專利名稱：一種超高退火溫度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，特別是涉及一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種高效的擴(kuò)增特定DNA的方法，在生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域特別是醫(yī)學(xué)臨床檢測(cè)上有廣泛的應(yīng)用。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)主要由25-35個(gè)溫度呈周期變化的循環(huán)組成，每一個(gè)循環(huán)包括變性，退火和延伸三個(gè)步驟。其中，退火步驟目的是使正、反引物分別與模板的二條單鏈互補(bǔ)結(jié)合，DNA聚合酶則從互補(bǔ)部分的3’端開始按5’至3’的方向擴(kuò)展延伸，從而完成一個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。在合適的溫度下使引物與模板充分退火是保證高擴(kuò)增效率的關(guān)鍵，一般而言退火溫度較低有利于引物與模板結(jié)合。另一方面，退火又必須保持在一定的溫度以上，退火溫度偏低使引物與非模板順序的互補(bǔ)及引物之間的互補(bǔ)顯著增強(qiáng)，從而不僅導(dǎo)致非專一擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚物的形成，也會(huì)因競(jìng)爭(zhēng)而降低目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)增效率甚至得不到目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物。適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟仁且跀U(kuò)增效率和專一性之間取得平衡，要通過(guò)引物設(shè)計(jì)和針對(duì)每一擴(kuò)增產(chǎn)物的試驗(yàn)來(lái)確定，合適的退火溫度是整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程獲得成功的最重要一步。
根據(jù)教課書、手冊(cè)、試劑盒說(shuō)明書和數(shù)以萬(wàn)計(jì)的研究論文，現(xiàn)行PCR的典型退火溫度在55℃左右，通常退火溫度范圍在45-65℃之間，少數(shù)情況下使用更高的溫度如68℃，文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的最高退火溫度為72℃，一些引物設(shè)計(jì)軟件如Oligo也將72℃設(shè)定為最高允許退火溫度。對(duì)PCR過(guò)程的分析和我們的實(shí)踐表明，采用具有高解鏈溫度的引物能在72-82℃高退火溫度下完成擴(kuò)增，這不僅這對(duì)各種模板是一種普遍可行的方法，而且產(chǎn)生在通常退火溫度下所達(dá)不到的良好效果，有廣泛的實(shí)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
所需要解決的技術(shù)問題本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種超高退火溫度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法及其應(yīng)用，以突破現(xiàn)有PCR方法中引物與模板退火溫度上限的常規(guī)，拓展了利用退火溫度的調(diào)節(jié)來(lái)排除非專一性擴(kuò)增產(chǎn)物、引物二聚體以及排除假陰性結(jié)果的能力。
技術(shù)方案本發(fā)明的超高退火溫度的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，依次包括如下三個(gè)步驟模板變性、引物與模板退火和在DNA聚合酶催化下延伸合成互補(bǔ)DNA鏈，然后按此三步驟循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。其中，引物與模板退火溫度為72-82℃，優(yōu)選為75-80℃。
為實(shí)現(xiàn)上述超高退火溫度的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可采用長(zhǎng)度為15-50堿基的正反引物，優(yōu)選引物長(zhǎng)度為30-45堿基。正反引物的解鏈溫度Tm值范圍均為74-96℃，優(yōu)選84-92℃。在引物設(shè)計(jì)中應(yīng)遵循嚴(yán)謹(jǐn)性的原則，使引物堿基序列與模板完全互補(bǔ)，但根據(jù)檢測(cè)需要可有個(gè)別堿基在引物3’端之外區(qū)域出現(xiàn)錯(cuò)配。
由于采用超高退火溫度進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其退火溫度范圍達(dá)72-82℃，故擴(kuò)增反應(yīng)中可實(shí)現(xiàn)退火溫度和延伸溫度相同的設(shè)計(jì)，將PCR循環(huán)步驟由變性—退火—延伸三步簡(jiǎn)化為高溫變性和退火延伸兩步，在引物與模板退火的同時(shí)，即進(jìn)行DNA聚合酶催化的新DNA鏈延伸，退火延伸步驟的恒溫時(shí)間短于常規(guī)三步法。
本發(fā)明的退火溫度為72-82℃的超高退火溫度PCR方法適用于標(biāo)準(zhǔn)PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR，也可用于競(jìng)爭(zhēng)定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以減少和排除非專一性擴(kuò)增產(chǎn)物或引物二聚體，還可以應(yīng)用于多重PCR、嵌套PCR和其他由標(biāo)準(zhǔn)PCR衍生的各種改良性PCR和應(yīng)用性PCR方法，提高反應(yīng)特異性和反應(yīng)靈敏度，排除非專一性擴(kuò)增產(chǎn)物或引物二聚體的產(chǎn)生。在上述應(yīng)用中，其擴(kuò)增產(chǎn)物與正反引物的解鏈溫度之差可以達(dá)到22--5℃，優(yōu)選范圍為15-0℃。
本發(fā)明的超高退火溫度PCR方法在當(dāng)原始模板與引物有0-5個(gè)堿基的錯(cuò)配，特別是錯(cuò)配堿基為1-3個(gè)時(shí)，可有效的減少和排除各類標(biāo)準(zhǔn)PCR和由標(biāo)準(zhǔn)PCR衍生的各種改良性PCR和應(yīng)用性PCR方法的假陰性結(jié)果。
為理解本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思和應(yīng)用要點(diǎn)，對(duì)反應(yīng)引物的設(shè)計(jì)及其解鏈溫度測(cè)試作如下說(shuō)明PCR的最適退火溫度和最高允許退火溫度與引物的解鏈溫度密切相關(guān)。一般認(rèn)為最適退火溫度比一對(duì)引物中解鏈溫度較低的一個(gè)引物的解鏈溫度低5-10℃。
以乙型肝炎病毒基因?yàn)槔靡镌O(shè)計(jì)軟件Oligo共搜索到116對(duì)長(zhǎng)度為20堿基的具有非常高嚴(yán)謹(jǐn)性的優(yōu)秀引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在150-800堿基之間。用引物設(shè)計(jì)軟件分析了這116對(duì)引物的解鏈溫度，最適PCR退火溫度和最高允許退火溫度，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果列于表1表1.116對(duì)引物解鏈溫度和退火溫度分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表1說(shuō)明當(dāng)采用的引物長(zhǎng)度為20堿基時(shí)，相應(yīng)的最適退火溫度范圍在53-63℃之間，平均最適退火溫度為54.7℃。最適退火溫度比引物對(duì)中解鏈溫度較低的那個(gè)引物的退火溫度低7-17℃，平均低12℃。退火的最高允許溫度比引物對(duì)中解鏈溫度較低的那個(gè)引物的退火溫度高3℃。但無(wú)論引物的解鏈溫度多高，軟件分析的最高允許退火溫度均為72℃。
進(jìn)一步用適合短鏈寡核苷酸的G+C％方法來(lái)計(jì)算含不同G+C％的長(zhǎng)度為18-25堿基寡核苷酸的解鏈溫度，結(jié)果示于表2。
表2.用G+C％方法計(jì)算的15-25堿基長(zhǎng)引物的解鏈溫度

通常認(rèn)為引物的G+C％適宜范圍在45％-55％之間，所以，18-25堿基長(zhǎng)引物的解鏈溫度通常在64-80℃之間，應(yīng)用表1的所得到的分析結(jié)果，可推算當(dāng)引物長(zhǎng)度為18-25堿基時(shí)最適退火溫度范圍通常在52-68℃之間。
對(duì)較長(zhǎng)的寡核苷酸的解鏈溫度用最鄰近堿基計(jì)算方法比較適宜。這種方法考慮了引物的長(zhǎng)短和堿基組成，也考慮了堿基排列對(duì)解鏈溫度的影響。以乙型肝炎病毒基因?yàn)槔S機(jī)取樣分析長(zhǎng)度為15，18，25，30和40堿基寡核苷酸的解鏈溫度，每一長(zhǎng)度測(cè)試50個(gè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果示于表3。
表3.用最鄰近堿基法計(jì)算的解鏈溫度統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表3說(shuō)明當(dāng)寡核苷酸長(zhǎng)度為30和40堿基時(shí)，平均解鏈溫度已分別高達(dá)80℃和近90℃，解鏈溫度高于84℃的寡核苷酸分別占統(tǒng)計(jì)數(shù)的26％和90％。換言之，根據(jù)表1的分析結(jié)果，分別有26％和90％的30和40堿基長(zhǎng)引物的最適退火溫度高于72℃。
雖然如表3所示50個(gè)隨機(jī)抽樣的15和18堿基寡核苷酸的最高解鏈溫度都低于69℃，而根據(jù)表1分析結(jié)果，其最高允許退火溫度均低于72℃。但是，如以下實(shí)施例所顯示的，用引物設(shè)計(jì)軟件還是可以搜尋到少數(shù)長(zhǎng)度在15-18之間的有高解鏈溫度并有高嚴(yán)謹(jǐn)性的引物對(duì)，它們能在72℃以上退火。隨引物長(zhǎng)度增加能在高溫下退火的引物的比例就增加。當(dāng)引物長(zhǎng)度擴(kuò)展到30或40堿基時(shí)能在72℃以上退火的引物就相當(dāng)普遍。
有益效果本發(fā)明的PCR方法在72-82℃高溫下退火的意義和效果是非常明顯的第1，在72℃以上高溫下退火，變性與退火步驟的溫度差顯著縮小，并且可以將PCR由變性，退火和延伸三步簡(jiǎn)化為變性和退火延伸二步，這些改進(jìn)顯然有利于PCR反應(yīng)的操作穩(wěn)定性和結(jié)果的重復(fù)性。
第2，退火溫度越高，引物與非模板順序退火的可能性就越低，有利于減少和完全克服非專一擴(kuò)增產(chǎn)物的形成，使PCR反應(yīng)專一性更有保證。
第3，Taq-DNA聚合酶的最適溫度通常在72-78℃之間。在此范圍內(nèi)退火和延伸，不僅使PCR的步驟簡(jiǎn)化也使反應(yīng)速度加快。Taq DNA聚合酶非常耐熱，在78℃以上退火和延伸，仍顯示較強(qiáng)的反應(yīng)活力，并可能有其他有利于擴(kuò)增的特性。
第4，能在72℃以上高溫下與模板退火的引物，必然具有高解鏈溫度，與擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度的差距較小甚至高于擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度。
以人甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因?yàn)槔?，在不同區(qū)域隨機(jī)取9個(gè)長(zhǎng)度為400堿基的擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增每一個(gè)產(chǎn)物的引物長(zhǎng)度分別為20，30和40堿基，根據(jù)引物軟件計(jì)算的9個(gè)引物和擴(kuò)增產(chǎn)物的的特性的統(tǒng)計(jì)結(jié)果列于表4。
表4.引物長(zhǎng)度與引物和擴(kuò)增產(chǎn)物特性的關(guān)系

結(jié)果表明如引物長(zhǎng)度為20堿基，引物解鏈溫度與擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度平均差22℃，當(dāng)引物長(zhǎng)度為30-40堿基時(shí)，引物的解鏈溫度與擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度相接近甚至超過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度。PCR進(jìn)行到一定階段，擴(kuò)增產(chǎn)物累積到相對(duì)較高濃度時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物能在從變性溫度降低至退火溫度的過(guò)程中迅速完成自身的退火，從而抑制了引物與模板的退火，使PCR擴(kuò)增效率降低進(jìn)入平臺(tái)期。提高引物的解鏈溫度能減少或消除引物與模板退火和擴(kuò)增產(chǎn)物自身退火之間的時(shí)間差，從而推遲PCR平坡的出現(xiàn)，有利于定量PCR的實(shí)現(xiàn)。
第5，能在高退火溫度下擴(kuò)增的引物，不僅引物與模板的結(jié)合強(qiáng)度大大提高，同時(shí)，分析表明引物與模板的假性匹配卻反而有所降低，這對(duì)提高PCR的專一性和效率有很大的正面作用。
以全長(zhǎng)近10,000堿基的人免疫缺失病毒(HIV〕基因?yàn)槔?，隨機(jī)選取3’端位置相同的長(zhǎng)20，30和40堿基的引物各10個(gè)，用Oligo分析引物與模板的專一結(jié)合強(qiáng)度和假性匹配強(qiáng)度，統(tǒng)計(jì)結(jié)果示于表5。
表5.引物與模板的專一結(jié)合強(qiáng)度和假性匹配強(qiáng)度分析


表5顯示，40堿基的引物平均解鏈溫度高達(dá)85℃，能在72℃以上退火，比20堿基長(zhǎng)引物的平均解鏈溫度高約26℃。與模板結(jié)合的平均強(qiáng)度則比20堿基引物高130點(diǎn)以上，而假性結(jié)合反而低20％以上。
第6，在72℃以上高溫下退火可以適當(dāng)降低引物設(shè)計(jì)時(shí)對(duì)引物發(fā)夾結(jié)構(gòu)特性和正反引物自身及相互間3’端互補(bǔ)結(jié)合特性的限制。標(biāo)準(zhǔn)PCR的退火溫度在45-65℃之間，在引物設(shè)計(jì)時(shí)通常對(duì)引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和正反引物自身和相互間的3’互補(bǔ)結(jié)構(gòu)有一定的限制，因?yàn)樵诖藴囟确秶鷥?nèi)有相對(duì)嚴(yán)重的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和3’端堿基互補(bǔ)的引物，就不能充分線性化和比較容易形成引物二聚體。在72℃以上高溫下引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)幾乎都被解開，引物二聚體也幾乎沒有機(jī)會(huì)形成。
第7，在高退火溫度下，引物發(fā)夾結(jié)構(gòu)和二聚體不易形成，就為增加反應(yīng)體系中引物的濃度創(chuàng)造了鍥機(jī)，而高濃度引物有利于增強(qiáng)引物與模板退火對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物自身退火的競(jìng)爭(zhēng)，使平坡出現(xiàn)推遲。
第8，具有高解鏈溫度的引物，特別是高解鏈溫度的長(zhǎng)引物，仍能在72℃左右與非3’端有1-3個(gè)錯(cuò)配的目標(biāo)順序退火完成擴(kuò)增，從而既保持?jǐn)U增的專一性，又減少了臨床檢測(cè)的假陰性。
第9，具有高解鏈溫度的引物可以在含10-20％甘油的反應(yīng)液中，仍在72℃左右高退火溫度下完成專一擴(kuò)增，有利于預(yù)混試劑的組建。這一特性也有利于在反應(yīng)液中引入其他變性劑和PCR反應(yīng)促進(jìn)劑，而保持?jǐn)U增的專一性。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的實(shí)施例中PCR的模板DNA為人組織總RNA，用Poly(dT)為引物，按Clontech公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒推薦的操作所合成的cDNA。PCR反應(yīng)均采用Clomech公司Advantage-2試劑盒。PCR反應(yīng)液(25μL計(jì))成分如表6所示。PCR首次變性條件均為95.5℃ 1分鐘，循環(huán)變性條件均為95.5℃30秒。PGR擴(kuò)增結(jié)果以電泳方法檢測(cè)判別。
表6.25μL PCR反應(yīng)液組分及含量

實(shí)施例1.
超高退火溫度PCR的引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)結(jié)果。
以人肌動(dòng)球蛋白基因序列為目標(biāo)序列，設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為15、20、30、40和50堿基左右的高嚴(yán)謹(jǐn)引物對(duì)(表7和8)。
表7.實(shí)施例1引物順序

表8.實(shí)施例1引物的特性

實(shí)施例1試驗(yàn)的退火溫度范圍為72-80℃停留時(shí)間30秒，延伸步驟均為80℃ 60秒，共25個(gè)循環(huán)。結(jié)果見表10。
表9.實(shí)施例1的PCR反應(yīng)電泳結(jié)果

+表示陽(yáng)性結(jié)果；-表示陰性結(jié)果實(shí)施例2.
進(jìn)行兩步法PCR。
實(shí)施例2所用引物和反應(yīng)條件與實(shí)施例1相同，但退火和延伸溫度相同。引物對(duì)A1退火和延伸為72℃60秒鐘，引物對(duì)A2退火和延伸為76℃60秒鐘，引物對(duì)A3退火和延伸為78℃60秒鐘，引物對(duì)A4和A5退火和延伸為80℃60秒鐘。結(jié)果A1-A5對(duì)引物經(jīng)PCR和電泳后均檢出與目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度一致的電泳條帶。
實(shí)施例3.
利用超高退火溫度排除非專一性產(chǎn)物。
從人甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因中選擇二對(duì)引物，二對(duì)引物的3’區(qū)域完全相同(下劃線表示)。前一對(duì)引物長(zhǎng)約20堿基稱標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)引物，后一對(duì)引物稱40堿基長(zhǎng)引物，引物的順序和特性列于表10和11。
表10.實(shí)施例3引物順序

表11.實(shí)施例3引物特性

實(shí)施例3的反應(yīng)條件與實(shí)施例1相同，標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)引物試驗(yàn)退火溫度范圍為52-68℃，延伸溫度均為72℃。40堿基長(zhǎng)引物試驗(yàn)退火溫度范圍為60-80℃，延伸溫度均為80℃。試驗(yàn)結(jié)果列于表12。
表12.實(shí)施例3試驗(yàn)結(jié)果

+表示陽(yáng)性結(jié)果；-表示陰性結(jié)果結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)引物能在52-62℃退火溫度下完成擴(kuò)增，但均伴隨非專一擴(kuò)增產(chǎn)物。40堿基長(zhǎng)引物能在60-78℃退火溫度下完成擴(kuò)增。當(dāng)退火溫度高于70℃時(shí)非專一擴(kuò)增產(chǎn)物消失。
實(shí)施例4.
利用超高退火溫度減少引物發(fā)夾和二聚體形成。
各種引物設(shè)計(jì)軟件都將弱發(fā)夾結(jié)構(gòu)和低3’端堿基互補(bǔ)作為引物嚴(yán)謹(jǐn)性的主要指標(biāo)，用引物設(shè)計(jì)軟件搜尋到的嚴(yán)謹(jǐn)性引物的發(fā)夾解鏈溫度都較低，3’端互補(bǔ)堿基數(shù)通常也小于3，在使用熱啟動(dòng)PCR情況下和標(biāo)準(zhǔn)PCR的退火溫度范圍內(nèi)，發(fā)夾和二聚體形成問題實(shí)際上并不嚴(yán)重。但是，高退火溫度可以使那些具有強(qiáng)發(fā)夾結(jié)構(gòu)在標(biāo)準(zhǔn)退火溫度下仍不能解開其發(fā)夾的引物充分線性化。
實(shí)施例4用分子信標(biāo)測(cè)試分析了發(fā)夾的解鏈特性。分子信標(biāo)順序?yàn)镚CGAGAAGATAAGACCCTATGCTCGC，發(fā)夾炳含5對(duì)堿基，發(fā)夾解鏈溫度為67℃。試驗(yàn)表明在55℃時(shí)約有一半的分子信標(biāo)呈發(fā)夾狀態(tài)，而在72℃以上時(shí)幾乎全部線性化。
實(shí)施例5.
利用超高退火溫度排除假陰性。
在有相同數(shù)量錯(cuò)配堿基的情況下，引物的近似解鏈溫度的下降與引物的長(zhǎng)度有關(guān)。下表是用OIigo軟件計(jì)算的從18至50堿基長(zhǎng)引物，每一個(gè)錯(cuò)配堿基導(dǎo)致的近似解鏈溫度的下降(表13)。
表13.每一個(gè)錯(cuò)配堿基導(dǎo)致的近似解鏈溫度的下降

超高退火溫度PCR的優(yōu)選引物長(zhǎng)度為40堿基左右，約為標(biāo)準(zhǔn)PCR所用引物的一倍。根據(jù)示于表3的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，20堿基長(zhǎng)引物的平均解鏈溫度為62℃，而40堿基長(zhǎng)引物為89℃。假定引物與某目標(biāo)基因變種有三個(gè)堿基的錯(cuò)配，20堿基長(zhǎng)引物與變種模板的近似解鏈溫度為44℃，在常規(guī)的退火溫度下難以完成擴(kuò)增，會(huì)造成在檢測(cè)該變種時(shí)出現(xiàn)假陰性。40堿基長(zhǎng)引物與同樣變種模板的近似解鏈溫度約為80℃，仍能在相當(dāng)高的退火溫度下專一地完成擴(kuò)增，從而減少或消除了假陰性。
實(shí)施例5將表10所示的正反標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)引物和正反40堿基長(zhǎng)引物的第4和10位堿基作A與T或C與G的置換(用黑體表示〕，經(jīng)改造的“突變”引物的順序列于表14。
表14.實(shí)施例5引物順序

用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo計(jì)算出示于表10的“野生”引物和示于表14的“突變”引物與目標(biāo)基因的近似解鏈溫度和結(jié)合強(qiáng)度，結(jié)果列于表15。
表15.“野生”和“突變”引物的特性

實(shí)施例5試驗(yàn)了“突變”引物的擴(kuò)增能力，試驗(yàn)條件與實(shí)施例3相同，標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)“突變”引物退火試驗(yàn)溫度范圍為45-55℃，結(jié)果均未得到目標(biāo)擴(kuò)增條帶。40堿基長(zhǎng)“突變”引物退火試驗(yàn)溫度范圍為55-70℃，結(jié)果均得到目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種超高退火溫度的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，依次包括如下步驟(1)模板變性；(2)引物與模板退火；(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互補(bǔ)DNA鏈；(4)按步驟(1)-(3)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；其特征在于，引物與模板退火溫度為72-82℃。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于引物長(zhǎng)度為15-50堿基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于引物長(zhǎng)度為30-45堿基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于擴(kuò)增反應(yīng)中退火溫度和延伸溫度相同。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，其特征在于正反引物的解鏈溫度均為72-96℃，優(yōu)選84-92℃。
6.權(quán)利要求1所述的超高退火溫度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法在排除非專一性擴(kuò)增產(chǎn)物中的應(yīng)用，其特征在于引物與模板退火溫度為72-82℃。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的應(yīng)用，其特征在于擴(kuò)增產(chǎn)物與正反引物的解鏈溫度之差為22--5℃。
8.權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法在排除引物二聚體中的應(yīng)用，其特征在于引物與模板退火的溫度為72-82℃。
9.權(quán)利要求1所述的超高退火溫度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法在排除假陰性結(jié)果中的應(yīng)用，其特征在于原始模板與引物有0-5個(gè)堿基的錯(cuò)配且引物與模板退火溫度為72-82℃。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法在排除假陰性結(jié)果中的應(yīng)用，其特征在于原始模板與引物有1-3個(gè)堿基的錯(cuò)配且引物與模板退火溫度為72-82℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法及其應(yīng)用。提供了一種在超高退火溫度下進(jìn)行PCR反應(yīng)的方法，采用具有高解鏈溫度的引物，能在72－82℃高退火溫度下完成擴(kuò)增，大大高于常規(guī)的72℃的退火溫度上限，突破了PCR反應(yīng)設(shè)計(jì)的普遍認(rèn)知和人為限制，使PCR循環(huán)步驟亦隨之簡(jiǎn)化為高溫變性和退火延伸兩步。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方法不但同樣可以成為一種普遍應(yīng)用的PCR，而且利用超高溫變性來(lái)提高反應(yīng)的專一性，使本發(fā)明在排除非專一性擴(kuò)增產(chǎn)物和排除假陰性結(jié)果等方面有著獨(dú)特的作用，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1517441SQ0311491
公開日2004年8月4日 申請(qǐng)日期2003年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月16日
發(fā)明者徐定邦, 朱德芬, 謝文凱, 徐文慧 申請(qǐng)人:徐定邦, 徐文慧