專利名稱:解鏈溫度依賴性dna擴(kuò)增的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增的方法。本發(fā)明特別涉及一種新的選擇性核酸擴(kuò)增方法及該方法的應(yīng)用。
背景技術(shù):
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是基于雙鏈DNA變性、隨后寡核苷酸與DNA模板退火、以及通過DNA聚合酶進(jìn)行引物延伸的往復(fù)循環(huán)而進(jìn)行的(例如參見Mullis等,美國專利No.4,683,195,4,683,202和4,800,159)。將PCR中使用的寡核苷酸引物設(shè)計成與DNA的相對鏈退火并且定位,以使得DNA聚合酶催化的一個引物的延伸產(chǎn)物可以作為另一個引物的模板鏈。所述PCR方法使分散的DNA以指數(shù)方式增加,其長度通過所述寡核苷酸引物的5’末端限定。
在PCR中,反應(yīng)條件通常在3個溫度之間循環(huán)高溫(通常為90°-100℃)使雙鏈DNA片段解鏈(變性),隨后選擇一個溫度(通常為50°-70℃)以促進(jìn)引物與DNA特異性退火,最后在最佳溫度(通常為60°-72℃)孵育以通過DNA聚合酶延伸。選擇引物、退火溫度及緩沖液條件以用于提供靶序列的選擇性擴(kuò)增。
在2003年2月25日申請的發(fā)明名稱為“Headloop DNAAmplification”的我們的共同未決國際申請中(在此全文并入?yún)⒖?,我們公開了使用引物選擇性擴(kuò)增核酸的方法,所述引物包含一個在非靶核酸中是一個反向重復(fù)序列的區(qū)域。
本發(fā)明人揭示了核酸的選擇性擴(kuò)增也可以通過改變變性溫度而實現(xiàn)。PCR產(chǎn)物的解鏈溫度依賴于其長度(長度增加則解鏈溫度提高)及其堿基成分(G+C含量增多則解鏈溫度提高)。實質(zhì)上,本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識到解鏈溫度高于變性溫度的DNA片段的擴(kuò)增可以被抑制。盡管解鏈模式的差異先前已經(jīng)用于區(qū)分和/或鑒別PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,但是就我們所知,解鏈溫度的差異尚未用于選擇性擴(kuò)增。
發(fā)明概述在第一個方面,本發(fā)明提供了一種選擇性擴(kuò)增樣品中至少一個靶核酸的方法,所述樣品包含至少一個靶核酸和至少一個非靶核酸,所述靶核酸的解鏈溫度低于非靶核酸的解鏈溫度,所述方法包括進(jìn)行核酸變性步驟及隨后使用至少一個擴(kuò)增引物進(jìn)行的擴(kuò)增步驟的一或多次循環(huán),其中所述變性步驟在所述至少一個靶核酸的解鏈溫度或高于該溫度但低于所述至少一個非靶核酸的解鏈溫度的溫度進(jìn)行,以基本上抑制所述非靶核酸的擴(kuò)增。
所述核酸可以是DNA。
發(fā)明詳述本發(fā)明的方法可以包括應(yīng)用一種單引物,盡管優(yōu)選所述擴(kuò)增是“指數(shù)式”擴(kuò)增并因此利用一對引物,成對引物一般稱為“正向”及“反向”引物,其一與一條核酸鏈互補(bǔ),另一與該鏈的互補(bǔ)鏈互補(bǔ)。
本發(fā)明的方法可以包括應(yīng)用甲基化特異性引物。
該方法的擴(kuò)增步驟可以通過任何合適的擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行。
所述擴(kuò)增步驟可以通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、鏈置換反應(yīng)(SDA)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、連接介導(dǎo)的PCR及滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)進(jìn)行。
優(yōu)選所述擴(kuò)增技術(shù)是PCR等。所述PCR可以是任何PCR技術(shù),包括但非限于實時PCR。
本發(fā)明的選擇性擴(kuò)增方法可以對含有靶核酸及非靶核酸的任何樣品進(jìn)行,其中靶核酸與非靶核酸的解鏈點(diǎn)不同。這種解鏈點(diǎn)不同可以是核酸中固有的,或者可以是通過修飾靶核酸及非靶核酸中之一和/或兩者而產(chǎn)生或強(qiáng)化。這種修飾可以是化學(xué)修飾,例如通過變換(convert)核酸的一或多個堿基以導(dǎo)致所述核酸的解鏈點(diǎn)改變。所述化學(xué)修飾例如是如以下詳細(xì)闡述的亞硫酸氫鹽處理。
所使用的變性溫度優(yōu)選在靶核酸及非靶核酸的解鏈溫度之間。更優(yōu)選進(jìn)行變性的溫度是低于所述非靶核酸的解鏈溫度但在所述核酸的解鏈溫度或高于該溫度,以允許所述靶核酸擴(kuò)增。
本發(fā)明的選擇性擴(kuò)增方法具有廣泛的可能應(yīng)用范圍。例如通過擴(kuò)增短DNA片段,本發(fā)明可以用于檢測小缺失及堿基改變并選擇性擴(kuò)增不同的但相關(guān)的DNA序列(如多基因家族成員)。如果靶核酸和非靶核酸的引發(fā)位點(diǎn)是相同的,這種檢測是關(guān)鍵性的。本發(fā)明的方法還用于突變及多態(tài)性的診斷分析中及用于相關(guān)基因的各個成員的分析中。本發(fā)明還可以用于選擇性擴(kuò)增混合的DNA樣品中來自特定物種基因組的基因。
另外本發(fā)明還可以用于抑制在PCR中通??梢姷募貾CR產(chǎn)物的擴(kuò)增,其中那些PCR產(chǎn)物的解鏈溫度高于所希望的產(chǎn)物的解鏈溫度。
由于本發(fā)明方法中變性步驟可以在低于常規(guī)PCR的溫度進(jìn)行,因此在使用較低解鏈溫度時還具有另一優(yōu)勢,即聚合酶不會迅速地喪失活性并可以潛在地以較少量使用。
在所述擴(kuò)增步驟之前,本發(fā)明的方法可以包括將樣品中的核酸與至少一種修飾劑接觸,以改變至少一個靶核酸及非靶核酸的相對解鏈溫度。
通過修飾劑進(jìn)行的修飾可以提高所述靶核酸與非靶核酸之間的解鏈溫度差異。
因此,在第二方面,本發(fā)明提供了一種針對第一方面的方法,其中樣品中的靶核酸和/或非靶核酸已經(jīng)進(jìn)行修飾以建立所述靶核酸與非靶核酸解鏈溫度之間的差異或提高解鏈溫度差異。
優(yōu)選所述修飾步驟降低靶核酸的解鏈溫度。
優(yōu)選所述修飾步驟改變至少一個靶核酸及至少一個非靶核酸的相對解鏈溫度。在所述至少一個靶核酸及至少一個非靶核酸的解鏈溫度相差不大情況中,所述修飾步驟可以提高解鏈溫度的差異。所述修飾步驟可以不同程度地修飾所述至少一個靶核酸及至少一個非靶核酸。
所述修飾可以是核酸的化學(xué)修飾。所述核酸可以包含甲基化及非甲基化的胞嘧啶。
因此在第三方面,本發(fā)明提供了一種針對第二方面的方法,其中將樣品中的核酸與一種修飾非甲基化的胞嘧啶的修飾劑接觸以產(chǎn)生一種變換的核酸。
所述修飾劑可以是一種亞硫酸氫鹽。
例如,本發(fā)明的方法可特別用于提高亞硫酸氫鹽處理的DNA擴(kuò)增的特異性。通過降低PCR中用于變性DNA片段的溫度,我們已經(jīng)能消除或抑制那些解鏈溫度高于所希望的靶核酸的不希望的產(chǎn)物。這種產(chǎn)物可以是未變換的或部分變換的DNA。
可以理解本發(fā)明不限于對亞硫酸氫鹽修飾的DNA的應(yīng)用。
本發(fā)明的方法的一種特殊的但非唯一的應(yīng)用是分析或檢測核酸序列中的位點(diǎn)異常性,包括異常甲基化不足(abnormal under-methylation)。
基因表達(dá)研究已經(jīng)提示基因調(diào)控區(qū)域的甲基化與包括許多形式的癌癥的許多疾病或病癥(condition)密切相關(guān)。事實上一些疾病特征在于在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTP1)基因和/或其調(diào)控側(cè)翼序列內(nèi)的位點(diǎn)胞嘧啶的異常甲基化。GSTP1基因的異常甲基化的作用在WO 9955905中公開,該文獻(xiàn)以其全文并入?yún)⒖肌?br>
甲基化不足和/或異常DNA甲基化與包括癌癥的各種人體病理的發(fā)展相關(guān)。以甲基化不足形式的異常甲基化與疾病和癌癥相關(guān)。例如包含甲基化不足的癌癥的例子是肺癌、乳腺癌、子宮頸非典型增生及癌變、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌和肝癌。例如見Cui等,Cancer Research,Vol 62,p6442,2002;Gupta等,Cancer Research,Vol.63,p 664 2003;Scelfo等,Oncogen,Vol 21,p2654。
本發(fā)明的方法可用于分析異常甲基化,其中所述異常甲基化是甲基化不足。
因此,在另一方面,本發(fā)明提供了一種核酸異常甲基化不足的試驗,其中所述試驗包括如下步驟i)將分離的核酸與亞硫酸氫鹽反應(yīng);ii)對來自(i)的核酸進(jìn)行選擇性擴(kuò)增,其中所述選擇性擴(kuò)增包括進(jìn)行變性步驟及隨后的擴(kuò)增步驟的一或多次循環(huán),其中所述變性在含有異常甲基化不足的核酸的靶核酸的解鏈溫度或高于該溫度但低于甲基化或基本上甲基化的非靶核酸的解鏈溫度的溫度進(jìn)行,以基本上抑制所述非靶核酸的擴(kuò)增;以及iii)確定擴(kuò)增的核酸的存在情況。
所述核酸可以是DNA。
在另一方面,本發(fā)明提供一種診斷或預(yù)測受試對象中疾病或癌癥的試驗,所述疾病或病癥的特征在于核酸的異常甲基化不足,其中所述試驗包括如下步驟i)將分離的核酸與亞硫酸氫鹽反應(yīng);ii)對來自(i)的核酸進(jìn)行選擇性擴(kuò)增,其中所述選擇性擴(kuò)增包括進(jìn)行變性步驟及隨后的擴(kuò)增步驟的一或多次循環(huán),其中所述變性在含有異常甲基化不足的核酸的靶核酸的解鏈溫度或高于該溫度但低于甲基化或基本上甲基化的非靶核酸的解鏈溫度的溫度進(jìn)行,以基本上抑制所述非靶核酸的擴(kuò)增;以及iii)確定擴(kuò)增的核酸的存在情況。
后一方面的試驗可用于診斷以核酸甲基化不足為特征的癌癥或判斷其預(yù)后。所述癌癥可以是肺癌、乳腺癌、子宮頸非典型增生及癌癥、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌及肝癌。
術(shù)語本發(fā)明申請中所用術(shù)語“引物”是指一種寡核苷酸,其在存在核苷酸及聚合劑的情況下能作為合成的起始點(diǎn)。所述引物優(yōu)選是單鏈的但也可以是雙鏈的。如果引物是雙鏈的,則在擴(kuò)增反應(yīng)之前所述的兩條鏈?zhǔn)欠蛛x的。選擇本發(fā)明中使用的引物以便其與要擴(kuò)增的序列的不同鏈充分互補(bǔ),以至于所述引物在擴(kuò)增反應(yīng)條件下能與所述序列的鏈雜交。因此,所述引物中可以包含非互補(bǔ)的堿基或序列,條件是所述引物與感興趣的序列充分互補(bǔ)以與所述序列雜交。
所述寡核苷酸引物可以通過本領(lǐng)域熟知的方法制備或者從生物學(xué)原料分離。美國專利No.4,458,068公開了一種在固體支持物上合成寡核苷酸引物的方法,該文獻(xiàn)在此并入?yún)⒖肌?br>
術(shù)語“核酸”包括雙鏈或單鏈DNA或RNA或者雙鏈的DNA-RNA雜種和/或其類似物和衍生物。在PCR中,“模板分子”可代表加入反應(yīng)中的核酸的一個片段或一部分。特別地,“模板分子”是指兩個引物之間并包含所述引物的序列。特異的序列的核酸可以衍生自許多種來源,包括人、哺乳動物、脊椎動物、昆蟲、細(xì)菌、真菌、植物和病毒。在某些實施方案中,所述靶核酸是這樣的一種核酸,即其存在與否可用于某些醫(yī)學(xué)或法醫(yī)領(lǐng)域如診斷、DNA指紋法等。使用本發(fā)明可以擴(kuò)增任何核酸,只要已知所述序列兩端足夠數(shù)量的堿基,以便可以制備將與被擴(kuò)增的序列的不同鏈雜交的寡核苷酸引物。
術(shù)語“PCR”是指聚合酶鏈反應(yīng),其是熱循環(huán)的、聚合酶介導(dǎo)的DNA擴(kuò)增反應(yīng)。PCR典型包括模板分子、與所述模板分子的每個鏈互補(bǔ)的寡核苷酸引物、一種耐熱DNA聚合酶及脫氧核糖核苷酸,并包括三個獨(dú)特的多次重復(fù)的程序,以擴(kuò)增所述原始核酸。所述三個程序(變性、雜交和引物延伸)通常在獨(dú)特溫度及在獨(dú)特時間步驟進(jìn)行。然而在許多實施方案中,所述雜交及引物延伸程序可以同時進(jìn)行。
術(shù)語“三磷酸脫氧核苷”是指dATP、dCTP、dGTP和dTTP或類似物。
本發(fā)明申請中所用術(shù)語“聚合劑”是指可以用于合成一種引物延伸產(chǎn)物的任何化合物和系統(tǒng)。合適的化合物包括但非限于熱穩(wěn)定聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、T.litoralis DNA聚合酶及逆轉(zhuǎn)錄酶。
“熱穩(wěn)定聚合酶”是指一種能經(jīng)受住非常高的溫度如接近100℃的DNA和RNA聚合酶。通常熱穩(wěn)定聚合酶衍生自生活在極端溫度中的生物體,如衍生自水生棲熱菌(Thermus aquaticus)。熱穩(wěn)定聚合酶例如包括Taq、Tth、Pfu、Vent、deep vent、UlTma及其變體和衍生物。
“大腸桿菌聚合酶I”是指大腸桿菌的DNA聚合酶I全酶。
所述“Klenow片段”是指DNA聚合酶I全酶的兩個蛋白酶解片段中較大的那個,該片段保留聚合酶活性但喪失與完整酶相關(guān)的5’-外切核酸酶活性。
“T7 DNA聚合酶”是指來自噬菌體T7的一種DNA聚合酶。
“靶核酸”是指衍生自任何多種來源包括人、哺乳動物、脊椎動物、昆蟲、細(xì)菌、真菌、植物和病毒的特異序列的核酸。在某些實施方案中,所述靶核酸是這樣的一種核酸,其存在與否可用于醫(yī)學(xué)和法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域如診斷、DNA指紋法等。所述靶核酸序列可以包含在一較大核酸內(nèi)。所述靶核酸的大小可以是大約30-1000堿基對或更大。所述靶核酸可以是原始核酸或其擴(kuò)增子。
“非靶核酸”是指衍生自多種來源包括人、哺乳動物、脊椎動物、昆蟲、細(xì)菌、真菌、植物和病毒的特異序列的核酸,其可以通過使用與所述靶核酸相同的引物引發(fā)。在某些實施方案中,所述非靶核酸是其存在與否可用于醫(yī)學(xué)和法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域如診斷、DNA指紋法等的核酸。所述非靶核酸可以是這樣的一個序列,其在經(jīng)過設(shè)計為用于變換核酸序列中的一或多個堿基的化學(xué)反應(yīng)之后而未變換或部分變換。所述非靶核酸序列可以被包含在較大的核酸內(nèi)。所述非靶核酸的大小可以是大約30-1000堿基對或更大。所述非靶核酸可以是原始核酸或其擴(kuò)增子。
為了更易于理解本發(fā)明,我們提供了如下非限制性實施例。
附圖簡述
圖1示出來自大腸桿菌(E.coli)、沙門氏菌(Salmonella)及熱氧化硫化桿菌(Sulfobacillus thermosulfidooxidans)的16S核糖體RNA基因的擴(kuò)增的區(qū)域的序列排列。在所有這三個物種中均相同的堿基以黑色字標(biāo)示,僅在大腸桿菌和沙門氏菌中相同的那些堿基用灰色字標(biāo)示。圖中示出了相應(yīng)于所述引物的序列。
圖2使用不同變性溫度對細(xì)菌rDNA進(jìn)行的PCR擴(kuò)增。將來自不同細(xì)菌物種的DNA使用文中所述引物NR-F1i和NR-R1i進(jìn)行擴(kuò)增。在84.4℃-92.8℃的變性溫度范圍進(jìn)行擴(kuò)增。各個反應(yīng)的溫度是84.4℃、85.7℃、87.2℃、88.7℃、90.2℃、91.6℃和92.8℃。將反應(yīng)產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上分析,并示出了針對每個物種觀測到的擴(kuò)增的最低溫度。
圖3在存在過量熱氧化硫化桿菌rDNA的情況下對大腸桿菌rDNA的擴(kuò)增。將大腸桿菌(E.coli)和熱氧化硫化桿菌rDNA的所示比率的混合物通過PCR擴(kuò)增,變性溫度使用91.6℃或87.2℃。使用Applied Biosystems ABI PRISM 7700序列檢測系統(tǒng)中SybrGreen對擴(kuò)增產(chǎn)物繪出解鏈曲線圖形。右側(cè)箭頭所指峰相應(yīng)于熱氧化硫化桿菌rDNA擴(kuò)增子,左側(cè)箭頭所指峰相應(yīng)于大腸桿菌rDNA擴(kuò)增子。在70℃-80℃之間的直至左側(cè)的寬峰對應(yīng)于引物二聚體。在每組中呈現(xiàn)熱氧化硫化桿菌rDNA峰的痕跡是從91.6℃擴(kuò)增,而沒有該峰的其它痕跡是87.2℃擴(kuò)增。
圖4將來自文中所述細(xì)菌混合物的DNA使用86.3℃變性溫度進(jìn)行擴(kuò)增。放射標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物用可以區(qū)分大腸桿菌(E.coli)與沙門氏菌(Salmonella)擴(kuò)增子的Taq1消化。將產(chǎn)物通過在10%聚丙烯酰胺、7M脲凝膠上電泳分析。箭頭標(biāo)示衍生自沙門氏菌rDNA擴(kuò)增子的限制片段的位置,星號標(biāo)示來自大腸桿菌擴(kuò)增子的限制片段位置。
圖5示出在與亞硫酸氫鈉反應(yīng)之前及之后GSTP1基因的啟動子區(qū)域的序列。
圖6是一系列圖,示出變性溫度變化對未變換的及亞硫酸氫鹽變換的甲基化及非甲基化啟動子序列的擴(kuò)增作用的影響。
發(fā)明詳述實施例1特異性細(xì)菌DNA的選擇性擴(kuò)增為表明本發(fā)明可以用于任何類型的DNA序列,我們已經(jīng)示出其怎樣可以用于從不同細(xì)菌物種中差別擴(kuò)增核糖體DNA。
16S核糖體DNA的擴(kuò)增通常用于鑒別細(xì)菌物種并且大量物種的該序列已經(jīng)確定。某些高度保守的區(qū)域的存在使得可以設(shè)計引物對以擴(kuò)增基本上所有的細(xì)菌核糖體DNA。圖1示出三個細(xì)菌物種大腸桿菌、沙門氏菌和熱氧化硫化桿菌的16S核糖體RNA的靶區(qū)域的序列及所述引物結(jié)合的區(qū)域。來自每個物種的細(xì)菌rDNA使用如下正向和反向引物擴(kuò)增NR-F1i5’-GTA GTC CII GCI ITA AAC GAT-3’NR-R1i5’-GAG CTG ICG ACI ICC ATG CA-3’(I=次黃嘌呤核苷)PCR反應(yīng)在含有如下物質(zhì)的25μl溶液中進(jìn)行2x PCR master Mix(Promega) 12.5μl正向引物0.8μl反向引物0.8μlDNA 1.0μl水 9.9μl
反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler設(shè)備中運(yùn)行。在4次其中使用高溫變性溫度(95℃)的循環(huán)之后,隨后的循環(huán)應(yīng)用跨越變性步驟阻斷的溫度梯度。在早期循環(huán)中的較高溫度保證在存在指定大小的PCR產(chǎn)物之前較長基因組DNA片段完全變性。循環(huán)條件如下95℃ 2分鐘 72℃ 5分鐘在84℃-93℃變性溫度進(jìn)行的PCR反應(yīng)通過瓊脂糖凝膠電泳加以分析(圖2)。來自熱氧化硫化桿菌的rDNA僅在變性溫度為90.2℃或更高的反應(yīng)中擴(kuò)增,來自大腸桿菌的rDNA在變性溫度為87.2℃以上的反應(yīng)中擴(kuò)增,來自沙門氏菌的rDNA在變性溫度為85.7℃以上的反應(yīng)中擴(kuò)增。熱氧化硫化桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌擴(kuò)增子的G+C含量分別為63.2%、55.4%和53.9%。271bp的大腸桿菌擴(kuò)增子比沙門氏菌僅多4個G/C對,但這樣仍提供變性溫度的足夠差異以可以選擇性擴(kuò)增沙門氏菌rDNA。
大腸桿菌及熱氧化硫化桿菌DNA的混合物的擴(kuò)增在存在來自熱氧化硫化桿菌的大量DNA的情況下對大腸桿菌rDNA的選擇性擴(kuò)增示于圖3。將50fg大腸桿菌rDNA擴(kuò)增子與增加量的熱氧化硫化桿菌擴(kuò)增子(50fg-50pg)以1∶1-1∶1000以及10fg∶50pg(1∶5000)比率混合。隨后使用87.2℃或91.2℃的變性溫度進(jìn)行30次擴(kuò)增循環(huán)。當(dāng)使用較高的變性溫度時,從解鏈曲線中鑒別的擴(kuò)增產(chǎn)物的相對量接近大腸桿菌和熱氧化硫化桿菌DNA的輸入水平,等于頂部實驗對象中水平,當(dāng)輸入比率為1∶10時顯而易見一些大腸桿菌擴(kuò)增子,當(dāng)比率為1∶100或更高時基本上僅有一個熱氧化硫化桿菌峰。用87.2℃變性溫度進(jìn)行PCR產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物圖形明顯改變。在解鏈曲線圖形相應(yīng)于熱氧化硫化桿菌解鏈圖形甚至當(dāng)存在超過5000倍的輸入DNA的情況中基本上沒有擴(kuò)增子產(chǎn)生。大腸桿菌DNA的擴(kuò)增在所有輸入比率均顯而易見,盡管引物-二聚體的實際量的擴(kuò)增(解鏈圖形直至左側(cè)的寬峰)呈現(xiàn)限制大腸桿菌產(chǎn)物擴(kuò)增的最終水平。顯然與熱氧化硫化桿菌相比,大腸桿菌rDNA的至少5000倍優(yōu)先擴(kuò)增可以通過選擇一個變性溫度進(jìn)行PCR而獲得,所述變性溫度低熱氧化硫化桿菌rDNA擴(kuò)增子的解鏈溫度。
在存在過量的大腸桿菌的情況中對沙門氏菌的檢測對來自不同比例的大腸桿菌和沙門氏菌混合物的DNA進(jìn)行不同解鏈溫度的PCR。所述混合物為于50μl的10mM Tris,pH 8.0,1mM EDTA中的104沙門氏菌與104、105和106大腸桿菌的混合物,并將該混合物煮沸10分鐘。細(xì)菌碎片通過在微量離心機(jī)中離心15分鐘而除去。將4μl每種上清加入PCR混合物中,并在86.3℃變性溫度如上述進(jìn)行PCR。產(chǎn)物在摻入α-32P dATP通過使用非選擇性95℃變性溫度進(jìn)行4次額外PCR循環(huán)之后,通過限制性消化加以分析。相應(yīng)于沙門氏菌擴(kuò)增子的限制片段(箭頭所示,圖4)在1∶1和1∶10比率占優(yōu)勢,但當(dāng)沙門氏菌與大腸桿菌的比率為1∶100時,相對于大腸桿菌擴(kuò)增子(星號所示)較少。該數(shù)據(jù)表明沙門氏菌rDNA擴(kuò)增子的大約30倍優(yōu)先擴(kuò)增。提供解鏈溫度中的微小差異,應(yīng)該可能通過選擇引物以產(chǎn)生具有物種之間最大差異的更小的擴(kuò)增子獲得更大差別的擴(kuò)增。
實施例2當(dāng)DNA用亞硫酸氫鈉處理時,胞嘧啶(C)被變換為尿嘧啶(U),而甲基胞嘧啶(meC)保持不反應(yīng)。在通過PCR擴(kuò)增DNA期間,U被胸腺嘧啶(T)置換,meC以C保持在擴(kuò)增的DNA中。在哺乳動物DNA中,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)meC在CpG位點(diǎn)。在特殊位點(diǎn)或區(qū)域,CpGs可以是甲基化的或非甲基化的。在亞硫酸氫鹽處理后,是CpG位點(diǎn)一部分的C可以是C或U,而其它C應(yīng)變換為U。由于不完全變性或二級結(jié)構(gòu),DNA與亞硫酸氫鹽的反應(yīng)不總是完全的,而且依賴于引物和PCR條件,未修飾的或部分修飾的DNA可以被擴(kuò)增。這特別可以是當(dāng)使用“甲基化特異性PCR”引物的情況,因為所述引物通常設(shè)計為擴(kuò)增含有與引發(fā)位點(diǎn)鄰近的甲基化胞嘧啶(即未變換的)的分子。在擴(kuò)增GSTP1基因的甲基化序列中,我們在一些DNA樣品中發(fā)現(xiàn)不希望的未或不完全變換的DNA擴(kuò)增,這種擴(kuò)增可以抑制群體中存在的真正甲基化分子的擴(kuò)增。在這個實施例中我們示出使用較低的變性溫度就可以抑制解鏈溫度顯著較高的未變換的DNA的擴(kuò)增。
GSTP1基因的啟動子區(qū)域和3’端至轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的序列示于圖5,序列即位點(diǎn)的編號相對于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。上面的線示出未修飾的序列,接下來的兩條線是在與亞硫酸氫鈉反應(yīng)后的序列,假定CpG位點(diǎn)分別是非甲基化(B-U)或甲基化(B-M)的。示出了在此及隨后的實施例中使用的引物和TaqMan探針的位置。
為論證本發(fā)明的原理,取擴(kuò)增的GSTP1 DNA的混合物,其含有相應(yīng)于非甲基化的DNA、甲基化的DNA及未變換的DNA的序列。將該混合物使用下表所示引物和TaqMan探針進(jìn)行擴(kuò)增。注意引物L(fēng)UHF2含有一個5’“尾”,其被設(shè)計為抑制非甲基化的DNA擴(kuò)增(結(jié)果未發(fā)表),但這不依賴于這里所證明的解鏈溫度作用。
25μl反應(yīng)液含有Platinum Taq PCR緩沖液(Promega)Platinum Taq(0.25μ)引物L(fēng)UHF2(200nM)和CSPR4(40nM)dCTP、dGTP、dATP和dUTP(200μM)擴(kuò)增條件50℃2分鐘95℃2分鐘95℃15秒, 60℃ 1分鐘 循環(huán)5次XX℃15秒, 60℃ 1分鐘 循環(huán)40次 (XX-不同溫度)在Applied Biosystems 7700設(shè)備中進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)產(chǎn)物隨后釋放熒光探針。探針PRB-M、PRB-U和PRB-W分別檢測甲基化的、非甲基化的及未變換的DNA。在95℃變性溫度使用5次初始循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增,以便在降低變性溫度進(jìn)行隨后的循環(huán)之前較長的起始DNA分子基本上變性。不同變性溫度的擴(kuò)增結(jié)果示于圖6。
當(dāng)使用90℃變性溫度進(jìn)行PCR時,檢測所有3個模板的擴(kuò)增情況。變性溫度降至80℃時阻止未變換的DNA擴(kuò)增,而甲基化和非甲基化的DNA產(chǎn)物均得以擴(kuò)增,其效力與在90℃變性溫度所見相同。將變性溫度進(jìn)一步降至77℃時阻止甲基化的DNA產(chǎn)物擴(kuò)增而不抑制非甲基化的產(chǎn)物擴(kuò)增。甲基化和非甲基化的產(chǎn)物在141bp的擴(kuò)增子中有10個堿基不同。
實施例3將PCR變性溫度降低的條件用于一系列患者的DNA樣品,所述樣品當(dāng)使用95℃的正常變性溫度時示出未變換的DNA擴(kuò)增。將使用另一系列引物擴(kuò)增的PCR第一次循環(huán)產(chǎn)物的樣品,在與實施例2相同的條件下分析,不同之處是使用引物msp81和msp82。在95℃或80℃進(jìn)行變性。PCR產(chǎn)物達(dá)到每個樣品和探針的域值水平的循環(huán)次數(shù)示于下表。
使用80℃變性溫度有效抑制未變換的DNA擴(kuò)增,在擴(kuò)增的終點(diǎn)(50次循環(huán))檢測不到這種擴(kuò)增。在檢測甲基化DNA產(chǎn)物之處,擴(kuò)增效力在這兩個溫度基本相同,相等循環(huán)次數(shù)可見產(chǎn)物出現(xiàn)。
實施例4在不同的變性溫度下檢測未變換的DNA的擴(kuò)增對甲基化的完全變換的DNA的檢測敏感性的影響。將含有通過PCR從完全亞硫酸氫鹽變換的甲基化的DNA中衍生的克隆的GSTP1序列的質(zhì)粒,單獨(dú)或與1μl的PCR反應(yīng)液混合進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)生高水平的未變換的DNA序列。將所述質(zhì)粒DNA和未變換的DNA使用用于PCR擴(kuò)增的引物msp81和msp82進(jìn)行衍生。質(zhì)粒DNA的輸入在0-106拷貝/PCR反應(yīng)之間變化。如實施例3所述進(jìn)行擴(kuò)增,檢測到PCR產(chǎn)物的閾值示于下表。
當(dāng)單獨(dú)的質(zhì)粒被擴(kuò)增時,在正常(95℃)和80℃變性條件下均易于擴(kuò)增100或更多個拷貝。在存在未變換的DNA的情況下,當(dāng)變性溫度為95℃時,未變換的序列的擴(kuò)增(通過11-12次循環(huán)達(dá)到檢測閾值)完全抑制甲基化的變換的DNA擴(kuò)增。然而,當(dāng)變性溫度為80℃時,未變換的DNA的擴(kuò)增被完全抑制,使得允許甲基化的變換的DNA擴(kuò)增。擴(kuò)增效力比在沒有競爭的未變換的DNA的情況下略差。因此,使用較低的變性溫度可以檢測這樣一些序列,所述序列在不使用所述較低的變性溫度的情況下可能被相關(guān)的序列DNA的競爭擴(kuò)增而掩蓋。
實施例5為論證相同的原理可以應(yīng)用于一單獨(dú)的序列區(qū),使用引物msp303和msp352擴(kuò)增在GSTP1基因轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)的序列(見圖5)。使用兩個臨床樣品進(jìn)行擴(kuò)增,所述樣品其一預(yù)先已經(jīng)示出未變換的DNA的擴(kuò)增越過該區(qū)域,另一個示出只含有甲基化的變換的序列。檢測PCR產(chǎn)物的閾循環(huán)(每個條件一式兩份進(jìn)行)示于下表。
就樣品85ES而言,不論變性溫度是95℃還是80℃,在8或9次循環(huán)后均檢測到恰當(dāng)?shù)腜CR產(chǎn)物,因此擴(kuò)增在較低溫度未被抑制。相反,當(dāng)變性溫度為95℃時針對樣品86U觀測到未變換的DNA擴(kuò)增,但這種擴(kuò)增當(dāng)變性溫度降低至80℃時受到抑制。
從上述內(nèi)容認(rèn)識到本發(fā)明具有許多可能的應(yīng)用。這些應(yīng)用包括但非限于DNA和RNA的選擇性擴(kuò)增,物種的選擇和/或鑒別,擴(kuò)增反應(yīng)如PCR中假的或非所希望的產(chǎn)物的抑制,以DNA的異常甲基化不足特征的疾病或癌癥的預(yù)測及診斷試驗。
在本說明書中術(shù)語“包含”,應(yīng)理解為是指包含一定的元件、整數(shù)或步驟,或者元件、整數(shù)或步驟的組,但不除外任何其它元件、整數(shù)或步驟,或者元件、整數(shù)或步驟的組。
另外,本說明書中包含的對任何文獻(xiàn)、法案、材料、設(shè)備、文章等的討論其目的僅用于交待本發(fā)明的背景。不能認(rèn)為這些事件的任何或全部構(gòu)成了現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分,或是在本申請的每一個權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前既已存在于澳大利亞的與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域的一般知識。
最后,本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到在不偏離廣泛闡述的本發(fā)明的精神或范圍的前提下,對本發(fā)明可以做如特異的實施方案所示的許多改變和/或修改。因此本發(fā)明的實施方案僅是加以例證而無限制之意。
權(quán)利要求
1.一種選擇性擴(kuò)增樣品中至少一個靶核酸的方法,所述樣品包含至少一個靶核酸及至少一個非靶核酸,所述靶核酸解鏈溫度低于所述非靶核酸,所述方法包括進(jìn)行核酸變性步驟并隨后使用至少一個擴(kuò)增引物的擴(kuò)增步驟的一或多次循環(huán),其中所述變性步驟在所述至少一個靶核酸的解鏈溫度或高于該溫度但低于所述至少一個非靶核酸的解鏈溫度的溫度進(jìn)行,以基本上抑制所述非靶核酸的擴(kuò)增。
2.權(quán)利要求1的方法,其中所述擴(kuò)增引物是正向引物。
3.權(quán)利要求1的方法,其中所述擴(kuò)增引物是反向引物。
4.權(quán)利要求1的方法,其中所述擴(kuò)增步驟使用至少一個正向及一個反向引物。
6.前述權(quán)利要求中任一項的方法,其中所述擴(kuò)增步驟選自如下一組聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、鏈置換反應(yīng)(SDA)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、連接介導(dǎo)的PCR及滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)。
8.前述權(quán)利要求中任一項的方法,其中所述擴(kuò)增步驟使用PCR等進(jìn)行。
9.前述權(quán)利要求中任一項的方法,其中所述擴(kuò)增步驟使用實時PCR進(jìn)行。
10.前述權(quán)利要求中任一項的方法,其中所述變性步驟在所述靶核酸的解鏈溫度與所述非靶核酸的解鏈溫度之間的溫度進(jìn)行。
11.前述權(quán)利要求中任一項的方法,其中所述變性步驟在低于所述非靶核酸的解鏈溫度但在所述靶核酸的解鏈溫度或足夠高于所述靶核酸的解鏈溫度的溫度進(jìn)行,以允許所述靶核酸的擴(kuò)增。
12.一種選擇性擴(kuò)增不同的但相關(guān)的核酸序列的方法,其中所述不同是在至少一個靶核酸與至少一個非靶核酸之間的一或多個缺失、添加和/或堿基改變,所述方法包括前述權(quán)利要求中任一項所述的方法。
13.一種在包含來自兩或多個靶物種的核酸(靶核酸)及來自一或多個非靶物種的核酸(非靶核酸)的混合物的樣品中進(jìn)行物種選擇和/或鑒別的方法,所述靶核酸的解鏈點(diǎn)低于所述非靶核酸的解鏈點(diǎn),所述方法包括將所述樣品進(jìn)行核酸變性步驟及隨后的使用至少一個擴(kuò)增引物進(jìn)行的擴(kuò)增步驟的一或多次循環(huán),其中所述變性步驟在所述至少一個靶核酸的解鏈溫度或高于該溫度但低于所述至少一個非靶核酸的解鏈溫度的溫度進(jìn)行,以基本上抑制所述非靶核酸的擴(kuò)增;以及確定擴(kuò)增產(chǎn)物的存在情況。
14.權(quán)利要求13的方法,其中所述物種選自動物、細(xì)菌、真菌及植物物種。
15.權(quán)利要求13或14的方法,用于在物種群體中選擇一或多個物種。
16.權(quán)利要求15的方法,用于選擇性擴(kuò)增分離的核酸,所述核酸是得自次要物種和優(yōu)勢物種的核酸混合物,其中次要物種的解鏈點(diǎn)低于優(yōu)勢種的解鏈點(diǎn)。
17.權(quán)利要求13-16中任一項的方法,其中所述核酸是DNA。
18.權(quán)利要求13-17中任一項的方法,其中所述核酸是RNA。
19.權(quán)利要求13-18中任一項的方法,其中所述物種是細(xì)菌物種。
20.權(quán)利要求13-19中任一項的方法,其包含權(quán)利要求1-11中任一項的方法。
21.一種在靶核酸擴(kuò)增期間抑制或消除假的或非所希望的擴(kuò)增產(chǎn)物的方法,其中所述非所希望的產(chǎn)物的解鏈溫度高于靶核酸的解鏈溫度,所述方法包括進(jìn)行核酸變性步驟及隨后的使用至少一個擴(kuò)增引物進(jìn)行的擴(kuò)增步驟的一或多次循環(huán),其中所述變性步驟在所述至少一個靶核酸的解鏈溫度或高于該溫度但低于所述至少一個非靶核酸的解鏈溫度的溫度進(jìn)行,以基本上抑制所述非靶核酸的擴(kuò)增。
22.權(quán)利要求21的方法,其中所述靶核酸已經(jīng)進(jìn)行化學(xué)處理以產(chǎn)生一種變換了的核酸,而其中所述非所希望的擴(kuò)增產(chǎn)物是未被變換或部分變換的核酸。
23.權(quán)利要求22的方法,其中所述靶核酸已經(jīng)用亞硫酸氫鹽處理,所述非所希望的擴(kuò)增產(chǎn)物衍生自與亞硫酸氫鹽部分反應(yīng)或不完全反應(yīng)的核酸。
24.一種選擇性擴(kuò)增包含至少一個靶核酸及至少一個非靶核酸的樣品中的至少一個靶核酸的方法,所述方法包括如下步驟(a)修飾所述靶核酸和/或非靶核酸以改變所述靶核酸和非靶核酸的相對解鏈溫度,所述靶核酸的解鏈溫度低于所述非靶核酸的解鏈溫度;(b)通過進(jìn)行核酸變性及隨后的擴(kuò)增步驟的一或多次循環(huán)而擴(kuò)增所述靶核酸,其中所述變性步驟在步驟(a)所述靶核酸的解鏈溫度或高于該溫度但低于步驟(a)所述至少一個非靶核酸的解鏈溫度的溫度進(jìn)行,以基本上抑制所述非靶核酸的擴(kuò)增。
25.權(quán)利要求24的方法,其中在步驟(a)之前,所述至少一個靶核酸及至少一個非靶核酸的解鏈溫度基本相同,而所述化學(xué)修飾使所述靶核酸和非靶核酸的相對解鏈溫度產(chǎn)生差異。
26.權(quán)利要求24的方法,其中在步驟(a)之前,所述靶核酸的解鏈溫度低于所述非靶核酸的解鏈溫度,而步驟(a)中的修飾提高所述靶核酸與所述非靶核酸之間的解鏈溫度差異。
27.權(quán)利要求24或25的方法,其中所述修飾是變換至少一個堿基對。
28.權(quán)利要求24-27中任一項的方法,其中所述修飾劑是一種亞硫酸氫鹽。
29.權(quán)利要求24-28中任一項的方法,其中所述修飾是修飾非甲基化的胞嘧啶以產(chǎn)生一個變換的核酸。
30.權(quán)利要求1-12和24-26中任一項的方法,還包括分離所述靶核酸及任選進(jìn)行分離的靶核酸的序列分析的步驟。
31.核酸異常甲基化不足的分析方法,其中所述分析方法包括如下步驟i)將懷疑含有異常甲基化不足的核酸及任選甲基化的核酸的樣品進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理;ii)進(jìn)行核酸的選擇性擴(kuò)增,其中所述選擇性擴(kuò)增包括進(jìn)行核酸變性步驟的一或多次循環(huán),其中所述變性在含有異常甲基化不足的核酸的核酸的解鏈溫度或高于該溫度,但低于含有甲基化的核酸的核酸的解鏈溫度的溫度進(jìn)行;iii)確定所述擴(kuò)增的核酸的存在情況。
32.一種診斷研究對象的疾病或癌癥或判斷其預(yù)后的分析方法,所述疾病或病癥的特征在于核酸的異常甲基化不足,其中所述分析方法包括如下步驟i)將取自所述對象的核酸樣品與亞硫酸氫鹽反應(yīng);ii)對步驟(i)中的核酸進(jìn)行選擇性擴(kuò)增,其中所述選擇性擴(kuò)增包括進(jìn)行變性步驟及隨后的擴(kuò)增步驟的一或多次循環(huán),其中所述變性在含有異常甲基化不足的核酸的靶核酸的解鏈溫度或高于該溫度,但低于甲基化或基本甲基化的非靶核酸的解鏈溫度的溫度進(jìn)行,以基本上抑制所述非靶核酸的擴(kuò)增;以及iii)確定擴(kuò)增的核酸的存在情況。
33.權(quán)利要求32的方法,其中所述病癥或疾病是癌癥。
34.權(quán)利要求33的方法,其中所述癌癥選自肺癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌或肝癌。
35.權(quán)利要求32-34中任一項的方法,其中所述擴(kuò)增步驟選自如下一組聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、鏈置換反應(yīng)(SDA)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、連接介導(dǎo)的PCR及滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)。
36.權(quán)利要求35的方法,其中所述擴(kuò)增步驟使用PCR等進(jìn)行。
37.權(quán)利要求34的方法,其中所述擴(kuò)增步驟使用實時PCR進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種選擇性擴(kuò)增樣品中至少一個靶核酸的方法,所述樣品包含至少一個靶核酸和至少一個非靶核酸的混合物。所述方法包括核酸變性步驟,其中所述變性步驟在所述至少一個靶核酸的解鏈溫度或高于該溫度但低于所述至少一個非靶核酸的解鏈溫度進(jìn)行;擴(kuò)增步驟使用至少一個擴(kuò)增引物進(jìn)行。
文檔編號C12N15/09GK1650028SQ03809364
公開日2005年8月3日 申請日期2003年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月26日
發(fā)明者彼得·勞倫斯·莫洛伊, 基思·蘭德, 蘇珊·喬伊·克拉克 申請人:聯(lián)邦科學(xué)技術(shù)研究組織