一種人基因組dna34個基因座的復合擴增的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術常染色體和Y染色體分型和鑒定領域，涉及一種PCR擴增試 劑盒，尤其涉及一種單管同時檢測人基因組常染色體及Y染色體基因座的六色熒光標記復 合擴增試劑盒以及該試劑盒在司法鑒定領域中的應用。
【背景技術】
[0002] 短串聯(lián)重復序列（short tandom repeat，STR)是人類基因組中由2-6個堿基作為 核心單位串聯(lián)重復形成的一類具有長度多態(tài)性的DNA序列，其核心單位的數(shù)目變化和重復 次數(shù)不同構成了 STR的遺傳多態(tài)性。STR分布廣，數(shù)目多，約占人類基因組的10%，所包含 的信息量巨大，不同的序列可以產(chǎn)生數(shù)以億計的基因型組合，而每一種組合在群體中出現(xiàn) 的頻率都非常低，具有極高的個體鑒定能力，所以常作為遺傳標記而被用于DNA分析技術 中法醫(yī)個體識別、親緣關系鑒定，同時也是DNA數(shù)據(jù)庫建立的主流技術。同時，STR基因座 的片段小，容易擴增，適宜于檢驗微量和降解檢材，而且各基因座的擴增條件相似而能夠符 合擴增，因而具有靈敏、準確、快速、信息量大等優(yōu)點。由于這些優(yōu)點STR基因座的分型研究 與篩選早已在國內(nèi)外人類學、醫(yī)學遺傳學和法醫(yī)學及各相關領域中得到了廣泛的應用。
[0003] 人類Y染色體是小的近端著絲粒染色體，它由長臂和微小的短臂兩部分組成。Y染 色體，除擬常染色體區(qū)外，在減數(shù)分裂中不發(fā)生交換重組，呈單倍型獨立向下傳遞，表現(xiàn)出 父系遺傳特征，同時序列的變異完全由累積的突變所致，并非重組引起。由于Y染色體的 這些特點，Y染色體STR基因座（Y-STR)遺傳標記作為一種工具已經(jīng)被廣泛應用于法醫(yī)鑒 定、親權鑒定、失蹤人員鑒定、人類迀移進化研究、歷史和家系進化研究等多個領域。已發(fā)現(xiàn) 的Y-STR基因座已有400多個，常用來檢測的Y-STR基因座有9個歐洲最小單倍型基因座， 包括 DYS19、DYS385a/b、DYS389I/II、DYS390、DYS392、DYS393 和 2 個美國 DNA 分析方法技 術工作組（Scientific Working Group on DNA Analysis Methods,簡稱 SWGDAM)推薦的 基因座，包括DYS438、DYS439。
[0004] 在法醫(yī)鑒定與親子鑒定領域，DNA分析主要依賴商業(yè)化的試劑盒進行。首先是國 外的試劑盒發(fā)展歷程，第一個Y-STR試劑盒是由ReliaGene Technologies在2001年研發(fā) 的 Y-PLEX?6,可復合擴增 DYS19、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS393、DYS385a/b ;2002 年 ReliaGene Technologies 又研發(fā)了可符合擴增 DYS389I/II、DYS439、DYS438、DYS392 的 Y-PLEX?5,到 2003 年 9 月 ReliaGene Technologies 推出了整合了 Y-PLEX?6 和 Y-PLEX?5 所有基因座在內(nèi)的Y_PLEX?12。同年10月，Promega公司推出了 PowerPlex Y試劑盒，可 復合擴增 12 個基因座，其中包括 DYS19、DYS385a/b、DYS389I/II、DYS390、DYS391、DYS392、 DYS393、DYS437、DYS438、DYS439。 2〇04 年秋，Applied Biosystems 公司（簡稱 AB 公司） 發(fā)布了包含17個Y-STR基因座的yfiler?試劑盒，其在PowerPlex Y的基礎上增加了另 外5個具有高度多態(tài)性的Y-STR基因座，包括DYS456、DYS458、DYS635、GATA-H4、DYS448。 2012年秋，Promega公司推出了 PowerPlex Y23試劑盒，在兼容了 yfiler?試劑盒的17個 位點外又額外增加了 6個新位點包括DYS549、DYS481、DYS533、DYS570、DYS576、DYS643,進 一步的提高了試劑盒的分辨率。目前PowePlex Y23試劑盒是目前市面上可復合擴增Y-STR 最多的國外試劑盒。國內(nèi)Y-STR試劑盒的發(fā)展相對較晚，目前主要有北京基點認知公司的 Goldeneye 20Y試劑盒，可復合擴增20個Y-STR基因座，除包含yfiler?試劑盒的17個位 點外新增加了 DYS460、DYS447、DYS388。此外還有江蘇中德美聯(lián)公司推出的AGCU Y24STR 熒光檢測試劑盒，包含了 24個Y-STR基因座包括DYS391、DYS389I/II、DYS439、DYS438、 DYS449、DYS456、DYS458、DYS437、DYS635、DYS448、DYS527a/b、GATA H4、DYS447、DYS19、 DYS392、DYS522、DYS393、DYS388、DYS390、DYS385a/b 以及 DYS444。
[0005] 隨著法醫(yī)DNA分型技術的發(fā)展，目前已經(jīng)能對類似血痕、精斑、唾液斑、毛發(fā)、骨骼 等進行DNA分型；同時，隨著PCR技術的發(fā)展，多重擴增體系可檢測的基因座數(shù)量也越來 越多。專利CN101144774公開了一種同時分析人基因組DNA的多個基因座的熒光標記復 合擴增系統(tǒng)，用于檢測如下21個常染色體基因座：TPOX、D3S1358、D5S818、FGA、CSF1P0、 D8S1179、D7S820、TH01、VWA、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D12S391、D19S433、 DlS1656、D2S1338、D6S1043、PentaE、PentaD、AMEL。該專利提供了對 20 個常染色體基因座 和一個性別基因座的分型結果，為五色熒光檢測系統(tǒng)。目前在法醫(yī)檢測中，常染色體分型與 Y染色體檢測一般都是分開的。最多在常染色體檢測中加入了 DYS391。因為DYS391多態(tài) 性差，主要用于輔助性別判定。如果能同時檢測常染色體基因座及多態(tài)性更高的Y染色體 基因座，既能用Y染色體基因座信息用于嫌疑人的快速排查，又能根據(jù)常染色基因座信息 確定嫌疑人。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對以上技術問題，在發(fā)明CNlOl 144774方案的基礎上，選擇了 16 個基因座 AMEL、TP0X、D3S1358、D5S818、FGA、CSF1P0、D8S1179、D7S820、TH01、VWA、 D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、D2S1338、D19S433,這樣使得基因座和 ABI (Applied Biosystems, USA)公司的Identifiler試劑盒基因座一樣，同時加入了 18個Y染色體基因 座其中包含了 ABI (Applied Biosystems，USA)公司的Yfiler試劑盒的17個基因座以及一 個輔助性別判定的Y-indel基因座。
[0007] 本發(fā)明的目的之一在于：提供一種通過復合擴增34個基因座來進行個體識別和 親子鑒定的熒光標記STR復合擴增檢驗系統(tǒng)，同時檢測16個常染色體基因座、18個Y染色 體基因座及一個性別基因座。涉及檢測人基因座中具有多態(tài)性的遺傳標記。
[0008] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用的技術方案為：
[0009] (1)基因座的確定。在專利CN101144774的基礎上，選擇與ABI公司Identifiler 試劑盒相同的16個基因座，通過對這些基因座進行頻率調(diào)查分別計算個體識別能力（DP)、 雜合度⑶、非父排除率（PE)等數(shù)據(jù)，表明在16個STR基因座中，除THOl、ΤΡ0Χ基因座外， 其余各基因座的DP值均接近0. 9, H均大于0. 7, PE值大都在0. 5以上，這表明它們在法醫(yī) 學上有較好的應用價值。保持現(xiàn)有的常染色STR，增加一定個數(shù)的Y-STR，對親緣關系的鑒 定，家系排查，估計可能的人群來源有巨大的作用。此外本發(fā)明同時添加了使用最廣泛的 Yfiler 試劑盒里的 17 個 Y 基因座 DYS456、DYS458、DYS437、DYS439、DYS392、DYS385a/b、 DYS393、DYS391、DYS390、DYS635、DYS438、DYS389I、DYS19、GATA-H4、DYS389II、DYS448。除 DYS391之外其余基因座的基因多樣性（gene diversity,⑶）值均在0. 6以上，DYS391為美 國最新CODIS推薦的基因座。添加 Y基因座的排查能力大大優(yōu)于專利CN101144774。
[0010] (2)確定一種人基因組DNA34個基因座的復合擴增的試劑盒。
[0011] 基于以上基因座的確定，本發(fā)明還提供一種人基因組DNA34個基因座的復合擴增 的試劑盒，本發(fā)明所提供的試劑盒同時包含下列34個STR基因座的特異性寡核苷酸擴增引 物：Y-inde I、DYS456、DYS458、DYS437、DYS439、DYS392、DYS385a/b、DYS393、DYS391、DYS390、 DYS635、DYS438、DYS389I、DYS19、GATA-H4、DYS389II、DYS448、ΤΡΟΧ、