一種高效擴(kuò)增冷凍保存nk細(xì)胞的方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體涉及一種高效擴(kuò)增冷凍保存NK細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。所述方法通過(guò)將融合基因通過(guò)質(zhì)粒進(jìn)行基因重組至AAVS1轉(zhuǎn)座子，并在細(xì)胞擴(kuò)增中間階段引入冷凍/融化步驟至修飾K562細(xì)胞系為基礎(chǔ)的NK細(xì)胞擴(kuò)增步驟；最后進(jìn)行NK細(xì)胞的擴(kuò)增和保存。通過(guò)使用位點(diǎn)特異性基因的整合技術(shù)開(kāi)發(fā)的K562?mbIL15?41BBL?mbIL21細(xì)胞系，通過(guò)具有高的NK細(xì)胞活性，純度和細(xì)胞毒性，實(shí)現(xiàn)高NK細(xì)胞擴(kuò)增效率以提高NK擴(kuò)增；具有極大的市場(chǎng)前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專利說(shuō)明】
一種高效擴(kuò)増冷凍保存NK細(xì)胞的方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體涉及一種高效擴(kuò)增冷凍保存NK細(xì)胞的方法及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人自然殺傷(NK)細(xì)胞是由表達(dá)⑶56和缺乏⑶3(⑶-⑶56+)的天然免疫系統(tǒng)的淋巴 細(xì)胞組成的。NK細(xì)胞具有廣譜的殺傷腫瘤細(xì)胞的功能，能夠通過(guò)細(xì)胞毒性顆粒諸如穿孔素 和顆粒酶，并通過(guò)如死亡受體相互作用，F(xiàn)as-Fas配體結(jié)合和TNF相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體 結(jié)合等機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用。NK細(xì)胞還可以通過(guò)膜受體FcRyIII(CD16)介導(dǎo)抗體依賴性細(xì) 胞毒性(ADCChNK細(xì)胞的靶向識(shí)別和激活通過(guò)抑制和激活NK細(xì)胞表面受體和表達(dá)在靶細(xì)胞 上的相關(guān)配體這個(gè)平衡來(lái)發(fā)揮作用，其允許對(duì)病原體入侵和惡變立即響應(yīng)。這一獨(dú)特的靶 向識(shí)別NK細(xì)胞的機(jī)制不同于主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性T細(xì)胞受體(TCR)的T細(xì)胞 依賴性機(jī)制。因此，使用同種異體NK細(xì)胞來(lái)治療癌癥可能不會(huì)引起移植物抗宿主病(GVHD)。
[0003] 在健康受試者中，NK細(xì)胞大約占外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的5-20%。在過(guò)繼免疫 治療中，大劑量的NK細(xì)胞范圍從5\10~6-5\10~7/1^體重每劑量，最多4劑量?，F(xiàn)有技術(shù)中， 能夠從大量的外周血中富集擴(kuò)增NK細(xì)胞的方法，多數(shù)是借助于使用侵入性白細(xì)胞分離和大 型磁分離裝置，這種方式十分昂貴，并對(duì)患者造成一定風(fēng)險(xiǎn)。另一種流行的NK細(xì)胞療法是使 用飼養(yǎng)細(xì)胞擴(kuò)增NK細(xì)胞，如K562細(xì)胞修飾的膜結(jié)合分子，例如白介素（IL)-15和4-1BB配體 (K562-mbl5-41BBL)。這些飼養(yǎng)細(xì)胞可以迅速地從外周血單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增NK細(xì)胞，使NK細(xì)胞 在第7天平均擴(kuò)增21.6倍，第21天擴(kuò)增277倍。但是，由于衰老導(dǎo)致的端粒酶縮短，所以會(huì)限 制繼續(xù)擴(kuò)增。
[0004] 獲得大劑量NK細(xì)胞通常需要擴(kuò)增數(shù)周，回輸?shù)腘K細(xì)胞必須是新鮮的，細(xì)胞培養(yǎng)和 多劑量細(xì)胞輸注之間的協(xié)調(diào)是具有極大的挑戰(zhàn)性的。因此，擴(kuò)增后的NK細(xì)胞的凍存是很非 常有必要的。然而，傳統(tǒng)的NK細(xì)胞的凍存對(duì)細(xì)胞具有有害的影響，如降低NK細(xì)胞活力，細(xì)胞 毒性以及對(duì)功能至關(guān)重要的NK細(xì)胞受體的表達(dá)。通常NK細(xì)胞無(wú)法從凍存解凍后立即裂解癌 細(xì)胞，復(fù)蘇的NK細(xì)胞需要用IL-2刺激過(guò)夜以恢復(fù)凍存的NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性（Denman， Senyukov et al.，2012;Lapteva N et al.，2012)。因此，現(xiàn)有技術(shù)中，細(xì)胞存活性仍然是 一個(gè)問(wèn)題，并且復(fù)蘇后的NK細(xì)胞存活不能持續(xù)超過(guò)一周。同時(shí)，復(fù)蘇的NK細(xì)胞能否進(jìn)一步擴(kuò) 增仍然不明。因此，本領(lǐng)域目前非常需要一種新的保持NK細(xì)胞活性和原有功能并且具有很 好的擴(kuò)增性的凍存方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，從而提出一種保持NK細(xì)胞活性，功能和以 及擴(kuò)增性的凍存方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種高效擴(kuò)增冷凍保存NK細(xì)胞的方法，所述 方法通過(guò)將融合基因通過(guò)質(zhì)粒進(jìn)行基因重組至AAVS1轉(zhuǎn)座子，并在細(xì)胞擴(kuò)增中間階段引入 冷凍/融化步驟至修飾K562細(xì)胞系為基礎(chǔ)的NK細(xì)胞擴(kuò)增步驟;最后進(jìn)行NK細(xì)胞的擴(kuò)增和保 存。
[0007] 優(yōu)選的，所述融合基因?yàn)槿巳旧w19編碼mbIL15,4-lBBL和mbIL21。
[0008] 優(yōu)選的，所述融合基因的基因表達(dá)質(zhì)粒骨架為將pFastBacl。
[0009] 優(yōu)選的，所述質(zhì)粒骨架的啟動(dòng)子為巨細(xì)胞病毒。
[0010]優(yōu)選的，所述質(zhì)粒的重組使用鋅指核酸酶-介導(dǎo)的同源重組技術(shù)。
[0011]優(yōu)選的，所述基因重組的步驟具體為：
[0012] 將K562細(xì)胞進(jìn)行懸浮處理；
[0013 ] 將pFas tBac-ZFN和PFB-融合基因宿主電轉(zhuǎn)至細(xì)胞；
[0014]將電穿孔的細(xì)胞隨后轉(zhuǎn)移到K562生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0015] 培養(yǎng)后，進(jìn)行擴(kuò)增單細(xì)胞、克隆進(jìn)行PCR基因分型、流式細(xì)胞術(shù)分析，制得穩(wěn)定表達(dá) 融合基因的細(xì)胞。
[0016] 優(yōu)選的，所述NK細(xì)胞的擴(kuò)增具體步驟為：
[0017] 先取外周血單個(gè)核細(xì)胞，并進(jìn)行密度梯度法分析處理；
[0018] 然后使用無(wú)血清干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基對(duì)所述NK細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，并用PBMC與γ照射 Κ562飼養(yǎng)細(xì)胞在ΝΚ細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)；
[0019] 將擴(kuò)增得到的ΝΚ細(xì)胞在含有SCGM培養(yǎng)基和10%FBS的冷凍培養(yǎng)基以及10%DMS0的 冷凍管中凍存；
[0020] 更為優(yōu)選的，將細(xì)胞置于凍存處理后再進(jìn)行解凍和洗滌;最后將解凍的NK細(xì)胞再 次與K562飼養(yǎng)細(xì)胞以1:1的比例進(jìn)行刺激培養(yǎng)。
[0021] 本發(fā)明還公開(kāi)了所述的高效擴(kuò)增冷凍保存NK細(xì)胞的方法在細(xì)胞保存領(lǐng)域中的應(yīng) 用。
[0022] 本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)使用位點(diǎn)特異性基因的 整合技術(shù)開(kāi)發(fā)的K562-mbIL15-41BBL-mbIL21細(xì)胞系，通過(guò)具有高的NK細(xì)胞活性，純度和細(xì) 胞毒性，實(shí)現(xiàn)高NK細(xì)胞擴(kuò)增效率以提高NK擴(kuò)增。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合 附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，其中
[0024]圖1是實(shí)施例中的位點(diǎn)特異性整合的融合基因至K562細(xì)胞的過(guò)程示意圖；
[0025] 圖2是實(shí)施例中的流式細(xì)胞儀分析mbIL15,4-lBBL和mbIL21在修飾的K 562細(xì)胞中 的蛋白表達(dá)水平；
[0026]圖3是實(shí)施例中NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)；
[0027] 圖4是實(shí)施例中使用K562mbill5-41BBL-mbil21后NK細(xì)胞的純度比較；
[0028]圖5是實(shí)施例中擴(kuò)增后NK細(xì)胞激活受體，抑制受體以及NK細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)情況。 [0029]圖6是實(shí)施例中擴(kuò)增得到的NK細(xì)胞對(duì)K562人白血病細(xì)胞系的殺傷活性示意圖； [0030]圖7是實(shí)施例中在抗CD20人源抗體存在下NK細(xì)胞對(duì)抗Raji B-細(xì)胞淋巴細(xì)胞系的 ADCC作用示意圖；
[0031]圖8是實(shí)施例中EpCAM特異性CAR修飾的初始NK細(xì)胞對(duì)PCRC7結(jié)直腸癌細(xì)胞的殺傷 活性示意圖；
[0032] 圖9是實(shí)施例中EpCAM特異性CAR修飾的初始NK細(xì)胞對(duì)MCF7乳腺癌細(xì)胞的殺傷活 性。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 實(shí)施例1本實(shí)施例公開(kāi)了一種高效擴(kuò)增冷凍保存NK細(xì)胞的方法，具體步驟如下：
[0034] 1、人源細(xì)胞系的培養(yǎng)
[0035]從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得野生型K562和Raji細(xì)胞系。并將這些細(xì)胞 放在在含10%胎牛血清(GIBC0)RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBC0)中，并于放入37°C，5%C〇2的培養(yǎng) 箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0036] 2、質(zhì)粒的構(gòu)建
[0037] 將口？&8七1^(31(111￥；[1：1'08611，0&1'18匕&(1，04)作為質(zhì)粒骨架用于表達(dá)2?1^和編碼 mbill5,4-lBBL和mbIL21的融合基因，其中啟動(dòng)子為巨細(xì)胞病毒(CMV)。其中，pFastBac-ZFN 的具體構(gòu)建之前被報(bào)道過(guò)(Tay，Tan et al.2013)。
[0038] 對(duì)于pFB-融合基因宿主的構(gòu)建，該編碼融合基因的DNA片段首次由AIT生物技術(shù)根 據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道的序列基因合成，將合成的構(gòu)建體克隆到pUC57(氨芐抗性），然后將該片 段通過(guò)PCR擴(kuò)增。
[0039]另外，CMV啟動(dòng)子，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)，新霉素抗性基因（新）和土撥鼠肝 炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)也通過(guò)PCR擴(kuò)增。所有這些片段使用GENEART無(wú)縫克隆和組裝 試劑盒(Invitrogen)克隆到一個(gè)pUC19的質(zhì)粒。隨后將合并片段切除，使用Asc/Clal I克隆 到pFastBacl骨干，其中包含屬于AAVS1轉(zhuǎn)座子的一個(gè)810bp的左同源臂與一個(gè)837bp的右同 源臂（Tay，Tan et al.2013)的。
[0040] 3、位點(diǎn)特異性整合的融合基因至K562細(xì)胞AAVS1基因座
[0041 ] 將2X106個(gè)K562細(xì)胞系分別重新懸浮于100μΙ的Opti-MEM。使用NE PA 21電穿孔 和Bio-Rad公司試管將3yg每一個(gè)的pFastBac-ZFN和PFB-融合基因宿主電轉(zhuǎn)至細(xì)胞。將電穿 孔的細(xì)胞隨后轉(zhuǎn)移到在6孔板中新鮮的K562生長(zhǎng)培養(yǎng)基。電穿孔后第5天，在200yg/mL濃度 下進(jìn)行為期1個(gè)月的G418選擇。培養(yǎng)基每2天更換。1個(gè)月的選擇后，使用細(xì)胞分選儀，BD FA CSAria(BD Biosciences公司）將單細(xì)胞分選到的96孔板。擴(kuò)增單細(xì)胞和克隆進(jìn)行PCR基因 分型和流式細(xì)胞術(shù)分析，以證實(shí)該位點(diǎn)特異性整合的融合基因的表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)。PCR基因 分選以鑒定細(xì)胞克隆與AAVS1位點(diǎn)的整合。細(xì)胞的基因組DNA，用廁ea s y?血液及組織試劑 盒(Qiagen，希爾登，德國(guó)）分離出來(lái)。PCR基因分型被用于檢測(cè)0KSM盒的位點(diǎn)特異性整合。 ΚΑΡΑ高保真熱啟動(dòng)預(yù)拌（ΚΑΡΑ Biosystem，Woburn，MA)被一起使用，正向引物： ATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGG和反向引物：CGGGGATGCAGGGGAACGGGGCTCAGTCTG。擴(kuò)增 產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。
[0042] 4、NK細(xì)胞的擴(kuò)增和凍存
[0043] 取20名健康捐助者外周血單個(gè)核細(xì)胞，并使用Ficoll-Paque PREMIUM(GE醫(yī)療集 團(tuán)生命科學(xué)），從外周血單個(gè)核細(xì)胞的新鮮棕黃層進(jìn)行密度梯度法分析處理。使用補(bǔ)充有 10%FBS(GIBC0)和 10 或 50IU/ml 的 11^-2(?6口1〇了6吐，1?〇。1^.出11，町，1]5厶）的6103的無(wú)血清干 細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基（SCGM)(CellGro/CellGenix)對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，并用PBMC與γ照射K562 飼養(yǎng)細(xì)胞(數(shù)量比1: 2)在NK細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中共培養(yǎng)。在T75培養(yǎng)瓶中2 X 106個(gè)TOMC與4 X 106的K562飼養(yǎng)細(xì)胞在10ml的NK培養(yǎng)基中共培養(yǎng)。每2-3天半量換液并補(bǔ)加100IU/ml IL-2。 [0044] NK細(xì)胞擴(kuò)增7天后，擴(kuò)增得到的NK細(xì)胞以2X107細(xì)胞/mL在含有SCGM培養(yǎng)基+10% FBS的冷凍培養(yǎng)基+10%DMS0(Invitrogen)中在冷凍管(NUNC)中凍存。將細(xì)胞置于冷凍1°C 的冷凍容器(Thermo Fisher Scientific，Rochester，NY)在-80°C冰箱中凍存24小時(shí)，然后 轉(zhuǎn)移并儲(chǔ)存在液氮蒸氣儲(chǔ)罐。冷凍的NK細(xì)胞在37°C水浴中解凍直至剩下少量冷凍物質(zhì)，然 后在NK細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗滌。解凍NK細(xì)胞每7天再次與K562飼養(yǎng)細(xì)胞以1:1的比例刺激。凍 存NK細(xì)胞可至少擴(kuò)增3個(gè)月。
[0045] 5、流式細(xì)胞儀分析
[0046] 所用流式細(xì)胞儀為BD Accuri C6流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，F(xiàn)ranklin Lakes, NJ)〇
[0047] 所使用的APC標(biāo)記的抗體購(gòu)自美天旎(德國(guó)Bergisch Gladbach)，BD Biosciences 公司，或Beckman Coulter(Brea，CA) 〇
[0048] 6、細(xì)胞毒性分析
[0049] 所述DEL.FU?細(xì)胞的細(xì)胞毒性試劑盒(Perkin Elmer)用來(lái)測(cè)試對(duì)野生型K562和 Raj i細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
[0050] NK細(xì)胞與靶細(xì)胞在1:1，1:5和1:10比例下在37°C，5%⑶2的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)2小 時(shí)。
[0051 ] 7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0052]位點(diǎn)特異性整合的融合基因至K562飼養(yǎng)細(xì)胞
[0053] 利用已建立的鋅指核酸酶(BV_ZFN)(Tay，Tan et al.2013)，兩個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)： 一個(gè)編碼ZFN，靶向和裂解AAVS1轉(zhuǎn)座子(pFastBac-ZFN)和其他用過(guò)含有CMV啟動(dòng)子以驅(qū)動(dòng) 融合基因編碼的表達(dá)的宿主mbill5,4-lBBL，和mbil21以及新霉素基因。具體見(jiàn)圖）。圖中， 位點(diǎn)特異性整合的融合基因至K562細(xì)胞。pFastBac-融合基因宿主的構(gòu)建，AAVS1至 PPP1R12C基因，剪切位點(diǎn)BV-ZFN，以及修飾的AAVS1在同源重組后。E1，E2和E3:前三個(gè) PPP1R12C基因的外顯子。箭頭表示PCR前頭和反向啟動(dòng)子(FP和RP)結(jié)合形成的一個(gè)2.4kb片 段的3'修飾的AAVS1
[0054] 此表達(dá)盒是由一個(gè)810-bp的左同源臂側(cè)翼和一個(gè)837-bp的右同源臂關(guān)于所述 AAVS1轉(zhuǎn)座子(pFastBac-mbIL21-宿主）（圖1)。1(562細(xì)胞通過(guò)電穿孔將兩種質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特 異性整合。電穿孔后，將K562細(xì)胞進(jìn)行G418選擇，5天后，進(jìn)行單細(xì)胞分選。從G418耐性單細(xì) 胞克隆的基因組提取DNA，并通過(guò)使用特異于19號(hào)染色體的新霉素存在于所述的pFastBac- mbIL21-宿主基因（右同源臂的3'末端的下游）引物對(duì)進(jìn)行PCR基因分型。2.5-kb的片段的擴(kuò) 增表明通過(guò)ZFN介導(dǎo)的同源重組成功AAVS1修飾。以證明成功的修改將導(dǎo)致融合基因在克隆 的穩(wěn)定的蛋白質(zhì)表達(dá)，所述克隆進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。一個(gè)克隆顯示出蛋白質(zhì)的高水平表 達(dá)被選定為NK細(xì)胞擴(kuò)增的飼養(yǎng)細(xì)胞。具體見(jiàn)圖2。
[0055]凍存后NK細(xì)胞的擴(kuò)增
[0056]已經(jīng)知道NK細(xì)胞的凍存對(duì)細(xì)胞有害，如細(xì)胞活力，細(xì)胞毒性的下降，NK細(xì)胞受體表 達(dá)的減少。為了克服這個(gè)問(wèn)題，我們開(kāi)發(fā)了一種方案，將新鮮分離的NK細(xì)胞與我們獲得的 K562細(xì)胞以1:2的比例培養(yǎng)短短7天，然后凍存擴(kuò)增得到的細(xì)胞，然后在復(fù)蘇后以1:1的比例 與K562細(xì)胞共培養(yǎng)。隨后每隔7天將NK細(xì)胞用K562飼養(yǎng)細(xì)胞再刺激，NK細(xì)胞的擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)3個(gè) 月。我們發(fā)現(xiàn)，這種方法可克服冷凍保存所引起細(xì)胞活力下降的問(wèn)題。如圖3所示，冷凍保存 的NK細(xì)胞能夠在復(fù)蘇后增殖至少35天。圖中顯示，NK細(xì)胞的平均總擴(kuò)增倍數(shù)為78，880，152， 范圍在280,354到226,456,888倍。每一行代表一個(gè)?8如患者(11 = 3)。疆細(xì)胞用1(5621111^115- 41BBL-mbil21飼養(yǎng)層細(xì)胞擴(kuò)增PBMC:K 562比例為1:2前7天，凍存于-80°C后。凍存的NK細(xì)胞 一周后復(fù)蘇，用K 562刺激后再次擴(kuò)增。
[0057] 為確定NK細(xì)胞增殖的最佳培養(yǎng)條件，分別評(píng)價(jià)PBMC至K562-mbIL15-41BBL-mbIL21 比率，1:2，1:1.5和1:1的差異。觀察到，在配給初始PBMC刺激的降低可能導(dǎo)致NK細(xì)胞擴(kuò)增倍 數(shù)的降低，PBMC: K562為1:2的比例產(chǎn)生最高NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)。比例的增加也將保持較高的 NK細(xì)胞純度，與PBMC:K562為1:2可以在培養(yǎng)的21天（圖4)后達(dá)到94.9±2.8%的最高純度。 [0058] 實(shí)驗(yàn)例
[0059] 1、擴(kuò)增的NK細(xì)胞的表型檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
[0060]對(duì)擴(kuò)增得到的NK細(xì)胞粘附分子和受體的一個(gè)廣泛的陣列進(jìn)行測(cè)試。大部分高表達(dá) 受體和粘附分子，有少數(shù)例外-活化受體，NKp44，和抑制性受體，表面CD158a，h，CD158i和 CD158el/e2(圖5)。
[0061 ]同時(shí)還比較了培養(yǎng)7天的NK細(xì)胞復(fù)蘇后粘附分子的表達(dá)以及在用K562-mbIL15- 41BBL-mbIL21重新刺激1周后黏附分子和受體的表達(dá)情況。抑制性受體，表面⑶158a，h和 ⑶158el/e2的以及活化受體，NKG2D和NKp44的表面表達(dá)出現(xiàn)顯著增加。結(jié)果顯示表面標(biāo)記 ⑶16的表達(dá)會(huì)因 NK細(xì)胞(Sakamoto，Ishikawa et al. 2015)的冷凍保存而下調(diào)。與這些結(jié)果 相一致的是，在凍存和復(fù)蘇后NK細(xì)胞的表面標(biāo)記⑶16的表達(dá)出現(xiàn)顯著的下降（高達(dá)86% )。 不過(guò)，這個(gè)問(wèn)題在使用K562-mbIL15-41BBL-mbIL21再刺激1周后得到改善。CD16表面表達(dá)顯 示增加至平均90.6 ± 1.8 %。
[0062] 2、擴(kuò)增的NK細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞殺傷性測(cè)試
[0063] 擴(kuò)增的NK細(xì)胞能夠直接殺死NK敏感的白血病細(xì)胞K562，平均16.1 % (范圍從0.9% 至31.2%)，69.8% (范圍從58.5%至98.9%)和86.3% (從74.9%到98.7%)，以1效靶比例 分別為1:1，5:1和10:1 (圖6)。其中NK細(xì)胞與K562細(xì)胞以1:1，5:1和10:1的比例共培養(yǎng)2個(gè)小 時(shí)。每一行代表一個(gè)PBMC健康志愿者(η = 6)但是，Raj i淋巴瘤細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞較不敏感。通過(guò) 利用這些NK細(xì)胞的ADCC功能，在抗體CD20-hIgGl (圖7)的存在下可以明顯觀察到對(duì)Raji細(xì) 胞的細(xì)胞毒性。因此，擴(kuò)增得到的NK細(xì)胞的ADCC功能可以顯著擴(kuò)大對(duì)惡性細(xì)胞的殺傷譜。
[0064]將免疫細(xì)胞嵌合抗原受體(CAR)可以提高他們對(duì)癌細(xì)胞的殺傷活性。冷凍保存后 進(jìn)一步增加擴(kuò)增的NK細(xì)胞的癌細(xì)胞殺傷效率，通過(guò)測(cè)試抗EpCAM CAR-重定向NK細(xì)胞是否顯 示抗EpCAM的陽(yáng)性結(jié)腸直腸癌和乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。電穿孔編碼抗EpCAM的mRNA后，將 修飾的NK細(xì)胞與pCRC7人大腸癌細(xì)胞（圖8)和MCF-7乳腺癌細(xì)胞（圖9)共培養(yǎng)。圖8、9中EpCAM 為特異性CAR修飾的初始NK細(xì)胞;CAR為對(duì)照修飾的初始NK細(xì)胞;wt為初始的NK細(xì)胞。
[0065] 得到如下結(jié)果:抗EpCAM CARNK細(xì)胞顯示強(qiáng)的細(xì)胞毒性活性，并能在E:T比值10:1 時(shí)100%的殺死腫瘤細(xì)胞，這較未修飾的初始NK細(xì)胞和mGFP CAR修飾的對(duì)照NK細(xì)胞具有更 有效的殺傷活性。
[0066] 綜上所述，可以看出過(guò)繼性NK細(xì)胞療法是一種有效的癌癥治療方法，顯示了高的 抗腫瘤潛力，同時(shí)在臨床試驗(yàn)中具有極低的移植物抗宿主病(GVHD)的風(fēng)險(xiǎn)。然而，獲得足夠 數(shù)量的NK細(xì)胞用于過(guò)繼移植的難度是NK細(xì)胞療法的一個(gè)限制。NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增通常與復(fù) 雜的方案和昂貴的成本相關(guān)聯(lián)。通過(guò)使用位點(diǎn)特異性基因的整合技術(shù)開(kāi)發(fā)的K562-mbIL15- 41BBL-mbIL21細(xì)胞系，通過(guò)具有高的NK細(xì)胞活性，純度和細(xì)胞毒性實(shí)現(xiàn)高NK細(xì)胞擴(kuò)增效率 以提高NK擴(kuò)增方案。隨機(jī)整合編碼NK刺激分子染K562細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因用來(lái)產(chǎn) 生經(jīng)遺傳修飾的K562細(xì)胞，這可能導(dǎo)致刺激分子的表達(dá)水平不同，因此這將是具有挑戰(zhàn)性 的復(fù)制的細(xì)胞系可能表達(dá)轉(zhuǎn)基因的相同的表達(dá)水平。通過(guò)克服了由位點(diǎn)特異性基因的整合 問(wèn)題引入AAVS1轉(zhuǎn)座子。AAVS1位于蛋白磷酸酶1，調(diào)節(jié)(抑制劑)亞單位12C(PPP1R12C)基因 對(duì)人19號(hào)染色體（19ql3.3-qter)之內(nèi)。這個(gè)位點(diǎn)用作特異性整合基因座AAV血清型2(AAV2) 的非致病性人細(xì)小病毒。AAVS1具有轉(zhuǎn)錄能力包括一個(gè)敞開(kāi)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和包含天然絕緣 體，使對(duì)轉(zhuǎn)基因沉默的基因整合阻力。由于存在來(lái)自PPP1R12C基因和插入位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因盒 的轉(zhuǎn)錄能力的破壞所造成的細(xì)胞上沒(méi)有已知的不利影響保持在不同類型的細(xì)胞，AAVS1被 認(rèn)為是一個(gè)"安全港"為加法轉(zhuǎn)基因的成人類基因組。
[0067]擴(kuò)增的NK細(xì)胞被冷凍保存后具有更好的效率，并在后續(xù)的擴(kuò)增過(guò)程中具有改善的 NK細(xì)胞功能。
[0068]目前，由于冷凍對(duì)⑶16表達(dá)的影響，立即復(fù)蘇的NK細(xì)胞不能用于ADCC抗腫瘤治療。 這種療法將通過(guò)用K562-mbIL15-41BBL-mbI121重新刺激變得可行。目前NK細(xì)胞療法治療白 血病較實(shí)體瘤更成功。這是由于該顯示抑制信號(hào)以NK細(xì)胞的殺傷作用的固體腫瘤微環(huán)境因 素的影響。因此，CAR的基因修飾的NK細(xì)胞具有靶向?qū)嶓w瘤有抗藥性的NK細(xì)胞，開(kāi)辟了更廣 泛的NK細(xì)胞治療各種癌癥類型的可能性。因此，復(fù)蘇凍存的NK細(xì)胞后，抗EpCAM CAR-重定向 NK細(xì)胞能有效殺滅EpCAM陽(yáng)性結(jié)腸直腸癌和乳腺癌細(xì)胞。
[0069]顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì) 于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或 變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或 變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高效擴(kuò)增冷凍保存NK細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法通過(guò)將融合基因通過(guò) 質(zhì)粒進(jìn)行基因重組至AAVS1轉(zhuǎn)座子，并在細(xì)胞擴(kuò)增中間階段引入冷凍/融化步驟至修飾K562 細(xì)胞系為基礎(chǔ)的NK細(xì)胞擴(kuò)增步驟;最后進(jìn)行NK細(xì)胞的擴(kuò)增和保存。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述融合基因?yàn)槿巳旧w19編碼mbIL15,4-lBBUPmbIL21。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述融合基因的基因表達(dá)質(zhì)粒骨架為將 pFastBacl〇4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)粒骨架的啟動(dòng)子為巨細(xì)胞病毒。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)粒的重組使用鋅指核酸酶-介導(dǎo)的同 源重組技術(shù)。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因重組的步驟具體為： 將K562細(xì)胞進(jìn)行懸浮處理； 將pFastBac-ZFN和PFB-融合基因宿主電轉(zhuǎn)至細(xì)胞； 將電穿孔的細(xì)胞隨后轉(zhuǎn)移到K562生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。 培養(yǎng)后，進(jìn)行擴(kuò)增單細(xì)胞、克隆進(jìn)行PCR基因分型、流式細(xì)胞術(shù)分析，制得穩(wěn)定表達(dá)融合 基因的細(xì)胞。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述NK細(xì)胞的擴(kuò)增具體步驟為： 先取外周血單個(gè)核細(xì)胞，并進(jìn)行密度梯度法分析處理； 然后使用無(wú)血清干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基對(duì)所述NK細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，并用PBMC與γ照射K562飼 養(yǎng)細(xì)胞在ΝΚ細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)； 將擴(kuò)增得到的ΝΚ細(xì)胞在含有SCGM培養(yǎng)基和10%FBS的冷凍培養(yǎng)基以及10%DMS0的冷凍 管中凍存； 將細(xì)胞置于凍存處理后再進(jìn)行解凍和洗滌;最后將解凍的NK細(xì)胞再次與K562飼養(yǎng)細(xì)胞 以1:1的比例進(jìn)行刺激培養(yǎng)。8. 如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的高效擴(kuò)增冷凍保存NK細(xì)胞的方法在細(xì)胞保存領(lǐng)域中的 應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/0783GK105838677SQ201610340117
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月20日
【發(fā)明人】卓朗, 王暉, 王柯
【申請(qǐng)人】深圳市科暉瑞生物醫(yī)藥有限公司