專利名稱：新化合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新細菌基因和用于增進例如棒酸的棒烷生產的方法。本發(fā)明也提供能夠產生增加量的棒酸的新生物。
微生物，具體地說是鏈霉菌屬菌種(Streptomyces sp.)，產生一些抗生素，包括棒酸和其它棒烷、頭孢菌素、聚酮化合物、頭孢霉素、衣霉素、全霉素和青霉素。能夠操作這些由所述微生物產生的絕對量和相對量的抗生素具有可觀的利益，并因此有大量的學者研究生物合成途徑的代謝和遺傳機制[Domain，A.L.(1990)“β-內酰胺抗生素的生物合成與調節(jié)”，載于青霉素50年的應用、歷史和發(fā)展趨勢]?，F在已知許多在所述代謝途徑中執(zhí)行不同步驟的酶和編碼這些酶的基因。
可以根據棒烷環(huán)的立體化學結構，將其任意分為兩組(5S和5R棒烷)。還沒有完全解釋明白生物合成5R和5S棒烷的生物化學途徑，但有人認為它們由相同的起子單元(至今尚未鑒別出的3碳化合物)[Townsend，CA.和Ho，M.F.(1985)J.Am.Chem.Soc.107(4)，1066-1068和Elson，S.W.和Oliver，R.S.(1978)J.Antibiotics XXXI No.6，568]和精氨酸[Valentine，B.P.等(1993)J.Am Chem.Soc.15，1210-1211]衍生，并共享一些共同的中間體[Iwata-Reuyl，D.和C.A.Townsend(1992)J.Am.Chem.Soc.1142762-63和Janc，J.W.等(1993)Bioorg.Med.Chem.Lett.32313-16]。
5S棒烷的實例包括棒烷-2-羧化物(C2C)、2-羥甲基棒烷(2HMC)、2-(3-丙氨酰)棒烷、Valclavam和棒霉酸(clavaminic acid)[GB 1585661，Rohl，F.等Arch.Microbiol.147315-320，US 4,202,819]。然而幾乎沒有5R棒烷的實例，迄今最廣為人知的是由帶小棒鏈霉菌(Streptomycesclavuligerus)發(fā)酵產生的β-內酰胺酶抑制劑棒酸。在抗生素AUGMENTIN(Trade Mark SmithKline Beecham)中，將棒酸鉀形式的棒酸同β-內酰胺阿莫西林結合。由于這具有商業(yè)利益，所以了解棒烷生物合成的研究集中在帶小棒鏈霉菌的生物合成5R棒烷、棒酸方面。已經鑒別和公開了一些與棒酸生物合成有關的酶及其基因。這些公開的實例包括Hodgson，J.E.等，Gene 166，49-55(1995)，Aidoo，K.A.等，Gene 147，41-46(1994)，Paradkar，A.S.等，J.Bact.177(5)，1307-14(1995)。相反，除了霉棒酸，關于5S棒烷的生物合成和遺傳是未知的，棒霉酸是帶小棒鏈霉菌中的棒酸生物合成途徑中通過棒酸合酶作用產生的棒酸前體。
基因克隆實驗已經證實，帶小棒鏈霉菌包含兩個棒霉酸合酶同工酶，cas1和cas2[Marsh，E.N.等，Biochemistry31，12648-657，(1992)]，cas1和cas2都可以在一定營養(yǎng)條件下影響棒酸產量[Paradkar，A.S.等，J.Bact.177(5)，1307-14(1995)]。在其它產生棒酸的微生物中也檢測出棒霉酸合酶活性，所述微生物即S.jumonjinensis[Vidal，C.M.，ES 550549，(1987)]和桂濱鏈霉菌(S.Katsurahamanus)[Kitano，K.等JP53-104796，(1978)]以及5S棒烷valclavam的生產者抗生鏈霉菌(S.Antibioticos)[Baldwin，J.E.等，Tetrahedron Letts.35(17)，2783-86，(1994)]。后一篇論文也報道了具有原棒霉酸(proclavaminic acid)脒基水解酶活性的抗生鏈霉菌，該酶為已知參與棒酸生物合成的另一個酶。有報導指在帶小棒鏈霉菌中鑒別出的參與棒烷生物合成的所有其它基因，是棒酸生物合成所需要的[Hodgson，J.E.等，Gene，166，49-55(1995)，Aidoo，K.A.等，Gene，147，41-46(1994)]，而且至今尚未報導5S棒烷生物合成特有的基因。
我們現在已經鑒別出了一些5S棒烷生物合成特有的基因，如在帶小棒鏈霉菌中由C2C和2HMC作為示例的基因。因此本發(fā)明提供了包含一種或多種基因的DNA，所述基因是帶小棒鏈霉菌中5S棒烷的生物合成特有的，且對5R棒烷(例如棒酸)生物合成不是必需的。
我們在本文使用的“基因”也包括任何基因功能或表達所需的調節(jié)區(qū)。在一優(yōu)選方面，所述DNA如

圖1鑒定的。所述DNA最好包含在圖1中顯示的、稱為orfup3、orfup2、orfup1、orfdwn1、orfdwn2和orfdwn3的核苷酸序列。本發(fā)明也提供由所述DNA編碼的蛋白。本發(fā)明也提供包含本發(fā)明所述DNA的載體和包含這種載體的宿主。
令人驚奇的是，我們發(fā)現當至少一種按照本發(fā)明的基因是缺陷型時，由所述生物產生的棒酸的量增加。因此本發(fā)明也提供用于增加由合適的微生物產生的棒酸產量的方法。在本發(fā)明的一個方面，可以操作鑒別的基因，以產生能夠產生增加量的棒烷(更恰當的說是棒酸)的生物。本發(fā)明的研究結果也提供鑒別具有較高棒酸產量的生物的改進方法，所述方法包括初步篩選具有較低5S棒烷產量或不產5S棒烷的微生物(例如通過hplc和/或如在本文的實施例中所述的棒烷生物測定)。
合適的是，可以以本文提供的序列為基礎，通過常規(guī)的克隆方法(諸如PCR)，獲得本發(fā)明的5S棒烷基因?？梢酝ㄟ^遺傳技術，諸如基因破壞[Aidoo，K.A.等，(1994)，Gene，147，41-46]、隨機誘變、定點誘變和反義RNA，干擾或去除/刪除所述基因的功能。
在本發(fā)明的另一方面，提供包含一種或多種缺陷基因的質粒，優(yōu)選為下文所述的質粒pCEC060、pCEC061、pDES3、pCEC056和pCEC057?？梢杂酶鞣N方法使所述基因產生缺陷。例如通過插入編碼抗生素抗性基因的DNA片段，所述DNA片段完全消除了那個基因的活性。另一方面，可以使用其它策略產生缺陷基因，包括插入不編碼抗生素抗性基因的DNA、消除部分所述基因、刪除所有所述基因、或通過增加和/或置換一個或多個核苷酸改變所述基因的核苷酸序列。按照本發(fā)明的缺陷基因可以在不同程度上缺陷。它們可以是缺陷型，因為它們的活性完全消除，或可以保留一部分原始活性。
合適的是，將本發(fā)明所述質粒用于轉化諸如帶小棒鏈霉菌的生物，所述帶小棒鏈霉菌例如菌株ATCC 27064(其相當于帶小棒鏈霉菌NRRL 3585)?？梢栽谟嘘P資料中發(fā)現合適的轉化方法，所述資料包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，分子克隆實驗室指引，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，N.Y.；Hopwood，D.A.等(1985)，鏈霉菌屬遺傳操作，克隆指引，和Paradkar，A.S.和Jensen，S.E.(1995)，J.Bacteriol.177(5)1307-1314。
帶小棒鏈霉菌菌株工業(yè)上用于生產棒酸(棒酸鉀)。在的英國和美國藥典(英國藥典1993，附錄1994，第1362-3頁和美國藥典政府專論1995，USP 23 NF18第384-5頁)中，關于棒酸鉀，具體控制了毒性5S棒烷棒烷-2-羧化物的量。
因此在本發(fā)明的另一方面，提供能夠高產棒酸、但已使其不能產生C2C的生物，或者提供能夠高產棒酸、但只能產生低水平C2C的生物。產生棒酸的生物合適地是包括一種或多種缺陷型棒烷基因，而優(yōu)選是下文所述的帶小棒鏈霉菌菌株56-1A、56-3A、57-2B、57-1C、60-1A、60-2A、60-3A、61-1A、61-2A、61-3A和61-4A。這類生物適于生產棒酸而不生產5S棒烷棒烷-2-羧化物，或者明顯降低了棒烷-2-羧化物的產量。實施例在所述實施例中，除非另有說明，否則所有方法都如以下文獻所述Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，分子克隆實驗室指引(第二版)，或Hopwood，D.A.等(1985)，鏈霉菌屬遺傳操作，克隆指引，和Paradkar，A.S.和Jensen，S.E.(1995)，J.Bacteriol.177(5)1307-1314。I.棒霉酸合酶基因cas1的帶小棒鏈霉菌染色體上游和下游的DNA序列A.cas1的分離為了從帶小棒鏈霉菌NRRL 3885中分離編碼棒霉酸合酶同工酶1(cas1)的基因的染色體DNA片段，根據先前測序的cas1基因(Marsh，E.N.，Chang，M.D.T.和Townsend，C.A.(1992)Biochemistry3112648-12657)的核苷酸9-44，合成寡核苷酸探針ROM1。使用標準方法，在應用生物系統391 DNA合成儀上構建寡核苷酸。合成36-mer的ROM1序列，所述ROM1序列在方向上同Marsh等(1992，ibid)公開的序列反向平行，通過末端標記DNA寡核苷酸的標準技術(Sambrook等，1989出處同上)，用32P放射性標記ROM1，并通過由Stahl和Amann所述的DNA雜交法(載于Nucleic acid techniques inbacterial systematics.E.Stackebrandt和M.Goodfellow編輯，多倫多John Wiley and Sons，第205-248頁，1991)，使用ROM1篩選帶小棒鏈霉菌基因組DNA的粘粒庫。Doran，J.L等(1990)，J.Bacteriol.172(9)，4909-4918中描述了在粘粒pLAFR3中制備的帶小棒鏈霉菌DNA基因組庫。
于60℃在溶液中同放射性標記的ROM1整夜溫育帶小棒鏈霉菌粘粒庫的菌落印跡，所述溶液由5×SSC、5×Denhardt′s溶液和0.5％SDS(1×SDS0.15M NaCl+0.015M檸檬酸鈉；1×Denhardt′s溶液0.02％BSA、0.02％Ficoll和0.02％PVP)組成。然后于68℃在0.5×SSC+0.1％SDS的溶液中洗滌所述印跡30分鐘。分離一個粘粒克隆10D7，它同ROM1強烈雜交，并在用限制性核酸內切酶SacI和EcoRI消化時產生雜交信號，所述雜交信號和在使用帶小棒鏈霉菌基因組DNA消化物的相似的實驗中檢定的雜交信號相一致。B.cas1側翼的帶小棒鏈霉菌染色體的DNA序列用限制性核酸內切酶SacI、NcoI和KpnI產生粘粒10D7的部分限制性酶切圖譜。在ROM1和1OD7 DNA的各種消化物間的DNA雜交實驗表明，cas1最可能位于7-kb SacI-SacI DNA亞片段的一個末端。這個片段由cas1開放讀框和大約6kb的上游DNA組成。然后，在噬菌粒載體pBluescriptII SK+(2.96kb；Stratagene)中，由10D7的SacI消化物亞克隆所述7-kb片段，因此產生重組質粒pCEC007。
為了易化對cas1染色體上游測序的方法，在pUC120(3.2kb；Vieirra和Messing，酶學方法，153，3-11，1987)中以兩個方向亞克隆所述7-kb SacI-SacI片段的3-kb NcoI-NcoI亞片段，產生重組質粒pCEC026和pCEC027。所述3-kb亞片段由cas1的氨基末端編碼部分和大約2.6kb的上游DNA組成。
使用外切核酸酶III和S1核酸酶消化法(Sambrook等，1989出處同上)，在pCEC026和pCEC027中產生嵌套重疊缺失，并通過雙脫氧鏈終止法(Sanger，F.，Nicklen，S.和Coulson，A.R.(1977)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.745463-5467)，使用Taq dye-deoxy2終止子試劑盒和應用生物系統373A測序儀，在兩個鏈上測定所述3-kb NcoI-NcoI片段的DNA序列。
為了測定緊接cas1染色體下游的DNA序列，在pBluescript IISK+中由粘?？寺?0D7亞克隆4.3kb的KpnI-EcoRI DNA片段，產生pCEC018。在pSL1180(3.422kb，Pharmacia)中由pCEC018克隆3.7-kb的SacI-SacI亞片段；這個片段的一個SacI末端同cas1的TGA終止密碼子部分重疊，另一SacI末端是載體編碼的。在亞克隆過程中得到兩個方向的所述3.7-kb片段，所得的重組質粒稱為pCEC023和pCEC024。在兩種質粒中產生嵌套重疊缺失，并在兩個鏈上測定所述3.7-kb片段的DNA序列。在圖1中顯示了在這些實驗中產生的帶小棒鏈霉菌染色體的核苷酸序列，包括cas1序列和cas1側翼的序列。II.cas1側翼的開放讀框的功能分析cas1上游DNA序列的計算機分析預示，存在兩個完整的orf和一個不完整的orf。所有三個orf均位于cas1的相反DNA鏈上，并因此以相反的方向定向。第一個開放讀框orfup1位于cas1上游579bp，并編碼344個氨基酸(aa)的多肽。第二個開放讀框orfup2位于orfup1的3′-末端以外437bp，并編碼151個aa的多肽。orfup3在orfup2之外。orfup3的起始密碼子與orfup2的翻譯終止密碼子重疊，這使人們猜測所述兩個orf翻譯上偶聯。orfup3的翻譯終止密碼子沒有位于所述3-kb的NcoI-NcoI片段上。
對cas1下游DNA序列的相似分析預示，存在兩個完整的orf和一個不完整的orf。其中兩個所述orf位于cas1的相反DNA鏈上，并因此以cas1的方向定向。所述第三個orf位于同cas1相同的鏈上，并因此以遠離cas1的方向定向。第一個下游開放讀框orfdwn1位于cas1下游373bp，并編碼328個aa的多肽。第二個開放讀框orfdwn2位于orfdwn1上游55bp，并編碼394個aa的多肽。orfdwn3在orfdwn2上游315bp，并在相反的鏈上。因為在所述3.7-kb片段上沒有發(fā)現orfdwn3的終止密碼子，所以orfdwn3編碼219aa的不完整多肽。orfup和orfdwn開放讀框的基因破壞為評價cas1側翼的開放讀框在由帶小棒鏈霉菌產生的棒酸和其它棒烷的生物合成中可能起的作用，通過基因替換產生插入失活或缺失突變體。Paradkar和Jensen(1995出處同上)大體描述了用于基因破壞和置換的方法。A.orfup1按Paradkar和Jensen(1995出處同上)所述，構建帶有阿泊拉霉素抗性基因(aprr)的1.5-kb NcoI-NcoI片段，對其用克列諾片段處理，以產生平端(Sambrook等，1989出處同上)，并將其與pCEC026連接，所述pCEC026已用BsaBI消化，并也用克列諾片段處理。pCEC026具有一個位于orfup1中距翻譯起始密碼子636bp的BsaBI位點。連接混合物用于轉化大腸桿菌GM 2163感受態(tài)細胞(得自New EnglandBiolabs，USA.，Marinus，M.G.等MGG(1983)第122卷，第288-9頁)至阿泊拉霉素抗性。從產生的轉化體中，分離兩個包含質粒pCEC054和pCEC055的克??；通過限制酶切分析，發(fā)現pCEC054具有以與orfup1相同的方向插入的aprr-片段，而pCEC055具有以相反方向插入的aprr-片段。
為將pCEC054引入到帶小棒鏈霉菌中，用BamHI和Hind III消化質粒DNA，并連接到高拷貝數的鏈霉菌屬載體pIJ486(6.2kb；Ward等，(1986)Mol.Gen.Genet.203468-478)上。然后使用連接混合物轉化大腸桿菌GM 2163感受態(tài)細胞至阿泊拉霉素抗性。從產生的轉化體中，分離出一個具有穿梭質粒pCEC061的克隆。然后使用這個質粒轉化帶小棒鏈霉菌NRRL 3585。在非選擇性培養(yǎng)基上將所得的轉化體連續(xù)進行兩輪孢子形成，然后復制平板接種至包含抗生素的培養(yǎng)基上，以鑒別阿泊拉霉素抗性和硫鏈絲菌肽-敏感轉化體。根據此方法，選擇四個推斷的突變體(61-1A、-2A、-3A和-4A)，用于進一步的分析。
為證實這些推斷的突變體在orfup1中被破壞，由分離的61-1A和61-2A制備基因組DNA，用SacI消化，并接受DNA印跡分析。DNA印跡分析的結果符合發(fā)生的雙交換，并證明這些突變體在orfup1中是真正的破壞置換突變體。
在大豆粉(Soya-Flour)培養(yǎng)基中培養(yǎng)突變體61-1A、-24、-34和-44，通過HPLC分析它們的培養(yǎng)物上清液的棒酸和棒烷產量。除了用于HPLC分析的電泳緩沖液由0.1 M NaH2PO4+6％甲醇，pH3.68(用冰醋酸調節(jié))組成，先前報導了大豆粉培養(yǎng)基的組成和通過HPLC分析棒烷的方法(Paradkar和Jensen，1995出處同上)。HPLC分析表明，所述突變體沒有產生可檢測水平的棒烷-2-羧化物或2-羥甲基棒烷。而且，當使用Pruess和Kellett法(1983，J.Antibiot.36208-212)對芽孢桿菌屬菌種(Bacillus sp.)ATCC 27860培養(yǎng)物上清液進行生物測定時，所述突變體沒有產生可檢測水平的丙氨酰棒烷。相反，當與野生型對比時，所述培養(yǎng)物上清液的HPLC分析顯示，所述突變體似乎產生高水平的棒酸(表1)。表1在搖瓶實驗中orfup1突變體的棒酸效價(CA)
orfup1缺失進行克隆實驗，以在orfup1的Aat II位點之間產生654個核苷酸的基因缺失。使用列于下文的寡核苷酸引物和上述pCEC061作為模板，產生PCR產物。改變原始核苷酸序列，以將一個PstI摻入到oligo11中，和將一個SphI位點摻入到oligo 14中。用于產生PCR產物1的寡核苷酸對1引物115′dCTGACGCTGCAGGAGGAAGTCCCGC3′引物125′dCGGGGCGAGGACGTCGTCCCGATCC3′用于產生PCR產物2的寡核苷酸對2引物135′dGAGCCCCTGGACGTCGGCGGTGTCC 3′引物145′dGACGGTGCATGCTCAGCAGGGAGCG 3′使用GRI(Felsted，Dunmow，Essex，CM6 3LD)的PTC-200 Peltier循環(huán)變溫加熱器進行標準PCR反應。
使用引物11和12產生PCR產物1。這個產物大約1Kb，并包含從第二Aat II位點起的orfup1羧基末端和下游區(qū)域。
使用引物13和14產生PCR產物2。這個產物大約1.1Kb，并包含從第一個Aat II位點起的orfUp1氨基末端和上游區(qū)域。
按照使用手冊(Strategene Ltd，Cambridge Science Park，MiltonRoad，Cambridge CB44GF)連接PCR產物2和用SrfI消化的pCR-ScriptAmp SK(+)。使用所述連接混合物轉化Epicurian大腸桿菌XL1-BlueMRF′Kan超感受態(tài)細胞(由Strategene獲得)至氨芐青霉素抗性(按照生產商的說明)。由獲得的轉化體分離質粒DNA，DNA限制酶切分析顯示，7個克隆包含已經連接了PCR產物2的質粒。這些質粒之一稱為pDES1。
用PstI和Aat II消化PCR產物1，并通過瓊脂糖凝膠電泳分級分離所得的DNA。使用Sephaglas band prep試劑盒(Pharmacia，StAlbans，Herts，ALI 3AW)，從凝膠上切下并洗脫出1Kb片段。然后將所分離的片段與Aat II和PstI消化的pDES1相連接。所述連接混合物用于轉化大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細胞(由Strategene獲得)至氨芐青霉素(按照生產商的說明)。從所得的轉化體中分離質粒DNA，限制酶切分析顯示，1個克隆包含連接了PCR產物1的質粒。這個質粒稱為pDES2。
為將pDES2引入到帶小棒鏈霉菌中，進一步修飾所述質粒，以包含可以在鏈霉菌中起作用的復制起點。為達到這個目的，用EcoRI和Hind III消化pDES2的質粒DNA，并將所述質粒DNA連接到高拷貝數的鏈霉菌屬載體pIJ486(6.2KbWard等，(1986)Mol.Gen.Genet.203468-478)上，所述pIJ486也用EcoRI和Hind III消化。所述連接混合物用于轉化大腸桿菌(JM109)感受態(tài)細胞(Strategene Ltd)至氨芐青霉素抗性。從所得的轉化體中分離質粒DNA，限制酶切分析顯示，6個克隆具有包含pDES2的pIJ486。這些質粒之一稱為pDES3。質粒pDES3用于轉化帶小棒鏈霉菌菌株，其中通過插入阿泊拉霉素抗性基因(如上所述)，已經破壞了orfup1基因。選擇硫鏈絲菌肽抗性轉化體，然后將這些轉化體在非選擇性的培養(yǎng)基上完成3輪孢子形成，并篩選丟失阿泊拉霉素抗性的轉化體。根據這個方法鑒別出45個喪失阿泊拉霉素抗性的突變體。然后通過HPLC分析這些突變體，證實了象orfup1破壞體(disruptant)61-1A、61-2A、61-3A和61-4A一樣，當在正常生產這些棒烷的條件下發(fā)酵時，這些菌株不能產生棒烷-2-羧化物和2-羥甲基棒烷。B.orfdwn1和orfdwn2通過先用NcoI消化pCEC018(7.3kb)，并釋放1-kb包含大部分orfdwn1和一部分orfdwn2的亞片段，在orfdwn1和orfdwn2中產生缺失/置換突變體。通過瓊脂糖凝膠電泳分級分離所述消化物，從所述凝膠中切下并洗脫出6.3-kb片段。然后將這個片段和具有aprr的NcoI-NcoI DNA片段相連接，并用于轉化大腸桿菌XL1-Blue至阿泊拉霉素抗性。由這個實驗獲得一個克隆，但所獲重組質粒的限制酶切分析顯示，兩個拷貝的所述阿泊拉霉素抗性片段已經連接入所述缺失質粒。為消除多余拷貝的aprr-片段，用NcoI消化所述質粒，并自身連接所述質粒。所述連接混合物用于轉化大腸桿菌GM2163至阿泊拉霉素抗性。由所述轉化體分離兩個包含質粒pCEC052和pCEC053的克隆，所述兩個質粒都只具有一個拷貝的所述aprr-片段；pCEC052具有相對于orfdwn1和2反方向的所述aprr-片段，而pCEC053具有在與orfdwn1和2相同的方向插入的所述aprr-片段。
通過將BamHI消化的pCEC052和相似消化的pIJ486相連接，并轉化大腸桿菌GM2163至阿泊拉霉素抗性，構建pCEC052穿梭質粒。由這個實驗分離一個包含穿梭質粒pCEC060的克隆。這個質粒用于轉化野生型帶小棒鏈霉菌3585至阿泊拉霉素和硫鏈絲菌肽抗性。所得轉化體在非選擇性條件下完成兩輪孢子形成，然后平板復制到包含抗生素的培養(yǎng)基上，以鑒別阿泊拉霉素抗性、硫鏈絲菌肽敏感菌落。選擇三個推斷的突變體(60-1A、-2A和3A)用于進一步的分析。
為確立這些推斷突變體的身份，從菌株60-1A和60-2A中分離基因組DNA，用或者SacI，或者BstE II消化基因組DNA，并接受DNA印跡分析。由這個實驗產生的雜交帶和經歷雙交換事件的兩種菌株一致，這證明這些突變體是真正的orfdwn1/2破壞置換突變體。
當在大豆粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些突變體，并通過HPLC測定它們的培養(yǎng)物上清液時，所述突變體沒有產生可檢測水平的棒烷-2-羧化物或2-羥甲基棒烷。培養(yǎng)物上清液的生物測定顯示，所述突變體也沒能產生可檢測水平的丙氨酰棒烷。同orfup1突變體一樣，orfdwn1/2突變體能夠產生高于野生型水平的棒酸(表2)。表2在搖瓶實驗中orfdwn1/2突變體的棒酸效價(CA)
orffdwn3為破壞orfdwn3，用NcoI消化pCEC023(包括亞克隆到pSL1180的cas1下游DNA的3.7-kb片段)，然后自身連接pCEC023。用連接混合物轉化大腸桿菌后，分離一個具有質粒pCEC031的克隆。這個質粒僅保留編碼一部分orfdwn2和不完整的orfdwn3的1.9kb NcoI-EcoRI片段。DNA序列檢查顯示，pCEC031在距orfdwn3翻譯起始位點158bp處具有唯一的BstE II位點。所以，用BstE II消化pCEC031，用克列諾片段處理pCEC031，以產生平端，然后連接到平頭阿泊拉霉素抗性盒上。所述連接混合物用于轉化大腸桿菌GM2163至阿泊拉霉素抗性和氨芐青霉素抗性。選擇兩個分別包含pCEC050和pCEC051的轉化體。限制酶切分析顯示，在pCEC050中，所述阿泊拉霉素抗性盒以與orfdwn3相同的方向定向，而在pCEC051中，所述阿泊拉霉素抗性盒以與orfdwn3相反的方向定向。然后都用HindIII消化這兩種質粒，并連接到相似消化的pIJ486上。然后將所述連接混合物分別用于轉化大腸桿菌GM2163至阿泊拉霉素和氨芐青霉素抗性。從所得的轉化體中分離穿梭質粒pCEC056(pCEC050+pIJ486)和pCEC057(pCEC051+pIJ486)。然后兩種質粒都用于轉化帶小棒鏈霉菌NRRL3585。
從每個轉化實驗中選擇一個轉化體，并在非選擇性培養(yǎng)基中完成兩輪連續(xù)的孢子形成，然后平板復制到包含抗生素的培養(yǎng)基中，以鑒別阿泊拉霉素抗性和硫鏈絲菌肽敏感轉化體。根據這個方法從每個原始轉化體的后代中分離兩個推斷的突變體。(對于pCEC056為56-1A和56-3A，而對于pCEC057為57-1C和57-2B)。
為確立這些推斷突變體的身份，從這些菌株中分離基因組DNA，用或者SacI，或者Acc65I消化基因組DNA，并接受DNA印跡分析。由這個實驗產生的雜交帶和經歷雙交換事件的兩種菌株一致，這證明這些突變體是真正的orfdwn3破壞置換突變體。
當在大豆粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些菌株，并通過HPLC測定它們的培養(yǎng)物上清液時，所述突變體產生大大降低水平的棒烷-2-羧化物或2-羥甲基棒烷。所述培養(yǎng)物上清液的生物測定顯示，所述突變體也沒能產生可檢測水平的丙氨酰棒烷。同所述orfup1和orfdwn1/2突變體一樣，所述orfdwn3突變體能夠產生高于野生型水平的棒酸(表3)。表3在搖瓶實驗中orfup3突變體的棒酸效價(CA)
本申請公開了下列核苷酸序列SEQ ID No.1 圖1的DNA序列SEQ ID No.2 orfup3序列SEQ ID No.3 orfup2序列SEQ ID No.4 orfup1序列SEQ ID No.5 orfdwn1序列SEQ ID No.6 orfdwn2序列SEQ ID No.7 orfdwn3序列SEQ ID No.8 寡核苷酸引物11序列SEQ ID No.9 寡核苷酸引物12序列SEQ ID No.10寡核苷酸引物13序列SEQ ID No.11寡核苷酸引物14序列圖1包括cas1和cas1側翼的帶小棒鏈霉菌染色體的核苷酸序列NcoI. . . . . .1GGTACCGCCCGCCGCCGACGGGGCCTCGGAGCCGGCCTGGCCACTGGTCCTGGTGGGGCC60M A P P P Q G P A E A P G T V L V V G. . . . . .61 ACCCTATCACCGGGCGGTGGGCCGCGTCGTCTGAGGGCCTGTGCCTGGGCACCCACACGC 120T P Y H G A V R R L L S G S V S G H T H. .<orfup3. . .121 GCCTTTCCGGGCCTCCGGCCCAGTGTCGGTGCCCATTGCGCGCCACAGGAACGGGCGCAT 180* L W P Y R A T D K G A YA S L G P P R T M. . . . . .181 TAGCCCCAGGTCTATCTGCTTCCGGGCCACCTGCTCCTTCAGGGCGTGGAGCATCTGGCA 240D P D L Y V F A R H V L F D R V E Y V T. . . . . .241 CGTGGTCGCGGGCCGCCGGGTGAGCCCCAGTGGGCGGGCGGTGCCGGGCAGGGCCACGAG 300C W R G A A W E P D G A R W P G D R H E. . . . . .301 TGGCACCCACCACGGGAGGCGCCGCTCCTCAAGCCAGGGCCAGTCTTAGGTCAACTGCCT 360G H T T G E A A L L E T G T L I W N V S. . . . . .361 GGTGTCTACCACCCACTAGCTCGCCTACCACGGGGGCTCCAGCAGCTTCTCGGCCCGCTA 420W L H H T I S R I T G G L D D F L R A I. . . . . .421 GAGCCTGAACGGGGCCCGGTCTGGGGTGAACCCCTTCTTCTTCTGGCGCAGGAGCCGCTT 480E S K G R A L G W K P F F F V A D E A F. . . . . .481 CATCAGCTAGCGCCCCCACGGCAGCGACGGCTGCGGCGGCAACAGCTTGCGGAACTTCAT 540Y D I A P T G D S G V G G N D F A K F Y. . . . . <orfup2541 GCGCCACTACTGGCGGAACGCGACGAGCAGGCAGTATGGCCGGCTACGGTGCCTGTACTT 600A T I V A K R Q E D T M G A S A V S M. . . . . .601 TGCTGGAGGTCTCTAAGGCCCACCGACACGACCCCGACGCCTTCCCCACAGGGGGCGCTT 660
. . . . . .661 CCTGCCGCCTGCGGCGCCTGCGGCGCCGGCAGAGGGGCCGCCTGCCCAGGGTCGCAGGAC 720. . . . . .721 CTCTCCCGAACCGCCGCCGAACTGCGGCACGACAGGGCGCCGAACGCCTTGCGCTTCATG 780. . . . . .781 GCCGGTCGCATGCCCGCAACGTGGCCTGCACATGCGGCCAGCCCTGGGGAGCATGGGGGC 840. . . . . .841 CTCGGCCGGCTGGGGCCGCCGAGGCCCCCATGCCTGCGCGGCCTGGCCGGGCTCGCTCGG 900. . . . . .901 CCTGCCCAGCCTGCCACGCGCACCAAGGCCACACAGCCTGTCGAGCCTGCCTGGCCTGCC 960. . . . . .961 ACGCGCACCAAGGCCACACAGCCTGTCGAGCCTGCCCAGCCTGCCACGCGCACCAAGGCC 1020. . . . . .1021 GTGCGGCCTGCCCAGTCAACGGCTAGTACCGCTCGTTACGGCCCCACATGGCGAGGGGCC 1080* N G I M A L L A P T Y R E G. . . . . .1081 TGTGGCCCACCCTCTAGCGCCGGCAGTGGAGGCGCTCCCTGGCCAGCAGGTCGGCCTAGC 1140S V P H S I A A T V E A L S R D D L R I. . . . . .1141 TCCGCCGCCGCTCTAACAGGCGCTCTACCCGGCCCAAGCGCCACGGGCCCTAGCCCTGCT 1200S A A A L N D A L H A P N A T G P I P V. . . . . .1201 GCAGGAGCGGGGCCACCACGTCGGTCCGCTCGCGCTCGACACGGTCCCAGTCGGGGTCTG 1260V D E G R H H L W A L A L Q A L T L G L. . . . . .1261 GCAGGCGCTGGCCCGCGTCGGCCACGTCGTTGCTCGCCAACGCGCGCTCCCGGCCTCGCG 1320G D A V P R L R H L L S R N R A L A P A. . . . . .1321 ACTTGGCCCCGACCGGGGCCGCCTTCAGGAGCAGGGGGTCTAGCAGCCACCACGCCTACC 1380S F R P Q G R R F D E D G L D D T T R I. . . . . .1381 ACGGCCACTCTTTTGGGGCAGGGTCTCCCCGCATTCGCTGCTAGGGCTAGGGGTCGAGGG 1440T G T L F G R G L P A Y A V I G I G L E. . . . . .1441 CCGTCTGCCCGTGGTGGAGCAGGAGCTAGGGCGCGCTGGTGTCCGAGGTGAGCGAGACGT 1500R C V P V V E D E I G R S W L S W E S Q. . . . . .1501 GGCGGCAGTGGCCCACGTGGCGCAGGCGGGCCGCGTCGCACCGGCGCCTCCCGAGCCTCT 1560V A T V P H V A D A R R L T A A S P E S
. . . . . .1561 CTGGCTCGGACGCCTGGAACGGGAGCGCGTGGTCGAGCCGGTGGCGTGGGTGCCAGAGGA1620L G L R R V K G E R V L E A V A G V T E. . . . . .1621 GCTAGCCGTGGCGGCCCAGGCAGGTCACGACCATCATGTCCAGCTACGCCAGCCACGGCT1680E I P V A P D T W H Q Y Y L D I R D T G. . . . . .1681 CTGCTGCGTCCCTGGCAAGCGTCCGGCGCGCCTGCATCCTGCCGAGCGGCGTGTTCGGGA1740L R R L S R E C A A R V Y S P E G C L G. . . . . .1741 CCCTCCGCGGCAGCCTGCTCGCGTGGTACGGCTTGAACCACCGCTAGTCGTGGAGCAGGG1800Q S A G D S S R V M G F K T A I L V E D. . . . . .1801 CCGCCGGGCGCTGGCGGGCAGGCTCGTCGAGGAGTGGCCGCGGCTCGGGGACCTGCAGCC1860R R G A V A R G L L E E G A G L G Q V D. . . . . .1861 GCCACAGGTCGTCCCACTGGGGCCGCAGCTGCCGCCGCGCCTACCACCGGCAGCGGGCCC1920A T D L L T V G A D V A A R I T A T A R. . . . . .1921 GCGCCAGGCCCGCAGGCATCTTCAGCCACCAGCCGTCCGTCGGCTCGGGGACCCGTGACT1980A R D P R G Y F D T T P L C G L G Q A S. . . . . .1981 GGCCTTCCAGGGCGTCCCGCGCCTGGCCGCCTGCGCCTTGGCGCCGCCTGTGCCTTGGCC2040V P L D R L A R V P P R P V A A S V S G. . <orfup1 . . .2041 CCGGGGACTCGGGCGGAGAGCGGGACATACGGAACCTCCACAGGCGGAGCCGGGAACGGG2100GGCCCCTGAGCCCGCCTCTCGCCCTGTATGCCTTGGAGGTGTCCGCCTCGGCCCTTGCCCA P S E P P S R S M. . . . . .2101 ACGAGGGCGAGGACGGGACGGAACGAAGGAGAGGACGGGACGGACAGCACGGACGGGACG2160TGCTCCCGCTCCTGCCCTGCCTTGCTTCCTCTCCTGCCCTGCCTGTCGTGCCTGCCCTGC. . . . . .2161 GACGGAACGGAGTCGGGAACCGGGGGGGGTGACCGGAACCGGGCCGTCCTTGGCCCTCCC2220CTGCCTTGCCTCAGCCCTTGGCCCCCCCCACTGGCCTTGGCCCGGCAGGAACCGGGAGGG. . . . . .2221 CCGTCCTCCCCGCCATCCGCCGTTCTCCCCCGTTCCCTCTCCCGTCCTCCAGCCAACACC2280GGCAGGAGGGGCGGTAGGCGGCAAGAGGGGGCAAGGGAGAGGGCAGGAGGTCGGTTGTGG
. . . . . .2281 GCCGCCCTTTCCAAGCGCTTGACACGGCACCGACAGCCGCCGCCGGGCGCCCGATGGGGA 2340CGGCGGGAAAGGTTCGCGAACTGTGCCGTGGCTGTCGGCGGCGGCCCGCGGGCTACCCCT. . . . . .2341 CCCGTGCCCGCCGGTGAGCGGCGGTGAGCGCCGGTACGGGACCCCACGCGCCGCCGCCCG 2400GGGCACGGGCGGCCACTCGCCGCCACTCGCGGCCATGCCCTGGGGTGCGCGGCGGCGGGC. . . . . .2401 GGCGCCCGCCAGGGCCCGCGCGGCCACCCCGGCCCGCCCCGGCCGGAGCGGCGATCCGGG 2460CCGCGGGCGGTCCCGGGCGCGCCGGTGGGGCCGGGCGGGGCCGGCCTCGCCGCTAGGCCC. . . . . .2461 CCGCTCGCTGCAAGAGGAACATCCACAGCCGCACAAGGAGCGCTCCGCACAGTGGGCACC 2520GGCGAGCGACGTTCTCCTTGTAGGTGTCGGCGTGITCCTCGCGAGGCGTGTCACCCGTGG. . . . . .2521 ACGTCCGCCCCGTCCCCCACACCGTGGCCGGTCCCCACCGGACAGCACAGCACCGCACAG 2580TGCAGGCGGGGCAGGGGGTGTGGCACCGGCCAGGGGTGGCCTGTCGTGTCGTGGCGTGTC. . . . . .2581 CACCACATCGCACGGCACAGCACAGCACCACCGGCACGAGGAACCAAGGAAAGGAACCAC 2640GTGGTGTAGCGTGCCGTGTCGTGTCGTGGTGGCCGTGCTCCTTGGTTCCTTTCCTTGGTGcas1>
M T S V D C T A Y G P E L R A L A A2641 ACCACCATGACCTCAGTGGACTGCACCGCGTACGGCCCCGAGCTGCGCGCGCTCGCCGCC 2700TGGTGGTACTGGAGTCACCTGACGTGGCGCATGCCGGGGCTCGACGCGCGCGAGCGGCGG. . . . . .2701 CGGCTGCCCCGGACCCCCCGGGCCGACCTGTACGCCTTCCTGGACGCCGCGCACACAGCC 2760R L P R T P R A D L Y A F L D A A H T A. . . . . .2761 GCCGCCTCGCTCCCCGGCGCCCTCGCCACCGCGCTGGACACCTTCAACGCCGAGGGCAGC 2820A A S L P G A L A T A L D T F N A E G S. . . . . .2821 GAGGACGGCCATCTGCTGCTGCGCGGCCTCCCGGTGGAGGCCGACGCCGACCTCCCCACC 2880E D G H L L L R G L P V E A D A D L P T. . . .NcoI . .2881 ACCCCGAGCAGCACCCCGGCGCCCGAGGACCGCTCCCTGCTGACCATGGAGGCCATGCTC 2940T P S S T P A P E D R S L L T M E A M L. . . KpnI. . .2941 GGACTGGTGGGCCGCCGGCTCGGTCTGCACACGGGGTACCGGGAGCTGCGCTCGGGCACG 3000
G L V G R R L G L H T G Y R E L R S G T. . . . . .3001 GTCTACCACGACGTGTACCCGTCGCCCGGCGCGCACCACCTGTCCTCGGAGACCTCCGAG 3060V Y H D V Y P S P G A H H L S S E T S E. . . . . .3061 ACGCTGCTGGAGTTCCACACGGAGATGGCCTACCACCGGCTCCAGCCGAACTACGTCATG 3120T L L E F H T E M A Y H R L Q P N Y V M. . . . . .3121 CTGGCCTGCTCCCGGGCCGACCACGAGCGCACGGCGGCCACACTCGTCGCCTCGGTCCGC 3180L A C S R A D H E R T A A T L V A S V R. . . . . .3181 AAGGCGCTGCCCCTGCTGGACGAGAGGACCCGGGCCCGGCTCCTCGACCGGAGGATGCCC 3240K A L P L L D E R T R A R L L D R R M P. . . . . .3241 TGCTGCGTGGATGTGGCCTTCCGCGGCGGGGTGGACGACCCGGGCGCCATCGCCCAGGTC 3300C C V D V A F R G G V D D P G A I A Q V. . . . . .3301 AAACCGCTCTACGGGGACGCGGACGATCCCTTCCTCGGGTACGACCGCGAGCTGCTGGCG 3360K P L Y G D A D D P F L G Y D R E L L A. . . . . .3361 CCGGAGGACCCCGCGGACAAGGAGGCCGTCGCCGCCCTGTCCAAGGCGCTCGACGAGGTC 3420P E D P A D K E A V A A L S K A L D E V. . . . . .3421 ACGGAGGCGGTGTATCTGGAGCCCGGCGATCTGCTGATCGTCGACAACTTCCGCACCACG 3480T E A V Y L E P G D L L I V D N F R T T. . . . . .3481 CACGCGCGGACGCCGTTCTCGCCCCGCTGGGACGGGAAGGACCGCTGGCTGCACCGCGTC 3540H A R T P F S P R W D G K D R W L H R V. . . . . .3541 TACATCCGCACCGACCGCAATGGACAGCTCTCCGGCGGCGAGCGCGCGGGCGACGTCGTC 3600Y I R T D R N G Q L S G G E R A G D V VA F T P R G * SacI . . . .3601 GCCTTCACACCGCGCGGCTGAGCTCCCGGGTCCGACACCGCGCGGCTGAACCCACGGTCC 3660CGGAAGTGTGGCGCGCCGACTCGAGGGCCCAGGCTGTGGCGCGCCGACTTGGGTGCCAGG. . . . . .3661 GGGGCCCACGGTCCGGCACCGCGCGGCTGAGCCCCCGGGTCCGGCAGCGGGCGGCTGAAC 3720CCCCGGGTGCCAGGCCGTGGCGCGCCGACTCGGGGGCCCAGGCCGTCGCCCGCCGACTTG. . . . . .3721 CCCCGCCCCGGGCCACCGCCCGACCGCCCCCGCGCACCGGACGCGCCCGCCTGTACGGCG 3780GGGGCGGGGCCCGGTGGCGGGCTGGCGGGGGCGCGTGGCCTGCGCGGGCGGACATGCCGC. . . . . .3781 GTCCCGCCCGGGCCCGTACACCTGAAGCGCCCGGCGGACCGCCGCCCCGCCGGGGGACGG 3840CAGGGCGGGCCCGGGCATGTGGACTTCGCGGGCCGCCTGGCGGCGGGGCGGCCCCCTGCC----------------><----------------. .3841 ACAGAGCCGGGTGCGGGAGGACGTCCTCCCGCACCCGGCTCCCACCGTTCCGCACCGACC 3900TGTCTCGGCCCACGCCCTCCTGCAGGAGGGCGTGGGCCGAGGGTGGCAAGGCGTGGCTGG. . . . . .3901 GCACCCGACCGTGCCGCAGGCGCCACCGGCACCGCACCGCCCGCGCCGGCAGCCACCACA 3960CGTGGGCTGGCACGGCGTCCGCGGTGGCCGTGGCGTGGCGGGCGCGGCCGTCGGTGGTGT. . . . . .3961 GGCGCCACGCCGCCCGCACGGTGCCCGCGCTGCTCAGCCCCCGTCCACCGGGCTGTCCAG 4020CCGCGGTGCGGCGGGCGTGCCACGGGCGCGACGAGTCGGGGGCAGGTGGCCCGACAGGTC* G G D V P S D L. . . . . .4021 GTCGGCGGCGTCGCGCGGGGGCTACTTGAGGGCCAGCCGCCGGCTGGGGGGCCTGGGGCG 4080L R R L A G G I F E R D A A S G G S G A. . . . . .4081 CTCTACGGGGGTGTGAGGGCCCTAGTGGAGGTCGCTCCGTATGCCGTCGTCTAGCCGGTG 4140L H G W V G P I V E L S A Y P L L D A V. . . . . .4141 GGCGAAGAGCAGGAGCTGCCGCTTTGTGTGCAGGTCCCGCGGGCCGTCGTGGTGCCGGGC 4200R K E D E V A F C V D L A G P L V V A R. . . . . .4201 GCGGCACTGCCTCCGGTCGCGGCGGAGCTGCGAGGGGGGCCGGGGCCCACAGCGGGGGTG 4260A T V S A L A A E V S G G A G P T A G V. .NcoI . . . .4261 TAGGCACAAGAGGGTCCACGCGTGGTACCACTCGTCTAGGCGCCGCGGCCCGGGCCTCTC 4320D T N E W T R V M T L L D A A G P G S L. . . . . .4321 CTTCTGGACGAGGGTCTTCGGCCACTCCATGAGGAGCGCCCACCGCTTTGGGTCGAGGGC 4380F V Q E W F G T L Y E E R T A F G L E R. . . . . .4381 CACCCGTGCCGCCCGGGTCTTCCTTGCGCTCCAGGGGGTGGGCCGCTTGTGGGCCGGGCG 4440H A R R A W F S R S T G W G A F V R G A. . . . . .4441 GCGGAAGGCGGGGGCGAGGGGCCGCAGCCGCGACTCGCGGCGCCGGTCTGGCCTGTCGTC4500A K R G R E G A D A S L A A A L G S L L. . . . . .4501 CTGGTCCGACACGCCCGACGAGTGGCCGCGGGGCGTCTAGCCCCGCTAGGCCGCGTGGTA4560V L S H P S S V P A G C I P A I R R V M. . . . . .4561 GGGGCCTACGCTGTGCCGGGTGACCATCCGCACCCGGCGCGGGTAGCTGGTCGGGCACTG4620G P H S V A W Q Y A H A A G M S W G T V. . . . . .4621 GTCCCGGTCAAGGGCATGGGGGTCGAGGAGCCACTCGTCGGCCACGACGCGGCGCTGTAA4680L A L E R V G L E E T L L R H Q A A V N. . . . . .4681 CAGGACGCCTCACTAGTCGCCTTTCGCCCTGGGGCTGCCCACCAACGGCCCGCTCGACCT4740D Q P T I L P F R S G S P H N G P S S S. . . . . .4741 CTGGGGCAACGGCTTCTCAGGCCGCCACTGCTGCGTCATGGCGGCCCACAGGTCGCCGTC4800V G N G F L G A T V V C Y R R T D L P L. . . . . .4801 GGGGCGTGGCTAGTCGGTCAGCATGGGCCACACCAGGGCCGGCTTCTTGCTGCCTGTCTC4860G A G I L W D Y G T H D R G F F S P C L. . . . . .4861 GTGGTGCAAGCAGGGCAGCCGCAAGCCGCACGGCATGTACCGCATTGGCTAGGCCCGCAG4920V V N T G D A N P T G Y M A Y G I R A D. . . . . <orfdwnl4921 GGCGTCCTGGAGGGGCAGGTCGTTGCCGTCAAGCAGCTAGAGCTTATACGCCGTAAGGTG4980R L V E G D L L P L E D I E F I R C E M. . . . . .4981 GCGACTGGAGGAACAAGCTAGGGGGGCCTGTTGTCCAGCCAGCACCGGCCTCTGAGTCTC5040. . . . . .5041 GGTCAACCCCCGCTAGAGCCACCGGGTGTCGAGGTCCGACGCGTCGACCTGTAGCACGCC5100W N P A I E T A W L E L S R L Q V D H P. . . . . .5101 CTAGTCGGGCCTCATGACCGTGACCTCGTCTATGAGGCCTAGCACGGCGAGGTGGTCGAA5160I L G S Y Q C Q L L Y E P D H R E V L K. . . . . .5161 GAGCTAGTACGCCAACTACAGCAGGCCCCACGGCTGGGTGAGGTCGGGGGCCAGCTGGTC5220E I M R N I D D P T G V W E L G R D V L
. . . . . .5221 CCAGAACATCAGGCTCGGCTAGCCTGGGCAGAGCGGCCAGCGCGCGTCGCGGAGCCACTT 5280T K Y D S G I P G T E G T A R L A E T FNcoI . . . . . .5281 CGGGTACCCCGGCTTGGTCAAGAGCTTCTACTTCGGCGGCGGCGCCCTGCGGGTCACCAC 5340G M P G F W N E F I F G G G R S A W H H. . . . . .5341 CCGGAGCGGCCTCAGGGCCCTCTGGTCCTGCAGGAAGTAGIGGGGCTGGGCGAGCGGGGC 5400A E G S D R S V L V D K M V G V R E G R. . . . . .5401 GGCGTCCCACGGCACCGGGCGGCGGAGCCGGAGGAGGGCCATCTACAGGTAGTCGGCCCG 5460R L T G H G A A E A E E R Y I D M L R A. . . . . .5461 CTGCTAGACCAGCAGCCACAAGTAGTCCTAGCCGTGGTGCGGGAGGGCCCGTGTCTTGGC 5520V I Q D D T N M L I P V V G E R A C F R. . . . . .5521 CTTGCACAGGAGTGACTTCGACTTGCCGACCTTCTGCCCGCCCACCCCCGCGACCATCCC 5580F T D E S F S F P Q F V P P H P R Q Y P. . . . . .5581 GAACCCGCGCTACGGGTGGAGCGCCTACTGCGGCAAGAGCAGCTCCGGGGCCGGCATCGC 5640K P A I G V E R I V G N E D L G R G Y R. . . . . .5641 CGCGTGGCGGAGCATCCCCTTGAGGTCCAGGCCGTGGCCCTAGCAGGTGACGAGGGGCCT 5700R V A E Y P F E L D P V P I T W Q E G S. . . . . .5701 CACCCACTTGCAGAGCCAGCAGGTGCGGAAGAACTACTAGAGGGTCACGAGGAGCTTCTC 5760H T F T E T T W A K K I I E W H E E F L. . . . . .5761 CCGTGCTAACGCGGCCAGGGCGAGGGGCCGCAGCCTGTCCCACGGCGGCTGGGGCATGTG 5820A R N R R D R E G A D S L T G G V G Y V. . . . . .5821 GACGGGGTACTACAGCCGGGTCGCGAAGACCTTGGGCGCGCGCTAGGGCTGCTTCCGCGC 5880Q G M I D A W R K Q F G R A I G V F A R. . . . . .5881 CGGGGCCCAGTACACCAGCTCGTAGCGGTCTAGGAGCCGGTCGGCGTCGCCTAACACGTC 5940G R T M H D L M A L D E A L R L P N H L. . . . . .5941 GCCGTCCTGCAACCGGTAGACCGGCTGGGCCTACACGGCCCAGACGTACGGCTCCATCTC 6000
P L V N A M Q G V R I H R T Q M G L Y L. . . . . .6001 GGGGTCGTACTAGCCCAACAACCTCTGGAGCTTTGGGAGCCACACCTTCACCACGAGCCA6060G L M I P N N S V E F G E T H F H H E T. . . . . .6061 CTTCCTGTCAGGGGTCATCGGCTCAAGCAGCCGGCGGACGCGGACGGCCCACTCGACGGC6120F S L G W Y G L E D A A Q A Q R T L Q R. . . . . .6121 CTCGTACAAGACCATCAAGACGCCTAACTGGGGGCGGTATGGGGCGACCTGGACGCGTAC6180L M N Q Y N Q P N V G A M G R Q V Q A H. . .<orfdwn2 . .6181 ACTGCCGACCGTTGGCAGATAGAAGAGAATGGACTTCACCCTGGCTCCTCCGGTTCGCGG6240TGACGGCTGGCAACCGTCTATCTTCTCTTACCTGAAGTGGGACCGAGGAGGCCAAGCGCCS G V T P L Y F L I S K M. . . . . .6241 CGCCCTCCATTGACGTGCGCCGAAAGCGGCTCGACCGTCCCACTCCGCCCTTGAGTTCCG6300GCGGGAGGTAACTGCACGCGGCTTTCGCCGAGCTGGCAGGGTGAGGCGGGAACTCAAGGC. . . . . .6301 TCTGACGCCGCGCCAGTCGGCGGGCCGTCCGCCGGGGTGCCCGCCGGGGTCCGCACCCGC6360AGACTGCGGCGCGGTCAGCCGCCCGGCAGGCGGCCCCACGGGCGGCCCCAGGCGTGGGCG. . . . . .6361 CGGACGGCACGGCGCGCACCGCGCGCGCGGCGCTTCGGGGCACCGGGCTCGACGGGGTGC6420GCCTGCCGTGCCGCGCGTGGCGCGCGCGCCGCGAAGCCCCGTGGCCCGAGCTGCCCCACG. . . . . .6421 TCAGCGGGACGTCCAACGGAAGGCAAGCCCCCGTACCCAGCCTGGTCAAGGCGCTCATCG6480AGTCGCCCTGCAGGTTGCCTTCCGTTCGGGGGCATGGGTCGGACCAGTTCCGCGAGTAGCorfdwn3>
. . . . . M P G6481 CCATTCCCTGAGGAGGTCCCGCCTTGACCACAGCAATCTCCGCGCTCCCGACCGTGCCCG6540GGTAAGGGACTCCTCCAGGGCGGAACTGGTGTCGTTAGAGGCGCGAGGGCTGGCACGGGC. . . . . .6541 GCTCCGGACTCGAAGCACTGGACCGTGCCACCCTCATCCACCCCACCCTCTCCGGAAACA6600S G L E A L D R A T L I H P T L S G N T. . . . . .6601 CCGCGGAACGGATCGTGCTGACCTCGGGGTCCGGCAGCCGGGTCCGCGACACCGACGGCC6660A E R I V L T S G S G S R V R D T D G R. . . . . .6661 GGGAGTACCTGGACGCGAGCGCCGTCCTCGGGGTGACCCAGGTGGGCCACGGCCGGGCCG 6720E Y L D A S A V L G V T Q V G H G R A E. . . . . .6721 AGCTGGCCCGGGTCGCGGCCGAGCAGATGGCCCGGCTGGAGTACTTCCACACCTGGGGGA 6780L A R V A A E Q M A R L E Y F H T W G T. . . . . .6781 CGATCAGCAACGACCGGGCGGTGGAGCTGGCGGCACGGCTGGTGGGGCTGAGCCCGGAGC 6840I S N D R A V E L A A R L V G L S P E P. . . . . .6841 CGCTGACCCGCGTCTACTTCACCAGCGGCGGGGCCGAGGGCAACGAGATCGCCCTGCGGA 6900L T R V Y F T S G G A E G N E I A L R M. . . . . .6901 TGGCCCGGCTCTACCACCACCGGCGCGGGGAGTCCGCCCGTACCTGGATACTCTCCCGCC 6960A R L Y H H R R G E S A R T W I L S R R. . . . . .6961 GGTCGGCCTACCACGGCGTCGGATACGGCAGCGGCGGCGTCACCGGCTTCCCCGCCTACC 7020S A Y H G V G Y G S G G V T G F P A Y H. . . . . .7021 ACCAGGGCTTCGGCCCCTCCCTCCCGGACGTCGACTTCCTGACCCCGCCGCAGCCCTACC 7080Q G F G P S L P D V D F L T P P Q P Y R. . . . . .7081 GCCGGGAGCTGTTCGCCGGTTCCGACGTCACCGACTTCTGCCTCGCCGAACTGCGCGAGA 7140R E L F A G S D V T D F C L A E L R E T. . . . Sau7141 CCATCGACCGGATCGGCCCGGAGCGGATCGCGGCGATGATCGGCGAGCCGATCI D R I G P E R I A A M I G E P I
權利要求
1.包含一種或多種基因的DNA，所述基因為帶小棒鏈霉菌中5S棒烷生物合成所特有的，并且對5R棒烷生物合成不是必需的。
2.按照權利要求1、如圖1(SEQ ID No.1)鑒定的DNA。
3.按照權利要求1的DNA，所述DNA具有在圖1中顯示的、如orfup3、orfup2、orfup1、orfdwn1、orfdwn2或orfdwn3(SEQ ID No.2-7)的序列或大致的序列。
4.按照權利要求1的DNA，所述DNA具有在圖1中顯示的、如orfup1(SEQ ID No.4)的序列或大致的序列。
5.在嚴格性強的條件下、同權利要求1至4中任何一項的DNA雜交的DNA。
6.包含權利要求1至5中任何一項的DNA的載體，其中一種或多種5S棒烷生物合成特有的基因已經被破壞或成為缺陷型。
7.按照權利要求6包含一種或多種缺陷基因的載體，所述載體是pCEC060、pCEC061、pCEC056、pCEC057或pDES3。
8.按照權利要求7的載體，所述載體是pCEC061或pDES3。
9.包含權利要求6至8中任何一項的載體的宿主。
10.按照權利要求9的宿主，所述宿主能夠產生增加水平的棒酸。
11.按照權利要求9或10的宿主，所述宿主能夠產生低水平的5S棒烷或不能產生5S棒烷。
12.按照權利要求9至11中任何一項的宿主，所述宿主是帶小棒鏈霉菌。
13.包含對應于casl側翼可讀框的DNA的帶小棒鏈霉菌，所述DNA已經被破壞或成為缺陷型。
14.按照權利要求13的帶小棒鏈霉菌，其中所述可讀框是orfup3、orfup2、orfup1、orfdwn1、orfdwn2或orfdwn3。
15.在合適的微生物中提高5R棒烷產量的方法，所述方法包括在所述微生物中操作在權利要求1至5中任何一項定義的DNA及其內含物。
16.按照權利要求15的方法，其中所述合適的微生物是帶小棒鏈霉菌。
17.在帶小棒鏈霉菌中提高5R棒烷產量的方法，所述方法包括破壞cas1側翼的DNA區(qū)域或使其產生缺陷。
18.按照權利要求15、16或17的方法，其中所述DNA對應于可讀框orfup3、orfup2、orfup1、orfdwn1、orfdwn2或orfdwn3。
19.按照權利要求15至18中任何一項的方法，其中所述DNA對應于可讀框orfup1。
20.按照權利要求15至19中任何一項的方法，其中所述5R棒烷是棒酸。
21.用于鑒別適于高產5R棒烷的微生物的方法，所述方法包括初步篩選低產或不產生5S棒烷的微生物。
22.按照權利要求21的方法，其中所述微生物是帶小棒鏈霉菌。
23.按照權利要求21或22的方法，其中所述5R棒烷是棒酸。
24.按照權利要求21至23中任何一項的方法，其中一種或多種5S棒烷生產所特有的基因是缺陷型。
25.通過權利要求15至24中任何一項的方法可獲得的微生物，所述微生物能夠產生5R棒烷，且低產或不產5S棒烷。
26.通過權利要求25的方法可獲得的微生物，所述微生物能夠產生棒酸，但其不產生棒烷-2-羧化物和/或2-羥甲基棒烷。
27.通過權利要求15的方法獲得的微生物，所述微生物是菌株56-1A、56-3A、57-2B、57-1C、60-1A、60-2A、60-3A、61-1A、61-2A、61-3A或61-4A。
28.由權利要求25或26中定義的微生物發(fā)酵可獲得的棒酸。
29.按照權利要求28的棒酸，所述棒酸不含棒烷-2-羧化物。
30.按照權利要求28、以其鉀鹽形式存在的棒酸。
31.不含任何5S棒烷的棒酸。
32.不含任何棒烷-2-羧化物的棒酸。
33.包含與β-內酰胺抗生素組合的、按照權利要求30的棒酸鉀的組合物。
34.按照權利要求33的組合物，其中所述β-內酰胺抗生素是阿莫西林。
35.用于制備包含棒酸鉀和阿莫西林的組合物的方法，所述方法包括由按照權利要求25的微生物產生棒酸，以及隨后將所述棒酸轉化成鉀鹽，并將所述鉀鹽和阿莫西林組合。
全文摘要
用于提高5R棒烷生產的新細菌基因、微生物和方法,所述5R棒烷例如棒酸。
文檔編號C12N15/74GK1251612SQ98803747
公開日2000年4月26日 申請日期1998年2月2日 優(yōu)先權日1997年2月4日
發(fā)明者B·巴頓, J·P·格里芬, R·H·莫舍, A·S·帕拉德卡, S·詹森, C·安德斯 申請人:史密絲克萊恩比徹姆有限公司, 艾伯塔大學校董