專利名稱：光合細(xì)菌濃縮方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖、污水凈化應(yīng)用的有益微生物制劑的制備。
背景技術(shù)：
光合細(xì)菌是地球生物圈中最原始的能進(jìn)行光合作用的原核生物，廣泛分布于湖泊、海洋、河流、稻田的底部表層和城市的污水排放渠中，具有很強(qiáng)的生命力。它們不僅能利用光能、固氮合成有機(jī)物質(zhì)，也能通過多種方式和途徑轉(zhuǎn)化不同類型的有機(jī)物和無機(jī)物質(zhì)，在水生態(tài)系統(tǒng)能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)循環(huán)、水體凈化過程中起著重要的作用。應(yīng)用光合細(xì)菌凈化水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘水質(zhì)，改善養(yǎng)殖環(huán)境，提高水產(chǎn)苗種成活率，防治魚、蝦病害方面顯示了巨大的潛力。但光合細(xì)菌菌液在使用保存和運輸過程中具有許多局限性，主要表現(xiàn)在光合細(xì)菌菌液品質(zhì)不穩(wěn)定，隨著保存時間的推移，有效活菌數(shù)不斷衰退、老化，影響使用效果。其次光合細(xì)菌菌液體積龐大，包裝桶費用高，運輸、保存不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決常規(guī)光合細(xì)菌菌液品質(zhì)不穩(wěn)定、不易保存，菌液體積龐大，包裝桶費用高，運輸、保存不便的技術(shù)問題，提供一種能克服常規(guī)光合細(xì)菌菌液存在的問題的光合細(xì)菌濃縮方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括采用規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)的液體光合細(xì)菌和進(jìn)行液體光合細(xì)菌電位決定離子(Pdi)測定，其特征是當(dāng)菌液中出現(xiàn)絮狀時，立即用弱堿液體將電位決定離子調(diào)節(jié)至+130mv，稍加攪拌，添加RP-50凝絮劑，通過弱堿液和凝絮劑使電位決定離子(Pdi)值在32mv左右終止反應(yīng)；菌體、電解質(zhì)、RP-50絮凝劑在弱堿環(huán)境中沉淀，沉淀成低親和能的凝膠在容器中陳化8小時以上；用虹吸管吸取三分之二的上清液，余下的膠體團(tuán)裝袋過濾；然后從濾袋中取出糊狀光合細(xì)菌稱重分裝成糊狀光合細(xì)菌產(chǎn)品。
本發(fā)明采用光合細(xì)菌培養(yǎng)至高峰期濃縮，使其處于休眠狀態(tài)，不但能最大限度地保存活菌數(shù)，而且經(jīng)水稀釋后光合細(xì)菌復(fù)活率高，并以幾何倍數(shù)繁殖成優(yōu)勢種群，克服了常規(guī)菌液產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定、不易保存等缺點，具有體積小，重量輕，隨用隨配，使用簡便，便于運輸和儲存的技術(shù)效果。
具體實施例方式
本發(fā)明適用于紫色非硫細(xì)菌，紅螺菌科(Rhodospirillaceae)主要菌種是球型紅假單胞菌(RP.Sphaeroides)和沼澤紅假單胞菌(RP.Palustris)莢膜紅假單胞菌(RP.Capulata)光合細(xì)菌規(guī)模生產(chǎn)工藝。
菌種培養(yǎng)采用斜面培養(yǎng)(Molisch瓊脂斜面)，取菌種與茄子瓶斜面，在28度、2000lx光照厭氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，七天后刮種收獲；菌液第一次擴(kuò)大培養(yǎng)(RCVBN培養(yǎng)基)是將幾只茄子瓶斜面菌種在無菌室內(nèi)用無菌生理鹽水洗至500ml三角燒瓶中，每瓶裝載不大于60ml，同時裝入數(shù)粒玻璃珠，用200RPm/min搖床震搖過夜，次日將均質(zhì)后的液體移至4000ml三角燒瓶中，滿載培養(yǎng)液的狀態(tài)下，用雷磁攪拌機(jī)攪拌，溫度28-30℃，光照2000lx培養(yǎng)七天；第二次擴(kuò)大培養(yǎng)用二萬毫升血清瓶，裝載19000ml，接種量大于15％，在溫度28-30℃，光照2000lx條件下培養(yǎng)七天，每天早晚人工各搖二次；第二次擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行敞開式富集培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方乙酸納CH3COONa(3g/L)、氯化鈉NaCL(0.1g/L)、硫酸胺(NH4)2SO4(0.3g/L)、硫酸鎂MgSO4.7H2O(0.2g/L)、磷酸二氫鉀KH2PO4(0.5g/L)、磷酸氫二鉀KH2O4(0.3g/L)、檸檬酸鐵(3.35mg/l)，取容積0.5-0.7噸(T)容器，接血清瓶菌種60L和340L培養(yǎng)基至容積0.5-0.7噸(T)容器，在溫度28-30℃，光照2000lx條件下培養(yǎng)，七天后測酸堿度(PH)、吸光值(OD)收獲。
經(jīng)過深層厭氧光照培養(yǎng)的液體光合細(xì)菌，細(xì)胞壁分為兩層；內(nèi)層為一薄層、厚約7-8納米，含有包壁酸的肽聚糖；外層由脂多糖和脂蛋白構(gòu)成，為革蘭氏陰性菌；菌液中除了這兩種離子表面(菌體)外，還有電解質(zhì)(培養(yǎng)基)；由擴(kuò)散電荷層使溶液平衡，一旦平衡打亂，膠體物(菌體)隨即沉降；糊狀光合細(xì)菌固化后，一經(jīng)稀釋，菌體與培養(yǎng)基恢復(fù)液態(tài)的電荷平衡，光合細(xì)菌在培養(yǎng)基中能正常生長。
糊狀光合細(xì)菌的制備工藝包括液體光合細(xì)菌電位決定離子(Pdi)的測定，測定時取10L新鮮的液體光合細(xì)菌，用電位儀測定，一般情況下Pdi為32mv左右；當(dāng)菌液中出現(xiàn)絮狀時，Pdi值為-130mv，立即用弱堿液體將Pdi調(diào)節(jié)至+130mv，稍加攪拌，添加RP-50凝絮劑，Pdi為32mv左右終止反應(yīng)；菌體、電解質(zhì)、RP-50絮凝劑在弱堿環(huán)境中形成沉淀，這種沉淀在容器中陳化8小時以上；經(jīng)陳化后的凝膠是以較小的低親和能的活性為特點，陳化后菌體容易過濾分離，采用虹吸管吸取近三分之二的上清液，余下的膠體團(tuán)裝錦綸濾袋過濾；在錦綸濾袋中取出糊狀光合細(xì)菌稱重分裝成糊狀光合細(xì)菌產(chǎn)品。
產(chǎn)品質(zhì)量的測定可隨機(jī)采樣10g取其中1g裝四支10ml離心管；四支離心管共裝載1g樣品后，用生理鹽水裝至每管的10ml刻度線，并滴入一滴6N氫氧化納NaOH，搖勻后離心15min，3000r/min，重復(fù)三次；收集四支離心管濕菌體，將液體光合細(xì)菌培養(yǎng)基注入離心管中洗下濕菌體搖勻后進(jìn)行吸光值OD光度測定，采用三管法進(jìn)行活菌數(shù)測定；將經(jīng)堿處理、離心、洗滌過的菌體稱重烘干(105℃)測定每克糊狀光合細(xì)菌的干重。
權(quán)利要求
1.光合細(xì)菌濃縮方法，包括采用規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)的液體光合細(xì)菌和進(jìn)行液體光合細(xì)菌電位決定離子測定，其特征是當(dāng)菌液中出現(xiàn)絮狀時，立即用弱堿液體將電位決定離子調(diào)節(jié)至+130mv，稍加攪拌，添加RP-50凝絮劑，通過弱堿液和凝絮劑使電位決定離子值在32mv左右終止反應(yīng)；菌體、電解質(zhì)、RP-50絮凝劑在弱堿環(huán)境中沉淀，沉淀成低親和能的凝膠，在容器中陳化8小時以上；用虹吸管吸取三分之二的上清液，余下的膠體團(tuán)裝袋過濾；然后從濾袋中取出糊狀光合細(xì)菌稱重分裝成糊狀光合細(xì)菌產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光合細(xì)菌濃縮方法，其特征是糊狀光合細(xì)菌產(chǎn)品質(zhì)量的測定隨機(jī)采樣10g取其中1g裝四支10ml離心管；四支離心管共裝載1g樣品后，用生理鹽水裝至每管的10ml刻度線，并滴入一滴6N氫氧化納NaOH，搖勻后離心15min，3000r/min，重復(fù)三次；收集四支離心管濕菌體，將液體光合細(xì)菌培養(yǎng)基注入離心管中洗下濕菌體搖勻后進(jìn)行吸光值OD光度測定，采用三管法進(jìn)行活菌數(shù)測定；將經(jīng)堿處理、離心、洗滌過的菌體稱重烘干(105℃)測定每克糊狀光合細(xì)菌的干重。
全文摘要
光合細(xì)菌濃縮方法，涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖、污水凈化用的有益微生物制劑的制備，需要解決光合細(xì)菌菌液品質(zhì)不穩(wěn)定、菌液體積大、包裝費用高、運輸、保存不便的問題。本發(fā)明包括采用規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)的液體光合細(xì)菌和液體光合細(xì)菌電位決定離子測定，其特征是當(dāng)菌液中出現(xiàn)絮狀時，立即用弱堿液體將電位決定離子調(diào)節(jié)至+130mv，稍加攪拌，添加凝絮劑，通過弱堿液和凝絮劑使電位決定離子值在32mv左右終止反應(yīng)；菌體、電解質(zhì)、絮凝劑在弱堿環(huán)境中沉淀成低親和能的凝膠，在容器中陳化8小時以上；用虹吸管吸取三分之二上清液，余下膠體團(tuán)裝袋過濾；然后從濾袋中取出糊狀光合細(xì)菌稱重分裝成糊狀光合細(xì)菌產(chǎn)品。本發(fā)明適用于光合細(xì)菌規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/20GK1854289SQ200510025529
公開日2006年11月1日 申請日期2005年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月28日
發(fā)明者黃寧宇, 常仁亮, 夏連軍 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所