24個y染色體str基因座的熒光復(fù)合擴增試劑盒及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種24個Y染色體STR基因座的熒光復(fù)合擴增試劑盒，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，該試劑盒能同時擴增分析STR基因座DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643，本發(fā)明采用四色熒光標(biāo)記，擴增產(chǎn)物大小在100-400bp之間，操作簡單，并提供了很高的累計個體識別力和累積非父排除率。
【專利說明】
24個Y染色體STR基因座的熒光復(fù)合擴增試劑盒及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)計檢測人體基因組中的短串聯(lián)重復(fù)序列基因座 多態(tài)性，具體地，本發(fā)明設(shè)計24個Y染色體STR基因座的熒光復(fù)合擴增試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前DNA檢測技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于法醫(yī)DNA分析、親緣關(guān)系鑒定、細胞系鑒定、醫(yī) 學(xué)遺傳學(xué)、人類學(xué)等領(lǐng)域。而應(yīng)用最廣泛的DNA分析即為遺傳標(biāo)記的分析，多數(shù)的DNA分析 方法的核心技術(shù)在于片段長度多態(tài)性和序列多態(tài)性的分析。
[0003] 近年來，隨著短串聯(lián)重復(fù)序列的發(fā)現(xiàn)與技術(shù)發(fā)展使其成為目前應(yīng)用最廣泛的DNA 分析技術(shù)。在大多數(shù)的案件中，由于其在人群中的高度遺傳多樣性，常染色體STR基因座被 廣泛應(yīng)用，然后Y染色體由于其特殊的非重組性質(zhì)，使其可以應(yīng)用于同一父系關(guān)系的親緣 關(guān)系研究。
[0004] 人類Y染色體特異的短串聯(lián)重復(fù)序列即Y_STR(short tandem repeat, STR)，為人 類男性所特有，按父系單倍型遺傳，在法醫(yī)學(xué)親子鑒定和個體識別、人類種群學(xué)、類起源和 進化研究中具有獨特的應(yīng)用價值，在無創(chuàng)傷性產(chǎn)前基因診斷的研究工作中也具有重要應(yīng) 用前景。Y染色體在很多案件的應(yīng)用中具有其特殊的價值，如在性侵案件中，男性DNA樣本 中常?；煊泻芏嗯訢NA樣本，Y染色體STR的可以特異性地從混合樣本中檢測出，此外，Y 染色體STR可以應(yīng)用于父系親緣關(guān)系的鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明對男性人群的Y-STR基因座的遺傳多態(tài)性進行了深入的研究，并提供了一 種具有改善鑒別能力的Y染色體STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴增試劑盒，本發(fā)明所提供的試 劑盒操作簡單、快速，系統(tǒng)多態(tài)性高，均衡性好，靈敏度高，可以應(yīng)用在法醫(yī)鑒定及親子鑒定 等領(lǐng)域中。
[0006] 24個Y染色體STR基因座的熒光復(fù)合擴增體系，包括24對特異性引物，能同時擴 增 24 個 Y 染色體 STR 基因座：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、 DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、 DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643,所述 24 對特異性引物見下表如述：
[0007]
[0008]

[0010] 所述特異性引物的濃度分別為：
[0011]


[0014] 所述擴增體系中的被擴增位點分別由四種顏色的熒光標(biāo)記，相同熒光標(biāo)記視為 同一組，五組組合分別為：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4 為第一組； DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533 為第二組；DYS456、DYS389I/II、DYS390、 DYS438、DYS576 為第三組；DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643 為第四組。
[0015] 所述第一組米用FAM標(biāo)記，第二組米用HEX標(biāo)記，第二組米用TAMRA標(biāo)記，第四組 采用R0X標(biāo)記，所述熒光標(biāo)記位于特異性引物對中其中一條引物的5'端。
[0016] 所述擴增體系中還含有基因座的等位基因標(biāo)準物。
[0017] 所述等位基因標(biāo)準物采用橙色標(biāo)記物0RG標(biāo)記。
[0018] -種試劑盒，包括上述任一擴增體系。
[0019] 上述擴增體系或試劑盒在法醫(yī)DNA分析、親子鑒定中的應(yīng)用，所述應(yīng)用為采用上 述擴增體系或試劑盒用于檢測DNA樣本。
[0020] 所述DNA樣本來源于血液、血痕、唾液、精液、精斑、體液、毛發(fā)、肌肉以及其他組織 器官。
[0021] 所述DNA樣本采用Chelex-100提取法、磁珠提取法、試劑盒提取法、酚氯仿提取法 而得到。
[0022] 本發(fā)明的技術(shù)方案的設(shè)計思路：
[0023] (一）Y染色體STR基因座的確定
[0024] 本發(fā)明共調(diào)查了 35個Y染色體STR基因座在男性人群中的遺傳多態(tài)性，最后確 定了多個具有高度遺傳多態(tài)性的Y染色體遺傳標(biāo)記，包括DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、 DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/ II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643 等 24 個基因座。 這些基因座可以與現(xiàn)在市面上使用較為廣泛的試劑盒兼容，保證了已有DNA數(shù)據(jù)的比對和 交流，在此基礎(chǔ)上增加位點提高了累計個體識別力和累積非父排除率。
[0025] (二）五色熒光標(biāo)記的確定
[0026] 本發(fā)明采用了五色熒光標(biāo)記技術(shù)，將上述24個Y染色體STR基因座分成四組， DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4,采用 FAM 熒光標(biāo)記；DYS460、DYS458、 DYS481、DYS635、DYS448、DYS533，采用 HEX 熒光標(biāo)記；DYS456、DYS389I/II、DYS390、 DYS438、DYS576,采用 TAMRA 熒光標(biāo)記；DYS391、DYS439、DYS437、DYS385a/b、DYS643,采用 R0X熒光標(biāo)記。內(nèi)標(biāo)采用橙色標(biāo)記物0RG標(biāo)記。
[0027] (三）本發(fā)明進一步提供了 24個Y染色體STR基因座的特異性寡核苷酸擴增引物 對：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、 DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、 DYS385a/b、DYS643。
[0028] (四）24個Y染色體STR基因座的等位基因范圍、Genbank登記號、參考序列見下 表：
[0030] 擴增相應(yīng)STR基因座的引物對有一定的序列，這些引物在擴增體系中有一定的濃 度，所述各個引物濃度見下表。
[0031]
[0033] 本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點：
[0034] 本發(fā)明所提供的 DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、 DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、 DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643 這 24 個 Y 染色體 STR 基因座包含了市場上使 用最廣泛的ABI公司的Yfiler的17個位點，在此基礎(chǔ)上又增加了 7個位點，提高了累積個 體識別力和累積非父排除率。
[0035] 本發(fā)明所提供試劑盒與國內(nèi)外試劑盒比較
[0036]
[0037]
[0038] 本發(fā)明采用四色熒光標(biāo)記，擴增產(chǎn)物大小在100_400bp之間，操作簡單，并提供了 很高的累計個體識別力和累積非父排除率。本發(fā)明所提供的試劑盒操作簡單、快速，系統(tǒng)多 態(tài)性高，均衡性好，靈敏度高，完全能夠滿足個體識別、親緣關(guān)系鑒定以及DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè) 的需要。
[0039] 本發(fā)明的優(yōu)勢
[0040] 1、更高的累積個體識別力和累積非父排除率，應(yīng)用該體系對600個無關(guān)男性個體 進行檢測，共檢測出599個單倍型，個體識別力達到99. 83 %。
[0041] 通過計算得到如下統(tǒng)計學(xué)參數(shù)：HD(單倍型多樣性）=0· 99999165275
[0042] 每個基因座的⑶值
[0045] 所有基因座的累積非父排除率TGD = 1，累積個體識別率和累積非父排除率相等。
[0046] 2、物種特異性強
[0047] 應(yīng)用該體系擴增了包括雞、豬、鼠、貓、狗、兔子、馬、鹿以及大腸桿菌等物種的DNA 樣本，均沒有檢測出特異性擴增峰。
[0048] 3、混合樣本的檢測
[0049] 在男性DNA模板與女性DNA模板的比例達到1:400時，仍能有效檢測出24個Y染 色體STR基因座，無任何基因座丟失。
【附圖說明】
[0050] 圖1男性個體1的DNA檢測圖，
[0051] 圖2男性個體2的DNA檢測圖，
[0052] 圖3牛的DNA檢測圖，
[0053] 圖4羊的DNA檢測圖，
[0054] 圖5雞的DNA檢測圖，
[0055] 圖6魚的DNA檢測圖，
[0056] 圖7男性樣本A的DNA檢測圖，
[0057] 圖8男性樣本B的DNA檢測圖，
[0058] 圖9男性樣本A+女性樣本C的DNA檢測圖，
[0059] 圖10男性樣本B+女性樣本C的DNA檢測圖。
【具體實施方式】
[0060] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明。
[0061] 實施例1
[0062] 1、124個Y染色體STR基因座的選擇、熒光標(biāo)記組合以及引物設(shè)計
[0063] 通過對35個Y染色體STR基因座在男性人群中的遺傳多態(tài)性進行統(tǒng)計學(xué)分析， 確定了包括 DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、 DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、 DYS437、DYS385a/b、DYS643在內(nèi)的24個具有高度遺傳多態(tài)性的Y染色體STR基因座。這 些基因座提高了系統(tǒng)的累積非父排除率和累計個體識別力，能夠更好地滿足法醫(yī)DNA檢測 的技術(shù)要求。
[0064] 將24個基因座分成四組，分別采用FAM、HEX、TAMAR、R0X的熒光染料進行標(biāo)記， 通過反復(fù)多次實驗驗證后，確定最優(yōu)熒光染料組合方案，DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、 DYS549、Y-GATA-H4,采用 FAM 熒光標(biāo)記；DYS460、DYS458、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533， 采用 HEX 熒光標(biāo)記；DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576,采用 TAMRA 熒光標(biāo)記； DYS391、DYS439、DYS437、DYS385a/b、DYS643，采用 R0X 熒光標(biāo)記。
[0065] 針對上述每個基因座設(shè)計一對引物，單對引物進行擴增實驗，確保不會引起非特 異擴增后，24對引物復(fù)合擴增，重新設(shè)計可能引起非特異的引物，直到體系中無非特異擴增 出現(xiàn)，根據(jù)引物對效率的高低調(diào)整復(fù)合擴增體系中引物的濃度。
[0066] 1、2復(fù)合擴增體系中各組分的優(yōu)化
[0067] 基于反應(yīng)體系10ul優(yōu)化體系中酶的含量和Mg2+的濃度進行優(yōu)化，酶含量梯度為 0. 5U、1. 0U、1. 5U、2. 0U，鎂離子濃度梯度為1. 5mM、2. 0mM、2. 5mM、3. OmM，設(shè)計正交實驗，共 16組，最后確定復(fù)合擴增體系中成分的最優(yōu)組合。
[0068] 1、3熱循環(huán)參數(shù)優(yōu)化
[0069] 確定了體系中酶的含量和鎂離子的濃度后，對熱循環(huán)參數(shù)進行優(yōu)化，針對擴增循 環(huán)數(shù)大小進行梯度實驗，27個循環(huán)、29個循環(huán)、31個循環(huán)以及33個循環(huán)四個梯度進行實驗， 確定最優(yōu)擴增循環(huán)數(shù)為31個循環(huán)。退火溫度是在確定了循環(huán)數(shù)后進行優(yōu)化，在31個擴增循 環(huán)數(shù)下，退火溫度分別設(shè)置56 °C、58 °C、60 °C、62 °C、64°C，確定最優(yōu)的退火溫度為60 °C。另 外也可以兼容不同PCR儀之間的溫度差異。
[0070] 1、4確定本發(fā)明推薦使用的反應(yīng)體系和熱循環(huán)參數(shù)
[0071] 反應(yīng)體系
[0073] 熱循環(huán)參數(shù)
[0074]
[0075] 1、5擴增產(chǎn)物的毛細管電泳檢測
[0076] 在檢測前，對產(chǎn)物進行變性處理并與分子量內(nèi)標(biāo)混合，lul產(chǎn)物+0. 5ul分子量內(nèi) 標(biāo)+8. 5ul的HIDI (去離子甲酰胺），混勻后短暫離心，95°C變性5min后立即冰浴lOmin，用 ABI系列遺傳分析儀進行電泳檢測。
[0077] 無關(guān)個體的24個Y染色體STR基因座檢測結(jié)果，男性個體1、男性個體2的檢測圖 見圖1、圖2。
[0078] 實驗例2物種特異性驗證報告 [0079] 實驗?zāi)康模?br>[0080] 測試 Microreader?24Y Direct ID System 的物種特異性
[0081] 1.實驗儀器與試劑
[0082] 1. 1 實驗儀器：9700-金（ΑΒΙ)
[0083] 1. 2實驗試劑：配套BufferB和TaqII、引物混合物（自配）
[0084] 2實驗方法
[0085] 取純凈豬、牛、羊、小鼠、雞、鴨、魚及人類模板各一個。
[0086] 2. 1擴增程序
[0087]
[0088] 2· 2擴增體系
[0089]
[0090] 2.3毛細管電泳：ΑΒΙ 3500檢測（進樣電壓3.0KV，進樣時間4秒），數(shù)據(jù)分析采用 Genemapper ID-X 軟件。
[0091] 3.實驗結(jié)果，見圖3、4、5、6。
[0092] 本發(fā)明的擴增體系作為身份鑒定系統(tǒng)在豬、牛、羊、小鼠、雞、鴨、魚等均不能有效 擴增，只在人類DNA獲得擴增，具有較好的物種特異性。
[0093] 實施例3混合模板擴增能力驗證報告
[0094] 實驗?zāi)康模?br>[0095] 測試Microreader?24Y Direct ID System男女混合模板擴增能力
[0096] 1.實驗儀器與試劑
[0097] 1. 1 實驗儀器：9700-金（ABI)
[0098] 1. 2實驗試劑：配套BufferB和TaqII、引物混合物（自配）
[0099] 2實驗方法
[0100] 純凈男性模板2個編號A，B ;純凈女性模板編號C。A、B與C分別按照1:500的比 例進行混合。
[0101] 2.1擴增程序
[0102]
[0103] 2. 2擴增體系
[0104]
[0105] 2.3毛細管電泳：ABI 3500檢測（進樣電壓3.0KV，進樣時間4秒），數(shù)據(jù)分析采用 Genemapper ID-X 軟件。
[0106] 4.實驗結(jié)果：
[0107] 樣本A基因型見圖7,樣本B基因型見圖8,樣本A+C混合基因型見圖9,樣本B+C 混合基因型，見圖10。
[0108] 本發(fā)明的擴增體系作為身份鑒定系統(tǒng)在男女混合模板中有良好的擴增能力，結(jié)果 穩(wěn)定，不影響分型。
【主權(quán)項】
1. 24個Y染色體STR基因座的復(fù)合擴增體系，包括24對特異性引物，能同時擴增24個 Y 染色體 STR 基因座：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、 DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、 DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643,所述 24 對特異性引物見下表如述：2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合擴增體系，所述特異性引物的濃度分別為：3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合擴增體系，所述擴增體系中的被擴增基因座分別由四 種顏色的巧光標(biāo)記，相同巧光標(biāo)記視為同一組，五組組合分別為：DYS393、DYS570、DYS19、 0￥5392、0￥5549、￥-6414寸4為第一組；0￥5391、0￥5439、0￥5481、0￥5635、0￥5448、0￥5533 為 第二組；DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576 為第S組；DYS460、DYS458、DYS437、 DYS385a/b、DYS643 為第四組。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的復(fù)合擴增體系，所述第一組采用FAM標(biāo)記，第二組采用肥X標(biāo) 記，第=組采用TAMRA標(biāo)記，第四組采用ROX標(biāo)記，所述巧光標(biāo)記位于特異性引物對中其中 一條引物的5'端。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合擴增體系，所述擴增體系中還含有基因座的等位基因標(biāo) 準物。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合擴增體系，所述等位基因標(biāo)準物采用澄色標(biāo)記物ORG標(biāo) 記。7. -種試劑盒，包括權(quán)利要求1-6任一復(fù)合擴增體系。8. 權(quán)利要求1-6任一復(fù)合擴增體系或權(quán)利要求7的試劑盒在法醫(yī)DNA分析、親子鑒定 中的應(yīng)用，所述應(yīng)用為采用權(quán)利要求1-6任一復(fù)合擴增體系或權(quán)利要求7的試劑盒用于檢 DNA樣本。9. 權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述DNA樣本來源于血液、血痕、唾液、精液、精斑、體液、毛 發(fā)、肌肉W及其他組織器官。10. 權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，所述DNA樣本采用化elex-100提取法、磁珠提取法、試劑 盒提取法或酪氯仿提取法而得到。
【文檔編號】C12Q1/68GK105986022SQ201510076934
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月13日
【發(fā)明人】于在亮, 趙洪玉, 付亮劍, 陳初光
【申請人】蘇州閱微基因技術(shù)有限公司