專利名稱：一種無差別擴增雙鏈cDNA及基因組DNA的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種無差別擴增雙鏈cDNA及基因組DNA的方法。
背景技術：
當樣品比較小、稀少以及珍貴時，要往往要先對其RNA進行逆轉(zhuǎn)錄和擴增，才能得 到足夠的cDNA用于構(gòu)建cDNA文庫、基因克隆及表達情況分析等實驗。目前擴增的方法 主要有三種①在逆轉(zhuǎn)錄過程中加入T7、T3或SP6等RNA聚合酶的啟動子序列，合成雙鏈 cDNA后再利用這些RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄RNA，進而使其得到擴增；②逆轉(zhuǎn)錄過程中加入其它接頭 序列，然后利用與接頭序列相匹配的引物通過PCR擴增cDNA ；③逆轉(zhuǎn)錄后，將單鏈cDNA用 Circligase (Epicentre Biotechnologies)連接成環(huán)狀，然后滾環(huán)擴增。這些方法都有各 自的缺點，由于逆轉(zhuǎn)錄過程中長鏈和GC含量高的cDNA本身就不容易合成到頭，方法①中轉(zhuǎn) 錄出來的RNA還需要再重新逆轉(zhuǎn)錄成cDNA才能用于其它用途，長鏈和GC含量高的cDNA在 所有cDNA中的豐度會成倍降低，同時RNA也不易于保存；方法②則因為PCR對長鏈和GC含 量高的cDNA的擴增效率遠低于普通的短鏈cDNA，容易丟失長鏈和GC含量高的cDNA，抑制 性PCR只能部分解決長鏈cDNA擴增不足的問題；方法③則由于長鏈cDNA的兩個末端碰撞 的概率比短鏈的低很多，不容易形成環(huán)狀，造成其擴增比例大幅下降。因此需要一種等效的 cDNA擴增方法，這種方法既能夠高效擴增長鏈cDNA，也能夠高效擴增GC含量高的cDNA。另 外，稀有樣品的基因組等效擴增也存在相似的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種無差別擴增雙鏈cDNA及基因組DNA的方法，能夠高效并切 無差別的擴增各種cDNA及基因組DNA，對珍稀樣本的基因組DNA和cDNA有擴大保存的作 用，并能高效的擴增高GC含量以及復雜二級結(jié)構(gòu)的cDNA。本發(fā)明采用的技術方案是一種無差別擴增DNA的方法，所述DNA可以是直接從樣品中提取獲得的基因組 DNA，也可以是對樣品RNA進行逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA，所述方法包括(1)往DNA片段中加入T4DNA polymerase抹平末端；(2)步驟(1)產(chǎn)物加入Taq DNA polymerase使DNA片段的3 ‘末端加上堿基A ；(3)步驟(2)產(chǎn)物在 T4DNAligase 和 T4polynucleotide kinase 的作用下在 DNA 片段兩端都加上接頭Zip T ；(4)步驟( 產(chǎn)物在phi29DNA聚合酶作用下進行滾環(huán)擴增，產(chǎn)生大量DNA。一種所述DNA為基因組DNA時，所述方法如下(1)提取待測樣品基因組DNA ；(2)往基因組DNA片段中加入T4DNA polymerase抹平末端；(3)步驟(2)產(chǎn)物加入Taq DNA polymerase使基因組DNA的3 ‘末端加上堿基A ；(4)步驟(3)產(chǎn)物在 T4DNA Iigase 和 T4polynucleotide kinase 的作用下在基因組DNA兩端都加上接頭Zip T ；(5)步驟(4)產(chǎn)物在phi29DNA聚合酶作用下進行滾環(huán)擴增，產(chǎn)生大量基因組DNA。所述DNA為雙鏈cDNA時，所述方法如下(1)構(gòu)建含有稀有限制性內(nèi)切酶I-SceI識別位點的Oligo dT引物HceIdT，利 用該引物對樣品RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA ；(2)往第一鏈 cDNA 中加入 RNaseH 酶和 DNAPolymerase I 酶，合成雙鏈 cDNA ；(3)往雙鏈cDNA中加入T4DNApolymerase抹平雙鏈cDNA末端；(4)步驟(3)產(chǎn)物加入Taq DNA polymerase使雙鏈cDNA的3 ‘末端加上堿基A ；(5)步驟(4)產(chǎn)物在 T4DNA Iigase 和 T4polynucleotide kinase 的作用下在雙鏈 cDNA兩端都加上接頭Zip T ；(6)步驟( 產(chǎn)物在phi29DNA聚合酶作用下進行滾環(huán)擴增，產(chǎn)生大量雙鏈cDNA。本發(fā)明關鍵在于操作路線的涉及和酶的選擇，其各步驟具體操作過程可按本領域 常規(guī)方法進行選擇。本發(fā)明方法原理參見圖1，首先，利用一個含有識別序列為非回文序列 的稀有限制性內(nèi)切酶HceI識別位點位點的Oligo dT引物(I-SceIdT)先成第一鏈cDNA， 在Oligo dT中引用此位點為接下來全長cDNA的定向克隆提供基礎。第一鏈cDNA合成完成 后，加入RNAse H使和第一鏈cDNA結(jié)合的RNA出現(xiàn)切割，這些斷掉的RNA被DNAPolymerase I利用合成第二鏈cDNA。接著，利用T4DNAp0lymerase的3，一 5，外切核酸酶活性使雙鏈 cDNA變成平末端，基因組DNA可直接進行該步驟。然后，加入Taq DNA polymerase使雙鏈 cDNA的3 ‘末端加上堿基A。結(jié)果以上處理后，合成的雙鏈cDNA就可以在T4DNA Iigase以 及！^polynucleotide kinase的作用下兩端都加上接頭Zip Τ。ZipT是一個含有UceI 限制性酶切位點的發(fā)夾型的寡核苷酸，其3’末端有個突出的堿基Τ。加上Zip T之后，雙鏈 cDNA經(jīng)變性會形成一個單鏈的環(huán)狀DNA，然后在phU9等具有鏈置換活性的DNA聚合酶的 作用下進行滾環(huán)擴增，產(chǎn)生大量的雙鏈cDNA。這些cDNA經(jīng)過I-ke I酶切，可以進行定向 克隆。所述引物HceIdT帶有識別序列為非回文結(jié)構(gòu)的稀有限制性內(nèi)切酶HceI的位 點，可以用于定向克隆，序列包括但不限于如下GACGCTAGGGATAACAGGGTAATTTTTTTTTTTTTTTTVN下劃線部分為內(nèi)切酶HceI識別位點，V表示堿基A、C或G的簡并堿基，N表示 堿基A、T、C或G的簡并堿基。所述接頭Zip T序列可形成3 ‘末端有個突出堿基T的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并帶有識別序列 為非回文結(jié)構(gòu)的稀有限制性內(nèi)切酶HceI的位點，序列包括但不限于如下GCGGCCGCACGCTAGGGATAACAGGGTAATGCGGCCGCT下劃線部分為內(nèi)切酶UceI識別位點。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(a)本發(fā)明方法利用一個接頭ZipT使cDNA或基 因組DNA成環(huán)，因此對不同cDNA及基因組DNA環(huán)化效率相同，因此可以無差別的擴增雙鏈 cDNA及基因組DNA，這與利用連接酶使自身環(huán)化的方法相比更具有“無差別擴增“的優(yōu)勢； (b)與PCR方法擴增雙鏈cDNA及基因組DNA相比，這種方法對長片段以及高GC含量的DNA 的擴增效率不會受到影響。

圖1為本發(fā)明方法原理示意圖；圖2為使用原始雙鏈cDNA和稀釋不同倍數(shù)的擴增后雙鏈cDNA做模板，擴增GC含 量正常的產(chǎn)物電泳結(jié)果圖；圖3為使用原始雙鏈cDNA和稀釋不同倍數(shù)的擴增后雙鏈cDNA做模板，進行PCR 擴增高GC含量基因的產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例1 擴增小鼠的脊髓雙鏈cDNA步驟如下 一、第一鏈cDNA合成 1.在冰上加入5 μ 1 Total RNA (約 2 μ g)4μ 1 5 X RT buffer (Takara) 1 μ 1 IOmM dNTPs (Takara) 0. 5μ 1 I-SceIdT(50M, as OligodT primer) 0. 5μ 1 RNase Inhibitor (40u/μ 1)(NEB)1 μ 1 PrimeScriptII(200u/μ 1)(Takara) 8μ 1 DEPC-treated H2O
總體積20 μ 1 ;I-SceIdT 序列如下GACGCTAGGGATAACAGGGTAATTTTTTTTTTTTTTTTVN,下劃線部分
為內(nèi)切酶HceI識別位點；2.輕柔混勻后短暫離心，42°C孵育1小時、接著45°C 30分鐘，再在50°C 10分鐘。 二、雙鏈cDNA的合成1.加入20 μ 1第一鏈cDNA合成反應產(chǎn)物至以下體系(冰上操作): 8 μ 1 IOXRNase H buffer (NEB)1.5μ 1 IOmM dNTPs0. 2μ 1 RNase H (5u/μ 1) (NEB) 1 μ 1 DNAPolymerase I (IOu/μ 1)(NEB 69. 3 μ 1 H2O 總體積100 μ 12.輕柔混勻后短暫離心，15°C孵育2小時，避免溫度超過15°C。 3.加入0.5 μ 1 (5u/ μ 1)T4DNA Polymerase(NEB)后 15°C孵育 10 分鐘，使末端平滑。4.力口 入 Ιμ Taq DNA Polymerase (5u/μ 1) ,72 "C 孵育 20 分鐘，使 T4DNAPolymerase失活并在雙鏈cDNA末端加3 ‘ -A。5.加入250 μ 1的乙醇，混勻-20 V沉淀1小時。
6. 12，OOOXXg離心10分鐘，輕輕倒掉上清，加入Iml的75%乙醇。7. 12，000Xg離心5分鐘，輕輕倒掉上清，小心吸干殘留乙醇。8.力口入 4μ1 10 μ M ZipT(adaptor)溶解。Zip T序列如下GCGGCCGCACGCTAGGGATAACAGG GTAATGCGGCCGCT,下劃線部分為內(nèi) 切酶HceI識別位點；三、接頭連接1.加入以下反應液至上述溶解的雙鏈cDNA中1 μ 1 IOXLigation buffer1 μ 1 50% PEG40000·25 μ 1 T4Polynucleotide Kinase(lOu/μ 1)(NEB)1 μ 1 T4DNA Ligase(NEB)2. 75 μ 1 H2O總體積10 μ 12.輕柔混勻后短暫離心，16°C孵育過夜。四、滾環(huán)擴增1.加入如下2μ 1 連接了接頭的雙鏈cDNA2 μ 1 250 μ M exonuclease resistant random Octamer(NNNNNNsNsN)2 μ 1 IOmM dNTPs11 μ 1 H2O將混合物在95 °C孵育5分鐘，使變性，冰上迅速冷卻2.在上述樣品中加入下列試劑2μ 1 10XPhi29Buffer0. 5μ 1 BSA(10mg/ml)0. 5μ 1 Phi29DNA Polymerase (lOu/ μ 1)總體積 20 μ 13.輕柔混勻后短暫離心，30°C孵育過夜。65°C孵育10分鐘使Wii29DNAPolymerase 失活終止反應，即可獲得大量小鼠脊髓雙鏈cDNA。實施例2 使用擴增完成的小鼠脊髓雙鏈cDNA對GC含量正常的目的片段的擴增根據(jù)Genbank的中目的基因Gprl78的序列設計引物，擴增一段58;3bp的片段，其 GC含量為53. 69%o引物序列如下正向引物TGCTTGGCTTCCCTGGTGGCTC
反向引物ATGGGCTGGTTCAGGTGCPCR反應體系組成如下17. 25 μ 1 H2O2. 5μ 1 IOXTaq Buffer(Fermentas)1· 5 μ 1 MgC 12 (25mM, Fermentas)0· 5 μ 1 dNTPs (IOmM, NEB)
1μ 1正向引物(10 μ Μ)1μ 1反向引物(10 μ Μ)1 μ 1模板 cDNA0.25 μ 1 Taq DNA Polymerrase(Fermentas)總體積25 μ 1每管。PCR條件如下94°C 預變性 4min
權(quán)利要求
1.一種無差別擴增DNA的方法，所述方法包括(1)往DNA片段中加入T4DNApolymerase抹平末端；(2)步驟(1)產(chǎn)物加入TaqDNA polymerase使DNA片段的3 ‘末端加上堿基A ；(3)步驟(2)產(chǎn)物在T4DNA Iigase 和 T4polynucleotide kinase 的作用下在 DNA 片段 兩端都加上接頭Zip T ；(4)步驟C3)產(chǎn)物在phi29DNA聚合酶作用下進行滾環(huán)擴增，產(chǎn)生大量DNA。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述DNA為基因組DNA，所述方法如下(1)提取待測樣品基因組DNA;(2)往樣品基因組DNA中加入T4DNApolymerase抹平末端；(3)步驟(1)產(chǎn)物加入TaqDNA polymerase使基因組DNA的3 ‘末端加上堿基A ；(4)步驟(3)產(chǎn)物在jMDNAIigase和！^polynucleotide kinase的作用下在基因組 DNA都加上接頭Zip T ；(5)步驟(4)產(chǎn)物在phi29DNA聚合酶作用下進行滾環(huán)擴增，產(chǎn)生大量基因組DNA。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述DNA為雙鏈cDNA，所述方法如下(1)構(gòu)建含有稀有限制性內(nèi)切酶HceI識別位點的OligodT引物I-keldT，利用該 引物對樣品RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA ；(2)往第一鏈cDNA中加入RNaseH酶和DNAPolymeraseI酶，合成雙鏈cDNA ；(3)往雙鏈cDNA中加入iMDNApolymerase抹平雙鏈cDNA末端；(4)步驟(3)產(chǎn)物加入TaqDNA polymerase使雙鏈cDNA的3 ‘末端加上堿基A ；(5)步驟(4)產(chǎn)物在T4DNA Iigase 和 T4polynucleotide kinase 的作用下在雙鏈 cDNA 兩端都加上接頭Zip T ；(6)步驟( 產(chǎn)物在phi29DNA聚合酶作用下進行滾環(huán)擴增，產(chǎn)生大量雙鏈cDNA。
4.如權(quán)利要求1 3之一所述的方法，其特征在于所述引物HceIdT序列如下 GACGCTAGGGATAACAGGGTAATTTTTTTTTTTTTTTTVN下劃線部分為內(nèi)切酶HceI識別位點，V表示堿基A、C或G，N表示堿基A、T、C或G。
5.如權(quán)利要求1 3之一所述的方法，其特征在于所述接頭ZipT序列如下 GCGGCCGCACGCTAGGGATAACAGGGTAATGCGGCCGCT下劃線部分為內(nèi)切酶HceI識別位點。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種無差別擴增雙鏈cDNA及基因組DNA的方法。所述方法包括構(gòu)建含有稀有限制性內(nèi)切酶I-SceI識別位點的OligodT引物I-SceIdT，利用該引物對樣品RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA；往第一鏈cDNA中加入RNAseH酶和DNA Polymerase I酶，合成雙鏈cDNA，然后抹平雙鏈cDNA末端(基因組DNA擴增從此步驟開始做)，接著使雙鏈cDNA(或基因組DNA)的3‘末端加上堿基A，最后在雙鏈兩端都加上接頭Zip T，使雙鏈DNA可以變性成單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在phi29DNA聚合酶作用下進行滾環(huán)擴增，產(chǎn)生大量雙鏈cDNA或基因組DNA。本發(fā)明方法能夠高效并且無差別的擴增各種cDNA及基因組DNA，對珍稀樣本的基因組DNA和cDNA有擴大保存的作用，并能高效的擴增高GC含量以及復雜二級結(jié)構(gòu)的DNA。
文檔編號C12N15/10GK102134566SQ20101061240
公開日2011年7月27日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者張遵義, 戴忠敏, 朱曉靜, 趙盼 申請人:杭州師范大學