專利名稱：一種單管原位嵌套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，特別是涉及嵌套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種高效體外擴(kuò)增特定DNA的方法，在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的嵌套式PCR(巢式PCR，Nested-PCR)的擴(kuò)增專一性和靈敏性均顯著提高。但傳統(tǒng)的嵌套式PCR需要中途開啟反應(yīng)管蓋分二輪進(jìn)行既麻煩又顯著增加了滯后污染的機(jī)會(huì)。九十年代建立了一種基于控制低外套引物濃度和高外套引物解鏈溫度的單管嵌套式方法，(Gookin等Journal-Clinical-Microbiology，2002，40，4126，F(xiàn)orsman等Journal-Viological-Methods，2003，1111-11)這種方法需要通過(guò)試驗(yàn)來(lái)摸索確定合適的外套引物濃度。近年來(lái)出現(xiàn)將內(nèi)套引物置于毛細(xì)管(ES，P9801642，July，31，1998和Nucleic-Acid-Research(1999)27(6)1564)，置于反應(yīng)管蓋內(nèi)壁上(Walsh等Journal-Medical-Virology，2001，63259-63，Ratcliff等Journal-clinical-Microbiology，2002，404091-9，Abath等Biotechniques，2002，331210-2)，或通過(guò)礦物油層使內(nèi)套引物與反應(yīng)液分開的單管嵌套式方法(Ratge等J-Clinical-Virology，2002，24161-72，Hu等American-Journal-Clincal-Pathology，2003，11995-100)，但這些物理方法必須小心操作而且要將反應(yīng)管從擴(kuò)增儀上移開并增加了離心等步驟。此外，所有上述各種方法均不能在第二輪內(nèi)套反應(yīng)階段立即和完全停止外套引物的作用。本發(fā)明提供了一種通過(guò)含錯(cuò)配順序或“帶尾”(5‘端帶一段非基因?qū)Ｒ豁樞?的內(nèi)套引物，循環(huán)退火溫度按中溫-低溫-高溫的模式進(jìn)行的單管原位嵌套式PCR，反應(yīng)過(guò)程中既不需要開啟管蓋也不需要將試管從基因擴(kuò)增儀上移開，克服了各種已公開的嵌套式PCR技術(shù)的種種缺點(diǎn)有著廣泛的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
所需要解決的技術(shù)問題本發(fā)明提供了一種單管原位嵌套式PCR方法，以克服現(xiàn)行各種嵌套式PCR方法步驟繁瑣、易污染、內(nèi)外套引物的擴(kuò)增相互影響或需要特殊反應(yīng)容器的缺點(diǎn)。
發(fā)明構(gòu)思單管原位嵌套式PCR反應(yīng)液同時(shí)含有外套和內(nèi)套引物。設(shè)計(jì)內(nèi)套引物與目標(biāo)基因順序有錯(cuò)配或在5‘端帶一段非基因?qū)Ｒ豁樞?，使?nèi)套引物基因?qū)Ｒ徊糠峙c原始模板的解鏈溫度比外套引物解鏈溫度低20℃左右，同時(shí)又使整個(gè)內(nèi)套引物順序與匹配模板之間的解鏈溫度比外套引物解鏈溫度高3℃以上。PCR反應(yīng)開始階段控制退火溫度較高只有外套引物能擴(kuò)增而內(nèi)套引物不能退火擴(kuò)增。第一輪反應(yīng)進(jìn)行一定循環(huán)數(shù)后降低退火溫度使內(nèi)套引物能與外套引物的擴(kuò)增產(chǎn)物退火進(jìn)行擴(kuò)增。數(shù)個(gè)循環(huán)后再將退火溫度提高至比第一輪反應(yīng)更高，使外套引物停止退火擴(kuò)增而內(nèi)套引物能繼續(xù)退火擴(kuò)增。
技術(shù)方案根據(jù)通常引物設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)性要求的原則借助引物設(shè)計(jì)軟件選擇相互嵌套的二對(duì)引物。在內(nèi)套引物中引進(jìn)若干錯(cuò)配鹼基或在5’端除去一段順序而另加一段非基因?qū)Ｒ豁樞?，使?nèi)套引物基因?qū)Ｒ徊糠菖c原始模板之間的解鏈溫度比外套引物低20℃左右，而整個(gè)內(nèi)套引物與匹配模板之間的解鏈溫度比外套引物高3℃以上。PCR反應(yīng)液包括緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶、模板核酸、外套引物和內(nèi)套引物。PCR反應(yīng)步驟依次包括(1)DNA模板變性解鏈；(2)引物與模板退火；(3)在DNA聚合酶催化下延伸合成互補(bǔ)DNA鏈；(4)按步驟(1)-(3)循環(huán)進(jìn)行合成反應(yīng)；PCR反應(yīng)完成前無(wú)需開蓋也不需將反應(yīng)管從基因擴(kuò)增儀上移開。PCR程序按退火溫度高低變化分成中溫階段，低溫過(guò)渡階段和高溫階段。反應(yīng)開始5-25循環(huán)為中溫階段，在該階段退火溫度下外套引物能退火完成擴(kuò)增，但內(nèi)套引物與原始模板之間不能發(fā)生退火不進(jìn)行擴(kuò)增。隨后2-5循環(huán)為低溫過(guò)渡階段，在該階段退火溫度下內(nèi)套引物能與原始模板退火開始擴(kuò)增，而外套引物也能繼續(xù)擴(kuò)增。最后5-25個(gè)循環(huán)為高溫階段，在該階段退火溫度下外套引物不能退火擴(kuò)增，而內(nèi)套引物能繼續(xù)擴(kuò)增直至反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)結(jié)束后可用常規(guī)的電泳分離和染色檢測(cè)目標(biāo)條帶，或者直接向反應(yīng)管內(nèi)加雙鏈DNA專一熒光試劑如SYBR錄I來(lái)檢測(cè)，或者將上述熒光試劑預(yù)加在反應(yīng)管內(nèi)但不與反應(yīng)液接觸，反應(yīng)完成后在閉管狀態(tài)下使熒光試劑與反應(yīng)液接觸來(lái)檢測(cè)目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物。按相同方法在PCR反應(yīng)溶液內(nèi)加SYBR錄I同時(shí)或分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的分子探針可進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案將方法擴(kuò)展至彼此獨(dú)立的雙重單管原位嵌套PCR。設(shè)計(jì)二組內(nèi)套引物的錯(cuò)配特性和解鏈溫度參數(shù)彼此相同或接近，二組外套引物的解鏈溫度等參數(shù)也彼此相同或接近。本發(fā)明的另一個(gè)技術(shù)方案將方法擴(kuò)展至含一對(duì)外套引物和二對(duì)內(nèi)套引物的PCR反應(yīng)，即二對(duì)內(nèi)套引物各自獨(dú)立且錯(cuò)配特性和解鏈溫度等參數(shù)彼此相同或接近有益效果1，本發(fā)明所述嵌套式PCR操作與標(biāo)準(zhǔn)PCR一樣簡(jiǎn)單但更專一、靈敏。
2，本發(fā)明所述嵌套式PCR操作比傳統(tǒng)開管式嵌套PCR操作簡(jiǎn)單又無(wú)滯后污染。
3，本發(fā)明所述嵌套式PCR與控制外套引物濃度的嵌套式PCR相比不需前期預(yù)備試驗(yàn)并且更可靠。
4，本發(fā)明所述嵌套式PCR與用物理方法達(dá)到的嵌套PCR相比操作更簡(jiǎn)單也更可靠。
5，本發(fā)明所述嵌套式PCR可擴(kuò)展成為雙重嵌套和一外套二內(nèi)套等多種形式，可同時(shí)專一地?cái)U(kuò)增二個(gè)基因及減少假陰性結(jié)果。
6，本發(fā)明所述嵌套式PCR排除了非專一擴(kuò)增產(chǎn)物使目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法更簡(jiǎn)單7，本發(fā)明所述嵌套式PCR可用于各種實(shí)時(shí)熒光定量PCR使之更專一、靈敏。
8，本發(fā)明所述嵌套式PCR對(duì)引物在目標(biāo)基因中的位置沒有特殊要求可普遍應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.
實(shí)施例1目標(biāo)基因?yàn)槿薭eta肌動(dòng)球蛋白基因(美國(guó)國(guó)家生物信息中心基因庫(kù)編號(hào)BC016045)。引物順序和特性示于表1和2，下劃線為非基因?qū)Ｒ豁樞颉?br> 表1.實(shí)施例1引物順序

表1 線材性能

表2 螺栓性能

由實(shí)施例可以看出，MFT8及MFT10超細(xì)晶非調(diào)鋼盤條，加工前，具有良好的塑性性能，不經(jīng)退火，就能直接冷鐓成型；加工成緊固件后，不經(jīng)調(diào)質(zhì)熱處理，就能達(dá)到中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)GB3098-2000標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的機(jī)械性。用超細(xì)晶非調(diào)鋼盤條制作緊固件，大大簡(jiǎn)化了加工工序，緊固件制品強(qiáng)度高，外觀質(zhì)量好，顯著地降低了加工費(fèi)用。
由表3可見內(nèi)套引物在約63℃以上完全不能退火，而一旦退火形成匹配模板后就能在高溫下繼續(xù)退火擴(kuò)增。
表4為應(yīng)用A外套引物和A內(nèi)套引物的嵌套PCR程序表4.實(shí)施例1PCR程序

PCR反應(yīng)結(jié)束加1ul 100倍稀釋的SYBR錄I熒光試劑在紫外光下顯示強(qiáng)熒光，另一份樣品反應(yīng)結(jié)束后電泳染色得到預(yù)期的401個(gè)堿基條帶并沒有非專一擴(kuò)增條帶。
實(shí)施例2.
實(shí)施例2設(shè)計(jì)一對(duì)外套引物和二組內(nèi)套引物的嵌套PCR，目標(biāo)基因、試劑和PCR程序方法與實(shí)施例1相同。除表1所示外套和內(nèi)套引物外，反應(yīng)液另增加一對(duì)內(nèi)套引物，其順序和特性示于表5和6，下劃線為非基因?qū)Ｒ豁樞颉內(nèi)套引物2擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為276個(gè)堿基，擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度90.2℃
表5.實(shí)施例2引物順序

表6.實(shí)施例2部分引物特性

PCR擴(kuò)增可得到預(yù)期的長(zhǎng)度為401個(gè)堿基和279個(gè)堿基的二條帶。
實(shí)施例3實(shí)施例3設(shè)計(jì)二對(duì)外套引物和二對(duì)內(nèi)套引物的多重嵌套PCR，目標(biāo)基因，試劑和PCR程序方法與實(shí)施例1相同。二對(duì)外套和二對(duì)內(nèi)套引物順序和特性示于表7和8，下劃線為非基因?qū)Ｒ豁樞颉?br> 權(quán)利要求
1，一種以基因組DNA或cDNA為模板的單管原位嵌套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，反應(yīng)液含至少一對(duì)外套引物和至少一個(gè)內(nèi)套引物，內(nèi)套引物順序與原始目標(biāo)模板順序有錯(cuò)配或在5’端有一段非基因?qū)Ｒ豁樞颉CR反應(yīng)依次包括如下步驟(1)DNA模板變性解鏈；(2)引物與模板退火；(3)在DNA聚合酶催化下延伸合成互補(bǔ)DNA鏈；(4)按步驟(1)-(3)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；按退火溫度擴(kuò)增分為二輪反應(yīng)，其特征在于二輪反應(yīng)之間不打開反應(yīng)管蓋並保持原位。第二輪內(nèi)套反應(yīng)的退火溫度高于第一輪外套反應(yīng)的退火溫度，二輪反應(yīng)之間的過(guò)渡循環(huán)的退火溫度比二輪反應(yīng)都低。
2，根據(jù)權(quán)利要求1所述單管原位嵌套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的反應(yīng)液含一對(duì)外套引物和一對(duì)內(nèi)套引物，正反內(nèi)套引物的順序均與原始目標(biāo)模板順序有錯(cuò)配或在5’端有一段非基因?qū)Ｒ豁樞颉?br> 3，根據(jù)權(quán)利要求1和2所述單管原位嵌套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法用于閉管熒光終點(diǎn)、直接熒光終點(diǎn)和其他終點(diǎn)檢測(cè)方法。
4，根據(jù)權(quán)利要求1和2所述單管原位嵌套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法用于SYBR錄I熒光染料、TaqMan探針、分子信標(biāo)、雙重探針和其他應(yīng)用分子探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR。
5，根據(jù)權(quán)利要求1所述單管原位嵌套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的反應(yīng)液含一對(duì)外套引物和二對(duì)內(nèi)套引物。二對(duì)內(nèi)套引物順序均與原始目標(biāo)模板順序有錯(cuò)配或在5’端有一段非基因?qū)Ｒ豁樞颉?br> 6，根據(jù)權(quán)利要求1所述單管原位嵌套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的反應(yīng)液所含二對(duì)外套引物和二對(duì)內(nèi)套引物分屬不同基因或位置上相互隔開。二對(duì)內(nèi)套引物順序均與原始目標(biāo)模板順序有錯(cuò)配或在5’端有一段非基因?qū)Ｒ豁樞颉?br> 全文摘要
一種單管原位嵌套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法及其在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用。反應(yīng)液含內(nèi)套引物和外套引物，內(nèi)套引物與目標(biāo)基因順序有錯(cuò)配或在5’端帶一段非基因?qū)Ｒ豁樞?。?nèi)套引物與原始模板的最高允許退火溫度低于第一輪反應(yīng)的退火溫度，而內(nèi)套引物與匹配模板的解鏈溫度高于外套引物的最高允許退火溫度?？刂频谝惠哖CR循環(huán)的退火溫度使外套引物能退火擴(kuò)增但內(nèi)套引物不能退火擴(kuò)增。提高第二輪PCR循環(huán)的退火溫度使外套停止退火擴(kuò)增而內(nèi)套引物能退火擴(kuò)增。在第一和第二輪之間有二至若干循環(huán)退火溫度低于二者的過(guò)渡階段，使內(nèi)套引物能與原始模板退火擴(kuò)增形成匹配模板啟動(dòng)第二輪反應(yīng)。整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程中不開管蓋反應(yīng)管也不移離基因擴(kuò)增儀。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1858219SQ20051002563
公開日2006年11月8日 申請(qǐng)日期2005年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月30日
發(fā)明者徐定邦, 謝文凱, 府雷宇 申請(qǐng)人:徐定邦, 徐文慧