專利名稱：道地性金銀花聚合酶鏈反應－限制性酶切圖譜鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥材種質(zhì)的品質(zhì)鑒定技術(shù)領(lǐng)域。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下首先從各藥材中提取總DNA，利用一對引物，用PCR方法擴增一段DNA片段，經(jīng)純化后，對該片段進行DNA序列測定，建立各樣品的DNA序列數(shù)據(jù)庫，在比較數(shù)據(jù)庫DNA序列的基礎(chǔ)上，得到道地產(chǎn)區(qū)金銀花的特征DNA堿基序列為5’-GCCCCCCCGC CCCGCCTCCCACAGGGTCGC G-3’，針對道地與非道地產(chǎn)區(qū)金銀花DNA序列的差異，選擇合適的DNA限制性內(nèi)切酶酶切位點，通過分析聚合酶鏈反應產(chǎn)物的限制酶切圖譜差異，達到快速、準確鑒別道地與非道地產(chǎn)區(qū)金銀花的目的。對需要鑒定的金銀花樣品，提取其DNA，在給定的PCR條件下，用一對引物(LjP1、LjP2；TakaiwaF，Oono K，Sugiura M.Nucleotide sequence of the 17S-25S spacer region from ricerDNA.Plant Mol Biol，1985，4355-364)，供試品能夠擴增出一段DNA片段；用限制性內(nèi)切酶EcoN I或其同切酶對供試品的PCR擴增產(chǎn)物進行酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，將會出現(xiàn)708、461、247bp的條帶，道地產(chǎn)區(qū)461bp的條帶顯著亮于或近等于708bp的條帶，非道地產(chǎn)區(qū)708bp的條帶顯著亮于461bp的條帶。當供試樣品經(jīng)用本法進行PCR擴增，并對PCR產(chǎn)物進行限制性內(nèi)切酶酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA片段的大小及亮度，便可準確地鑒定道地及非道地產(chǎn)區(qū)的金銀花。本發(fā)明設(shè)計的用于鑒別道地產(chǎn)區(qū)金銀花PCR-RFLP分子鑒定方法是采用以下步驟a、藥材DNA的提取按常規(guī)進行，用無離子水將供試樣品的DNA濃度調(diào)節(jié)至0.1～0.3μg/μl；b、擴增DNA片段，即進行聚合酶鏈反應，用于聚合酶鏈反應的一對引物的DNA序列為LjP15’-CGTAAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’LjP25’-TTATTG ATA TGC TTA AAC TCA GCG GG-3’c、PCR擴增產(chǎn)物中加入限制性內(nèi)切酶EcoN I或其同切酶進行酶切，限制性內(nèi)切酶EcoN I或其同切酶的酶切位點為CCTNN^NNNAGG；d、瓊脂糖凝膠電泳分析；e、鑒定結(jié)果的判斷，若461bp的條帶顯著亮于或近等于708bp的條帶則供試品為道地產(chǎn)區(qū)的金銀花，若708bp的條帶顯著亮于461bp的條帶則供試品為非道地產(chǎn)區(qū)的金銀花。
本發(fā)明的效果是可解決道地與非道地產(chǎn)區(qū)金銀花的鑒定難題，提供鑒定所需的一對PCR引物、PCR反應條件、道地產(chǎn)區(qū)金銀花的特征DNA堿基序列、一種限制性內(nèi)切酶。與非道地金銀花相比，道地性金銀花所含的有效成分有明顯差別，其藥效強于非道地藥材，因此市場上道地性金銀花的價格高于非道地藥材。然而，道地與非道地金銀花難以通過形態(tài)、顯微等特征來加以區(qū)別，因此，急需找到一種可靠的鑒別方法。本發(fā)明利用道地與非道地藥材DNA序列的差異，建立了快速、便捷、可靠的PCR-RFLP鑒別方法，對于保證金銀花的藥材質(zhì)量，打擊假冒道地產(chǎn)區(qū)金銀花的市場行為具有重要的價值。
(3)PCR產(chǎn)物的電泳檢測取上述反應液4μl，與1μl載樣緩沖液混合，用1.5％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/μl溴化乙錠，即EB)電泳檢測擴增結(jié)果，各種DNA樣品均能擴增出一條約708bp的DNA條帶；b、聚合酶鏈反應產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶酶切反應DNA限制性內(nèi)切酶酶切反應反應液參考體積為20μl，其中各種物品的用量為PCR產(chǎn)物 10μl10×R+限制性內(nèi)切酶緩沖液 2μl限制性內(nèi)切酶EcoN I 2～5U無離子水補齊至 20μl將反應液置37℃保溫3～4小時，反應結(jié)束后置于65℃水浴10分鐘，使酶失活；d、電泳觀察酶切結(jié)果酶切產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/μl的溴化乙錠，即EB)，在80V電壓下電泳1～2小時，觀察電泳結(jié)果；e、測定結(jié)果的判斷，使用限制性內(nèi)切酶EcoN I或其同切酶對聚合酶鏈反應擴增產(chǎn)物進行酶切，產(chǎn)生對道地與非道地產(chǎn)區(qū)金銀花具有鑒別性特征的酶切DNA片段長度及條帶亮度圖譜。若供試品461bp的條帶顯著亮于或近等于708bp的條帶則為道地產(chǎn)區(qū)的金銀花，若708bp的條帶顯著亮于461bp的條帶則為非道地產(chǎn)區(qū)的金銀花，見附

圖1。道地性金銀花聚合酶鏈反應一限制性酶切圖譜鑒定方法<110>中國藥科大學<120>道地性金銀花聚合酶鏈反應一限制性酶切圖譜鑒定方法<160>1<210>1<211>31<212>DNA<213>金銀花(Lonicera japonica Thunb.)<400>1gcccccccgc cccgcctccc acagggtcgc g
權(quán)利要求
1一種道地性金銀花特有的DNA堿基序列，其特征在于DNA序列為5’-GCCCCCCCGC CCCGCCTCCC ACAGGGTCGC G-3’。
2一種道地性金銀花聚合酶鏈反應-限制性酶切圖譜，其特征在于能夠識別道地產(chǎn)區(qū)金銀花特有DNA堿基序列的限制性內(nèi)切酶EcoN I及其同切酶對聚合酶鏈反應產(chǎn)物消化后的瓊脂糖凝膠電泳的特征圖譜。鑒定方法為(1)、藥材DNA的提取按常規(guī)進行，用無離子水將供試樣品的DNA濃度調(diào)節(jié)至0.1～0.3μg/μl；(2)、擴增DNA片段，即進行聚合酶鏈反應(PCR)，用于聚合酶鏈式反應的一對引物的DNA序列為LjP15’-CGT AAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’LjP25’-TTA TTG ATA TGC TTA AAC TCA GCG GG-3’(3)、PCR擴增產(chǎn)物中加入限制性內(nèi)切酶EcoN I或其同切酶進行酶切，限制性內(nèi)切酶EcoN I或其同切酶的酶切位點為CCTNN^NNNAGG；(4)、瓊脂糖凝膠電泳分析；(5)、鑒定結(jié)果的判斷若461bp的條帶顯著亮于或近等于708bp的條帶則供試品為道地產(chǎn)區(qū)的金銀花；若708bp的條帶顯著亮于461bp的條帶則供試品為非道地產(chǎn)區(qū)的金銀花。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥材種質(zhì)的品質(zhì)鑒定技術(shù)領(lǐng)域，目的是提供一種準確鑒別道地(河南、山東)與非道地(其他產(chǎn)區(qū))產(chǎn)區(qū)金銀花的聚合酶鏈反應－限制性酶切圖譜分子鑒定方法(PCR－RFLP)。道地產(chǎn)區(qū)金銀花的特征DNA堿基序列為5′－GCCCCCCCGC CCCGCCTCCC ACAGGGTCGC G－3’；限制性內(nèi)切酶EcoNI及其同切酶可識別并切割該序列。鑒定過程如下提取藥材DNA用一對引物進行PCR擴增；用限制性內(nèi)切酶EcoNI或其同切酶消化PCR產(chǎn)物；瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果；通過與道地性金銀花PCR─RFLP特征結(jié)果相比較，即可判斷供試品是否為道地性金銀花藥材。
文檔編號C07H21/04GK1438235SQ0311300
公開日2003年8月27日 申請日期2003年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月20日
發(fā)明者李萍, 王沖之, 周開亞 申請人:中國藥科大學