3’末端和DNA鏈緊挨著的上游5’末端相同，并且會(huì)競爭與相反鏈的雜交。不被理論所束縛，認(rèn)為DNA聚合酶與雜交引物的3’末端的高親合性會(huì)使兩種競爭結(jié)構(gòu)的平衡向新引物3’末端的雜交和以前引物延伸產(chǎn)物(標(biāo)為VII)5’末端的置換的方向進(jìn)行。沿第二鏈(正義)cDNA鏈的引物延伸導(dǎo)致以前第二引物延伸產(chǎn)物(VII)的置換，和引物2序列E的復(fù)制，形成復(fù)合體VIII。
3.復(fù)合體VIII在其一端具有由序列B及其互補(bǔ)序列構(gòu)成的RNA/DNA雜合體。雜合體的RNA部分被RNaseH降解，形成復(fù)合體IX，其導(dǎo)致單鏈3’末端的形成，新的引物1可以通過其5’B部分結(jié)合到所述單鏈3’末端。
4.雙鏈體中以前引物延伸產(chǎn)物的5’最末端的置換而導(dǎo)致的結(jié)合的引物1的3’末端序列A的雜交、引物延伸和以前產(chǎn)物的置換，上述進(jìn)程如圖1A-B所示連續(xù)進(jìn)行，并導(dǎo)致多拷貝反義單鏈DNA產(chǎn)物(標(biāo)為VII)積聚。這些產(chǎn)物在其3’末端具有與引物2的E部分互補(bǔ)的序列，并且在其5’末端具有與復(fù)合引物序列A基本相同(通常相同)的序列。Kurn美國專利號6,251,639B1。
增強(qiáng)方法的一個(gè)實(shí)施方案在圖2A-C中闡明。在這個(gè)實(shí)施方案中，在產(chǎn)生包含目的RNA序列互補(bǔ)序列的DNA產(chǎn)物后，進(jìn)行下述步驟。
C)DNA產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄1.PTO(參見圖2C)通過其3’末端序列與DNA產(chǎn)物XII的3’末端序列雜交而結(jié)合到DNA產(chǎn)物XII上形成復(fù)合體XIII。優(yōu)選但不必需封閉PTO3’末端以使其不能被DNA聚合酶延伸。
2.DNA聚合酶沿PTO模板延伸復(fù)合體XIII中產(chǎn)物XII的3’末端，以形成在其一端包含雙鏈啟動(dòng)子序列的復(fù)合體XIV。
3.DNA依賴的RNA聚合酶結(jié)合到復(fù)合體XIV的雙鏈啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄反義單鏈DNA產(chǎn)物以產(chǎn)生多拷貝正義RNA產(chǎn)物(標(biāo)為XV)。多種產(chǎn)物XV代表輸入RNA庫中多序列的多種拷貝。Kurn美國專利號6,251,639B1。
本發(fā)明方法可以用于產(chǎn)生樣品中多種RNA序列的多拷貝。例如，復(fù)合引物可以包含多聚dT序列，其預(yù)期會(huì)與樣品中所有mRNA的多聚A尾雜交，或者復(fù)合引物通?？砂辽倥c隨機(jī)或部分隨機(jī)序列(如包含多聚dT序列和隨機(jī)序列，其預(yù)期與mRNA的多聚A尾的開始部分雜交)雜交的3’部分。另一方面，本發(fā)明方法可以用于產(chǎn)生特異種類的RNA或RNA種類的一類(如RNA種類的家族或超家族)的多拷貝。在后一所述的情況中，復(fù)合引物通常包含與特異RNA靶(或RNA靶家族)序列互補(bǔ)的3’部分。
復(fù)合引物的5’RNA部分可以與特異RNA靶序列相關(guān)或不相關(guān)，并且可以或不可以與RNA靶雜交，例如，其可如此處另外所述形成尾。
盡管上述實(shí)施方案中僅敘述了一種復(fù)合引物，應(yīng)當(dāng)理解，在上述步驟(b)中可以使用不同的復(fù)合引物。不同的復(fù)合引物包含可與上述復(fù)合體IX的單鏈DNA部分雜交的序列。第二復(fù)合引物還可包含與第二引物延伸產(chǎn)物序列的一個(gè)部分雜交的序列，其中的述第二引物延伸產(chǎn)物序列的部分位于緊挨復(fù)合體IX的單鏈DNA的5’部分。第二復(fù)合引物通常包含與第一復(fù)合引物的重疊序列。第二復(fù)合引物與第二引物延伸產(chǎn)物雜交并通過引物延伸而延伸。利用RNase對DNA-RNA異質(zhì)雙鏈體的切割允許另一第二復(fù)合引物的結(jié)合、延伸和鏈置換，由此產(chǎn)生多拷貝單鏈產(chǎn)物。
為方便起見，圖1和2中僅描述和圖解了一種第一引物延伸產(chǎn)物(第一鏈cDNA)和第二引物延伸產(chǎn)物(第二鏈cDNA)。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明方法不僅用于產(chǎn)生大量的一種特異核酸序列，而且用于同時(shí)擴(kuò)增位于相同或不同靶核酸分子上的多于一種的不同特異核酸序列。例如，本發(fā)明方法用于擴(kuò)增樣品中所有的mRNA，或用于擴(kuò)增樣品中多種特異的RNA樣本(在這種情況下，可使用多種第一復(fù)合引物，其中的每種第一復(fù)合引物包含可與特異RNA樣本的特異序列雜交的3’部分)或用于擴(kuò)增RNA樣本的家族。利用單復(fù)合引物和靶RNA片段進(jìn)行線性核酸序列擴(kuò)增本發(fā)明還提供利用單引物(其為復(fù)合引物)、靶RNA片段和鏈置換來擴(kuò)增目的RNA的方法。利用這些方法的擴(kuò)增為線性擴(kuò)增，并且可以等溫進(jìn)行。在不包括轉(zhuǎn)錄步驟的實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物為包含與靶RNA中目的RNA序列具互補(bǔ)序列的DNA。在包括轉(zhuǎn)錄步驟的實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物為靶RNA中目的RNA序列的正義RNA拷貝。
基于單復(fù)合引物和鏈置換的本發(fā)明方法的一個(gè)非增強(qiáng)(線性)實(shí)施方案的示意圖在圖3A-B中給出。方法包括下述步驟(a)引物延伸形成靶RNA和第一鏈cDNA的RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體；(b)異質(zhì)雙鏈體中RNA靶的不完全降解，以形成第一鏈cDNA和至少一個(gè)接下來能作為引物的RNA片段；(c)形成與輸入靶RNA同義的第二鏈cDNA；(d)通過沿第二鏈cDNA(由復(fù)合引物進(jìn)行)的引物延伸和鏈置換線性擴(kuò)增第二鏈DNA的互補(bǔ)鏈，以產(chǎn)生多拷貝反義單鏈DNA產(chǎn)物。如圖所示，盡管每一步驟的溫度可以相同或不相同，所有步驟可以等溫進(jìn)行?；趩螐?fù)合引物和鏈置換的增強(qiáng)的本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖在圖4A-B中給出。方法包括下述步驟(a)引物延伸形成靶RNA和第一鏈cDNA的RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體；(b)異質(zhì)雙鏈體中RNA靶的不完全降解，以形成第一鏈cDNA和至少一個(gè)接下來能作為引物的RNA片段；(c)形成與輸入靶RNA同義的第二鏈cDNA；(d)通過沿第二鏈cDNA(由復(fù)合引物進(jìn)行)的引物延伸和鏈置換線性擴(kuò)增第二鏈DNA的互補(bǔ)鏈，以產(chǎn)生多拷貝反義單鏈DNA產(chǎn)物；以及(e)線性擴(kuò)增步驟產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝正義RNA產(chǎn)物。
此處所述的復(fù)合引物用于這些方法中的擴(kuò)增。如圖3A和4A所示，單(復(fù)合)引物(標(biāo)為1)可以由3’-DNA部分(標(biāo)為A)和5’RNA部分(標(biāo)為B)組成，上述3’-DNA部分與靶RNA上的序列互補(bǔ)，上述5’-RNA部分含有靶不相關(guān)序列(即在一組給定的條件下不可與靶RNA上的序列互補(bǔ)/雜交的序列)。復(fù)合引物的3’-DNA部分可以含有多聚dT核苷酸，這使得其(在一組給定的條件下)可與來自真核細(xì)胞的mRNA的多聚A3’末端互補(bǔ)/雜交。
與靶RNA雜交的復(fù)合引物利用RNA依賴的DNA聚合酶如反轉(zhuǎn)錄酶延伸以形成靶RNA和第一鏈cDNA的RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體。然后利用核糖核酸酶(如RNaseH)降解異質(zhì)雙鏈體中的靶RNA形成第一鏈cDNA和一個(gè)或多個(gè)RNA片段(寡核苷酸)的復(fù)合體。RNaseH活性可由RNA依賴的DNA聚合酶(如反轉(zhuǎn)錄酶)提供，或者由單獨(dú)的酶提供。用于本方法的反轉(zhuǎn)錄酶可以具有或不具有RNaseH活性。片段是異質(zhì)雙鏈體中靶RNA的不完全降解產(chǎn)物。這些片段作為DNA依賴的DNA聚合酶的引物起作用，以形成第二鏈cDNA。Okayama和Berg，分子和細(xì)胞生物學(xué)(Molecular and Cell Biology)(1982)，2161；和Gubler和Hoffman，基因(Gene)(1983)，25263。然后反轉(zhuǎn)錄酶沿復(fù)合引物延伸產(chǎn)物(第一鏈延伸cDNA)的5’RNA序列延伸雙鏈體中第二鏈cDNA的3’末端，以在雙鏈cDNA產(chǎn)物的末端形成RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體。
存在于雙鏈cDNA末端的異質(zhì)雙鏈體是RNaseH的底物。RNaseH降解第一鏈cDNA的5’RNA部分，以產(chǎn)生復(fù)合引物的雜交位點(diǎn)，上述復(fù)合引物通過其5’RNA部分與雙鏈體cDNA中第二鏈cDNA的3’末端雜交。新引物的3’DNA部分通過與第二鏈cDNA上其互補(bǔ)序列的雜交而置換第一鏈cDNA的5’末端。然后具有強(qiáng)鏈置換活性的DNA聚合酶沿第二鏈cDNA延伸新引物，并置換以前形成的cDNA產(chǎn)物。RNaseH降解異質(zhì)雙鏈體上新引物延伸產(chǎn)物的5’部分，以產(chǎn)生用于新復(fù)合引物雜交的游離位點(diǎn)，這樣導(dǎo)致了靶序列的連續(xù)線性擴(kuò)增，并產(chǎn)生了多拷貝的與靶RNA序列反義的單鏈DNA產(chǎn)物。
如圖4A-B所描繪和從此處描述顯而易見，單復(fù)合引物擴(kuò)增方法也可以包括轉(zhuǎn)錄步驟，上述轉(zhuǎn)錄步驟以與利用復(fù)合引物和第二引物的增強(qiáng)的擴(kuò)增方法中所述相同的方式使用前啟動(dòng)子多核苷酸。
本發(fā)明方法可用于產(chǎn)生樣品中多種RNA序列的多拷貝或用于產(chǎn)生特異RNA樣本或RNA樣本群體的多拷貝。在后一種情況下，復(fù)合引物通常包含與特異RNA靶或靶群體(如同源RNA靶或?yàn)樾蛄屑易寤虺易逯谐蓡T的靶)互補(bǔ)和/或雜交的3’部分。例如引物可以包括引物序列的集合(如在多于一個(gè)靶序列存在的情況下)。
本發(fā)明方法的另一個(gè)應(yīng)用是檢測共有序列側(cè)翼的多變區(qū)。通過設(shè)計(jì)識別共有序列的第一復(fù)合引物，產(chǎn)生的單鏈DNA或RNA產(chǎn)物不僅僅包含引物識別的共有區(qū)域，而且包含用于檢測序列變體的5’側(cè)翼區(qū)域。因此，例如可從有限量的臨床材料中產(chǎn)生出單鏈DNA或RNA產(chǎn)物，上述產(chǎn)物使得可按照常規(guī)技術(shù)鑒定病原體特異序列(如那些不同的病毒類型)、檢測基因多態(tài)性或鑒定另外的剪接變體。在另外的實(shí)施方案中，產(chǎn)生的單鏈DNA或RNA產(chǎn)物不僅僅包含引物識別的共有區(qū)域(例如保守的或功能序列基序)，而且還包含5’側(cè)翼序列，上述5’側(cè)翼序列使得可鑒定含有相似序列基序的RNA樣本群。
復(fù)合引物的5’RNA部分可以與特異RNA靶序列相關(guān)或不相關(guān)，并且可以與RNA靶雜交或不雜交。利用“尾”復(fù)合引物的本發(fā)明方法在于此進(jìn)一步敘述。利用單復(fù)合引物和靶RNA片段的線性mRNA擴(kuò)增正如此處所述，總mRNA可以利用包含足夠長度Poly-(T)的復(fù)合引物(即Poly-(T)n，其中n一般從約5到50或更多)與基本上全部信使群體雜交來擴(kuò)增。圖5為舉例說明的基于鏈置換的本發(fā)明方法的非增強(qiáng)實(shí)施方案的示意圖，上述方法包括單復(fù)合引物的使用，上述單復(fù)合引物包含含有多聚dT序列且還含有位于多聚dT序列3’的隨機(jī)序列的3’DNA部分多聚dT序列。復(fù)合引物1還包含基本上不與RNA靶序列雜交的5’RNA部分(即在多聚dT序列雜交的情況下形成尾序列)。任選地，第二復(fù)合引物可以按如下所述使用。
本方法包括下列步驟(a)引物延伸以形成靶RNA和第一鏈cDNA的RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體；(b)形成與輸入靶RNA同義的第二引物延伸產(chǎn)物(第二鏈cDNA)。第二引物延伸產(chǎn)物通常包含與復(fù)合引物的5’RNA部分(即尾)互補(bǔ)的3’部分；(c)通過引物延伸(從復(fù)合引物)和鏈置換線性擴(kuò)增第二鏈cDNA的互補(bǔ)鏈，以產(chǎn)生反義單鏈DNA產(chǎn)物(其與目的RNA序列互補(bǔ))的多拷貝。
圖6為舉例說明的基于鏈置換的本發(fā)明方法的非增強(qiáng)實(shí)施方案的示意圖，上述方法包括單復(fù)合引物的使用，上述單復(fù)合引物包含含有隨機(jī)序列的3’DNA部分，并且還包含基本上不與RNA靶序列雜交(即在隨機(jī)序列雜交的情況下形成尾)的5’RNA序列。任選地，第二復(fù)合引物可以按如下所述使用。
本方法包括下列步驟(a)引物延伸以形成靶RNA和第一鏈cDNA的RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體；(b)形成與輸入靶RNA同義的第二引物延伸產(chǎn)物(第二鏈cDNA)。第二引物延伸產(chǎn)物通常包含與復(fù)合引物的5’RNA部分(即尾)互補(bǔ)的3’部分；(c)通過從復(fù)合引物的引物延伸和鏈置換線性擴(kuò)增正義DNA鏈，以產(chǎn)生與目的RNA序列互補(bǔ)的反義單鏈DNA產(chǎn)物的多拷貝。
如在這些實(shí)施方案中所闡明，盡管每一步驟的溫度可以相同或不同，但所有的步驟為等溫進(jìn)行。應(yīng)當(dāng)理解，在上述提供的一般性描述下，可以進(jìn)行多種其它的實(shí)施方案。還應(yīng)當(dāng)理解，第二引物延伸產(chǎn)物的形成可以通過本領(lǐng)域公知或此處描述的任何方法(如通過延伸雜交的第二引物或RNA片段)來進(jìn)行。
從此處描述顯而易見的是，擴(kuò)增方法也可以包括轉(zhuǎn)錄步驟，上述轉(zhuǎn)錄步驟以與利用復(fù)合引物和第二引物的增強(qiáng)的擴(kuò)增方法中所述相同的方式使用前啟動(dòng)子多核苷酸。增強(qiáng)的擴(kuò)增方法的單鏈RNA產(chǎn)物一般包含與第一復(fù)合引物5’RNA部分互補(bǔ)的3’區(qū)域。
圖7為舉例說明的基于鏈置換的本發(fā)明方法的增強(qiáng)實(shí)施方案的示意描述，上述方法包括(a)單復(fù)合引物的使用，上述單復(fù)合引物包含含有隨機(jī)序列的3’DNA部分，且還包含5’RNA部分，上述5’RNA部分基本上不與RNA靶序列雜交(即在隨機(jī)序列雜交的情況下形成尾)；和(b)前啟動(dòng)子寡核苷酸的使用。任選地，第二復(fù)合引物可以按此處所述使用。
本方法包括下列步驟(a)引物延伸以形成靶RNA和第一鏈cDNA的RNA/DA異質(zhì)雙鏈體；(b)形成與輸入靶RNA同義的第二引物延伸產(chǎn)物(第二鏈cDNA)，以及利用可切割存在于RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體上RNA的試劑(如RNaseH)切割存在于RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體上的RNA，由此產(chǎn)生包含3’單鏈部分的第一和第二引物延伸產(chǎn)物的雙鏈復(fù)合體(圖8中的復(fù)合體IX，其對應(yīng)于圖1中所示的復(fù)合體IX)；和(c)PTO結(jié)合到雙鏈產(chǎn)物IX形成復(fù)合體X，如圖8所示。DNA聚合酶沿PTO模板延伸復(fù)合體XIII中的第二引物延伸產(chǎn)物的3’末端，形成復(fù)合體XI，上述復(fù)合體XI在其一端包含雙鏈啟動(dòng)子序列；和(d)利用DNA依賴的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生正義RNA產(chǎn)物的多拷貝。正如所圖解，盡管每一步驟的溫度可以相同或不相同，所有步驟都等溫進(jìn)行。
如圖8中所示，啟動(dòng)子模板寡核苷酸3(PTO)可按如下設(shè)計(jì)3’部分與第一復(fù)合引物的5’RNA部分(其與模板RNA雜交)相同。這種設(shè)計(jì)使PTO與第二引物延伸產(chǎn)物(其存在于和第一引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合體中)中的單鏈3’部分雜交成為可能。PTO的5’最末端部分為DNA依賴的RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列，如上所述，其用于本發(fā)明擴(kuò)增方法的某些(即其它的增強(qiáng)方法)的實(shí)施方案中。利用第一復(fù)合引物、第二復(fù)合引物和靶RNA的線性mRNA擴(kuò)增本發(fā)明提供了產(chǎn)生目的RNA序列的單鏈反義和正義多核苷酸(一般為DNA)拷貝的方法，上述方法利用第一復(fù)合引物、第二復(fù)合引物和靶RNA，上述第二復(fù)合引物用于產(chǎn)生第二鏈cDNA。在本發(fā)明的這一方面，第一復(fù)合引物用于產(chǎn)生第一延伸產(chǎn)物(一般為cDNA)，如前所述其作為利用復(fù)合引物進(jìn)行線性擴(kuò)增的底物。另外，第二復(fù)合引物用于產(chǎn)生作為線性擴(kuò)增底物的第二鏈cDNA，于是導(dǎo)致了目的RNA序列的單鏈多核苷酸拷貝的產(chǎn)生。
本方法包括如下步驟(a)雙鏈cDNA的形成，在其每一末端包含RNA-DNA異質(zhì)雙鏈體；和(b)第一鏈(正義)cDNA和第二鏈(反義)cDNA的線性擴(kuò)增，其通過從第一復(fù)合引物和第二復(fù)合引物(其結(jié)合第一鏈cDNA)的引物延伸和鏈置換實(shí)現(xiàn)。于是產(chǎn)生了單鏈第一和第二鏈cDNA產(chǎn)物，其用于例如產(chǎn)生cDNA文庫。顯而易見的是在本發(fā)明的這一方面，第二引物延伸產(chǎn)物由復(fù)合引物引發(fā)。
圖8用于闡明本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。包含不同“尾”序列的兩個(gè)復(fù)合引物用于產(chǎn)生雙鏈cDNA，上述雙鏈cDNA在其每一cDNA末端包含RNA-DNA異質(zhì)雙鏈體。利用從RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體上切割RNA的試劑切割RNA，允許另一第一復(fù)合引物、另一第二復(fù)合引物(其與第一引物延伸產(chǎn)物雜交)的結(jié)合、延伸和鏈置換，由此產(chǎn)生反義單鏈產(chǎn)物的多拷貝和正義單鏈DNA產(chǎn)物的多拷貝。正義和反義單鏈cDNA產(chǎn)物的組合可產(chǎn)生雙鏈cDNA。導(dǎo)致單鏈cDNA產(chǎn)物產(chǎn)生的本發(fā)明擴(kuò)增方法的過程如下(在圖7中所闡明的一個(gè)實(shí)施方案)，其中上述單鏈cDNA產(chǎn)物包括與目的RNA序列互補(bǔ)的序列和含有目的RNA序列的序列A)用于線性擴(kuò)增的雙鏈cDNA底物的形成1.通過引物A部分(其可以至少部分基于mRNA的多聚A序列)的雜交，復(fù)合引物1結(jié)合到樣品中RNA靶序列上形成復(fù)合體I。
2.反轉(zhuǎn)錄酶沿引物1雜交的靶RNA鏈延伸雜交的引物1，形成RNA/DNA雙鏈體，標(biāo)為II。用試劑(如RNaseH)降解雜合雙鏈體中的靶RNA鏈以產(chǎn)生單鏈第一鏈cDNA(標(biāo)為III)。III的5’末端為引物1。
3.通過序列F的雜交，復(fù)合引物2結(jié)合到第一鏈cDNA(III)，以形成復(fù)合體IV。
4.利用DNA聚合酶沿cDNA鏈III延伸復(fù)合引物2，形成由第一和第二鏈cDNA組成的雙鏈產(chǎn)物(標(biāo)為V)。利用RNA依賴的DNA聚合酶如反轉(zhuǎn)錄酶沿IV的5’RNA部分延伸引物，導(dǎo)致在復(fù)合體V的一個(gè)末端形成RNA/DNA雜合部分。
5.用試劑(如RNaseH)降解在復(fù)合體V一個(gè)末端的RNA/DNA雜合體中的RNA部分，產(chǎn)生具有3’DNA單鏈末端的部分雙鏈復(fù)合體(標(biāo)為VI)，其具有復(fù)合引物1的B部分的互補(bǔ)序列。
6.通過RNA部分與和RNA部分互補(bǔ)的單鏈DNA末端的雜交，復(fù)合引物1結(jié)合到復(fù)合體VI上形成復(fù)合體VII。
7.沿正義cDNA鏈延伸結(jié)合到復(fù)合體VII上的引物1，導(dǎo)致以前引物延伸產(chǎn)物(VII)的置換以及第二復(fù)合引物“G”部分的復(fù)制，形成復(fù)合體VIII。
8.用試劑(如RNaseH)降解RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體上的RNA部分，形成復(fù)合體VIII。復(fù)合體VIII具有兩個(gè)RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體，這兩個(gè)RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體包括在復(fù)合體VIII一端的復(fù)合引物1及其互補(bǔ)鏈，在復(fù)合體VIII另一端的第二復(fù)合引物及其互補(bǔ)鏈。復(fù)合體VIII作為隨后稱為A和B反應(yīng)的底物。
B)等溫線性擴(kuò)增1.在A反應(yīng)中，第一復(fù)合引物結(jié)合至復(fù)合體VIII。引物延伸和置換產(chǎn)生第一置換產(chǎn)物A.RNase切割產(chǎn)生第一復(fù)合引物的結(jié)合位點(diǎn)，并且隨后引物延伸，由此單鏈反義DNA產(chǎn)物積聚。
2.在B反應(yīng)中，第二復(fù)合引物結(jié)合至復(fù)合體VIII(或結(jié)合到第一置換產(chǎn)物A)。引物延伸和置換產(chǎn)生單鏈正義DNA產(chǎn)物。
單鏈產(chǎn)物可以退火形成第一和第二鏈cDNA的雙鏈復(fù)合體，或可以防止退火(或隨后的變性)以產(chǎn)生單鏈第一和第二鏈cDNA的混合物。本發(fā)明方法中使用的組分和反應(yīng)條件模板核酸待擴(kuò)增的RNA靶包括任何來源以純化或非純化形式的RNA，其可以是RNA和它的片段，上述RNA諸如總RNA、tRNA、mRNA、rRNA、線粒體RNA、葉綠體RNA、DNA-RNA雜合體、或它們的混合物，上述RNA來源于任何來源和/或種類，包括人、動(dòng)物、植物和微生物，諸如細(xì)菌、酵母、病毒、類病毒、霉菌、真菌、植物。RNA可以利用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)獲得和純化。DNA靶(包括基因組DNA靶)的擴(kuò)增需要將DNA靶起始轉(zhuǎn)錄成RNA形式。其可以利用公開在Kurn美國專利號6,251,639B1上的方法和本領(lǐng)域公知的其他技術(shù)實(shí)現(xiàn)。DNA-RNA雜合體的擴(kuò)增需要雜合體的變性以獲得ssRNA，或在DNA鏈轉(zhuǎn)錄后變性，以獲得RNA。靶RNA可以是復(fù)雜混合物諸如生物樣品的僅僅一小部分，并可以利用本領(lǐng)域公知的方法從多種生物材料中獲得。靶RNA可以是已知的或未知的，并且可以包含多于一種想要的特異目的核酸序列，每一目的核酸序列彼此之間可以相同或不同。因此，擴(kuò)增過程不僅用于產(chǎn)生大量的一種特異核酸序列，而且用于同時(shí)擴(kuò)增位于同一或不同核酸分子上的多于一種的不同特異核酸序列。
靶RNA序列擴(kuò)增的起始步驟是獲得單鏈靶序列。如果靶核酸為雙鏈(如RNA/DNA雜合體)，起始步驟為靶變性。變性也可以用于去除存在于RNA靶分子上的二級結(jié)構(gòu)。變性步驟可為領(lǐng)域內(nèi)已知的熱變性或任一其它方法。復(fù)合引物本發(fā)明方法使用包含RNA部分和DNA部分的復(fù)合引物。如此處所述，當(dāng)用于此處描述的RNA擴(kuò)增方法的雜交和起始時(shí)，復(fù)合引物通常包含與RNA靶序列雜交的DNA部分(其依據(jù)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增的RNA的性質(zhì)(是樣本還是一個(gè)群體)，如此所述可以具有任何數(shù)目的序列變化)。當(dāng)用于擴(kuò)增通過此處所述的本發(fā)明方法產(chǎn)生的cDNA鏈時(shí)，復(fù)合引物的設(shè)計(jì)使得隨后通過結(jié)合一個(gè)新的(另外的)復(fù)合引物而進(jìn)行的引物延伸產(chǎn)物的置換和通過聚合酶而進(jìn)行的新引物延伸得以實(shí)現(xiàn)。另外，引物延伸產(chǎn)物中RNA部分的切割導(dǎo)致產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物，不是用于復(fù)合引物擴(kuò)增的底物。應(yīng)當(dāng)理解，在以下部分一般性描述用于本發(fā)明方法的復(fù)合引物的方面時(shí)，如果用于RNA擴(kuò)增(產(chǎn)生第一延伸產(chǎn)物)的雜交和起始和/或線性置換擴(kuò)增時(shí)，描述的特性可以應(yīng)用于引物。
在本發(fā)明方法和組合物中使用的復(fù)合引物包含可與靶RNA雜交的序列?？膳c靶RNA雜交的序列可基于特異靶RNA(例如特定基因的mRNA)的特定序列，或者基于已知存在于多種RNA樣本中的較普遍存在的序列類型，如多聚A尾序列在本領(lǐng)域中廣泛認(rèn)為存在于所有真核mRNA中。另外，可與靶RNA雜交的序列可以包含與mRNA的多聚A尾互補(bǔ)的序列，且還可以在其3’部分的3’末端包含額外的隨機(jī)序列(其通常不與多聚A序列互補(bǔ))(或者包含隨機(jī)序列群體)。
可與靶RNA雜交的序列也可以包含隨機(jī)序列。隨機(jī)引物為本領(lǐng)域公知，(參見例如，)并且至少包括下列引物可與樣品中兩個(gè)或多個(gè)序列雜交的引物；以及包含可與樣品中多種RNA(如所有的mRNA)雜交的多聚dT序列的引物。為方便起見，以上討論的是單隨機(jī)引物。然而，應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語“隨機(jī)引物”可以指一群引物中的一個(gè)成員引物，上述引物群共同設(shè)計(jì)用于針對一個(gè)想要的和/或大量靶序列群。
還應(yīng)當(dāng)理解，在單一反應(yīng)混合物中擴(kuò)增多種mRNA樣本可以但并非必需使用多種(從兩種到許多種)引物。因此，當(dāng)在單一反應(yīng)混合物中擴(kuò)增多種mRNA樣本時(shí)，發(fā)明考慮使用多種不同的復(fù)合引物(隨機(jī)或非隨機(jī)引物)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用第一復(fù)合引物，包括涉及第二鏈cDNA鏈的線性置換擴(kuò)增(SPIA)的那些步驟。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法使用不同的第一和第二復(fù)合引物。第二復(fù)合引物用于線性置換擴(kuò)增(SPIA)步驟，并且可以包含第一復(fù)合引物的一些或所有序列，并且第一復(fù)合引物可以包含第二復(fù)合引物的一些或所有序列。在一些實(shí)施方案中，第二復(fù)合引物包含與第一復(fù)合引物不同的序列。
在一些實(shí)施方案中，復(fù)合引物設(shè)計(jì)為使整個(gè)引物與靶RNA雜交。在另外的實(shí)施方案中，復(fù)合引物包含(在給定的條件下)不與靶序列雜交的序列(優(yōu)選地在其5’末端)(例如，當(dāng)引物與靶結(jié)合時(shí)，形成“尾”的非雜交5’部分)。復(fù)合引物的單獨(dú)DNA和RNA部分可以與靶RNA完全或部分雜交。例如，復(fù)合引物的5’RNA部分可以部分雜交和部分不雜交，或者復(fù)合引物的DNA部分可以部分雜交和部分不雜交，或兩者都有。另外，DNA部分可以組成“尾”的一部分，并且RNA部分可以與靶RNA部分或完全雜交。例如，復(fù)合引物的5’RNA部分可以部分雜交和部分不雜交，或者復(fù)合引物的DNA部分可以部分雜交和部分不雜交，或兩者都有。
對用于線性置換擴(kuò)增而言，復(fù)合引物包含至少一個(gè)RNA部分，其可以(a)與第二鏈cDNA(可互換地稱為“第二引物延伸產(chǎn)物”或“復(fù)合引物延伸產(chǎn)物”)上的序列結(jié)合(雜交)，上述結(jié)合(雜交)不依賴于DNA部分與同一第二鏈cDNA上序列的雜交；和(b)當(dāng)與第二引物或片段延伸產(chǎn)物雜交后可用試劑如核糖核酸酶切割。復(fù)合引物結(jié)合到第二鏈cDNA形成部分異質(zhì)雙鏈體，在接觸切割RNA/DNA雜合體中的RNA的試劑(如酶，如核糖核酸酶(如RNaseH))時(shí)，只有上述異質(zhì)雙鏈體中的引物的RNA部分被切割，而第二鏈cDNA保持完整，這樣使得另一復(fù)合引物的退火成為可能。
當(dāng)復(fù)合引物用于此處所述的線性置換擴(kuò)增時(shí)，復(fù)合引物也包含可與第二鏈cDNA上序列雜交的3’DNA部分，這樣該復(fù)合引物與第二鏈cDNA的雜交優(yōu)于該復(fù)合引物與通過DNA聚合酶從第二鏈cDNA置換的核酸鏈的雜交。這些引物可以在熟知影響核酸結(jié)合親和力因素的基礎(chǔ)上合理設(shè)計(jì)，上述影響核酸結(jié)合親和力的因素如序列長度和/或同一性，以及雜交條件。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，復(fù)合引物的3’DNA部分與第二鏈cDNA上互補(bǔ)序列的雜交要優(yōu)于置換鏈的5’末端的同源序列與第二鏈cDNA的雜交。
產(chǎn)生適用于通過聚合作用延伸的引物為本領(lǐng)域公知，諸如在PCT公開號WO99/42618(及其中引用的參考文獻(xiàn))中所描述。復(fù)合引物包含RNA和DNA的組合(參見上述定義)，其3’末端核苷酸為適于核酸延伸的核苷酸。3’末端核苷酸當(dāng)存在于引物中時(shí)可為任一在DNA聚合酶作用下可延伸的核苷酸或類似物。通常3’末端核苷酸具有3’-OH。合適的引物包括那些包含至少一個(gè)RNA部分和至少一個(gè)DNA部分的引物。例如，復(fù)合引物可以包含5’RNA部分和3’DNA部分(其中RNA部分與3’DNA部分毗鄰)；或5’和3’DNA部分中間插有RNA部分。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，復(fù)合引物包含5’RNA部分和3’DNA部分，優(yōu)選地其中RNA部分與3’DNA部分毗鄰。在另一實(shí)施方案中，復(fù)合引物包含5’和3’DNA部分和至少一個(gè)插入RNA部分(即RNA部分在兩個(gè)DNA部分之間)。又在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的復(fù)合引物包含3’DNA部分和至少一個(gè)插入RNA部分(即RNA部分在DNA部分之間)。
包含3’DNA部分和RNA部分的復(fù)合引物中RNA部分的長度可以優(yōu)選地從約1到約50，更優(yōu)選地從約3到約20，甚至更優(yōu)選地從約4到約15，且最優(yōu)選地從約5到約10個(gè)核苷酸。在包含3’DNA部分和RNA部分的復(fù)合引物的一些實(shí)施方案中，RNA部分可至少為約1、3、4、5個(gè)核苷酸中的任何一種，其上限為約10、15、20、25、30、50個(gè)核苷酸中的任何一種。
包含5’RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物中5’RNA部分的長度可以優(yōu)選地從約3到約50，更優(yōu)選地從約5到約20，甚至更優(yōu)選地從約7到約18，優(yōu)選地從約8到約17個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選地從約10到約15個(gè)核苷酸。在包含5’RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物另外的實(shí)施方案中，5’RNA部分可以至少為約3、5、7、8、10個(gè)核苷酸中的任何一種，其上限為約15、17、18、20、50個(gè)核苷酸中的任何一種。在一個(gè)實(shí)施方案中，復(fù)合引物具有約14個(gè)核苷酸的RNA部分。
在包含5’RNA部分和3’DNA部分且還包含非5’RNA部分的復(fù)合引物的實(shí)施方案中，非5’RNA部分可以優(yōu)選地從約1到約7，更優(yōu)選地從約2到約6，且最優(yōu)選地從約3到約5個(gè)核苷酸。在某些包含5’RNA部分和3’DNA部分且還包含非5’RNA部分的復(fù)合引物的實(shí)施方案中，非5’RNA部分可以至少為約1、2、3、5個(gè)核苷酸中的任何一種，其上限為約5、6、7、10個(gè)核苷酸中的任何一種。
在包含5’RNA部分和3’DNA部分且其中5’RNA部分與3’DNA部分毗鄰的復(fù)合引物的實(shí)施方案中，5’RNA部分的長度可以優(yōu)選地從約3到約50，更優(yōu)選地從約5到約20，甚至更優(yōu)選地從約7到約18個(gè)核苷酸，優(yōu)選地從約8到約17個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選地從約10到約15個(gè)核苷酸。在某些包含5’RNA部分和3’DNA部分且其中5’RNA部分與3’DNA部分毗鄰的復(fù)合引物的實(shí)施方案中，5’RNA部分可以至少為約3、5、7、8、10個(gè)核苷酸中的任何一種，其上限為約15、17、18、20、50個(gè)核苷酸中的任何一種。
在包含5’和3’DNA部分并具有至少一個(gè)插入RNA部分的復(fù)合引物中，插入RNA部分的長度可以優(yōu)選地從約1到約7，更優(yōu)選地從約2到約6，且最優(yōu)選地從約3到約5個(gè)核苷酸。在包含5’和3’DNA部分且具有至少一個(gè)插入RNA部分的復(fù)合引物的一些實(shí)施方案中，插入RNA部分可以至少為約1、2、3、5個(gè)核苷酸中的任何一種，其上限為約5、6、7、10個(gè)核苷酸中的任何一種。在包含3’DNA部分和至少一個(gè)插入RNA部分的復(fù)合引物中，插入RNA部分的長度可以優(yōu)選地從約1到約7，更優(yōu)選地從約2到約6，且最優(yōu)選地從約3到約5個(gè)核苷酸。在包含3’DNA部分和至少一個(gè)插入RNA部分的復(fù)合引物的一些實(shí)施方案中，插入RNA部分可以至少為約1、2、3、5個(gè)核苷酸中的任何一種，其上限為約5、6、7、10個(gè)核苷酸中的任何一種。包含3’DNA部分和至少一個(gè)插入RNA部分且還包含5’RNA部分的復(fù)合引物中，5’RNA部分的長度可以優(yōu)選地從約3到約25，更優(yōu)選地從約5到約20，甚至更優(yōu)選地從約7到約18個(gè)核苷酸，優(yōu)選地從約8到約17個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選地從約10到約15個(gè)核苷酸。在包含3’DNA部分和至少一個(gè)插入RNA部分且還包含5’RNA部分的復(fù)合引物的一些實(shí)施方案中，5’RNA部分可以至少為約3、5、7、8、10個(gè)核苷酸中的任何一種，其上限為約15、17、18、20個(gè)核苷酸中的任何一種。
在包含3’DNA部分和RNA部分的復(fù)合引物中，3’DNA部分的長度可以優(yōu)選地從約1到約20，更優(yōu)選地從約3到約18，更優(yōu)選地從約5至約15，且最優(yōu)選地從約7到約12個(gè)核苷酸。在包含3’DNA部分和RNA部分的復(fù)合引物的一些實(shí)施方案中，3’DNA部分可以為至少約1、3、5、7、10個(gè)核苷酸中的任何一種，其上限為約10、12、15、18、20、22個(gè)核苷酸中的任何一種。
在包含5’RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物中，3’DNA部分的長度可以優(yōu)選地從約1到約20，更優(yōu)選地從約3到約18，甚至更優(yōu)選地從約5到約15，且最優(yōu)選地從約7到約12個(gè)核苷酸。在包含5’RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物的一些實(shí)施方案中，3’DNA部分可以為至少約1、3、5、7、10個(gè)核苷酸中的任何一種，其上限為約10、12、15、18、20、22個(gè)核苷酸中的任何一種。
在包含5’RNA部分和3’DNA部分且還包含非3’DNA部分的復(fù)合引物的實(shí)施方案中，非3’DNA部分可以優(yōu)選地從約1到約10，更優(yōu)選地從約2到約8，且最優(yōu)選地從約3到約6個(gè)核苷酸。在包含5’RNA部分和3’DNA部分且還包含非3’DNA部分的復(fù)合引物的一些實(shí)施方案中，非3’DNA部分可以為至少約1、2、3、5個(gè)核苷酸中的任何一種，其上限為約6、8、10、12個(gè)核苷酸中的任何一種。
在包含5’RNA部分和3’DNA部分且其中5’RNA部分與3’DNA部分毗鄰的復(fù)合引物的實(shí)施方案中，3’DNA部分的長度可以優(yōu)選地從約1到約20，更優(yōu)選地從約3到約18，甚至更優(yōu)選地從約5到約15，且最優(yōu)選地從約7到約12個(gè)核苷酸。在包含5’RNA部分和3’DNA部分且其中5’RNA部分與3’DNA部分毗鄰的復(fù)合引物的一些實(shí)施方案中，3’DNA部分可以為至少約1、3、5、7、10個(gè)核苷酸中的任何一種，其上限為約10、12、15、18、20、22個(gè)核苷酸中的任何一種。
在包含5’和3’DNA部分且具有至少一個(gè)插入RNA部分的復(fù)合引物中，非3’DNA部分的長度可以優(yōu)選地從約1到約10，更優(yōu)選地從約2到約8，且最優(yōu)選地從約3到約6個(gè)核苷酸。在包含5’和3’DNA部分且具有至少一個(gè)插入RNA部分的復(fù)合引物的實(shí)施方案中，非3’DNA部分可以為至少約1、2、3、5個(gè)核苷酸中的任何一種，其上限為約6、8、10、12個(gè)核苷酸中的任何一種。
在包含5’和3’DNA部分且具有至少一個(gè)插入RNA部分的復(fù)合引物中，3’DNA部分的長度可以優(yōu)選地從約1到約20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地從約3到約18個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選地從約5到約15個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選地從約7到約12個(gè)核苷酸。在包含5’和3’DNA部分且具有至少一個(gè)插入RNA部分的復(fù)合引物的實(shí)施方案中，3’DNA部分可以為至少約1、2、5、7、10個(gè)核苷酸中的任何一種，其上限為約10、12、15、18、20、22個(gè)核苷酸中的任何一種。
在包含3’DNA部分且具有至少一個(gè)插入RNA部分的復(fù)合引物中，非3’DNA部分(即除3’DNA部分以外的任何DNA部分)的長度可以優(yōu)選地從約1到約10個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地從約2到約8個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選地從約3到約6個(gè)核苷酸。在包含3’DNA部分且具有至少一個(gè)插入RNA部分的復(fù)合引物的一些實(shí)施方案中，非3’DNA部分可以為至少約1、3、5、7、10個(gè)核苷酸中的任何一種，其上限為約6、8、10、12個(gè)核苷酸中的任何一種。在包含3’DNA部分且具有至少一個(gè)插入RNA部分的復(fù)合引物中，3’DNA部分的長度可以優(yōu)選地從約1到約20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地從約3到約18個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選地從約5到約15個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選地從約7到約12個(gè)核苷酸。在包含3’DNA部分和至少一個(gè)插入RNA部分的復(fù)合引物的一些實(shí)施方案中，3’DNA部分可以為至少約1、3、5、7、10個(gè)核苷酸中的任何一種，其上限為約10、12、15、18、20、22個(gè)核苷酸中的任何一種。應(yīng)當(dāng)理解，為在本發(fā)明方法的反應(yīng)條件下合適，不同部分的長度可以更多或更少。
在一些實(shí)施方案中，復(fù)合引物的5’DNA部分包含引物的最5’端核苷酸。在一些實(shí)施方案中，復(fù)合引物的5’RNA部分包含引物的最5’端核苷酸。在另外的實(shí)施方案中，復(fù)合引物的3’DNA部分包含引物的最3’端核苷酸。在一些另外的實(shí)施方案中，3’DNA部分與5’RNA部分毗鄰，并包含引物的最3’端核苷酸(并且5’RNA部分包含引物的最5’端核苷酸)。
復(fù)合引物的總長度可以優(yōu)選地從約10到約50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地從約15到約30個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選地從約20到約25個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，長度可以為至少約10、15、20、25個(gè)核苷酸中的任何一種，其上限為約25、30、50、60個(gè)核苷酸中的任何一種。應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明方法的反應(yīng)條件下，適當(dāng)時(shí)不同部分的長度可以更長或更短。
在一些實(shí)施方案中，復(fù)合引物的5′-DNA部分包括該引物5′的最末端核苷酸。在一些實(shí)施方案中，復(fù)合引物的5′-RNA部分包括該引物5′的最末端核苷酸。在其它實(shí)施方案中，復(fù)合引物的3′-DNA部分包括該引物3′的最末端核苷酸。在其它實(shí)施方案中，3′-DNA部分鄰近于5′-RNA部分，并包括該引物3′的最末端核苷酸(且5′-RNA部分包括該引物5′的最末端核苷酸)。
復(fù)合引物的總長度可優(yōu)選地從約10-約50個(gè)核苷酸、更為優(yōu)選地從約15-約30個(gè)核苷酸、以及最為優(yōu)選地從約20-約25個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，該長度可至少為約10、15、20、25個(gè)核苷酸中的任何一種，上限為約25、30、50、60個(gè)核苷酸中的任何一種。據(jù)認(rèn)為，該長度在本發(fā)明方法的反應(yīng)條件下適當(dāng)時(shí)可更長或更短。
為實(shí)現(xiàn)與靶核酸的雜交(如本領(lǐng)域已眾所周知和了解的一樣，它取決于其它因素如離子強(qiáng)度和溫度)，可與靶多核苷酸雜交的引物部分優(yōu)選地與靶多核苷酸的互補(bǔ)性至少約為60％、更為優(yōu)選地至少約為75％、甚至更為優(yōu)選地至少約為90％、以及最為優(yōu)選地至少約為95％。
如此處所述，在擴(kuò)增反應(yīng)中可使用一種或多種復(fù)合引物。第二引物本發(fā)明方法中的第二引物(其引發(fā)第二引物延伸產(chǎn)物的產(chǎn)生，其中第二引物延伸產(chǎn)物可互換地稱為第二鏈cDNA，)包含可與第一鏈cDNA(可互換地稱為第一引物延伸產(chǎn)物)在第一鏈cDNA的位點(diǎn)上雜交(在給定的條件下)的序列(其可以是或不是引物的全部)，這樣第二鏈cDNA包括目的RNA序列。在一些實(shí)施方案中，第二引物的可雜交序列根據(jù)第一鏈cDNA上想要結(jié)合的位點(diǎn)的已知序列設(shè)計(jì)。在另外的實(shí)施方案中，可雜交序列根據(jù)例如本領(lǐng)域公知的適合隨機(jī)引發(fā)第一鏈cDNA的隨機(jī)序列，上述第一鏈cDNA從多種RNA樣本中產(chǎn)生。在另外的實(shí)施方案中，第二引物包含鏈轉(zhuǎn)換寡核苷酸(在美國專利號5,962,271和5,962,272中描述)，其可以與存在于mRNA上的帽序列雜交，并引起反轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板轉(zhuǎn)換到轉(zhuǎn)換寡核苷酸，導(dǎo)致由“轉(zhuǎn)換寡核苷酸”引發(fā)的第二鏈cDNA的產(chǎn)生?；蛘?，將同聚物尾序加到第一引物延伸產(chǎn)物的3’末端，這樣第二引物包含同聚物尾序的互補(bǔ)序列。
在一些實(shí)施方案中，第二引物包含DNA。在其它實(shí)施方案中，第二引物由DNA組成。在其它實(shí)施方案中(如此處所述)第二引物為靶RNA的片段，上述片段由RNA靶序列的切割產(chǎn)生。
在一些實(shí)施方案中，第二引物(其引發(fā)第二鏈cDNA的產(chǎn)生)為復(fù)合引物(如上所述)。在這些實(shí)施方案中，方法包括下列步驟(a)雙鏈cDNA的形成，上述雙鏈cDNA在其一端包含RNA-DNA異質(zhì)雙鏈體；和(b)第一鏈(正義)cDNA的線性擴(kuò)增，由此產(chǎn)生單鏈第一鏈cDNA的多拷貝。
為與第一鏈cDNA雜交(正如本領(lǐng)域所知和理解的，這取決于其它因素例如離子強(qiáng)度和溫度)，第二引物中可與第一鏈cDNA雜交的序列與第一鏈cDNA的互補(bǔ)性優(yōu)選地至少約60％，更優(yōu)選地至少約75％，甚至更優(yōu)選地至少約90％，且最優(yōu)選地至少約95％。
在某些實(shí)施方案(通常但并非必需為包括轉(zhuǎn)錄的實(shí)施方案)中，第二引物也可包含在一組給定的條件下不可與第一鏈cDNA雜交的序列，優(yōu)選地為在5’端的序列(其通常包括5’最末端的核苷酸)。該序列使第二鏈cDNA的5’末端產(chǎn)生特定末端序列(并且因此，隨后使單鏈DNA產(chǎn)物的3’末端產(chǎn)生特定序列)成為可能。單鏈DNA產(chǎn)物的3’末端具有特定末端序列對于在隨后的步驟中前啟動(dòng)子多核苷酸與置換的第一引物延伸產(chǎn)物的雜交特別有利。在某些實(shí)施方案中，5’非雜交序列包含其互補(bǔ)序列可被前啟動(dòng)子多核苷酸雜交的序列。包含3’特定末端序列的單鏈DNA產(chǎn)物對與連接在結(jié)合對或基片上的互補(bǔ)寡核苷酸的雜交也是有用的，其中所述基片如此處所述的基因微陣列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第二引物包含DNA。在另一實(shí)施方案中，第二引物包含RNA。又在另一實(shí)施方案中，第二引物包含DNA和RNA。
在一些實(shí)施方案中，第二引物通過復(fù)合引物延伸產(chǎn)物3’末端的自身引發(fā)(例如通過發(fā)卡環(huán))提供。在這些實(shí)施方案中，復(fù)合引物延伸產(chǎn)物3’末端的序列與復(fù)合引物延伸產(chǎn)物自身的另一序列雜交，例如正如美國專利號6,132,997中所述。在這些實(shí)施方案中，在復(fù)合引物延伸產(chǎn)物3’端的所述序列通常在其與復(fù)合引物延伸產(chǎn)物雜交和/或其沿復(fù)合引物延伸產(chǎn)物延伸后被切割(例如，利用S1核酸酶)。美國專利號6,132,997。
在一些實(shí)施方案中，第二引物由一個(gè)或多個(gè)靶RNA片段提供。這種靶RNA片段可以由靶RNA和第一引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體上的靶RNA被切割RNA/DNA雜合體上RNA的試劑(比如酶)不完全降解而產(chǎn)生，于是一個(gè)或多個(gè)靶RNA片段仍與第一引物延伸產(chǎn)物保持結(jié)合。包含前啟動(dòng)子并包含與引物延伸產(chǎn)物雜交的區(qū)域的多核苷酸一些實(shí)施方案使用了包含前啟動(dòng)子并包含與引物延伸產(chǎn)物產(chǎn)物雜交的區(qū)域的前啟動(dòng)子多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，前啟動(dòng)子多核苷酸作為PTO提供，這一點(diǎn)如下詳述。
前啟動(dòng)子模板寡核苷酸在一些實(shí)施方案中，方法使用由前啟動(dòng)子模板寡核苷酸(PTO)提供的用于轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列。
在本發(fā)明方法和組合物中使用的PTO為單鏈多核苷酸，一般為DNA，其包含設(shè)計(jì)用于形成RNA聚合酶的雙鏈啟動(dòng)子的前啟動(dòng)子序列，并包含可與引物延伸產(chǎn)物的3’末端雜交的部分。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可與引物延伸產(chǎn)物的3’末端雜交的部分包含這樣的序列，該序列的互補(bǔ)序列可與第二引物延伸產(chǎn)物的特定末端序列雜交(并且因此，接下來與單鏈DNA產(chǎn)物的3’末端雜交)。在另一實(shí)施方案中，可與引物延伸產(chǎn)物的3’末端雜交的部分包含隨機(jī)序列。在另一實(shí)施方案中，可與引物延伸產(chǎn)物的3’末端雜交的部分包含這樣的序列，該序列的互補(bǔ)序列可與多種第一鏈cDNA的3’末端序列雜交。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，前啟動(dòng)子序列位于寡核苷酸的5’部分，并且雜交序列位于寡核苷酸的3’部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，并且最為典型的是，啟動(dòng)子和雜交序列為不同的序列。在另一實(shí)施方案中，啟動(dòng)子和雜交序列在序列同一性上有重疊。又在另一實(shí)施方案中，啟動(dòng)子和雜交序列為相同的序列，并因此位于PTO的同一位置。在PTO與引物延伸產(chǎn)物雜交導(dǎo)致產(chǎn)生包含突出端(不與置換的引物延伸產(chǎn)物雜交的PTO的5’末端一般包含全部或部分前啟動(dòng)子序列)的雙鏈體的實(shí)施方案中，用DNA聚合酶填平突出端，以產(chǎn)生可通過合適的RNA聚合酶實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的雙鏈啟動(dòng)子。
允許模板DNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列為本領(lǐng)域公知并在以上進(jìn)行了討論。優(yōu)選地，選擇啟動(dòng)子序列以提供所使用的特定RNA聚合酶的最佳轉(zhuǎn)錄活性。此類選擇的標(biāo)準(zhǔn)，即尤其為特定RNA聚合酶所偏好的特定啟動(dòng)子序列也為本領(lǐng)域公知。例如，通過T7 DNA依賴的RNA聚合酶和SP6轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列為本領(lǐng)域公知。啟動(dòng)子序列可來自于原核或真核源。
在一些實(shí)施方案中，PTO在前啟動(dòng)子序列和可與引物延伸產(chǎn)物的3’末端雜交的部分之間包含插入序列。可由經(jīng)驗(yàn)確定插入序列的合適長度，并且該長度可以至少約為1、2、4、6、8、10、12、15個(gè)核苷酸。插入序列合適的序列組成也可以由經(jīng)驗(yàn)確定，并且與省略這段序列相比，此序列設(shè)計(jì)優(yōu)選但不必需增強(qiáng)擴(kuò)增的程度。在一個(gè)實(shí)施方案中，插入序列是設(shè)計(jì)用以提供增強(qiáng)或更優(yōu)化所使用RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄的序列。通常該序列與靶核酸無關(guān)(即其基本上不與靶核酸雜交)。當(dāng)啟動(dòng)子可操作地與該序列連接且從這樣的啟動(dòng)子的進(jìn)行的聚合酶轉(zhuǎn)錄活性高于來自沒有這樣連接的啟動(dòng)子時(shí)，更為優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄就發(fā)生了。需要用于優(yōu)化轉(zhuǎn)錄的序列通常在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，如以前對多種DNA依賴的RNA聚合酶的描述，如在美國專利號5766849和5654142中所描述的，并且也可由經(jīng)驗(yàn)來確定。
在另一實(shí)施方案中，PTO包含前啟動(dòng)子序列5’的序列，即PTO包含位于前啟動(dòng)子序列5’的額外的核苷酸(其可以是或可以不是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列)。該序列通常但并非必需(在一組給定的條件下)不與引物延伸產(chǎn)物雜交。
在一個(gè)實(shí)施方案中，PTO不能作為引物有效行使核酸延伸的功能。阻斷PTO引物功能的技術(shù)包括阻止DNA聚合酶在PTO的3′末端添加核苷酸的任一技術(shù)。這些技術(shù)在本領(lǐng)域已眾所周知，包括例如在PTO的3′最末端進(jìn)行置換或修飾3′羥基、或摻入修飾的核苷酸，如雙脫氧核苷酸，這樣使DNA聚合酶不能在PTO的3’最末端錨上額外的核苷酸?？捎脴?biāo)記或特異結(jié)合對中一員的小分子如生物素封閉3′末端。也可通過加入不與引物延伸產(chǎn)物雜交的核苷酸來使3′末端不可延伸，這歸因于非互補(bǔ)性或不支持氫鍵的結(jié)構(gòu)修飾。在其它實(shí)施方案中，PTO未被封閉。
與目的引物延伸產(chǎn)物雜交的PTO部分的長度優(yōu)選地從約5個(gè)至約50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地從約10個(gè)至約40個(gè)核苷酸，甚至更為優(yōu)選地從約15個(gè)至約35個(gè)核苷酸，以及最為優(yōu)選地從約20個(gè)至約30個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，雜交部分至少約為下述之一3、5、10、15、20個(gè)核苷酸；并小于約下述之一30、40、50、60個(gè)核苷酸。雜交部分與它在目的引物延伸產(chǎn)物上預(yù)期結(jié)合序列的互補(bǔ)性優(yōu)選地至少約25％，更為優(yōu)選地至少約50％，甚至更為優(yōu)選地至少約75％，以及最為優(yōu)選地至少約90％。DNA聚合酶、可切割RNA-DNA雜合體的試劑和RNA聚合酶本發(fā)明擴(kuò)增方法使用下述酶RNA依賴的DNA聚合酶、DNA依賴的DNA聚合酶和可切割RNA-DNA雜合體上RNA鏈的試劑(如核糖核酸酶，諸如RNaseH)，以及在一些方面使用了DNA依賴的RNA聚合酶。在單一酶中可找到和使用這些活性中的一種或多種。例如，RNaseH活性可由RNA依賴的DNA聚合酶(如反轉(zhuǎn)錄酶)提供，或由單獨(dú)的酶提供。用于本方法的反轉(zhuǎn)錄酶可以具有或不具有RNaseH活性。
本發(fā)明的一個(gè)方面是從引物-RNA復(fù)合體形成雙鏈cDNA。該過程通常利用RNA依賴的DNA聚合酶、DNA依賴的DNA聚合酶和可切割RNA/DNA雜合體上RNA的試劑(如RNaseH)的酶活性。
本發(fā)明的方法和組合物中使用的RNA依賴的DNA聚合酶可根據(jù)本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)引物延伸。因此，優(yōu)選的RNA依賴的DNA聚合酶是可沿著核酸模板延伸核酸引物的酶，其中所述模板至少主要由核糖核苷酸組成。本發(fā)明的方法和組合物中使用的合適RNA依賴的DNA聚合酶包括反轉(zhuǎn)錄酶。許多反轉(zhuǎn)錄酶如那些來源于鳥成髓細(xì)胞性白血病病毒(AMV-RT)和莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV-RT)的反轉(zhuǎn)錄酶包含一種以上的活性(例如聚合酶活性和核糖核酸酶活性)，并可在cDNA分子形成中發(fā)揮作用。然而，在一些實(shí)例中，優(yōu)選采用無RNaseH活性的反轉(zhuǎn)錄酶。無RNaseH活性的反轉(zhuǎn)錄酶在本領(lǐng)域中已眾所周知，此類酶包括那些在野生型反轉(zhuǎn)錄酶中具有可消除RNaseH活性的突變的反轉(zhuǎn)錄酶。在這些情況下，可采用加入其它來源的RNaseH，如分離自大腸桿菌的RNaseH，來形成cDNA。
本發(fā)明的方法和組合物中使用的DNA依賴的DNA聚合酶可根據(jù)本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)引物延伸。因此，優(yōu)選的聚合酶是可沿著核酸模板延伸核酸引物的酶，其中所述模板至少主要包含脫氧核糖核苷酸?？赏ㄟ^具有RNA依賴的DNA聚合酶和DNA依賴的DNA聚合酶酶活性的反轉(zhuǎn)錄酶實(shí)施雙鏈cDMA的形成。根據(jù)本發(fā)明的某些方法，對RNA序列的擴(kuò)增涉及到使用可從置換鏈結(jié)合的多核苷酸上置換該核酸鏈的DNA聚合酶，并且可優(yōu)選顯示更強(qiáng)鏈置換能力(即與其它沒有如此鏈置換能力的聚合酶相比)的聚合酶。優(yōu)選地，DNA聚合酶對雜交于核酸鏈的寡核苷酸的3′末端有高親和力。優(yōu)選地，DNA聚合酶不具有相當(dāng)大的缺口填補(bǔ)活性。一般地，為將引物的降解或引物延伸多核苷酸的降解減至最小，聚合酶優(yōu)選地具有極少或無5′-3′核酸外切酶活性。通常該核酸外切酶活性依賴于多種因素，如pH、鹽濃度、模板是雙鏈或是單鏈等，所有這些是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。5′-3′核酸外切酶活性已被刪除的突變DNA聚合酶在本領(lǐng)域中已眾所周知，并且適合于此處描述的擴(kuò)增方法。缺少5’至3’外切酶活性和3’至5’外切酶活性的突變DNA聚合酶也已有描述，例如，exo-/-Klenow DNA聚合酶。優(yōu)選的是，DNA聚合酶以該聚合酶和引物延伸產(chǎn)物5’末端間的至少約25％的接觸幾率，更為優(yōu)選地至少約50％，甚至更為優(yōu)選地至少約75％，以及最為優(yōu)選地至少約90％的接觸機(jī)率從模板核酸上置換引物延伸產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選使用具有鏈置換活性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶。這種聚合酶為本領(lǐng)域公知，諸如在美國專利號5744312中所述(于此引用作為參考)。優(yōu)選地，DNA聚合酶具有極小的或無校正活性。
本發(fā)明方法和組合物中適用的DNA聚合酶包括那些公開在美國專利號5648211和5744312中的聚合酶，其包括exo-Vent(New EnglandBiolabs)、exo-Deep Vent(New England Biolabs)、Bst(BioRad)、exo-Pfu(Stratagene)、Bca(Panvera)、測序級Taq(Promega)、exo-/-KlenowDNA聚合酶和來自thermoanaerobacter thermoh ydrosulfuricus的熱穩(wěn)定DNA聚合酶。
本發(fā)明方法和組合物使用的核糖核酸酶可切割RNA/DNA雜合體上核糖核苷酸。優(yōu)選地，核糖核酸酶切割RNA/DNA雜合體上的核糖核苷酸，而不管與被切割核糖核苷酸相鄰的核苷酸的特征和類型。核糖核酸酶的切割不依賴于序列特征是優(yōu)選的。本發(fā)明方法和組合物中適用的核糖核酸酶的實(shí)例為本領(lǐng)域公知，包括核糖核酸酶H(RNaseH)，后者包括Hybridase。
本發(fā)明的方法和組合物中使用的DNA依賴的RNA聚合酶在本領(lǐng)域已眾所周知。可使用真核或原核聚合酶。其實(shí)例包括T7、T3和SP6 RNA聚合酶。通常所選擇的RNA聚合酶可從此處所述的前啟動(dòng)子多核苷酸提供的啟動(dòng)子序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。通常RNA聚合酶是DNA依賴的聚合酶，只要啟動(dòng)子區(qū)域是雙鏈的，該酶優(yōu)選地可從單鏈DNA模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
總之，本發(fā)明的方法和組合物中所用的酶不應(yīng)使所述方法和組合物的核酸成分產(chǎn)生相當(dāng)多的降解。反應(yīng)條件和檢測實(shí)施本發(fā)明方法的合適反應(yīng)介質(zhì)和條件是那些根據(jù)本發(fā)明的方法允許核酸擴(kuò)增的反應(yīng)介質(zhì)和條件。這些介質(zhì)和條件已為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，并且在多個(gè)公開專利中有所描述，如美國專利號5,554,516、5,716,785、5,130,238、5,194,370、6,090,591、5,409,818、5,554,517、5,169,766、5,480,784、5,399,491和5,679,512以及PCT公開號WO99/42618。例如緩沖液可以是Tris緩沖液，雖然也可使用其它緩沖液，但條件是只要緩沖液成分不抑制本發(fā)明方法的酶成分。pH優(yōu)選地從約5至約11，更為優(yōu)選地從約6至約10，甚至更為優(yōu)選地從約7至約9，以及最為優(yōu)選地從約7.5至約8.5。反應(yīng)介質(zhì)也可包括雙價(jià)金屬離子，如Mg2+或Mn2+，游離離子的終濃度在約0.01至約15mM的范圍內(nèi)，并且最為優(yōu)選地從約1至10mM。反應(yīng)介質(zhì)也可包括有助于介質(zhì)總離子強(qiáng)度的其它鹽，如KCl或NaCl。例如，鹽如KCl的范圍優(yōu)選地從約0至約125mM，更為優(yōu)選地從約0至約100mM，以及最為優(yōu)選地從約0至約75mM。反應(yīng)介質(zhì)還可包括可影響擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行，但不是構(gòu)成本方法酶成分活性的添加劑。這樣的添加劑包括蛋白質(zhì)如BSA、單鏈結(jié)合蛋白(例如T4基因32蛋白)，以及非離子去污劑如NP40或Triton。也可包括能維持酶活性的試劑，如DTT。這樣的試劑在本領(lǐng)域中眾所周知。適當(dāng)時(shí)，也可包括不抑制本方法采用的RNase活性的RNase抑制劑(如RNasin)。本發(fā)明方法的任一方面可在相同或不同溫度下進(jìn)行。優(yōu)選的是，在等溫下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)(尤其是引物延伸(而不是第一鏈和第二鏈cDNA合成步驟)和鏈置換)，這避免了煩瑣的熱循環(huán)過程。擴(kuò)增反應(yīng)在某一溫度下進(jìn)行，該溫度使得本發(fā)明的寡核苷酸(引物和/或PTO)與模板多核苷酸和引物延伸產(chǎn)物雜交，并且基本上不抑制所使用酶的活性。溫度優(yōu)選地在約25℃到約85℃，更優(yōu)選地從約30℃到約80℃，且最優(yōu)選地從37℃到約75℃的范圍內(nèi)。在一些包括RNA轉(zhuǎn)錄的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄步驟的溫度低于之前步驟的溫度。在這些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄步驟的溫度可以優(yōu)選地從約25℃到約85℃，更優(yōu)選地從約30℃到約75℃，且最優(yōu)選地從37℃到約70℃的范圍內(nèi)。
可用于合成本發(fā)明方法中引物延伸產(chǎn)物的核苷酸和/或核苷酸類似物(如脫氧核糖核苷酸三磷酸)的量優(yōu)選地從約50到約2500μM，更優(yōu)選地從約100到約2000μM，甚至更優(yōu)選地從約200到約1700μM，且最優(yōu)選地從約250到1500μM。在一些實(shí)施方案中，包括在引物延伸鏈中存在可增強(qiáng)鏈置換(例如，通過引起弱于常規(guī)AT、CG堿基對的堿基配對)的核苷酸或核苷酸類似物。這些核苷酸或核苷酸類似物為本領(lǐng)域公知，包括脫氧肌苷和其它修飾堿基。本發(fā)明方法中用于合成RNA轉(zhuǎn)錄本的核苷酸和/或類似物(如核糖核苷酸三磷酸)的量優(yōu)選地從約0.25到約6mM，更優(yōu)選地從約0.5到約5mM，甚至更優(yōu)選地從約0.75到約4mM，且最優(yōu)選地從約1到3mM。
本發(fā)明擴(kuò)增反應(yīng)的寡核苷酸成分通常超過欲擴(kuò)增的靶核酸序列數(shù)。它們的供給約為或至少約為下述之一10、102、104、106、108、1010、1012倍于靶核酸的量。復(fù)合引物和PTO各自的供給約為或至少約為下述濃度之一50nM、100nM、500nM、1000nM、2500nM、5000nM。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在擴(kuò)增過程的開始階段同時(shí)加入上述的組分。在另一實(shí)施方案中，在擴(kuò)增反應(yīng)需要和/或允許的情況下，于擴(kuò)增過程期間的適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)之前或之后，按任意次序加入組分。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員容易確定這樣的時(shí)間點(diǎn)，這樣的一些時(shí)間點(diǎn)在下面有記錄。在靶核酸變性步驟之前，將用于本發(fā)明方法的核酸擴(kuò)增的酶加入反應(yīng)混合物，隨后進(jìn)行變性步驟，或在引物與靶多核苷酸雜交后，將用于本發(fā)明方法的核酸擴(kuò)增的酶加入反應(yīng)混合物，這由它們的熱穩(wěn)定性和/或其它為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的因素決定。第一鏈cDNA(復(fù)合引物延伸產(chǎn)物)和第二鏈cDNA(第二引物延伸產(chǎn)物)合成反應(yīng)可以連續(xù)地進(jìn)行，緊隨其后的是擴(kuò)增步驟(被另一復(fù)合引物結(jié)合，引物延伸和鏈置換)。在這些實(shí)施方案中，不同反應(yīng)的反應(yīng)條件和組分可以不同。
擴(kuò)增過程可以在不同的時(shí)間點(diǎn)終止，并且可以在隨后的時(shí)間重新開始。所述時(shí)間點(diǎn)可以被本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地認(rèn)定。一個(gè)時(shí)間點(diǎn)是在第一鏈cDNA合成結(jié)束時(shí)。另一個(gè)時(shí)間點(diǎn)是在第二鏈cDNA合成結(jié)束時(shí)。終止反應(yīng)的方法為本領(lǐng)域公知，包括例如冷卻反應(yīng)混合物到抑制酶活性的溫度或加熱反應(yīng)混合物到破壞酶活性的溫度。重新開始反應(yīng)的方法為本領(lǐng)域公知，包括例如將反應(yīng)混合物溫度提高至允許酶活性的溫度，或重新補(bǔ)充破壞(消耗)的酶。在一些實(shí)施方案中，在反應(yīng)重新開始之前、開始時(shí)或之后補(bǔ)充反應(yīng)的一種或多種組分。例如，如果使用同一復(fù)合引物，在開始線性擴(kuò)增反應(yīng)前可能必需補(bǔ)充復(fù)合引物?；蛘咦尫磻?yīng)沒有間斷地進(jìn)行(即從開始至結(jié)束)。
反應(yīng)可以不必純化中間產(chǎn)物(如去除引物)地進(jìn)行。產(chǎn)物可以在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)純化，上述時(shí)間點(diǎn)易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。一個(gè)時(shí)間點(diǎn)是在第一鏈cDNA合成結(jié)束時(shí)。另一個(gè)時(shí)間點(diǎn)是在第二鏈cDNA合成結(jié)束時(shí)。我們已經(jīng)觀察到第一和第二cDNA的常規(guī)純化導(dǎo)致在隨后的線性擴(kuò)增步驟中產(chǎn)生稍高的擴(kuò)增效率。
擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出表明存在靶序列。定量分析也是可行的。直接和間接檢測方法(包括定量)在本領(lǐng)域廣為人知。例如，通過比較從包含未知量的含有靶序列的多核苷酸的測試樣品中的擴(kuò)增產(chǎn)物量和具有已知量的靶序列的多核苷酸的參照樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物量，可確定測試樣品中靶序列的量。本發(fā)明的方法也可延伸至用于序列改變的分析和靶核酸的測序。而且可通過例如檢查來自RNA擴(kuò)增產(chǎn)物的翻譯產(chǎn)物可實(shí)現(xiàn)檢測。本發(fā)明的組合物和試劑盒本發(fā)明也提供了此處所述方法中使用的組合物和試劑盒。這些組合物可為是此處所述的任一組分、反應(yīng)混合物和/或中間體以及它們的任一組合。例如，本發(fā)明提供了包含復(fù)合引物和第二引物的組合物，其中第二引物為隨機(jī)引物。在一些實(shí)施方案中，第二引物包含DNA。在另外的實(shí)施方案中，第二引物由DNA組成。又在另一實(shí)施方案中，組合物包含含有非靶序列的復(fù)合引物和第二引物其中所述非靶序列的包含目的在于產(chǎn)生前啟動(dòng)子多核苷酸可雜交的置換的引物延伸產(chǎn)物。該第二引物也可以為隨機(jī)引物。
在一些實(shí)施方案中，復(fù)合引物包含與DNA部分毗鄰的RNA部分。在另外的實(shí)施方案中，復(fù)合引物包含具有至少一個(gè)插入RNA部分的5’-和3’-DNA部分。在其它實(shí)施方案中，復(fù)合引物包含多聚dT部分。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包含的復(fù)合引物為隨機(jī)引物。在一些實(shí)施方案中，包含多聚dT部分的隨機(jī)復(fù)合引物或復(fù)合引物還包含不與靶雜交的部分(在引物的一部分與靶序列雜交的條件下)。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含這樣的復(fù)合引物的組合物，該復(fù)合引物還通過與這樣的部分連接而衍生，該部分可實(shí)現(xiàn)將包含該復(fù)合引物的多核苷酸連接至用于制備核酸微陣列的固體基片上。在一些實(shí)施方案中，復(fù)合引物還可以通過與正電荷部分如胺相連而衍生。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含復(fù)合引物并包含含有前啟動(dòng)子序列的多核苷酸如PTO(即此處所述那些實(shí)施方案中的任何一種)的組合物。至于含有隨機(jī)引物的組合物，這些組合物也可以含有多種隨機(jī)引物(即具有不同序列的隨機(jī)引物群)。
在某些實(shí)施方案中，組合物包含(a)復(fù)合引物；(b)第二引物(其可以是隨機(jī)引物)；以及(c)反轉(zhuǎn)錄酶。在另外的實(shí)施方案中，組合物包含(a)復(fù)合引物；(b)第二引物(其可以是隨機(jī)引物)；(c)反轉(zhuǎn)錄酶；以及(d)DNA聚合酶。在一些實(shí)施方案中，組合物包含(a)復(fù)合引物；(b)第二引物(其可以是隨機(jī)引物)；以及(c)包含前啟動(dòng)子序列的多核苷酸(其可以是PTO)。上述組合物中的任何一種組合物還可以包含靶RNA(其含有目的RNA序列)和/或此處描述的任一種酶(諸如DNA聚合酶如反轉(zhuǎn)錄酶、RNaseH和/或RNA聚合酶)。組合物一般以冷冷凍干燥燥或液態(tài)形式存在，優(yōu)選地在合適的緩沖液中。
本發(fā)明也提供了包含此處描述的擴(kuò)增產(chǎn)物的組合物。因此，本發(fā)明提供了為靶序列的拷貝或互補(bǔ)序列的DNA或RNA分子群，其通過此處描述的任何方法(或包含產(chǎn)物的組合物)產(chǎn)生。
另一方面，本發(fā)明提供了為靶序列拷貝或互補(bǔ)序列的正義多核苷酸(優(yōu)選DNA)分子群和反義多核苷酸(優(yōu)選DNA)分子群，其通過此處描述的任何方法產(chǎn)生。本發(fā)明也包括這些群體的組合物和多種結(jié)構(gòu)(如陣列)，其可以是同源的(相同序列)或異源的(不同序列)。這些群體可以是此處描述方法獲得的序列的任意組合，包括建立在mRNA，以及某些mRNA樣本或類型。
雖然組合物可以冷凍干燥狀態(tài)存在，但它們通常溶于適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中。適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)包括但不限于含水介質(zhì)(如純水或緩沖液)。
本發(fā)明提供了用于進(jìn)行本發(fā)明方法的試劑盒。因此，以適當(dāng)?shù)陌b提供了多種試劑盒。試劑盒可用于任何一種或多種此處所述的用途，并且因此應(yīng)包括任何一種或多種下述用途的說明書擴(kuò)增RNA序列；目的RNA序列的測序；在擴(kuò)增RNA序列的基礎(chǔ)上檢測序列突變(即基因分型或核酸突變檢測)；確定目的序列存在與否；表達(dá)譜的方法；消減雜交的方法；消減雜交探針制備方法；差異擴(kuò)增方法；文庫制備方法(包括cDNA文庫和差異表達(dá)文庫)；固定化核酸的制備方法(其可以為固定于微陣列上的核酸)，以及鑒定用本發(fā)明方法產(chǎn)生的擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物的方法。
本發(fā)明的試劑盒包含一個(gè)或多個(gè)容器，它們含有此處所述組分的任一組合，試劑盒可以包括此處描述的任何復(fù)合引物。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含2種或多種復(fù)合引物和第二引物，其可以單獨(dú)包裝或不單獨(dú)包裝。試劑盒可以包含復(fù)合引物并包含含有前啟動(dòng)子序列的多核苷酸(其可以是PTO)。試劑盒還可以包含第二引物(其可以是隨機(jī)引物)。復(fù)合引物可以標(biāo)記或未標(biāo)記。試劑盒也還可以任選地包含任意一種或多種此處描述的酶(例如RNA依賴的DNA聚合酶諸如反轉(zhuǎn)錄酶，以及核糖核酸酶諸如RNaseH)，以及脫氧核糖核苷酸三磷酸(標(biāo)記或未標(biāo)記)和/或核糖核苷酸三磷酸(標(biāo)記或未標(biāo)記)。試劑盒也可以包含一種或多種合適的緩沖液(如此處所述)。用于核酸測序的試劑盒可以任選地包括標(biāo)記或未標(biāo)記的核苷酸類似物，其在摻入引物延伸產(chǎn)物或RNA轉(zhuǎn)錄本后實(shí)現(xiàn)核苷酸聚合的終止。試劑盒中的一種或多種試劑可以干粉的形式提供，通常是冷凍干燥粉，其中所述試劑包括賦形劑，溶解后使試劑溶液具有適當(dāng)?shù)臐舛?，以進(jìn)行此處所述的任何方法。每一組分可包裝在分開的容器中，或當(dāng)交叉反應(yīng)性和保存期限允許時(shí)，可將一些組分合并置于一個(gè)容器中。
本發(fā)明的試劑盒可任選地包括一套說明書，通常為與本發(fā)明方法的組分使用相關(guān)的書面說明書，用于擴(kuò)增預(yù)期核酸和/或適當(dāng)?shù)脑捰糜趯U(kuò)增產(chǎn)物用作進(jìn)行如核酸測序和檢測序列突變，含有說明書的電子存儲(chǔ)介質(zhì)(如磁盤或光盤)是可接受的提供說明書的模式。包含在試劑盒內(nèi)的說明書通常包括關(guān)于開展本發(fā)明方法所必需的試劑(包含或不包含在試劑盒內(nèi))、怎樣使用試劑盒的說明和/或適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件的信息。例如，本發(fā)明試劑盒可以包含復(fù)合引物(其可以包含多聚dT部分和/或?yàn)殡S機(jī)引物)、第二引物(其可以為隨機(jī)引物)，以及根據(jù)本發(fā)明方法使用這些引物擴(kuò)增RNA的說明書。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的試劑盒包含復(fù)合引物(其可以包含多聚dT部分和/或?yàn)殡S機(jī)引物)，以及根據(jù)本發(fā)明方法使用此引物擴(kuò)增RNA的說明書。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的試劑盒包含復(fù)合引物、第二引物(其可以為隨機(jī)引物)，以及根據(jù)本發(fā)明的方法從RNA靶產(chǎn)生雙鏈互補(bǔ)DNA和/或擴(kuò)增RNA的說明書。又在另一實(shí)施例中，這些試劑盒中的任一試劑盒還包含前啟動(dòng)子多核苷酸以及根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生引物延伸產(chǎn)物和前啟動(dòng)子多核苷酸雙鏈體以使雙鏈啟動(dòng)子區(qū)域產(chǎn)生和/或擴(kuò)增RNA的說明書。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的試劑盒包含能產(chǎn)生第一鏈cDNA的復(fù)合引物(其可包含多聚dT部分和/或?yàn)殡S機(jī)引物)、能與第一鏈cDNA雜交的第二復(fù)合引物，以及根據(jù)任一本發(fā)明方法使用這些引物產(chǎn)生雙鏈cDNA的說明書。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的試劑盒包含雙鏈cDNA復(fù)合體(包含第一和第二鏈cDNA)，其含有3’單鏈DNA部分。又在另外的實(shí)施方案中，任一這些試劑盒中還包含一個(gè)或多個(gè)對照(其可以是例如RNA模板、復(fù)合引物和/或含有3’單鏈DNA部分的雙鏈cDNA復(fù)合體(包含第一和第二鏈cDNA))。
試劑盒的組分可以以任何方便、適當(dāng)?shù)陌b提供。組分可以單獨(dú)包裝或以一個(gè)或多個(gè)組合包裝。其中試劑盒提供用于進(jìn)行涉及轉(zhuǎn)錄的本發(fā)明擴(kuò)增方法時(shí)，RNA聚合酶(如果包括的話)不與轉(zhuǎn)錄步驟之前的步驟中所用的組分一同提供，優(yōu)選地單獨(dú)提供。
試劑盒中不同組分的相對量可有很大不同，以提供相當(dāng)程度上優(yōu)化操作此處公開方法進(jìn)行的反應(yīng)的試劑濃度和/或提供進(jìn)一步優(yōu)化任一實(shí)驗(yàn)的敏感性的試劑濃度。
本發(fā)明也提供了實(shí)現(xiàn)此處所述方法的體系。這些系統(tǒng)包括上述討論的組分的多種組合。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了適于產(chǎn)生靶多核苷酸序列(或擴(kuò)增靶多核苷酸序列)的體系，上述體系包含(a)復(fù)合引物(任一此和所述的復(fù)合引物)，(b)DNA聚合酶；和(c)核糖核酸酶。在一些實(shí)施方案中，體系還包含含有前啟動(dòng)子序列的多核苷酸(其可以是為PTO)和DNA依賴的RNA聚合酶。在另外的實(shí)施方案中，體系還包含RNA依賴的DNA聚合酶。任一體系實(shí)施方案也可以包含此處描述的模板(靶)序列。體系通?？砂ㄒ环N或多種用于開展本發(fā)明的擴(kuò)增方法的儀器。這樣的儀器包括如加熱設(shè)備(如加熱部件或水浴)和實(shí)現(xiàn)此處所述方法的一步或多步的自動(dòng)化儀器。由于任何步驟都不需要熱循環(huán)，故本發(fā)明方法尤其適于使用小型裝置。合適裝置的非限制性實(shí)例包括BioAnalyzer(Agilant和Caliper)和eSensor。
本發(fā)明也提供了包含此處所述組分的多種組合的反應(yīng)混合物(或包含反應(yīng)混合物的組合物)。已對反應(yīng)混合物的實(shí)例進(jìn)行了描述。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的反應(yīng)混合物包括(a)靶RNA；(b)包含3’DNA部分和RNA部分的復(fù)合引物；(c)第二引物；以及(d)DNA聚合酶。正如此處所述，反應(yīng)混合物可以包含任一復(fù)合引物(或多種復(fù)合引物)，包含含有與3’DNA部分毗鄰的5’RNA部分的復(fù)合引物。反應(yīng)混合物也可以進(jìn)一步包括從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶，諸如RNaseH。本發(fā)明的反應(yīng)混合物還可包含含有此處所述的前啟動(dòng)子序列的多核苷酸。反應(yīng)混合物的另一實(shí)例是(a)置換的引物延伸產(chǎn)物(且在其5’末端含有與復(fù)合引物3’DNA部分互補(bǔ)的序列，但不含與復(fù)合引物的RNA部分互補(bǔ)的序列)；(b)包含前啟動(dòng)子序列的多核苷酸(例如PTO)；以及(c)RNA聚合酶。其它的反應(yīng)混合物在此處描述，并為本發(fā)明所包括。
本發(fā)明也包括含有此處所述任一復(fù)合體(為此處所述方法的中間體)的組合物。這樣的復(fù)合體的實(shí)例于圖1-8中示意描述。作為實(shí)例，一種本發(fā)明的復(fù)合體包含(a)靶RNA鏈；和(b)復(fù)合引物，所述復(fù)合引物包含3’DNA部分和RNA部分。復(fù)合引物可以具有與3’DNA部分毗鄰的5’RNA部分。作為另一個(gè)實(shí)例，一種本發(fā)明的復(fù)合體包含(a)復(fù)合引物延伸產(chǎn)物；和(b)靶RNA鏈。又在另外的實(shí)例中，一種本發(fā)明的復(fù)合體包含(a)第一引物延伸產(chǎn)物，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；和(b)第二引物。又在另外的實(shí)例中，一種本發(fā)明的復(fù)合體包含(a)第一引物延伸產(chǎn)物，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；和(b)第二引物延伸產(chǎn)物。又在另外的實(shí)例中，一種本發(fā)明的復(fù)合體包含(a)置換的引物延伸產(chǎn)物，其中引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；和(b)前啟動(dòng)子多核苷酸(例如PTO)。
又在另外的實(shí)例中，本發(fā)明的復(fù)合體為通過此處所述的任一方法制備的在其一個(gè)末端還包含RNA/DNA部分的雙鏈cDNA復(fù)合體。在一些實(shí)施方案中，雙鏈cDNA復(fù)合體在其第二個(gè)末端還包含第二RNA/DNA部分。又在另外的實(shí)例中，本發(fā)明的復(fù)合體為包含3’單鏈DNA部分的第一和第二引物延伸產(chǎn)物，其通過此處所述任一方法產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，組合物還包含第二3’單鏈區(qū)域。在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的復(fù)合體為(a)包含3’單鏈DNA部分的第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體，和(b)與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物。在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的復(fù)合體為第一鏈cDNA和第二鏈cDNA(其由引物沿第一鏈cDNA延伸產(chǎn)生)的復(fù)合體。在一些實(shí)施方案中，引物包含與第一鏈cDNA雜交的模板RNA片段。在一些實(shí)施方案中，引物為DNA。使用本發(fā)明的擴(kuò)增方法和組合物的方法本發(fā)明的方法和組合物可用于多種用途。為闡明用途，這里描述了測序方法、基因分型(核酸突變檢測)、確定目的序列存在與否、固定化核酸(其可以是固定于微陣列上的核酸)的制備以及用本發(fā)明方法產(chǎn)生的擴(kuò)增核酸產(chǎn)物來鑒定核酸。這里也描述了表達(dá)譜的方法、消減雜交方法和制備消減雜交探針的方法和制備文庫的方法(其可以是cDNA文庫和/或差異雜交文庫)。用本發(fā)明的方法對RNA靶測序例如，本發(fā)明的擴(kuò)增方法用于目的RNA序列的測序。通過使用此處所述的任一方法擴(kuò)增含有目的序列的靶RNA而進(jìn)行測序。引物延伸中核苷酸的加入利用本領(lǐng)域共知的方法分析，所述本領(lǐng)域公知的方法例如終止核苷酸的摻入或利用合成測序(如pyrosequencing技術(shù))。
在其中終產(chǎn)物為置換的DNA引物延伸產(chǎn)物形式的實(shí)施方案中，除用于擴(kuò)增方法的核苷酸諸如天然的脫氧核糖核酸三磷酸(dNTP)外，反應(yīng)混合物中可以加入適當(dāng)?shù)臉?biāo)記或未標(biāo)記的核苷酸類似物，其摻入引物延伸產(chǎn)物后實(shí)現(xiàn)引物延伸的終止。優(yōu)選地，dNTP類似物在自擴(kuò)增反應(yīng)起始足夠量的時(shí)間后加入，以使產(chǎn)生所需量的第二引物延伸產(chǎn)物或片段延伸產(chǎn)物。所述時(shí)間量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)確定。
在其中終產(chǎn)物為RNA產(chǎn)物形式的實(shí)施方案中，測序可基于實(shí)現(xiàn)RNA轉(zhuǎn)錄的過早(故意)終止。rNTP類似物的摻入將導(dǎo)致產(chǎn)生截短的RNA產(chǎn)物，這是因?yàn)樵陬愃莆飺饺氲奈稽c(diǎn)處阻斷了RNA聚合酶的作用，其中所述rNTP類似物可為標(biāo)記的或未標(biāo)記的rNTP類似物，其在摻入RNA轉(zhuǎn)錄本后將實(shí)現(xiàn)反應(yīng)混合物中rNTP聚合作用的終止。
合適的類似物(dNTP和rNTP)包含那些通常用于其它測序方法并且為本領(lǐng)域公知的類似物。dNTP類似物的實(shí)例包括雙脫氧核苷酸。rNTP類似物(諸如RNA聚合酶終止子)的實(shí)例包括3’dNTP。Sasaki等人，生物化學(xué)(Biochemistry)(1998)953455-3460。這些類似物可以用例如熒光染料或放射性同位素標(biāo)記。標(biāo)記物也可以為適用于質(zhì)譜的標(biāo)記物。標(biāo)記物也可為特異結(jié)合對之成員的小分子，并且可在隨后與特異結(jié)合對中的另一成員結(jié)合，如特異結(jié)合對分別為生物素和鏈親合素，其中該結(jié)合對的后一成員與酶結(jié)合，該酶可催化產(chǎn)生可被諸如比色法、熒光測定法、化學(xué)發(fā)光法檢測到的信號，由此可被檢測到。所有上述實(shí)施例在本領(lǐng)域已眾所周知。它們通過聚合酶摻入引物延伸產(chǎn)物或RNA轉(zhuǎn)錄本，并終止沿模板的進(jìn)一步延伸。產(chǎn)生的截短聚合產(chǎn)物被標(biāo)記。累積的截短產(chǎn)物在長度上根據(jù)每種類似物摻入位點(diǎn)的不同而不同，其代表模板序列上互補(bǔ)核苷酸的不同序列定位。
為闡明序列信息，可使用本領(lǐng)域眾所周知的多種方法中的任何一種進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的分析。這樣的方法包括凝膠電泳并使用適當(dāng)?shù)膾呙鑳x檢測標(biāo)記條帶、測序凝膠電泳并使用如分子動(dòng)力讀數(shù)儀直接通過磷光檢測放射標(biāo)記的條帶、裝配有對反應(yīng)中所使用標(biāo)記物特異的檢測儀的毛細(xì)管電泳等。標(biāo)記物也可為結(jié)合蛋白的配體，用于檢測標(biāo)記物與連接有酶的結(jié)合蛋白的結(jié)合，如生物素標(biāo)記的鏈終止子和與酶連接的鏈親合素。該標(biāo)記物通過酶的酶促活性檢測，它產(chǎn)生可檢測的信號。與本領(lǐng)域公知的其它測序方法一樣，對不同核苷酸類型(A、C、G、T或U)的測序反應(yīng)在單一或分開(每一容器代表不同核苷酸類型中的一種)的反應(yīng)容器中進(jìn)行。使用方法的選擇取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員相當(dāng)明顯的實(shí)際考慮，如使用核苷三磷酸類似物和/或使用標(biāo)記物。因此，例如當(dāng)每種類似物被不同標(biāo)記時(shí)，測序反應(yīng)可在單一容器中進(jìn)行。用于優(yōu)化根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行序列分析的試劑和反應(yīng)條件的選擇因素類似于其它以前描述的測序方法。試劑和反應(yīng)條件為如上所述的用于本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法。利用本發(fā)明的擴(kuò)增方法檢測突變，包括基于單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測突變按照本發(fā)明方法產(chǎn)生的DNA或RNA擴(kuò)增產(chǎn)物也適用于靶核酸序列中任何改變的檢測分析，其通過與參考核酸序列比較實(shí)現(xiàn)，上述參考核酸序列與靶核酸序列而不是與序列改變相同。序列改變可以是存在于基因組序列的改變，也可以是不反映在基因組DNA序列中的序列改變，例如來自轉(zhuǎn)錄后的改變，和/或mRNA過程的改變，包括剪接變體。序列改變(互換地稱作“突變”)包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的刪除、置換、插入和/或堿基顛換。
本擴(kuò)增方法產(chǎn)生的DNA或RNA產(chǎn)物適用于基于單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP或rSSCP)的突變檢測。本發(fā)明的擴(kuò)增方法可直接與合適的方法聯(lián)合，用于檢測單鏈構(gòu)象多態(tài)性，其中所述合適的方法如電泳分離方法，其用于鑒定單鏈DNA或RNA產(chǎn)物的特異遷移模式，用于闡明特定序列特征的存在，和/或與參照核酸相比用于闡明試驗(yàn)核酸中任何差異的存在。
基于凝膠電泳或毛細(xì)管電泳的方法可用于檢測和分析多種單鏈構(gòu)象異構(gòu)體。另外也可用識別序列依賴性二級結(jié)構(gòu)的核酸酶切割單鏈DNA或RNA產(chǎn)物產(chǎn)物用于確定序列特異的構(gòu)象多態(tài)性。這些核酸酶為本領(lǐng)域公知，諸如Cleavase測定法(Third Wave)。電泳方法潛在地更適于高通量突變或基因分型的檢測方法。
對給定的核酸序列確定序列特異的電泳模式可用于例如檢測測試序列的特異等位基因。此外，期望不同等位基因的電泳遷移模式可有大的差異，這樣使得可從單一個(gè)體的核酸樣品中檢測兩個(gè)等位基因，這為雜合基因型或多等位基因所需要。測試核酸序列的任何改變?nèi)鐗A基置換、插入或缺失均可用本方法檢測。本方法預(yù)期可用于檢測特異的單堿基多態(tài)性、SNP和發(fā)現(xiàn)新SNP。因此，本發(fā)明也提供了用于檢測包含單核苷酸多態(tài)性的多核苷酸的方法，其包括(a)用此處所述的任一方法擴(kuò)增靶多核苷酸；以及(b)分析擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈構(gòu)象，其中與參照的單鏈多核苷酸相比，構(gòu)象的差異顯示靶多核苷酸中的單核苷酸多態(tài)性，由此檢測包含單核苷酸多態(tài)性的多核苷酸。
其它本領(lǐng)域認(rèn)可的與參考核酸序列相比較檢測靶核酸序列的任何改變分析方法適用于本發(fā)明擴(kuò)增方法得到的單鏈核酸產(chǎn)物。這些方法為本領(lǐng)域所公知，并且包括用于檢測特定已知序列的多種方法，包括基于等位基因特異的引物延伸、等位基因特異的探針連接、差異探針雜交和限制性引物延伸的方法。參見例如Kurn等人，美國專利號6,251,639B1；美國專利號5,888,819；6,004,744；5,882,867；5,854,033；5,710,028；6,027,889；6,004,745；5,763,178；5,011,769；5,185,243；4,876,187；5,882,867；5,731,146；WOUS88/02746；WO99/55912；WO92/15712；WO00/09745；WO97/32040；WO00/56925和5,660,998。因此，本發(fā)明也提供檢測包含單核苷酸多態(tài)性的目的RNA序列中的突變的方法，包括(a)利用此處所述任何方法擴(kuò)增靶RNA；和(b)與參考單鏈多核苷酸相比分析擴(kuò)增產(chǎn)物存在的改變(突變)。確定目的序列存在與否的方法本發(fā)明的等溫?cái)U(kuò)增方法所使用的復(fù)合引物的獨(dú)特特性給用等溫方法在靶核酸序列上檢測特定突變(其定義為突變的定位是明確的)或多態(tài)位點(diǎn)(如SNP)提供了基礎(chǔ)。本方法用于基因分型、檢測導(dǎo)致藥物抗性的突變等等。
復(fù)合引物的RNA部分設(shè)計(jì)為可與其中懷疑存在序列改變的測試靶RNA雜交。換言之，引物包含含有與參考RNA序列(如野生型序列)雜交的序列的RNA部分，測試靶RNA序列與上述參考RNA序列相比。在一些實(shí)施方案中，改變的序列(即包含序列改變的序列)和參考序列為等位基因。序列改變可以是單核苷酸置換、刪除或插入。
在另一實(shí)施方案中，復(fù)合引物的RNA部分設(shè)計(jì)為與懷疑存在于測試靶RNA中的改變序列雜交。換言之，引物包括含有與測試靶RNA雜交的序列的RNA部分，并且因此不與參考序列(例如野生型序列)雜交，測試靶RNA中的序列與上述參考RNA序列相比。在一些實(shí)施方案中，改變的序列(即包含序列改變的序列)和參考序列為等位基因。
復(fù)合引物的RNA部分通常是5′RNA部分包含可與已知標(biāo)準(zhǔn)野生型序列或已知突變子或多態(tài)性基因型雜交的序列。通常，如果靶核酸序列包含可與復(fù)合引物RNA部分雜交的序列，將此情況與如果存在錯(cuò)配(即引物有突變序列而靶沒有，或反之亦然)的情況相比，則合適的復(fù)合引物包含使得該引物優(yōu)先地與前一種情況的靶核酸雜交的RNA部分，其中靶核酸具有結(jié)合的引物延伸產(chǎn)物，并且引物延伸產(chǎn)物的5′-RNA部分已被切除。序列改變的存在一般不會(huì)阻止擴(kuò)增的起始步驟，這樣形成包含RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體的第一和第二引物延伸產(chǎn)物的雙鏈復(fù)合體。隨后核糖核酸酶如RNaseH切割RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體的RNA部分。雖然錯(cuò)配堿基對的存在可能影響RNA/DNA雜合體的切割模式，但切割仍可能發(fā)生。錯(cuò)配將會(huì)抑制，優(yōu)選地阻止下一步另一復(fù)合引物與復(fù)合體通過5′-RNA部分雜交而進(jìn)行的結(jié)合步驟。這種作用取決于多種因素，如雜交寡核苷酸的大小和反應(yīng)條件的嚴(yán)緊性。根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)和常規(guī)，在設(shè)計(jì)復(fù)合引物時(shí)，這些因素得到考慮。錯(cuò)配也可能會(huì)抑制切割復(fù)合引物的RNA部分，因此阻止第二引物延伸產(chǎn)物的擴(kuò)增。另一種可能性是，錯(cuò)配將導(dǎo)致低效率切割引物的RNA部分，因此導(dǎo)致較低效率擴(kuò)增或產(chǎn)生較少的擴(kuò)增產(chǎn)物。在擴(kuò)增的這一步，復(fù)合引物不能與靶雜交會(huì)阻止后續(xù)步驟中引物延伸鏈的置換和多拷貝擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生。據(jù)認(rèn)為，通過本發(fā)明的方法檢測突變可基于有無單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物或定量比較累積的擴(kuò)增產(chǎn)物的量而進(jìn)行。例如，當(dāng)復(fù)合引物包含參照序列(例如野生型)時(shí)，靶鏈中突變的存在可導(dǎo)致檢測不到擴(kuò)增產(chǎn)物；或者是，可導(dǎo)致能檢測到產(chǎn)物，但產(chǎn)物量少于從無突變的模板鏈產(chǎn)生的量。
當(dāng)復(fù)合引物包含可完全與突變基因型雜交的RNA部分通常是5′RNA部分時(shí)，將阻止正?；蛐托蛄械臄U(kuò)增，而突變基因型靶將得到擴(kuò)增。因此，在這種情況下，多拷貝擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出和/或定量確定將表明突變基因型靶序列的存在。例如，可運(yùn)行包括目的核酸樣品或具野生型序列的靶核酸參照樣品的平行反應(yīng)。與后一個(gè)反應(yīng)相比，前一反應(yīng)積累較多的擴(kuò)增產(chǎn)物表明在目的樣品中存在突變基因型。另外，當(dāng)復(fù)合引物包含完全可與試驗(yàn)靶的標(biāo)準(zhǔn)基因型序列雜交的5′RNA序列時(shí)，將阻止突變基因型靶序列的擴(kuò)增，并且擴(kuò)增產(chǎn)物的檢出和/或定量確定表明存在標(biāo)準(zhǔn)基因型。
發(fā)明的任一擴(kuò)增方法適用于檢測如上所述的突變。
因此，本發(fā)明提供了確定目的序列存在與否的方法，所述方法包括(i)擴(kuò)增含有目的序列的靶RNA，所述擴(kuò)增包括延伸與由此處所述任一方法制備的切割的第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體雜交的復(fù)合引物，其中復(fù)合引物的RNA部分的序列已知，和(ii)將來自步驟(i)的擴(kuò)增產(chǎn)物量(如果有的話)與來自參考模板的擴(kuò)增產(chǎn)物量比較，其中(1)從模板產(chǎn)生的可檢測出的擴(kuò)增產(chǎn)物量少于從包含可與復(fù)合引物RNA部分雜交區(qū)域的參考模板中擴(kuò)增的產(chǎn)物量，說明第二引物延伸產(chǎn)物不包含可與復(fù)合引物RNA部分雜交的序列，且相對于可與復(fù)合引物RNA部分雜交的序列而言為一序列變體；或(2)從模板產(chǎn)生的可檢測出的擴(kuò)增產(chǎn)物量多于從不包含可與復(fù)合引物RNA部分雜交區(qū)域的參考模板中擴(kuò)增的產(chǎn)物量，說明第二引物延伸產(chǎn)物包含可與復(fù)合引物RNA部分雜交的序列，且相對于可與復(fù)合引物RNA部分雜交的序列而言為非序列變體。制備固定于基片的核酸，包括核酸微陣列的方法部分本發(fā)明擴(kuò)增方法的單鏈產(chǎn)物適于固定于表面。單鏈產(chǎn)物尤其適用于制備包含單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物的微陣列。
單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物可附著在例如由玻璃、塑料(如聚苯乙烯、聚丙烯、尼龍)、聚丙烯酰胺、硝酸纖維或其它材料制成的固相或半固相載體或表面。
幾種將核酸附著在于固體基片如玻璃片的技術(shù)在本領(lǐng)域已眾所周知。一種方法是將包含可吸附于固相基片的部分如胺類、胺類衍生物或另一帶正電荷的基團(tuán)的修飾堿基或類似物摻入擴(kuò)增的核酸。然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與固相基片如玻璃片結(jié)合，該玻璃片用醛或另一的反應(yīng)基包被，其中所述醛或另一反應(yīng)基將與擴(kuò)增產(chǎn)物上的反應(yīng)基形成共價(jià)連接并共價(jià)附著于玻璃片。含有擴(kuò)增產(chǎn)物的微陣列可用Biodot(BioDot，Inc.Irvine，CA)點(diǎn)樣裝置和醛包被的玻璃片(CEL Associates，Houston，TX)制備。將擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于醛包被的載玻片上，并根據(jù)發(fā)表的步驟(Schena等，美國國家科學(xué)院院報(bào)(1996)，9310614-10619)進(jìn)行加工。陣列也可通過機(jī)器人技術(shù)打印在玻璃、尼龍(Ramsay，G.，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnol.)(1998，1640-44)、聚丙烯(Matson等，生物化學(xué)年鑒紀(jì)事(Anal Biochem.)(1995)，224(1)110-6)和硅氧烷載玻片(Marshall，A和Hodgson，J.，自然生物技術(shù)，(1998)，1627-31)上。其它陣列裝配的方法包括電子領(lǐng)域中靈敏的微量點(diǎn)樣(Marshall和Hodgson，同上)并直接將多核苷酸點(diǎn)樣在帶正電的包被板上。如那些使用氨基丙基硅表面化學(xué)的方法在本領(lǐng)域內(nèi)也是公知的，如在http//www.cmt.corning.Com和http//cmgm.stanford.edu/pbrown/所公開的那樣。
制備微陣列的一種方法是制備高密度的多核苷酸陣列。迅速沉積多核苷酸的技術(shù)已眾所周知(Blanchard等，Biosensors & Bioelectronics，11687-690)。也可使用其它制備微陣列的方法，如通過掩模制備微陣列(Maskos和Southern，核酸研究。(1992)，201679-1684)。原則上，如上所提到的，可使用任何類型的陣列，例如使用尼龍雜交膜上的斑點(diǎn)印跡。然而，如將被本領(lǐng)域熟練人員所認(rèn)可的那樣，往往優(yōu)選極小的陣列，因?yàn)殡s交體積將更小。
擴(kuò)增的多核苷酸可以矩陣點(diǎn)樣在包括紙、玻璃、塑料、聚苯乙烯、聚丙烯、尼龍、聚丙烯酰胺、硝酸纖維、硅、光纖或任何其它合適的固相或半固相(如聚丙烯酰胺凝膠薄層(Khrapko等，DNA序列(DNASequence)(1991)，1375-388))的基片表面上。
陣列可在平坦的基片上裝配成二維矩陣，或者陣列可具有包括針、桿、纖維、帶、細(xì)線、珠、顆粒、微量滴定孔、毛細(xì)管、圓柱體和任何其它適于雜交和檢測靶分子排列的三維構(gòu)型。在一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物附著的基片是磁珠或顆粒。在另一實(shí)施方案中，固相基片包含光纖。又在另一實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)物分散在毛細(xì)管內(nèi)的流動(dòng)相中，其接下來被固定于固相。核酸的鑒定通過本發(fā)明方法獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物尤其適合于進(jìn)一步鑒定。本方法部分產(chǎn)物的單鏈特性便于鑒定。本發(fā)明方法產(chǎn)生的單鏈產(chǎn)物尤其可以進(jìn)行定量分析，因?yàn)楫a(chǎn)生了足量的單鏈DNA和RNA產(chǎn)物，這些產(chǎn)物通常精確地代表在起始材料中不同的mRNA。
擴(kuò)增的多核苷酸產(chǎn)物，無論DNA或RNA(即任一此處所述擴(kuò)增方法的產(chǎn)物)可以用例如本領(lǐng)域公知的探針雜交技術(shù)來分析，所述探針雜交技術(shù)諸如Southern和Northern印跡以及與探針陣列雜交。它們也可以用基于電泳的技術(shù)分析，諸如差異顯示和大小鑒定，其為本領(lǐng)域所公知。另外，單鏈DNA和RNA產(chǎn)物可以作為其它起始材料的起始材料，所述其它起始材料用于本領(lǐng)域公知的其它分析和/或定量方法，諸如實(shí)時(shí)PCR、定量TaqMan、利用分子信號的定量PCR，方法描述在Kurn，美國專利號6,251,639等。因此，本發(fā)明包括應(yīng)用任何此處所述方法產(chǎn)物的進(jìn)一步分析和/或定量的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明擴(kuò)增方法用于產(chǎn)生多拷貝單鏈產(chǎn)物，并通過與探針接觸來分析單鏈產(chǎn)物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明擴(kuò)增方法用于產(chǎn)生多拷貝單鏈多核苷酸(通常DNA)產(chǎn)物，其通過使用標(biāo)記的復(fù)合引物(在不被切割的部分標(biāo)記)而被標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明擴(kuò)增方法用于產(chǎn)生這樣的單鏈多核苷酸(DNA或RNA)產(chǎn)物的多拷貝，其通過在DNA或RNA聚合的過程中摻入標(biāo)記的核苷酸而被標(biāo)記。例如，根據(jù)本發(fā)明方法的擴(kuò)增可以用合適的標(biāo)記dNTP或rNTP進(jìn)行。這些標(biāo)記的核苷酸可以直接與標(biāo)記物相連，或者可以包括能與標(biāo)記物相連的部分。標(biāo)記物可以與擴(kuò)增產(chǎn)物共價(jià)或非共價(jià)相連。合適的標(biāo)記物為本領(lǐng)域公知，并且包括例如作為特異結(jié)合對一個(gè)成員的配基，其可以利用可檢測的結(jié)合對的第二成員檢測/定量。因此，在例如Cy3-dUTP或Cy5-dUTP存在下根據(jù)本發(fā)明方法擴(kuò)增總mRNA導(dǎo)致這些核苷酸摻入擴(kuò)增產(chǎn)物。
標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物尤其適用于通過將它們與如含有適當(dāng)探針如cDNA和/或寡核苷酸探針的微陣列(具有任何適合的表面，包括玻璃、芯片、塑料)、珠或顆粒接觸，而進(jìn)行分析(例如檢測和/或定量)。因此，本發(fā)明提供了通過使用本發(fā)明的擴(kuò)增方法產(chǎn)生標(biāo)記的多核苷酸(通常DNA或RNA)產(chǎn)物并分析標(biāo)記產(chǎn)物來鑒定(如檢測或定量)目的RNA序列的方法。例如通過將標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與例如固定于固體或半固體基片上特定位置的探針、固定于特定顆粒上的探針或固定于斑點(diǎn)(如膜)上的探針如陣列雜交，可進(jìn)行標(biāo)記產(chǎn)物的分析，這在上面已描述過。其它分析標(biāo)記產(chǎn)物的方法在本領(lǐng)域已眾所周知，如通過將它們與含有探針的溶液接觸，然后從溶液中提取含有標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物和探針的復(fù)合體。探針的特征提供了對擴(kuò)增產(chǎn)物的序列特征，并且因此推斷存在于樣品中的RNA的特性。標(biāo)記產(chǎn)物的雜交是可檢測到的，并且可檢測到的特異標(biāo)記物的量與特異目的RNA序列的標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的量成比例。這種測量方法用于例如測量樣品中多種RNA樣本的相對量，正如此處所述，多種RNA樣本的相對量與基因表達(dá)的相對水平相關(guān)。雜交在陣列上特定位置的標(biāo)記產(chǎn)物的量(其通過例如標(biāo)記物相關(guān)的可檢測信號)可以顯示出樣品中相應(yīng)靶RNA樣本的檢測和/或定量。
另一方面，本發(fā)明提供了單鏈多核苷酸(通常DNA或RNA)定量的方法，所述方法包括已知序列寡核苷酸(探針)的使用(其可以固定于例如微陣列上)。在本發(fā)明的這一方面，在5’和/或3’末端包含特定序列(如此處所述用“尾”第一和第二引物導(dǎo)入)的標(biāo)記單鏈多核苷酸(通常DNA或RNA)產(chǎn)物可與特定寡核苷酸雜交，其中所述寡核苷酸包含在5’和/或3’末端引入的特定序列的互補(bǔ)序列。在一些實(shí)施方案中，利用復(fù)合引物和/或第二引物擴(kuò)增特異mRNA樣本，上述復(fù)合引物和/或第二引物的尾部具有可與固定在陣列上的序列雜交的特定序列(這取決于是否將特定序列引入復(fù)合引物或第二引物)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，第一復(fù)合引物包含3’部分，所述3’部分可與特異RNA樣本的序列雜交，并且其5’部分不可與特異RNA模板雜交，但卻可與特定寡核苷酸雜交。在另一實(shí)施方案中，第二引物包含可與第一引物延伸產(chǎn)物的序列雜交的3’部分以及不可與第一引物延伸產(chǎn)物雜交但包含特定寡核苷酸序列的5’部分。產(chǎn)生的多拷貝單鏈標(biāo)記DNA或RNA產(chǎn)物可與寡核苷酸雜交。應(yīng)當(dāng)理解，盡管上述討論單RNA樣本，多種樣本也可以同時(shí)擴(kuò)增，每一種用包含可與不同特定寡核苷酸雜交的“尾”的復(fù)合引物或第二引物擴(kuò)增?；虮磉_(dá)譜的確定由于此處所述的方法可擴(kuò)增同一樣品中的一種或多種，優(yōu)選地多種靶RNA，所以本發(fā)明的擴(kuò)增方法尤其適用于確定樣品中一種或多種基因表達(dá)水平。如上所述，擴(kuò)增產(chǎn)物可通過此處所述和/或本領(lǐng)域已眾所周知的多種方法進(jìn)行檢測和定量。因?yàn)镽NA是基因表達(dá)的產(chǎn)物，樣品中不同RNA類型，如不同的mRNA的水平顯示不同基因的相對表達(dá)水平(基因表達(dá)譜)。因此，通過定量序列擴(kuò)增產(chǎn)物所確定的存在于樣品中的目的序列的量可提供用作確定樣品源中的基因表達(dá)譜。
因此，本發(fā)明提供確定樣品中基因表達(dá)譜的方法，所述方法包括用此處所述的任一方法從樣品中至少一個(gè)目的RNA序列擴(kuò)增單鏈產(chǎn)物；并且確定每一目的RNA序列擴(kuò)增產(chǎn)物的量，其中每一所述量顯示出樣品中每一目的RNA序列的量，由此樣品的表達(dá)譜被確定。通常，產(chǎn)生的是標(biāo)記產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶RNA為mRNA。又在另外的實(shí)施方案中，復(fù)合引物包含多聚dT序列(于是樣品中mRNA被擴(kuò)增)。應(yīng)當(dāng)理解，擴(kuò)增產(chǎn)物的量可以利用定量和/或定性方法確定。擴(kuò)增產(chǎn)物量的確定包括確定擴(kuò)增產(chǎn)物存在與否。因此，表達(dá)譜可以包含一個(gè)或多個(gè)目的RNA序列存在與否的信息。此處所用的產(chǎn)物的“存在”或“不存在”，以及“未檢測到產(chǎn)物”包括可忽略的極少產(chǎn)物。
表達(dá)譜方法在多種分子診斷上有用，并且尤其在研究幾乎所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(包括單細(xì)胞)或細(xì)胞群的基因表達(dá)上有用。細(xì)胞或細(xì)胞群(如組織)可以來自例如血液、腦、脾、骨、心臟、血管、肺、腎、垂體、內(nèi)分泌腺、胚胎細(xì)胞、腫瘤等等。表達(dá)譜也用于比較測試樣品與對照(正常)樣品，所述測試樣品包括不同時(shí)間收集的測試樣品，包括在發(fā)育、處理等之前、之后和/或過程中收集的測試樣品。制備文庫的方法本發(fā)明方法的單鏈DNA和RNA產(chǎn)物在制備文庫，包括cDNA文庫和消減雜交文庫上有用。利用本發(fā)明方法，文庫可以從有限量的起始材料例如從有限量組織或甚至是單細(xì)胞中提取的mRNA中制備。因此，一方面，本發(fā)明方法提供從本發(fā)明單鏈DNA或RNA產(chǎn)物中制備文庫的方法。另一方面，本發(fā)明提供從本發(fā)明方法產(chǎn)生的包含兩種復(fù)合引物的雙鏈cDNA中制備文庫的方法。從雙鏈cDNA中制備文庫的方法為本領(lǐng)域公知。又在另一方面，本發(fā)明提供建文庫的方法，所述方法包括利用此處所述的任一方法制備消減雜交探針。
在一些實(shí)施方案中，第一復(fù)合引物可與幾乎在所有mRNA中發(fā)現(xiàn)的多聚A序列雜交。在另外的實(shí)施方案中，第一復(fù)合引物為隨機(jī)引物。消減雜交的方法本發(fā)明的擴(kuò)增方法尤其適用于消減雜交方法，其中(至少)比較第一和第二靶RNA群體，因?yàn)榇颂幩龅姆椒稍谕粯悠分袛U(kuò)增多種靶RNA，并且本發(fā)明方法適用于產(chǎn)生大量單鏈反義核酸，上述反義核酸適用于在消減雜交中作為“傳動(dòng)器”。例如，兩個(gè)核酸群體，一個(gè)正義一個(gè)反義，可以被允許與一個(gè)摩爾過量(“傳動(dòng)器”)的群體混合。存在于兩個(gè)群體的序列會(huì)形成雜合體，而存在于僅僅一個(gè)群體的序列保持單鏈。隨后，使用多種已知技術(shù)分離代表差異表達(dá)序列的未雜交分子。參見例如Hamson等人，美國專利號5589339；Van Gelder，美國專利號6,291,170。
因此，本發(fā)明提供了用于進(jìn)行消減雜交的方法，所述方法包括(a)利用此處所述任一擴(kuò)增方法從第一RNA群體制備至少一個(gè)目的RNA序列的互補(bǔ)多拷貝DNA；和(b)多拷貝與第二mRNA群體雜交，由此第二mRNA群體的亞群體與核苷酸DNA拷貝形成復(fù)合體。本發(fā)明也提供用于進(jìn)行消減雜交的方法，所述方法包括利用任一此處所述任何擴(kuò)增方法從第一RNA群體中制備至少一個(gè)目的RNA序列互補(bǔ)鏈的多拷貝，將其與第二mRNA群體雜交，由此第二mRNA群體的亞群體與拷貝形成復(fù)合體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的“傳動(dòng)子”單鏈反義DNA產(chǎn)物與試驗(yàn)(正義)mRNA樣本結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，“傳動(dòng)子”單鏈反義核酸(通常為DNA)產(chǎn)物用此處所述本發(fā)明方法產(chǎn)生，且第一復(fù)合引物可與多聚A序列雜交(幾乎擴(kuò)增所有的mRNA樣本)。在另外的實(shí)施方案中，第一復(fù)合引物為隨機(jī)引物。
另一方面，本發(fā)明了提供差異擴(kuò)增的方法，在所述差異擴(kuò)增中，與試驗(yàn)者mRNA序列雜交的單鏈傳動(dòng)器(反義)DNA序列被切割DNA/RNA雜合體上RNA的試劑諸如RNaseH切割。mRNA的切割導(dǎo)致從測試mRNA鏈上無力產(chǎn)生單鏈DNA產(chǎn)物。相反地，非切割試驗(yàn)者(即不與傳動(dòng)器DNA分子雜交的試驗(yàn)者mRNA)可以作為隨后擴(kuò)增的底物。擴(kuò)增的差異表達(dá)產(chǎn)物有許多用途，包括作為差異表達(dá)探針，去產(chǎn)生差異表達(dá)文庫。因此，本發(fā)明提供了用于一個(gè)或多個(gè)目的RNA序列差異擴(kuò)增的方法，所述方法包括(a)用此處所述任一擴(kuò)增方法從第一RNA群體制備至少一個(gè)目的RNA序列的互補(bǔ)多核苷酸(通常為DNA)的多拷貝；(b)多拷貝與第二mRNA群體雜交，由此第二mRNA群體的亞群體與DNA拷貝形成復(fù)合體；(c)利用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割步驟(b)復(fù)合體中的RNA；和(d)擴(kuò)增第二mRNA群體中未雜交亞群體，由此產(chǎn)生與第二mRNA群體中未雜交亞群體互補(bǔ)的單鏈DNA的多拷貝。在一些實(shí)施方案中，步驟(d)用任一此處所述的擴(kuò)增方法進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，本方法包括將用任一此處所述的擴(kuò)增方法從第一RNA群體中至少一個(gè)目的RNA序列的互補(bǔ)鏈的多核苷酸(通常為DNA)拷貝與第二mRNA群體雜交，由此第二mRNA群體的亞群體與DNA拷貝形成復(fù)合體；(b)利用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割步驟(a)復(fù)合體中的RNA；和(c)擴(kuò)增第二mRNA群體中未雜交亞群體，由此產(chǎn)生與第二mRNA群體中未雜交亞群體互補(bǔ)的單鏈DNA的多拷貝。
下述實(shí)施例用于闡明但不用于限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1總多聚A mRNA的擴(kuò)增來源于MOLT-4細(xì)胞系(CLONTECH 6587-1)的多聚A mRNA作為擴(kuò)增反應(yīng)的靶。擴(kuò)增過程分成三步1)從樣品的總mRNA合成第一cDNA鏈；2)從樣品的總mRNA合成第二cDNA鏈以產(chǎn)生雙鏈cDNA；3)總mRNA的擴(kuò)增。雙鏈cDNA產(chǎn)物在其一個(gè)末端包含RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體，其為RNaseH的底物。該異質(zhì)雙鏈體部分的兩條鏈的序列與靶序列無關(guān)，并且其通過復(fù)合(第一)引物摻入。
引物序列MTA1 TTTTTTTMTA2 TTTTTTTTNMTA3 TTTTTTTNN其中斜體核苷酸表示核糖核苷酸，且“N”表示簡并核苷酸(即其可以是A、T、C或G)。
步驟1從多聚A mRNA合成第一鏈cDNA0.1μg總多聚A mRNA與下述試劑混合，總體積為10μl0.2μl引物MTA3(100μM)0.5μl dNTPs(25mM)0.1μl Rnasin0.1μl DTT2μl5×AMV反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液加DEPC處理水至10μl總體積將反應(yīng)混合物75℃孵育2分鐘，并且隨后冷卻至37℃。加1μlAMV反轉(zhuǎn)錄酶(USB 70041Y，15U/μl)至每一反應(yīng)，并且反應(yīng)混合物進(jìn)一步在此溫度下孵育60分鐘。
步驟2合成第二鏈cDNA10μl第二鏈cDNA合成混合物與第一鏈cDNA反應(yīng)混合物混合，所述第二鏈cDNA合成混合物包括
1μl10×Klenow反應(yīng)緩沖液0.1μldNTPs(25mM)0.5μlKlenow(USB 2141Y，5U/μl)DNA聚合酶8.4μl水反應(yīng)混合物37℃孵育30分鐘，隨后加熱至75℃5分鐘使酶失活終止反應(yīng)。
步驟3總cDNA的擴(kuò)增試驗(yàn)兩種復(fù)合引物——MTA1和MTA2。
反應(yīng)在總體積為20μl下進(jìn)行，包括如下成分1μlcDNA反應(yīng)液0.2μl引物MTA1或MTA2(均為100μM)0.2μl 25mM dNTPs0.1μl Rnasin0.1μl DTT17.2μl水上述混合物94℃孵育20秒，并且隨后冷卻至50℃。加入2U BCA，0.02UHybridase(RNaseH)和0.4μgT4 Gene 32蛋白質(zhì)(單鏈DNA結(jié)合蛋白)的混合物，并且反應(yīng)混合物孵育于60分鐘。
每一反應(yīng)混合物取5μl在5-20％PAGE(Novex)上電泳分析。通過擴(kuò)增的總mRNA的反應(yīng)產(chǎn)物顯示成功的擴(kuò)增為出現(xiàn)成片電泳條帶，其由于多種mRNA的擴(kuò)增而出現(xiàn)。在進(jìn)行沒有下述某一個(gè)組分的反應(yīng)時(shí)，不會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)產(chǎn)物a.雙鏈cDNA；b.用于第一鏈合成的引物；以及c.用于第一鏈cDNA合成的mRNA。實(shí)施例2鑒定實(shí)施例1中步驟2和步驟3的反應(yīng)產(chǎn)物在實(shí)施例1的擴(kuò)增反應(yīng)中，由于使用的復(fù)合引物的5’RNA部分的“特有”序列，“特有”序列(即不與RNA模板雜交的序列)預(yù)期在第二鏈cDNA的3’末端產(chǎn)生。(第二鏈cDNA3’末端)的該序列與復(fù)合引物的5’RNA部分互補(bǔ)，并且與靶RNA無關(guān)。為確定獲得的第二鏈cDNA中此序列的存在，利用與第二鏈cDNA的3’末端預(yù)期序列互補(bǔ)的引物作為正向引物，且G3PDH-特異引物作為反向PCR引物，進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物(出現(xiàn)于實(shí)施例1的步驟2反應(yīng)混合物中)的PCR擴(kuò)增。上述引物對預(yù)期從具有“特有”序列的雙鏈cDNA中擴(kuò)增出特異產(chǎn)物。然而不應(yīng)該從反義DNA產(chǎn)物(出現(xiàn)于實(shí)施例1的步驟3反應(yīng)混合物中)的PCR擴(kuò)增中產(chǎn)生特異產(chǎn)物，因?yàn)檫@些產(chǎn)物不應(yīng)該含有“特有”序列(其通過復(fù)合引物的RNA部分引入，上述復(fù)合引物被RNaseH切割)。由于實(shí)施例1的步驟3反應(yīng)混合物中主要含有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物(其不應(yīng)含有“特有”序列)，該反應(yīng)混合物的PCR擴(kuò)增應(yīng)該比實(shí)施例1步驟2反應(yīng)混合物(其主要含有雙鏈cDNA產(chǎn)物)的PCR擴(kuò)增效率低(并因此產(chǎn)生相當(dāng)少的產(chǎn)物)。
PCR反應(yīng)按照如下進(jìn)行每50μlPCR反應(yīng)含有每一種引物0.4μM(Biosource International)每一種dNTP 100μM(Epicenter)2mM氯化鎂(Epicenter)1-2單位聚合酶(MasterAmp taq或MasterAmp Tfl，都來自Epicenter)5μl 10×緩沖液，隨酶提供來自實(shí)施例1的步驟3的0.5μl線性擴(kuò)增反應(yīng)液或?qū)嵤├?步驟2產(chǎn)生的cDNA的1∶20稀釋液PCR擴(kuò)增循環(huán)為94℃30秒、51℃30秒和72℃30秒。一般地，樣品經(jīng)過20或25個(gè)循環(huán)。在樣品保持在4℃之前有一個(gè)最后的72℃5分鐘的延伸。
相似的反應(yīng)用MOLT細(xì)胞系表達(dá)的T細(xì)胞受體(TCR)特異mRNA的特異引物進(jìn)行。使用G3PDH引物預(yù)期的PCR產(chǎn)物大小(堿基對)
引物序列G3PDH55’TTT CCT GGT ATG ACA ACG AAG3PDH5-4 5’CCA GCA AGA GCA CAA GAG GAG3PDH35’GAT GGT ACA TGA CAA GGTdMTA1 5’GAC GGA TGC GGT CTT TTT TTT使用T細(xì)胞受體引物時(shí)預(yù)期的PCR產(chǎn)物大小(堿基對)
引物序列TCR55’CCC GCA ACC ACT TCC GCT GTCTCR5-25’CAA ACC CGT CAC CCA GAT CGTTCR35’CAA CAC AAG GGC GCT GAC C結(jié)果顯示特有序列摻入第二鏈cDNA，這一點(diǎn)通過當(dāng)使用引物DMTA1和G3PDH5 PCR擴(kuò)增(G3PDH mRNA的序列擴(kuò)增)步驟2反應(yīng)混合物時(shí)長度約250堿基對的產(chǎn)物存在和當(dāng)使用引物DMTA1和TCR5-2擴(kuò)增(TCRβ鏈mRNA的序列擴(kuò)增)時(shí)長度約400堿基對的產(chǎn)物存在而顯示出。相反，使用相同的引物對PCR擴(kuò)增步驟3的反應(yīng)混合物顯示擴(kuò)增產(chǎn)物量很大程度的減少。因此，結(jié)果表明雙鏈cDNA產(chǎn)物中摻入了(實(shí)施例1中使用的復(fù)合引物的RNA部分)“特有”序列，而在最終擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物中(由于RNA部分的切割)不存在特有序列。實(shí)施例3用總RNA制備物擴(kuò)增總mRNA從總RNA制備物中擴(kuò)增總mRNA的能力通過省略mRNA純化步驟而大大簡化了方法。用市售的來源于乳腺癌腫瘤的總RNA制備物(CLONTECH；貨號64015-1)進(jìn)行利用本發(fā)明方法的從總RNA制備物擴(kuò)增總mRNA的實(shí)驗(yàn)演示?？俶RNA擴(kuò)增的過程按照下述的三步進(jìn)行。
引物序列MTB2 TTTTTTTTTTTTTTNNBA5AAC TAC CTT CAA CTC CAT CABA3GGA CTC GTC ATA CTC CTG C其中斜體核苷酸表示核糖核苷酸，且“N”表示簡并核苷酸(即其可以是A、T、C或G)。
步驟1第一鏈cDNA的合成4μl 5×緩沖液(250 mM Tris-HCl，pH8.3；375mM KCl，15mM MgCl2)MTB2引物@1μM25mM dNTPs0.2μl RNasin核糖核酸酶抑制劑(Promege N2511，40u/μl)1μl 0.1M DTT每一反應(yīng)使用5μg、1μg、0.2μg或40ng總RNADEPC處理水至19μl總體積反應(yīng)混合物75℃孵育2分鐘，并且隨后冷卻至42℃。加SuperScript IIRNase H-反轉(zhuǎn)錄酶(200U，BRL 18064-022)至每一反應(yīng)，并且反應(yīng)混合物進(jìn)一步在42℃孵育50分鐘。
步驟2第二鏈cDNA合成第一鏈cDNA合成的反應(yīng)混合物10μl分裝至單個(gè)的反應(yīng)管中。向每一管中加入第二鏈合成的貯存反應(yīng)混合物20μl。所述第二鏈合成的貯存反應(yīng)混合物包含如下成分2μl 10×Klenow反應(yīng)緩沖液(10×緩沖液500mM Tris-HCl，pH8.0；100mM MgCl2，500mM NaCl)2U Klenow DNA聚合酶(BRL18012-021)0.1μl AMV反轉(zhuǎn)錄酶(BRL18020-016，25U/μl)0.2μl大腸桿菌核糖核酸酶H(BRL18021-014，4U/μl)0.2μl(25mM)dNTPs0或0.2μl大腸桿菌DNA連接酶(BRL18052-019，10U/μl)反應(yīng)混合物37℃孵育30分鐘。加熱至75℃5分鐘使酶失活終止反應(yīng)。
步驟3總cDNA的擴(kuò)增利用上述第二鏈cDNA反應(yīng)混合物1μl，在T4基因32蛋白存在下使用MTA1復(fù)合引物在50℃60分鐘進(jìn)行擴(kuò)增。
每一反應(yīng)混合物包含如下成分2μl 10×緩沖液(200mM Tris-HCl，pH8.5；50mM MgCl2，1％NP-40)0.2μl dNTPs(25mM)0.2μl MTA1(100μM)1μl第二鏈cDNA合成混合物0.1μl Rnasin0.1μl DTT(0.1M)加DEPC處理水至總體積18.8μl反應(yīng)混合物94℃孵育20秒，并且隨后冷卻至50℃。加2U Bca(Takara貨號2710A)，0.02U Hybridase熱穩(wěn)定RNase H(Epicentre H39100)和0.4μgT4基因32蛋白(USB70029Z)，并且反應(yīng)混合物進(jìn)一步在此溫度下孵育60分鐘。
步驟3的反應(yīng)混合物(預(yù)期含有擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物)通過凝膠電泳(5-20％PAGE，Novex)分析?？俶RNA擴(kuò)增產(chǎn)物顯示為成片電泳條帶表明為成功的擴(kuò)增，其中的成片電泳條帶預(yù)計(jì)是由于對樣品中多種mRNA的擴(kuò)增而產(chǎn)生。
利用特異引物對的PCR擴(kuò)增顯示出“特有”(特定)序列(與所用復(fù)合引物的5’末端RNA部分互補(bǔ)的序列)摻入第二鏈cDNA。步驟2和步驟3反應(yīng)混合物的一部分用引物G3PDH5-4/G3PDH3或BA5/BA3(β肌動(dòng)蛋白)在上述實(shí)施例2中所述條件下PCR擴(kuò)增。步驟2反應(yīng)混合物的擴(kuò)增產(chǎn)生大量正確大小的產(chǎn)物，而步驟3反應(yīng)混合物的擴(kuò)增產(chǎn)生相當(dāng)少量的相同產(chǎn)物。因此，結(jié)果顯示(本實(shí)施例所用復(fù)合引物的RNA部分的)“特有”序列摻入雙鏈cDNA產(chǎn)物，并且在最終擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物中(由于RNA部分的切割)無此序列。實(shí)施例4從總RNA制備物和純化的mRNA中制備在其第二鏈cDNA中包含附加特定序列的雙鏈cDNA制備自HCT116細(xì)胞系的總RNA(1μg)或制備自MOLT4細(xì)胞系(Clontech)的mRNA(100ng)作為靶用于產(chǎn)生中間雙鏈cDNA產(chǎn)物，所述雙鏈cDNA產(chǎn)物在其第二鏈cDNA包含附加特定序列。附加序列通過利用復(fù)合(第一)引物摻入。
制備第一和第二鏈cDNA的過程基本上按照實(shí)施例1和3所述進(jìn)行，并且通常包括下述步驟(1)第一鏈cDNA的合成；(2)第二鏈cDNA的合成以產(chǎn)生在其一個(gè)末端包含RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體的雙鏈cDNA，所述RNA/DNA異質(zhì)雙鏈體是RNaseH的底物。雙鏈cDNA中間產(chǎn)物預(yù)期包含來自靶RNA樣品的多種RNA的cDNA拷貝，每一cDNA具有相同的附加特定序列。附加特定序列的序列預(yù)期是與靶RNA雜交的復(fù)合(第一)引物的5’RNA部分的互補(bǔ)序列。
進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)以確認(rèn)第二鏈cDNA的存在，所述第二鏈cDNA包含(a)GAPDH mRNA序列的第二鏈cDNA拷貝其中所述GAPDHmRNA已知存在于上述兩種RNA靶樣品的mRNA中；以及(b)3’末端的“特有”序列(即第一復(fù)合引物5’RNA部分的互補(bǔ)序列)。所用PCR引物對如下1)與特有序列互補(bǔ)的引物(DMTA1)和與GAPDH mRNA的序列互補(bǔ)的引物(GAPDH5-4)用于產(chǎn)生203bp產(chǎn)物，其取決于第二鏈cDNA3’末端的附加序列。
2)與GAPDH mRNA序列互補(bǔ)的兩條引物GAPDH3以及引物GAPDH5-4，用于產(chǎn)生157bp GAPDH的特異產(chǎn)物，其不依賴于在第二鏈cDNA3’末端附加特定序列。
PCR按照實(shí)施例1和2所述進(jìn)行，其利用兩個(gè)單獨(dú)的如上所述來自每一起始模板的cDNA制備物。PCR反應(yīng)利用凝膠電泳分析。結(jié)果顯示在圖9。泳道對應(yīng)含有下述模板和引物對的反應(yīng)混合物1.標(biāo)記物2.來自HCT116的cDNAGAPDH3/GAPDH5-43.來自HCT116的cDNAGAPDH3/GAPDH5-44.來自MOLT4的cDNA GAPDH3/GAPDH5-45.來自MOLT4的cDNA GAPDH3/GAPDH5-46.無模板 GAPDH3/GAPDH5-47.來自HCT116的cDNAdMTA1/GAPDH5-48.來自HCT116的cDNAdMTA1/GAPDH5-49.來自MOLT4的cDNA dMTA1/GAPDH5-410.來自MOLT4的cDNAdMTA1/GAPDH5-411.無模板 dMTA1/GAPDH5-4箭頭指示預(yù)期的PCR產(chǎn)物的位置。
正如所期望，在利用引物對(1)擴(kuò)增HCT116和MOLT4樣品時(shí)，產(chǎn)生較長的片段，且在利用引物對(2)擴(kuò)增HCT116和MOLT4樣品時(shí)，產(chǎn)生較短的片段。在不加模板的對照樣品中無產(chǎn)物產(chǎn)生。該實(shí)施例表明利用此處所述的方法在第二鏈cDNA的3’末端產(chǎn)生高效率的特定序列的附加。實(shí)施例5利用實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增總polyA mRNA并定量產(chǎn)物來自人Colon腫瘤總RNA(Clontech貨號64014-1)的總RNA 200ng用于作為擴(kuò)增反應(yīng)的靶。第一和第二鏈cDNA的制備和隨后的擴(kuò)增步驟基本上按照實(shí)施例3所述進(jìn)行，且有如下修改(1)第二鏈cDNA合成的反應(yīng)混合物含有Klenow DNA聚合酶(其缺少3’和5’外切酶活性)，并且缺少連接酶。
(2)所得cDNA的擴(kuò)增用Bst聚合酶(4單位，NEB)代替Bca聚合酶進(jìn)行。
根據(jù)下列方法對使用對應(yīng)于4種不同mRNA的4種引物對產(chǎn)生的cDNA中間產(chǎn)物(第二鏈cDNA)和反義擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量和實(shí)時(shí)PCRcDNA或擴(kuò)增產(chǎn)物在TE緩沖液中1∶10或1∶100稀釋。
實(shí)時(shí)PCR的反應(yīng)混合物總體積設(shè)定為20μl，如下所述每一反應(yīng)包含10μl 2×ABI SYBR Green基本混合物(ABI貨號4309155)0.6μl 10μM正向引物0.6μl 10μM反向引物1μl模板(上述特異cDNA或擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋液)7.8μl水使用下列引物對定量按如上所述產(chǎn)生的cDNA或擴(kuò)增產(chǎn)物形式的4種特異表達(dá)基因G6PDG6 PD5 5′AGGCAGCCTCTCTGCTATAAGAAA 3′G6 PD3 5′GCAGGGCATTGAGGTTGG 3’LGALS1LGALS15 5′ATGGCAGCTGACGGTGACTT 3′LGALS13 5′CATGGGCTGGCTGATTT 3′MT2AMT2A5 5′CGCCTGATGCTGGGACAG 3′MT2A3 5′GTTGTACATAAAAAATCCAGGTTTGTG 3′RPL27RPL275 5′GATCCTGCTCTTAAACGCAAGG 3’RPL273 5′TGCCTGTCTTGTATCTCTCTTCAAAC 3’PCR反應(yīng)在iCycler(BioRad)上利用下述熱循環(huán)程序進(jìn)行
94℃10分鐘以活化DNA聚合酶40個(gè)循環(huán)94℃30秒，隨后60℃30秒數(shù)據(jù)分析按照制造商推薦方法進(jìn)行。
圖10顯示4個(gè)示蹤的熒光讀數(shù)與用PCR反應(yīng)定量cDNA產(chǎn)物(通過擴(kuò)增第二鏈cDNA)或定量相應(yīng)SPIA擴(kuò)增產(chǎn)物(通過擴(kuò)增積聚的第二鏈cDNA)而進(jìn)行的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)間的關(guān)系。圖片顯示了分別使用(從上至下)MTA2、RPL27、LGALS1和G6PD引物對進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。每一圖片顯示利用擴(kuò)增產(chǎn)物制備物(標(biāo)為“SPIA”)的6個(gè)實(shí)驗(yàn)和利用cDNA產(chǎn)物制備物(標(biāo)為“cDNA”)的2個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。X軸為PCR循環(huán)，且Y軸為減去RFU的PCR基線。
利用本發(fā)明方法的每一基因產(chǎn)物(使用cDNA產(chǎn)物模板的反應(yīng)和使用相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板的反應(yīng)間)的擴(kuò)增水平通過產(chǎn)生定義閾值之上的熒光信號所需PCR循環(huán)的不同數(shù)目(標(biāo)為“CT”)而定義。表1顯示每一基因產(chǎn)物的“ΔCT”值的計(jì)算結(jié)果(反映了對使用cDNA產(chǎn)物模板的反應(yīng)和使用相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板的反應(yīng)的CT值的比較)，并且其揭示不管在輸入總RNA中它們的表達(dá)水平如何，對應(yīng)于樣品中4種基因產(chǎn)物的mRNA被本發(fā)明方法同等地?cái)U(kuò)增。
表1每一基因產(chǎn)物的“ΔCT”值的計(jì)算結(jié)果基因cDNA CTSPIA CTΔCTMT2A31 26 11RPL27 30 19 11LGAL31 21 10G6PD35 26 9雖然為了清楚地理解，通過例證和實(shí)施例方式已詳細(xì)描述了上述發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可進(jìn)行某些改變和改進(jìn)。因此，此處的描述和實(shí)施例不應(yīng)構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍在附上的權(quán)利要求中有所描述。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生多拷貝的與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列的方法，所述方法包括下列步驟(a)用RNA依賴的DNA聚合酶延伸與靶RNA雜交的第一引物，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物，由此產(chǎn)生包含第一引物延伸產(chǎn)物和靶RNA的復(fù)合體；(b)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割步驟(a)復(fù)合體中的RNA；(c)用DNA依賴的DNA聚合酶延伸與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的第二引物，由此產(chǎn)生第二引物延伸產(chǎn)物，以形成第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體；(d)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶從第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體的復(fù)合引物上切割RNA，以使復(fù)合引物與第二引物延伸產(chǎn)物雜交，其中復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分；(e)用DNA依賴的DNA聚合酶延伸與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物；由此所述第一引物延伸產(chǎn)物被置換，且由此產(chǎn)生多拷貝的與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的方法，其中第二引物包含與引物延伸產(chǎn)物雜交的靶RNA片段，所述片段通過用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割步驟(a)復(fù)合體中的RNA產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求1的方法，其中第二引物包含DNA。
4.權(quán)利要求1的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物的RNA部分相對于其3’DNA部分而言為5’。
5.權(quán)利要求4的方法，其中5’RNA部分與3’DNA部分毗鄰。
6.權(quán)利要求1的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含在復(fù)合引物與靶RNA雜交的條件下不可與靶RNA雜交的5’部分。
7.權(quán)利要求1的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含多聚dT序列。
8.權(quán)利要求7的方法，其中靶RNA為mRNA。
9.權(quán)利要求1的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含隨機(jī)序列。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中靶RNA為mRNA，并且與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含多聚dT序列，且還包含在復(fù)合引物與靶mRNA雜交的條件下不可與靶mRNA雜交的5’部分。
11.權(quán)利要求1的方法，其中將多種不同的復(fù)合引物用于與靶RNA雜交。
12.權(quán)利要求1的方法，其中第二引物為隨機(jī)引物。
13.權(quán)利要求1的方法，其中第二引物包含在第二引物與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的條件下不可與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的5’部分。
14.權(quán)利要求1的方法，其中從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶為RNaseH。
15.權(quán)利要求1的方法，其中RNA依賴的DNA聚合酶和DNA依賴的DNA聚合酶為同一種酶。
16.權(quán)利要求1的方法，其中RNA依賴的DNA聚合酶和從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶為同一種酶。
17.權(quán)利要求1的方法，其中DNA依賴的DNA聚合酶和從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶為同一種酶。
18.權(quán)利要求1的方法，其中DNA依賴的DNA聚合酶、RNA依賴的DNA聚合酶和從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶為同一種酶。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所用dNTP的至少一種類型為標(biāo)記的dNTP，由此產(chǎn)生標(biāo)記的產(chǎn)物。
20.權(quán)利要求1的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物和與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物相同。
21.權(quán)利要求1的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物和與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物不相同。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法包括產(chǎn)生多拷貝的與兩種或多種不同目的序列互補(bǔ)的多核苷酸序列。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述方法包括至少兩種不同的與靶RNA雜交的復(fù)合引物。
24.權(quán)利要求22或23的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含多聚dT部分。
25.權(quán)利要求22或23的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物為隨機(jī)引物。
26.產(chǎn)生多拷貝目的RNA序列的方法，所述方法包括下列步驟(a)用RNA依賴的DNA聚合酶延伸與靶RNA雜交的第一引物，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物，由此產(chǎn)生包含第一引物延伸產(chǎn)物和靶RNA的復(fù)合體；(b)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割步驟(a)復(fù)合體中的RNA；(c)用DNA依賴的DNA聚合酶延伸與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的第二引物，由此產(chǎn)生第二引物延伸產(chǎn)物，以形成第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體；(d)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶從第一和第二引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合體中的復(fù)合引物上切割RNA，以使復(fù)合引物與第二引物延伸產(chǎn)物雜交，其中復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分；(e)用DNA依賴的DNA聚合酶延伸與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的上述復(fù)合引物；由此置換上述第一引物延伸產(chǎn)物；(f)在允許RNA聚合酶發(fā)生轉(zhuǎn)錄的條件下，用置換的第一引物延伸產(chǎn)物與包含前啟動(dòng)子并包含可與置換的第一引物延伸產(chǎn)物雜交的區(qū)域的多核苷酸雜交，以便產(chǎn)生包含與置換的第一引物延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的序列的RNA轉(zhuǎn)錄本，由此產(chǎn)生多拷貝目的RNA序列。
27.權(quán)利要求26的方法，其中第二引物包含與引物延伸產(chǎn)物雜交的靶RNA的片段，所述片段通過用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割步驟(a)復(fù)合體中的RNA而產(chǎn)生。
28.權(quán)利要求26的方法，其中第二引物包含DNA。
29.權(quán)利要求26的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物的RNA部分相對于其3’DNA部分而言為5’。
30.權(quán)利要求29的方法，其中5’RNA部分與3’DNA部分毗鄰。
31.權(quán)利要求26的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含在復(fù)合引物與靶RNA雜交的條件下不可與靶RNA雜交的5’部分。
32.權(quán)利要求26的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含多聚dT序列。
33.權(quán)利要求26的方法，其中靶RNA為mRNA。
34.權(quán)利要求26的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含隨機(jī)序列。
35.權(quán)利要求26的方法，其中靶RNA為mRNA，并且與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含多聚dT序列，且還包含在復(fù)合引物與靶mRNA雜交的條件下不可與靶mRNA雜交的5’部分。
36.權(quán)利要求26的方法，其中將多種不同的復(fù)合引物用于與靶RNA雜交。
37.權(quán)利要求26的方法，其中第二引物為隨機(jī)引物。
38.權(quán)利要求26的方法，其中第二引物包含在第二引物與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的條件下不可與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的5’部分。
39.權(quán)利要求26的方法，其中從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶為RNaseH。
40.權(quán)利要求26的方法，其中RNA依賴的DNA聚合酶和DNA依賴的DNA聚合酶為同一種酶。
41.權(quán)利要求26的方法，其中RNA依賴的DNA聚合酶和從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶為同一種酶。
42.權(quán)利要求26的方法，其中DNA依賴的DNA聚合酶和從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶為同一種酶。
43.權(quán)利要求26的方法，其中DNA依賴的DNA聚合酶、RNA依賴的DNA聚合酶和從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶為同一種酶。
44.權(quán)利要求26的方法，其中所用dNTP的至少一種類型為標(biāo)記的dNTP，由此產(chǎn)生標(biāo)記的產(chǎn)物。
45.權(quán)利要求26的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物和與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物相同。
46.權(quán)利要求26的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物和與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物不相同。
47.權(quán)利要求26的方法，其中前啟動(dòng)子多核苷酸在其3’末端包含與置換的引物延伸產(chǎn)物雜交的區(qū)域，由此用DNA聚合酶延伸置換的引物延伸產(chǎn)物產(chǎn)生雙鏈啟動(dòng)子，從所述雙鏈啟動(dòng)子發(fā)生轉(zhuǎn)錄。
48.權(quán)利要求26的方法，其中前啟動(dòng)子多核苷酸為前啟動(dòng)子模板寡核苷酸(PTO)。
49.權(quán)利要求26的方法，其中所用rNTP的至少一種類型為標(biāo)記的rNTP，由此產(chǎn)生標(biāo)記的產(chǎn)物。
50.權(quán)利要求26的方法，其中所述方法包括產(chǎn)生多拷貝的兩種或多種不同目的序列。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述方法包括至少兩種不同的與靶RNA雜交的復(fù)合引物。
52.權(quán)利要求50或51的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含多聚dT部分。
53.權(quán)利要求50或51的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物為隨機(jī)引物。
54.擴(kuò)增目的RNA序列的方法，其包括孵育反應(yīng)混合物，上述反應(yīng)混合物包含(a)權(quán)利要求1中步驟(c)的第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體；(b)可與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物，其中復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分；(c)DNA依賴的DNA聚合酶；和(d)從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶；其中孵育條件為允許引物雜交、RNA切割和當(dāng)其RNA被切割且復(fù)合引物結(jié)合至復(fù)合體中第二引物延伸產(chǎn)物并延伸時(shí)從權(quán)利要求1中步驟(c)的復(fù)合體上置換第一引物延伸產(chǎn)物，由此產(chǎn)生多拷貝與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列。
55.權(quán)利要求54的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物的RNA部分相對于其3’DNA部分而言為5’，且5’RNA部分與3’DNA部分毗鄰。
56.權(quán)利要求54的方法，其中靶RNA為mRNA。
57.權(quán)利要求54的方法，其中所用dNTP的至少一種類型為標(biāo)記的dNTP，由此產(chǎn)生標(biāo)記的產(chǎn)物。
58.擴(kuò)增目的RNA序列的方法，其包括孵育反應(yīng)混合物，上述反應(yīng)混合物包含(a)第一復(fù)合體，其中第一復(fù)合體為權(quán)利要求1中步驟(c)的第一和第二引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合體；(b)可與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物，其中復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分；(c)DNA依賴的DNA聚合酶；(d)RNA聚合酶；(e)包含前啟動(dòng)子并包含與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的區(qū)域的前啟動(dòng)子多核苷酸；和(f)從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶；其中孵育條件為允許引物雜交、RNA切割、當(dāng)其RNA被切割且復(fù)合引物結(jié)合至第一復(fù)合體中的第二引物延伸產(chǎn)物時(shí)從第一復(fù)合體上置換第一引物延伸產(chǎn)物、前啟動(dòng)子多核苷酸與置換的第一引物延伸產(chǎn)物雜交以形成包含置換的引物延伸產(chǎn)物和前啟動(dòng)子多核苷酸的第二復(fù)合體、以及從所述第二復(fù)合體進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄，由此產(chǎn)生多拷貝的目的RNA序列。
59.權(quán)利要求58的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物的RNA部分相對于其3’DNA部分而言為5’，且5’RNA部分與3’DNA部分毗鄰。
60.權(quán)利要求58的方法，其中從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶為RNaseH。
61.權(quán)利要求58的方法，其中前啟動(dòng)子多核苷酸在其3’末端包含與置換的引物延伸產(chǎn)物雜交的區(qū)域，由此用DNA聚合酶延伸置換的引物延伸產(chǎn)物產(chǎn)生雙鏈啟動(dòng)子，從所述雙鏈啟動(dòng)子發(fā)生轉(zhuǎn)錄。
62.權(quán)利要求58的方法，其中所用rNTP的至少一種類型為標(biāo)記的rNTP，由此產(chǎn)生標(biāo)記的產(chǎn)物。
63.權(quán)利要求58的方法，其中靶RNA為mRNA。
64.產(chǎn)生多拷貝(擴(kuò)增)目的RNA序列的方法，其包括(a)孵育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含(i)靶RNA；(ii)可與靶RNA雜交的第一引物，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；(iii)RNA依賴的DNA聚合酶；和(iv)從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶；其中孵育條件為允許引物雜交、形成包含第一引物延伸產(chǎn)物和靶RNA的復(fù)合體、以及切割包含第一引物延伸產(chǎn)物和靶RNA的復(fù)合體中的RNA；(b)孵育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含(i)第一引物延伸產(chǎn)物；(ii)DNA依賴的DNA聚合酶；和(iii)任選地，可從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶；其中孵育條件為允許形成包含第一引物延伸產(chǎn)物和第二引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合體，以及任選地允許在包含第一引物延伸產(chǎn)物和靶RNA的復(fù)合體中切割RNA。(c)孵育反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含(i)包含第一引物延伸產(chǎn)物和第二引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合體；(ii)可從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶；(iii)復(fù)合引物，其中復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分；(iv)包含第一引物延伸產(chǎn)物和第二引物延伸產(chǎn)物的切割的復(fù)合體；和(v)DNA依賴的DNA聚合酶，其中孵育條件為允許切割包含第一引物延伸產(chǎn)物和第二引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合體中的RNA、復(fù)合引物雜交、以及從包含第一引物延伸產(chǎn)物和第二引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合體上置換第一引物延伸產(chǎn)物；由此產(chǎn)生多拷貝的與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列。
65.權(quán)利要求64的方法，其中步驟(b)包括孵育還包含(iv)第二引物的反應(yīng)混合物，并且其中孵育在允許第二引物雜交的條件下進(jìn)行。
66.權(quán)利要求65的方法，其中第二引物包含DNA。
67.權(quán)利要求64的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物的RNA部分相對于其3’DNA部分而言為5’。
68.權(quán)利要求67的方法，其中5’RNA部分與3’DNA部分毗鄰。
69.權(quán)利要求64的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含在復(fù)合引物與靶RNA雜交的條件下不可與靶RNA雜交的5’部分。
70.權(quán)利要求64的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含多聚dT序列。
71.權(quán)利要求64的方法，其中靶RNA為mRNA。
72.權(quán)利要求64的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含隨機(jī)序列。
73.權(quán)利要求64的方法，其中靶RNA為mRNA，并且與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含多聚dT序列，且還包含在復(fù)合引物與靶mRNA雜交的條件下不可與靶mRNA雜交的5’部分。
74.權(quán)利要求64的方法，其中使用了多種不同的復(fù)合引物與靶RNA雜交。
75.權(quán)利要求64的方法，其中第二引物為隨機(jī)引物。
76.權(quán)利要求64的方法，其中第二引物包含在該第二引物與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的條件下不可與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的5’部分。
77.權(quán)利要求64的方法，其中從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶為RNaseH。
78.權(quán)利要求64的方法，其中RNA依賴的DNA聚合酶和DNA依賴的DNA聚合酶為同一種酶。
79.權(quán)利要求64的方法，其中RNA依賴的DNA聚合酶和從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶為同一種酶。
80.權(quán)利要求64的方法，其中DNA依賴的DNA聚合酶和從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶為同一種酶。
81.權(quán)利要求64的方法，其中DNA依賴的DNA聚合酶、RNA依賴的DNA聚合酶和從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶為同一種酶。
82.權(quán)利要求64的方法，其中所用dNTP的至少一種類型為標(biāo)記的dNTP，由此產(chǎn)生標(biāo)記的產(chǎn)物。
83.權(quán)利要求64的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物和與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物相同。
84.權(quán)利要求64的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物和與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物不相同。
85.權(quán)利要求64的方法，其中所述方法包括產(chǎn)生多拷貝的與兩種或多種不同目的序列互補(bǔ)的多核苷酸序列。
86.權(quán)利要求85的方法，其中所述方法包括至少兩種不同的與靶RNA雜交的復(fù)合引物。
87.權(quán)利要求85或86的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含多聚dT部分。
88.權(quán)利要求85或86的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物為隨機(jī)引物。
89.產(chǎn)生多拷貝與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列的方法，所述方法包括下列步驟(a)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體中的RNA，以使復(fù)合引物與第二引物延伸產(chǎn)物雜交，其中復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分，其中第一引物延伸產(chǎn)物通過用RNA依賴的DNA聚合酶延伸與靶RNA雜交的第一引物而產(chǎn)生，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；(b)將復(fù)合引物與第二引物延伸產(chǎn)物雜交，并用DNA依賴的DNA聚合酶延伸該復(fù)合引物；由此所述第一引物延伸產(chǎn)物被置換，并由此多拷貝的與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列得以產(chǎn)生。
90.權(quán)利要求89的方法，其中第二引物包含DNA。
91.權(quán)利要求89的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物的RNA部分相對于其3’DNA部分而言為5’。
92.權(quán)利要求91的方法，其中5’RNA部分與3’DNA部分毗鄰。
93.權(quán)利要求89的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含在復(fù)合引物與靶RNA雜交的條件下不可與靶RNA雜交的5’部分。
94.權(quán)利要求89的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含多聚dT序列。
95.權(quán)利要求94的方法，其中靶RNA為mRNA。
96.產(chǎn)生多拷貝的與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列的方法，所述方法包括延伸復(fù)合體中復(fù)合引物的步驟，所述復(fù)合體包含(i)第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體，其中第一引物延伸產(chǎn)物通過用RNA依賴的DNA聚合酶延伸與靶RNA雜交的第一引物而產(chǎn)生，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物，其中第二引物延伸產(chǎn)物通過延伸與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的第二引物而產(chǎn)生，且其中第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體中的RNA被從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割；和(ii)復(fù)合引物，所述復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分，其中復(fù)合引物雜交至第二引物延伸產(chǎn)物，并且其中復(fù)合引物可與第一引物相同或不相同；由此所述第一引物延伸產(chǎn)物被置換，并由此多拷貝的與目的RNA序列互補(bǔ)的多核苷酸序列得以產(chǎn)生。
97.權(quán)利要求96的方法，其中第二引物包含DNA。
98.權(quán)利要求96的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物的RNA部分相對于其3’DNA部分而言為5’。
99.權(quán)利要求98的方法，其中5’RNA部分與3’DNA部分毗鄰。
100.權(quán)利要求96的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含在復(fù)合引物與靶RNA雜交的條件下不可與靶RNA雜交的5’部分。
101.權(quán)利要求96的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物包含多聚dT序列。
102.權(quán)利要求101的方法，其中靶RNA為mRNA。
103.測定目的RNA序列的方法，所述方法包括(a)在dNTP和dNTP類似物的混合物存在下使用權(quán)利要求1、54、64、89和96中所述的任一方法擴(kuò)增含有目的序列的靶RNA，這樣在摻入dNTP類似物后引物延伸終止；和(b)分析擴(kuò)增產(chǎn)物以確定序列。
104.權(quán)利要求103的方法，其中靶RNA為mRNA。
105.測定目的RNA序列的方法，所述方法包括(a)在rNTP和rNTP類似物的混合物存在下使用權(quán)利要求26和58中所述的任一方法擴(kuò)增含有目的序列的靶RNA，這樣在摻入rNTP類似物后轉(zhuǎn)錄終止；和(b)分析擴(kuò)增產(chǎn)物以確定序列。
106.權(quán)利要求105的方法，其中靶RNA為mRNA。
107.通過單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測靶RNA中突變的方法，其包括(a)使用權(quán)利要求1、26、54、58、64、89和96中所述的任一方法擴(kuò)增靶RNA；和(b)分析擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈構(gòu)象，其中與參照單鏈多核苷酸相比較構(gòu)象的差異顯示出靶多核苷酸上的突變。
108.權(quán)利要求107的方法，其中靶RNA為mRNA。
109.確定目的序列存在與否的方法，所述方法包括(i)擴(kuò)增包含目的序列的靶RNA，所述擴(kuò)增包括延伸與權(quán)利要求1步驟(d)的復(fù)合體雜交的復(fù)合引物，其中復(fù)合引物的RNA部分序列已知，和(ii)將來自步驟(i)的擴(kuò)增產(chǎn)物如果有的話與來自參照模板的擴(kuò)增產(chǎn)物量相比較其中(1)從模板產(chǎn)生的可檢測出的擴(kuò)增產(chǎn)物量少于從包含可與復(fù)合引物RNA部分雜交區(qū)域的參考模板中擴(kuò)增的產(chǎn)物量，說明第二引物延伸產(chǎn)物不包含可與復(fù)合引物RNA部分雜交的序列，且相對于可與復(fù)合引物RNA部分雜交的序列而言為一序列變體；或(2)從模板產(chǎn)生的可檢測出的擴(kuò)增產(chǎn)物量多于從不包含可與復(fù)合引物RNA部分雜交區(qū)域的參考模板中擴(kuò)增的產(chǎn)物量，說明第二引物延伸產(chǎn)物包含可與復(fù)合引物RNA部分雜交的序列，且相對于可與復(fù)合引物RNA部分雜交的序列而言為非序列變體。
110.權(quán)利要求109的方法，其中靶RNA為mRNA。
111.產(chǎn)生固定于基片上的核酸的方法，其包括(a)使用權(quán)利要求1、26、54、58、64、89和96中所述的任一方法擴(kuò)增靶RNA；和(b)將擴(kuò)增產(chǎn)物固定于基片上。
112.權(quán)利要求111的方法，其中靶RNA為mRNA。
113.權(quán)利要求111的方法，其中基片為微陣列。
114.鑒定目的RNA序列的方法，其包括(a)使用權(quán)利要求1、54、64、89和96中所述的任一方法擴(kuò)增靶RNA；和(b)分析DNA產(chǎn)物。
115.權(quán)利要求114的方法，其中靶RNA為mRNA。
116.權(quán)利要求114的方法，其中DNA產(chǎn)物被標(biāo)記。
117.權(quán)利要求114的方法，其中分析DNA產(chǎn)物的步驟(b)包括確定所述產(chǎn)物的量，由此定量存在于樣品中的目的RNA序列的量。
118.權(quán)利要求114的方法，其中步驟(b)包括將DNA產(chǎn)物與至少一種探針接觸。
119.權(quán)利要求118的方法，其中DNA產(chǎn)物被標(biāo)記，且其中至少一種探針是以微陣列形式提供的。
120.權(quán)利要求119的方法，其中微陣列包含至少一種固定于基片上的探針，上述基片由選自紙、玻璃、陶瓷、塑料、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龍、聚丙烯酰胺、硝化纖維、硅和光纖的材料制備。
121.權(quán)利要求120的方法，其中探針固定在二維結(jié)構(gòu)或三維結(jié)構(gòu)的基片上，其中二維或三維結(jié)構(gòu)包括針、棒、纖維、帶、細(xì)線、珠、顆粒、微量滴定孔、毛細(xì)管和圓柱體。
122.鑒定目的RNA序列的方法，其包括(a)使用權(quán)利要求26和58中所述的任一方法擴(kuò)增靶RNA；和(b)分析RNA產(chǎn)物。
123.權(quán)利要求122的方法，其中靶RNA為mRNA。
124.權(quán)利要求122的方法，其中RNA產(chǎn)物被標(biāo)記。
125.權(quán)利要求122的方法，其中分析RNA產(chǎn)物的步驟(b)包括確定所述產(chǎn)物的量，由此定量存在于樣品中的目的RNA序列的量。
126.權(quán)利要求122的方法，其中步驟(b)包括將標(biāo)記的RNA產(chǎn)物與至少一種探針接觸。
127.權(quán)利要求122的方法，其中RNA產(chǎn)物被標(biāo)記，且其中至少一種探針是以微陣列形式提供的。
128.權(quán)利要求127的方法，其中微陣列包含至少一種固定于基片上的探針，上述基片由選自紙、玻璃、陶瓷、塑料、聚丙烯、聚苯乙烯、尼龍、聚丙烯酰胺、硝化纖維、硅和光纖的材料制備。
129.權(quán)利要求128的方法，其中探針固定在二維結(jié)構(gòu)或三維結(jié)構(gòu)的基片上，其中二維或三維結(jié)構(gòu)包括針、棒、纖維、帶、細(xì)線、珠、顆粒、微量滴定孔、毛細(xì)管和圓柱體。
130.確定樣品中基因表達(dá)譜的方法，所述方法包括(a)使用權(quán)利要求1、54、64、89和96中任意一項(xiàng)所述的方法擴(kuò)增樣品中至少一種目的RNA序列；和(b)確定每一目的RNA序列的擴(kuò)增產(chǎn)物量，其中每一所述量顯示出樣品中每一目的RNA序列的量，由此確定樣品的基因表達(dá)譜。
131.權(quán)利要求130的方法，其中每一靶RNA為mRNA。
132.制備文庫的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求1、26、54、58、64、89和96中任意一項(xiàng)所述的方法擴(kuò)增至少一種目的RNA序列。
133.權(quán)利要求132的方法，其中與靶RNA雜交的第一引物為隨機(jī)引物。
134.權(quán)利要求132的方法，其中與靶RNA雜交的第一引物包含多聚dT部分。
135.制備消減雜交探針的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求1、54、64、89和96中任意一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生與第一RNA群體中至少一種目的RNA序列互補(bǔ)的多種DNA拷貝。
136.進(jìn)行消減雜交的方法，所述方法包括(a)使用權(quán)利要求1、54、64、89和96中任意一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生與第一RNA群體中至少一種目的RNA序列互補(bǔ)的多種DNA拷貝；和(b)將該多種拷貝與第二mRNA群體雜交，由此第二mRNA群體的亞群體與DNA拷貝形成復(fù)合體。
137.權(quán)利要求136的方法，所述方法還包括(c)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割步驟(b)復(fù)合體中的RNA；和(d)擴(kuò)增第二mRNA群體中的未雜交亞群體，由此多拷貝的與第二mRNA群體的未雜交亞群體互補(bǔ)的單鏈DNA得以產(chǎn)生。
138.一種或多種目的RNA序列差異擴(kuò)增的方法，所述方法包括(a)將使用權(quán)利要求1、54、64、89和96中任意一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的與第一RNA群體中一種或多種目的RNA序列互補(bǔ)的多種多核苷酸拷貝與第二mRNA群體雜交，由此第二mRNA群體的亞群體與多核苷酸拷貝雜交形成復(fù)合體；(b)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割步驟(b)復(fù)合體中的RNA；以及(c)擴(kuò)增第二mRNA群體中的未雜交亞群體，由此多拷貝的與第二mRNA群體的未雜交亞群體互補(bǔ)的單鏈DNA得以產(chǎn)生。
139.制備cDNA文庫的方法，所述方法包括制備根據(jù)權(quán)利要求84的消減雜交探針。
140.包含復(fù)合引物和第二引物的組合物，其中復(fù)合引物包含RNA部分和3’DNA部分。
141.權(quán)利要求140的組合物，其中第二引物包含DNA。
142.權(quán)利要求141的組合物，其中第二引物為隨即引物。
143.權(quán)利要求140的組合物，其中第二引物包含與引物延伸產(chǎn)物雜交的靶RNA片斷。
144.權(quán)利要求140的組合物，其還包含RNA依賴的DNA聚合酶。
145.權(quán)利要求140的組合物，其中復(fù)合引物還包含在該復(fù)合引物與靶RNA雜交的條件下不可與目的RNA雜交的5’部分。
146.包含復(fù)合引物和第二引物的組合物，所述第二引物包含在復(fù)合引物與靶RNA雜交的條件下不可與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的序列。
147.一種組合物，其包含(a)復(fù)合引物；(b)第二引物；和(c)前啟動(dòng)子多核苷酸。
148.權(quán)利要求147的組合物，其中第二引物為隨機(jī)引物。
149.一種組合物，其包含由(a)第一引物延伸產(chǎn)物，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；和(b)前啟動(dòng)子多核苷酸組成的復(fù)合體。
150.一種組合物，其包含由(a)第一引物延伸產(chǎn)物，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；和(b)第二引物延伸產(chǎn)物組成的復(fù)合體，其中第二引物包含DNA。
151.一種組合物，其包含由(a)第一引物延伸產(chǎn)物，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；和(b)第二引物延伸產(chǎn)物組成的復(fù)合體，其中第二引物包含RNA靶片斷。
152.一種組合物，其包含由(a)切割的引物延伸產(chǎn)物，其中引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物；(b)第二引物延伸產(chǎn)物；和(c)與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物組成的復(fù)合體。
153.權(quán)利要求152的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物和與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物相同。
154.權(quán)利要求152的方法，其中與靶RNA雜交的復(fù)合引物和與第二引物延伸產(chǎn)物雜交的復(fù)合引物不同。
155.一種反應(yīng)混合物，其包含(a)靶RNA；(b)包含3’DNA部分和RNA部分的復(fù)合引物；(c)第二引物；和(d)DNA聚合酶。
156.權(quán)利要求155的反應(yīng)混合物，其還包含(e)從RNA/DNA雜合體中切割RNA的酶。
157.權(quán)利要求155的反應(yīng)混合物，其還包含(e)前啟動(dòng)子多核苷酸。
158.擴(kuò)增靶RNA的試劑盒，其包含(a)包含3’DNA部分和RNA部分的復(fù)合引物；(b)第二引物；和(c)根據(jù)權(quán)利要求1、26、54、58、64、89和96中所述任一方法擴(kuò)增RNA的說明書。
159.權(quán)利要求158的試劑盒，其還包含(d)前啟動(dòng)子多核苷酸。
160.權(quán)利要求157或158的試劑盒，其還包含從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶。
161.制備包含3’單鏈部分的第一和第二引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合體的方法，其包括(a)用RNA依賴的DNA聚合酶延伸與靶RNA雜交的第一引物，其中第一引物為包含RNA部分和3’DNA部分的復(fù)合引物，由此包含第一引物延伸產(chǎn)物和靶RNA的復(fù)合體得以產(chǎn)生；(b)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割步驟(a)復(fù)合體中的RNA；(c)用DNA依賴的DNA聚合酶延伸與第一引物延伸產(chǎn)物雜交的第二引物，由此產(chǎn)生第二引物延伸產(chǎn)物，以形成第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體；(d)用從RNA/DNA雜合體上切割RNA的酶切割第一和第二引物延伸產(chǎn)物復(fù)合體中復(fù)合引物上的RNA；由此包含3’單鏈部分的第一和第二引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合體得以產(chǎn)生；由此該3’單鏈部分與復(fù)合引物的RNA部分互補(bǔ)。
全文摘要
本發(fā)明提供了等溫?cái)U(kuò)增RNA的方法。這些方法尤其適用于擴(kuò)增樣品中多種RNA樣本。這些方法使用復(fù)合引物、第二引物和鏈置換以產(chǎn)生多拷貝的包含與目的RNA序列具互補(bǔ)序列的DNA產(chǎn)物。另一方面，這些方法使用了單引物(其為復(fù)合引物)和鏈置換來產(chǎn)生多拷貝的包含與目的RNA序列具互補(bǔ)序列的DNA產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，包括轉(zhuǎn)錄步驟以產(chǎn)生目的RNA序列的多拷貝正義RNA。這些方法用于制備核酸文庫和基片來分析生物樣品中細(xì)胞的基因表達(dá)。本發(fā)明還提供了用于實(shí)踐這些擴(kuò)增方法的組合物和試劑盒，并提供了使用擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。
文檔編號C07H21/02GK1473202SQ02802827
公開日2004年2月4日 申請日期2002年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月9日
發(fā)明者N·庫恩, N 庫恩 申請人:紐亙技術(shù)公司