專利名稱：一種小鏈霉菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種小鏈霉菌CGMCC No. 4027，以及該菌株在生產(chǎn)達(dá)托霉素中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
二十世紀(jì)80年代初美國禮萊公司的科學(xué)家從玫瑰孢鏈霉菌 (Streptomycesroseosporus)提取出一組具有強(qiáng)烈抑制革蘭陽性菌的活性物質(zhì)A21978C。 這組脂肽類物質(zhì)具有共同的環(huán)肽母核和由一個N-?；B接的不同的脂肪酸側(cè)鏈組成。其中，具有癸酸側(cè)鏈的化合物L(fēng)Y146032具有顯著的抗MRSA活性，從而被開發(fā)成為新型的抗菌藥物達(dá)托霉素(Daptomycin)。達(dá)托霉素具有在體外抗絕大多數(shù)的臨床革蘭陽性菌的作用。 主要用于治療耐藥菌，如耐萬古霉素的腸球菌(VRE)，耐甲氧西林的金葡菌(MRSA)，糖肽類敏感的金葡菌(GISA)，凝固酶陰性的葡萄球菌(CNS)和耐青霉素的肺炎鏈球菌(PRSP)引發(fā)的感染。目前，對于這些耐藥菌感染可選擇的抗生素很少，因此達(dá)托霉素具有良好的市場前景和研究價值。目前達(dá)托霉素主要是通過玫瑰孢鏈霉菌發(fā)酵提取。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可用于生產(chǎn)達(dá)托霉素的新型菌株。本發(fā)明的小鏈霉菌(Sti^ptomyces parvus)，于2010年7月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心正式保藏，保藏號為=CGMCC No. 4027。用于制備達(dá)托霉
ο采用本發(fā)明的小鏈霉菌CGMCC No. 4027在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵制備達(dá)托霉素，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源選自糊精、可溶性淀粉、檸檬酸鹽、甘油、葡萄糖、甘露醇、鼠李糖、L-阿拉伯糖、纖維二糖、糖原、水楊苷、苦杏仁苷、丙酸鈉、琥珀酸鈉、乙酸鈉、蘋果酸鈉，含量為 1. O 8. 0% ；氮源選自酵母粉、黃豆餅粉、花生餅粉，含量為0. 5 5. 0% ；發(fā)酵溫度為20 40°C，攪拌轉(zhuǎn)速100 450r/min，發(fā)酵pH6 7. 5，空氣流量
0.5 1. 5vvm,發(fā)酵時間為6 7天，且在發(fā)酵20 30h后，補(bǔ)加癸酸/油酸甲酯混合料液， 補(bǔ)料速率為0. 25 0. 35ml/h · L。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基含有可溶性淀粉4.0 6.0 %，葡萄糖
1.0 .2. 0 %，黃豆餅粉3. 0 4. 5 %，硫酸亞鐵銨0. 01 0. 03 %。根據(jù)本發(fā)明，另一優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基含有糊精1. 0 3. 0%，葡萄糖1. 0 5. 0%， 黃豆餅粉0. 2 1. 0%，花生餅粉2. 0 4. 0%，硫酸亞鐵銨0. 01 0. 03%。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的發(fā)酵溫度為四 30°C，發(fā)酵PH為6. 5。本發(fā)明提供的達(dá)托霉素產(chǎn)生菌株小鏈霉菌(Str印tomyce sparvus)的原始培養(yǎng)株系分離自采集到的自然環(huán)境土壤樣品，經(jīng)反復(fù)自然選育以及培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化，每公升發(fā)酵液達(dá)托霉素產(chǎn)量可達(dá)IOOOmg左右，且菌株性狀穩(wěn)定，能滿足工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)菌種的產(chǎn)量穩(wěn)定性要求，具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價值。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明公開的達(dá)托霉素產(chǎn)生菌株的原始培養(yǎng)株系分離自采集到的自然環(huán)境土壤樣品，經(jīng)反復(fù)自然選育，經(jīng)鑒定該菌株為小鏈霉菌(Sti^ptomyces parvus)，于2010年7 月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心正式保藏，保藏號為=CGMCC No. 4027。采用國際鏈霉菌計劃(ISP)和《鏈霉菌鑒定手冊》推薦的培養(yǎng)基，將CGMCC No. 4027菌種在接種后于培養(yǎng)5-7天，其培養(yǎng)形態(tài)特征如表1所示。顯微觀察顯示其孢子絲直、柔曲，孢子呈橢圓形和柱形。表1本發(fā)明的小鏈霉菌的形態(tài)特征
培養(yǎng)基氣生菌絲基內(nèi)菌絲可溶性色素察氏培養(yǎng)基白色淺乳黃色無葡萄糖天冬素培養(yǎng)基蠣肉色乳黃色無甘油天冬素培養(yǎng)基略帶紫的灰色略帶紫的棕色無無機(jī)鹽淀粉培養(yǎng)基乳白色乳黃色無ISP-2培養(yǎng)基白色栗棕色無燕麥粉培養(yǎng)基略粉的白色褐黃色無高氏1號培養(yǎng)基白色乳黃色無桑塔氏培養(yǎng)基略粉的白色略棕的紫色無本發(fā)明的菌株CGMCC No. 4027明膠液化反應(yīng)、淀粉酶反應(yīng)、酪氨酸酶反應(yīng)呈陽性， 可胨化和凝固牛奶。采用國際鏈霉菌計劃推薦的方法，碳源利用實驗以ISP9為基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng) 7-30天。得到該菌株的碳源利用特征如下可利用的碳源有半乳糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、L-阿拉伯糖、纖維二糖、淀粉、糖原、甘露醇、水楊苷、甘油、苦杏仁苷、檸檬酸鈉、丙酸鈉、 琥珀酸鈉、乙酸鈉、蘋果酸鈉。對棉籽糖、松三糖、蔗糖、菊糖、山梨糖、衛(wèi)矛醇、內(nèi)消旋赤蘚糖、丙二酸鈉、馬尿酸鈉、酒石酸鈉不能利用。實施例1菌種斜面培養(yǎng)物挖塊接種到裝有種子培養(yǎng)基的三角搖瓶，種子培養(yǎng)基的成分見表 2，于四1、2201·/!^!!轉(zhuǎn)速搖床上培養(yǎng)48小時。種子培養(yǎng)液以5% (ν/ν)轉(zhuǎn)種量接種到裝有4. 5L發(fā)酵培養(yǎng)基的玻璃發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基配方見表3。發(fā)酵罐設(shè)定條件溫度30°C、攪拌轉(zhuǎn)速400r/min，空氣流量lvvm，用氨水在線控制pH 6. 5。培養(yǎng)沈小時起開始補(bǔ)加由癸酸油酸甲酯=1 1 (ν/ν)組成的料液，補(bǔ)料速率為0. 3ml/h · L，培養(yǎng)168小時結(jié)束發(fā)酵。HPLC分析達(dá)托霉素量為970mg/L。表2種子培養(yǎng)基成分
權(quán)利要求
1.一種小鏈霉菌(Sti^ptomyces parvus)，保藏號為CGMCC No. 4027。
2.如權(quán)利要求1所述的小鏈霉菌在制備達(dá)托霉素中的應(yīng)用。
3.一種采用權(quán)利要求1所述的小鏈霉菌CGMCC No. 4027制備達(dá)托霉素的方法，其特征在于，所述小鏈霉菌CGMCC No. 4027在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵制備所述達(dá)托霉素，其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源選自糊精、可溶性淀粉、檸檬酸鹽、甘油、葡萄糖、甘露醇、鼠李糖、L-阿拉伯糖、纖維二糖、糖原、水楊苷、苦杏仁苷、丙酸鈉、琥珀酸鈉、乙酸鈉、蘋果酸鈉，含量為 1. 0 8. 0% ；氮源選自酵母粉、黃豆餅粉、花生餅粉，含量為0.5 5.0% ；發(fā)酵溫度為20 40°C，攪拌轉(zhuǎn)速100 450r/min，發(fā)酵pH6 7. 5，空氣流量0. 5 1. 5vvm,發(fā)酵時間為6 7天，且在發(fā)酵20 30h后，補(bǔ)加癸酸/油酸甲酯混合料液，補(bǔ)料速率為 0. 25 0. 35ml/h · L。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有可溶性淀粉4.0 6.0%,葡萄糖1. 0 .2. 0 %，黃豆餅粉3. 0 4. 5 %，硫酸亞鐵銨0. 01 0. 03 %。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有糊精1.0 3. 0%， 葡萄糖1.0 5.0%，黃豆餅粉0.2 1.0%，花生餅粉2.0 4.0%，硫酸亞鐵銨0.01 0. 03%。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵溫度為四 30°C，發(fā)酵pH為6.5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小鏈霉菌(Streptomyces parvus)CGMCC No.4027及其在生產(chǎn)達(dá)托霉素中的應(yīng)用。該菌株性狀穩(wěn)定，能滿足工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)菌種的產(chǎn)量穩(wěn)定性要求。
文檔編號C12R1/465GK102399706SQ20101028575
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者吳偉燕, 夏興, 孫新強(qiáng), 孟根水, 戈梅, 朱麗, 李秋爽, 殷瑜, 羅敏玉, 蔣含嫣, 阮麗軍, 陳玲玲, 魏維 申請人:上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)任公司, 浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠