專利名稱：一種含耐熱限制性內(nèi)切酶的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)，特別是涉及對基因組DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種簡單，快速，靈敏和專一的擴(kuò)增特定DNA的方法。但是，標(biāo)準(zhǔn)PCR方法在擴(kuò)增目標(biāo)基因產(chǎn)物的同時往往伴隨形成非專一產(chǎn)物，有時嚴(yán)重到比目標(biāo)產(chǎn)物更強(qiáng)甚至抑制了目標(biāo)產(chǎn)物的形成。所以，從擴(kuò)增產(chǎn)物的單一性角度而言，標(biāo)準(zhǔn)PCR方法在專一性方面還存在著嚴(yán)峻的問題。正因?yàn)榉菍Ｒ粩U(kuò)增產(chǎn)物相當(dāng)普遍地存在，就使得在PCR后用電泳分離或探針雜交等方法來鑒別和檢測目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物成為常規(guī)和必要。這種復(fù)雜地PCR后檢測步驟往往比PCR本身耗費(fèi)更多的時間和勞力，極大影響了PCR在醫(yī)學(xué)核酸檢測上的廣泛應(yīng)用。
為了避免和減少非專一擴(kuò)增產(chǎn)物的形成已建立了一套引物設(shè)計原則和順序，應(yīng)用引物設(shè)計軟件從目標(biāo)順序中找出那些3’端堿基內(nèi)部穩(wěn)定性合適，與模板順序假性結(jié)合率低于一定數(shù)值的引物，然后用BLAST等對初選的引物針對基因庫順序進(jìn)行同源性分析。但是任何一個引物設(shè)計軟件所能輸入的順序大小相當(dāng)有限，而對于20個堿基左右的寡核苷酸順序，BLAST也只能指出存在高度同源的非目標(biāo)基因順序。但實(shí)際上引物也可與并非高度同源的模板退火。所以，引物設(shè)計軟件和BLAST固然有用，但往往仍不能預(yù)測和解決PCR的非專一擴(kuò)增弊端。
近年來發(fā)展的各種熱啟動PCR技術(shù)能有效防止那些在室溫下引物與非目標(biāo)順序結(jié)合引發(fā)反應(yīng)而導(dǎo)至的非專一產(chǎn)物，但不能克服在通常PCR反應(yīng)退火溫度下仍
近年來發(fā)展的各種熱啟動PCR技術(shù)能有效防止那些在室溫下引物與非目標(biāo)順序結(jié)合引發(fā)反應(yīng)而導(dǎo)至的非專一產(chǎn)物，但不能克服在通常PCR反應(yīng)退火溫度下仍與引物結(jié)合的非目標(biāo)順序的干擾。本發(fā)明在反應(yīng)液中加入一種或幾種不切割目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物順序同時又耐熱的限制性核酸內(nèi)切酶，既不需要增加反應(yīng)步驟又能完全消除或顯著減少非專一擴(kuò)增產(chǎn)物形成。
發(fā)明構(gòu)思
根據(jù)PCR的基本原理目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物和非專一擴(kuò)增產(chǎn)物的形成必須滿足如下條件1.正、反引物能與模板退火。2DNA聚合酶能進(jìn)入正、反引物退火部位。3正、反引物退火部位之間的模板順序是連續(xù)而不是斷開的。4.正、反引物退火部位之間距離不能大于DNA聚合酶在規(guī)定條件下的最大延伸長度，通常延伸步驟時間爲(wèi)一分鐘在該時間內(nèi)最多能延伸2000個堿基左右。如果將原始模板用不切割目標(biāo)擴(kuò)增片段的限制性核酸內(nèi)切酶切割成較的小片段，則能促進(jìn)DNA聚合酶進(jìn)入引物退火部位有利目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)增，同時使非專一產(chǎn)物的擴(kuò)增機(jī)會大大減小或完全消除。另一方面，耐熱限制性核酸內(nèi)切酶能在50-75℃溫度下顯示活力，並能耐受75-95℃的高溫，這就使耐熱限制性核酸內(nèi)切酶在反應(yīng)的每一循環(huán)發(fā)生作用，而不必在反應(yīng)之前增設(shè)保溫步驟。多種商品化耐熱限制性核酸內(nèi)切酶的識別順序爲(wèi)4至5個鹼基，試驗(yàn)表明這些酶能在PCR反應(yīng)溶液中保持功能，控制變性溫度爲(wèi)75-95℃，在20-40個PCR反應(yīng)循環(huán)後仍保持活力。理論計算和限制性核酸內(nèi)切酶圖譜軟件分析均表明在幾百上千的目標(biāo)基因中很容易找到一個幾十至幾百鹼基長的目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物，不被某一種或幾種耐熱限制性核酸內(nèi)切酶所切割。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明提供一種在反應(yīng)液中添加耐熱限制性核酸內(nèi)切酶的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和試劑盒，從而在不增加反應(yīng)步驟的條件下，克服標(biāo)準(zhǔn)PCR方法往往形成非專一產(chǎn)物的缺陷，為在PCR后免除電泳分離或探針雜交等步驟來鑒別和檢測目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物創(chuàng)造了條件。
技術(shù)方案
用引物設(shè)計軟件(如Oligo 6.0)和限制性核酸內(nèi)切酶圖譜軟件(New EnglandBiolabs公司的NEBcutter，綱址www.neb.com)選擇引物。使擴(kuò)增產(chǎn)物不含某一種或幾種耐熱限制性核酸內(nèi)切酶的識別順序，優(yōu)選考慮使擴(kuò)增產(chǎn)物不含某二種或三種耐熱限制性核酸內(nèi)切酶的識別順序；優(yōu)選考慮耐熱性最強(qiáng)的酶如Pho I和PspG I；優(yōu)選考慮識別順序短的耐熱限制性核酸內(nèi)切酶如Mow I和Tsp509 I；優(yōu)選考慮最適反應(yīng)溫度在60-75℃的耐熱限制性核酸內(nèi)切酶如BstN I和Tfi I；優(yōu)選考慮擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度低于85℃的引物對。反應(yīng)液含有DNA聚合酶、緩沖液，dNTPs、引物、作為模板的基因組DNA或c-DNA。和上述所說的耐熱性限制性核酸內(nèi)切酶。反應(yīng)依次包括如下步驟
(1)模板變性；
(2)引物退火；
(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互補(bǔ)DNA鏈；
(4)步驟(1)-(3)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；
反應(yīng)完成後按常規(guī)電泳分離染色方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，也可採用各種非電泳染色的方法。
本發(fā)明可用于消除基因組DNA對RT-PCR的干擾，設(shè)計引物必須跨越至少一個內(nèi)涵子，比較c-DNA擴(kuò)增產(chǎn)物順序和基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物順序，找出切割基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物而不切割c-DNA擴(kuò)增產(chǎn)物順序的耐熱限制性核酸內(nèi)切酶。
本發(fā)明可用于崁套式PCR。設(shè)計外套引物和內(nèi)套引物各一對，比較內(nèi)套和外套擴(kuò)增產(chǎn)物的順序，找出找出切割外套擴(kuò)增產(chǎn)物而不切割內(nèi)套擴(kuò)增產(chǎn)物順序的耐熱限制性核酸內(nèi)切酶。耐熱酶可在反應(yīng)中途添加，或預(yù)先加在反應(yīng)管內(nèi)但不與反應(yīng)液接觸。在內(nèi)套反應(yīng)開始時用物理方法使之進(jìn)入反應(yīng)液。
有益效果
1.PCR反應(yīng)液含有耐熱限制性核酸內(nèi)切酶可將基因組DNA切割成較小分子，從而克服由於空間位阻對形成最初目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的影響，充分發(fā)揮引物與目標(biāo)順序完全匹配，其結(jié)合強(qiáng)于各種非專一退火的優(yōu)勢。
2.本發(fā)明不需要增加任何反應(yīng)步驟，但能有效減少或消除標(biāo)準(zhǔn)PCR方法通常會形成的非專一產(chǎn)物。
3.可用于PCR和以RNA爲(wèi)原始模板的一步或二步法RT-PCR。
4.本發(fā)明是基于隨機(jī)性的原則來降低非專一擴(kuò)增，除需要知道目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的順序外，不需要考慮其他各種背景、順序和數(shù)據(jù)。
5.與其他各種改善PCR專一性的技術(shù)如熱啟動，嵌套式PGR等完全兼容。
6.可用于反轉(zhuǎn)錄PCR消除基因組DNA干擾，也可用于崁套式PCR消除反應(yīng)後期外套引物擴(kuò)增的干擾。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.
實(shí)施例1以人beta-2-腎上腺素受體蛋白基因(3451堿基對，基因庫編號m15169)爲(wèi)目標(biāo)基因。正反引順序和特性示于表1和表2
表1.實(shí)施例1引物順序
表2.實(shí)施例1引物特性
擴(kuò)增產(chǎn)物長267堿基，解鏈溫度92.5℃。限制性內(nèi)切酶圖譜分析表明擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)有二個BstNI切點(diǎn)(17和240)，二個MwoI切點(diǎn)(39和74)，二個PhoI切點(diǎn)(33和243)和二個PspGI切點(diǎn)(15和238)。PCR和RT-PCR反應(yīng)所需的人基因組DNA(每微升0.1微克)，人組織總RNA(每微產(chǎn)品升1.0微克)，Advantage2-PCR試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒合均爲(wèi)為BD ClonTech公司產(chǎn)品。每100微升反應(yīng)液加基因組DNA或c-DNA5微升，c-DNA用試劑盒提供的Oligo(dT)引物合成。反應(yīng)液引物終濃度為0.4uM。每管反應(yīng)體積5微升。PCR反應(yīng)首次變性95℃1分鐘，循環(huán)變性95℃10秒，退火和延伸溫度64-75℃時間均爲(wèi)一分鐘，反應(yīng)共40個循環(huán)。對照管不加任何限制性核酸內(nèi)切酶，試驗(yàn)管分別加耐熱限制性核酸內(nèi)切酶PspG1或PhoI 2微升/50微升反應(yīng)液內(nèi)切酶均爲(wèi)New England Biolabs產(chǎn)品。試驗(yàn)結(jié)果列于表3。
表3.實(shí)施例1試驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果說明限制性核酸內(nèi)切酶PspG1和PhoI在PCR反應(yīng)液中及至少在64-75℃的溫度範(fàn)圍內(nèi)具有活力，並能耐受40個循環(huán)的95℃高溫變性。
實(shí)施例2
實(shí)施例2的目標(biāo)基因，所用核酸和反應(yīng)試劑盒等均與實(shí)施例1相同。正反引順序和特性示于表4和表5。
表4.實(shí)施例2引物順序
表5.實(shí)施例2引物特性
擴(kuò)增產(chǎn)物長172堿基，解鏈溫度79.9℃。限制性內(nèi)切酶圖譜分析表明擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)有二個BstNI切點(diǎn)(37和87)。PCR反應(yīng)首次變性78-94℃一分鐘，循環(huán)變性78-94℃10秒鐘，退火60℃一分鐘，延伸68℃30秒鐘。對照組不加酶，試驗(yàn)組每100微升反應(yīng)液加酶2微升。
試驗(yàn)結(jié)果列于表3。
表6.實(shí)施例2試驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果說明變性溫度太低擴(kuò)增產(chǎn)物不能完成變性，對照組和試驗(yàn)組均無擴(kuò)增產(chǎn)物形成。變性溫度太高限制性核酸內(nèi)切酶BstNI失活，對照組和試驗(yàn)組均形成擴(kuò)增產(chǎn)物，控制適當(dāng)?shù)淖冃詼囟葘φ战M形成苦增產(chǎn)物而試驗(yàn)組沒有擴(kuò)增產(chǎn)物形成。
實(shí)施例3
實(shí)施例3以人bRAF基因(2513堿基對，基因庫編號NM_004333)爲(wèi)目標(biāo)基因。RT-PCR所用反應(yīng)試劑盒等均與實(shí)施例1相同。正反引順序和特性示于表7和表8
表7.實(shí)施例3引物順序
表8.實(shí)施例3引物特性
擴(kuò)增產(chǎn)物長142堿基，解鏈溫度82.3℃。限制性內(nèi)切酶圖譜分析表明擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)有二個MwoI切點(diǎn)(105和114)。PCR反應(yīng)首次變性81-94℃一分鐘，循環(huán)變性81-94℃10秒鐘，退火60℃一分鐘，延伸70℃30秒鐘。對照組不加酶，試驗(yàn)組每100微升反應(yīng)液加酶2微升。
試驗(yàn)結(jié)果列于表9。
表9.實(shí)施例3試驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果說明變性溫度太低擴(kuò)增產(chǎn)物不能完成變性，對照組和試驗(yàn)組均無擴(kuò)增產(chǎn)物形成。變性溫度太高限制性核酸內(nèi)切酶MowI失活，對照組和試驗(yàn)組均形成擴(kuò)增產(chǎn)物，控制適當(dāng)?shù)淖冃詼囟葘φ战M形成苦增產(chǎn)物而試驗(yàn)組沒有擴(kuò)增產(chǎn)物形成。
實(shí)施例4
實(shí)施例4的目標(biāo)基因爲(wèi)人beta肌動球蛋白基因(1841堿基對，基因庫編號BC016045)。所用核酸和反應(yīng)試劑盒等均實(shí)施例1相同。正反引順序和特性示于表10和表11
表10.實(shí)施例4引物順序
表11.實(shí)施例4引物特性
擴(kuò)增產(chǎn)物長179堿基，解鏈溫度79.4℃。限制性內(nèi)切酶圖譜分析表明擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)沒有MwoI，BstNI，PhoI和PspGI切點(diǎn)。PCR反應(yīng)首次變性85℃一分鐘，循環(huán)變性85℃10秒鐘，退火55℃一分鐘，延伸68℃30秒鐘。試驗(yàn)組加任何二種或三種上述酶的組合擴(kuò)增後結(jié)果均顯示專一目標(biāo)擴(kuò)增條帶。
實(shí)施例5
實(shí)施例5的目標(biāo)基因爲(wèi)人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(1283堿基對，基因庫編號XM_006959)。RT-PCR所用反應(yīng)試劑盒等均實(shí)施例1相同。正反引順序和特性示于表12和表13
表12.實(shí)施例5引物順序
表13.實(shí)施例5引物特性
擴(kuò)增產(chǎn)物長166堿基，解鏈溫度87.1℃。限制性內(nèi)切酶圖譜分析表明擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)沒有PhoI和PspGI切點(diǎn)。PCR反應(yīng)首次變性90℃一分鐘，循環(huán)變性90℃10秒鐘，退火60℃30秒鐘，延伸72℃一分鐘。反應(yīng)液加PhoI和PspGI每100微升反應(yīng)液各2微升，反應(yīng)後電泳染色顯示專一擴(kuò)增條帶。
實(shí)施6爲(wèi)嵌套PCR其目標(biāo)基因也爲(wèi)人beta肌動球蛋白基因，RT-PCR反應(yīng)試劑等均與實(shí)施例1相同。內(nèi)套引物和外套引順序和特性示于表14和表15
表14.實(shí)施例6引物順序
表15.實(shí)施例6引物特性內(nèi)套和外套引物的擴(kuò)增產(chǎn)物長分別爲(wèi)173和652堿基，解鏈溫度分別爲(wèi)79.4和85.0℃。限制性內(nèi)切酶圖譜分析表明內(nèi)套擴(kuò)增產(chǎn)物沒有PhoI識別順序，而外套擴(kuò)增產(chǎn)物有4個PhoI切割位點(diǎn)(44，102，341和460)。PCR反應(yīng)首次變性90℃一分鐘，循環(huán)變性90℃10秒鐘，最初20循環(huán)退火和延伸72℃一分鐘。後20循環(huán)退火62℃一分鐘，延伸72℃一分鐘。在反應(yīng)進(jìn)行20循環(huán)後加PhoI，或在反應(yīng)管內(nèi)預(yù)加酶但不與反應(yīng)液接觸反應(yīng)進(jìn)行20循環(huán)後在閉管條件下用物理方法使之進(jìn)入反應(yīng)液。結(jié)果得到專一內(nèi)套擴(kuò)增產(chǎn)物，不加酶對照組同時有外套擴(kuò)增產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種含耐熱限制性核酸內(nèi)切酶的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和試劑盒，反應(yīng)液模板為基因組DNA或cDNA，反應(yīng)依次包括如下步驟
(1)模板變性；
(2)引物退火；
(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互補(bǔ)DNA鏈；
(4)按步驟(2)-(4)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
其特徵在于反應(yīng)之初或反應(yīng)中間在反應(yīng)液中加至少一種耐熱限制性核酸內(nèi)切酶，所加入的酶在目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)沒有識別順序
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含耐熱限制性核酸內(nèi)切酶的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和試劑盒，用于RNA為原始模板的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，相應(yīng)地在1所述反應(yīng)之初增加反轉(zhuǎn)錄步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的含耐熱限制性核酸內(nèi)切酶的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和試劑盒，含有二種以上的耐熱限制性核酸內(nèi)切酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的含耐熱限制性核酸內(nèi)切酶的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和試劑盒，所述的耐熱限制性核酸內(nèi)切酶是最適作用溫度在75-85℃，并能在95℃高溫下存活的酶，包括但不限於ApeK I、Pho I和PspG I。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的含耐熱限制性核酸內(nèi)切酶的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和試劑盒，所的耐熱限制性核酸內(nèi)切酶是最適作用溫度為50-65℃，能耐80℃以上高溫的酶，包括但不限於BstN I、BstU I、Mwo I、Tfi I、TseI、Tsp45 I、Tsp509 I和TspR I。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5所述的含耐熱限制性核酸內(nèi)切酶的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和試劑盒，所説的試劑盒含有完成PCR反應(yīng)必要的試劑和至少任意一種以上所述的耐熱限制性核酸內(nèi)切酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6所述的含耐熱限制性核酸內(nèi)切酶的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和試劑盒，用于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所述的引物至少跨越一個內(nèi)含子，而所述的酶切割內(nèi)含子順序。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7所述的含耐熱限制性核酸內(nèi)切酶的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和試劑盒，用于崁套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，所述的酶切割內(nèi)套與外套擴(kuò)增產(chǎn)物之間的順序。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8所述的含耐熱限制性核酸內(nèi)切酶的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和試劑盒，所述的試劑盒含有完成PCR反應(yīng)必要的試劑，所述的耐熱限制性內(nèi)切酶由任意二種或任意三種上述酶組合而成。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9所述的含耐熱限制性核酸內(nèi)切酶的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和試劑盒，可用于各種實(shí)時熒光PCR。
全文摘要
一種含耐熱限制性核酸內(nèi)切酶的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和相應(yīng)的試劑盒。選擇引物對的位置使擴(kuò)增產(chǎn)物不含有所述的耐熱限制性核酸內(nèi)切酶識別順序，或根據(jù)既定的擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶圖譜選擇含不同內(nèi)切酶組合的試劑盒。本發(fā)明可在不增加保溫或其他步驟的情況下完全消除或顯著降低非專一擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。根據(jù)所用限制性核酸內(nèi)切酶的耐熱程度選擇引物，使擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm比內(nèi)切酶的最高耐熱溫度稍低并控制循環(huán)變性溫度與之相適應(yīng)。發(fā)明可用于反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)降低非專一產(chǎn)物或消除基因組DNA對擴(kuò)增的干擾，也可用于崁套式PCR在后期阻斷外套引物的擴(kuò)增。
文檔編號C12Q1/68GK1858218SQ20051002563
公開日2006年11月8日 申請日期2005年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月30日
發(fā)明者徐定邦, 謝文凱, 府雷宇 申請人:徐定邦, 徐文慧