一種用于nk細胞體外擴增的培養(yǎng)基及nk細胞體外擴增的方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及免疫學領域，具體涉及一種用于NK細胞體外擴增的培養(yǎng)基及NK細胞體 外擴增的方法。
【背景技術】
[0002] 自然殺傷細胞(Natural killer cell，NK)是機體重要的免疫細胞，在抗腫瘤和抗 病毒感染免疫中起著重要作用。由于NK細胞殺傷活性無 MHC限值，因此稱為自然殺傷細胞。 NK細胞的靶細胞主要是腫瘤細胞、病毒感染細胞、某些自身組織細胞（如血細胞)及寄生蟲 等，因此NK細胞是機體抗腫瘤、抗感染免疫的重要組成部分。由于這些特點，NK細胞在細胞 免疫治療上有著廣泛的應用前景。在體外被活化的NK細胞毒性較高，可用作免疫細胞的治 療制劑。人體體外及動物試驗證實了其對各種癌癥治療的可能性:利用腫瘤細胞系的方法， 確認其對血液系統(tǒng)腫瘤（白血病和淋巴瘤等）、肝癌、肺癌、腎癌、神經系統(tǒng)腫瘤和皮膚癌等 均具有體外細胞毒性，特別是對白血病和神經源性腫瘤已明確了其臨床及非臨床的治療效 果。2009年，NK細胞治療技術就已列入國家三類醫(yī)療技術目錄。
[0003] 充足的細胞數量和強烈的細胞毒性是細胞治療療效提升的關鍵因素。由于人外周 血中NK細胞含量很少(約占淋巴細胞的5~10%)，從外周血中分離NK細胞成本昂貴，而且分 離的NK細胞一般都處于非活化狀態(tài)，在很大程度上限制了其在臨床上應用。要達到治療效 果，所需的有效NK細胞數量單一批次應用至少要5 X109個(且純度達到80%以上），目前有 報道的采用無血清培養(yǎng)體系，通過IL-2、IL-21及相關組合因子刺激培養(yǎng)均不能實現(xiàn)NK細胞 的高活性、高純度和高擴增倍數，其擴增能力最多達到300倍，臨床應用存在安全風險。通過 自體血清培養(yǎng)體系實現(xiàn)規(guī)模擴增，且獲得單一培養(yǎng)體系、單批次擴增的細胞數量大于IX 101()個疆細胞，且純度大于90%的未見報道。
[0004] CN 102586185 A公開了一種K562細胞擴增激活NK細胞的方法，具體為使用跨膜 IL-21，CD14，CD19，CD86和CD137轉染的K562細胞和低濃度白介素2共同作用定向擴增激活 自然殺傷細胞的方法，該發(fā)明是以K562細胞系轉錄穩(wěn)定表達⑶8α-白介素21、CD14、⑶19、 ⑶86和⑶137的表達載體，⑶8α為在細胞膜上表達的膜蛋白，⑶8α基因連接白介素21基因后 使得白介素21表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；然后培養(yǎng)Κ562細胞一段時間，最后經物理、 化學方式得到純化的Κ562細胞，再對ΝΚ細胞進行培養(yǎng)。CN 102268405 Β公開了一種自體ΝΚ 細胞體外活化擴增培養(yǎng)的方法及其專用培養(yǎng)基。該方法是利用如下成套培養(yǎng)基并同時添加 飼養(yǎng)細胞體外活化擴增自體ΝΚ細胞：由培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基3組成的成套培養(yǎng)基;所 述培養(yǎng)基1是在干細胞生長培養(yǎng)基中添加人白細胞介素2、人白細胞介素12、人白細胞介素 15、人白細胞介素18、植物血凝素、抗人Τ細胞CD3單克隆抗體和離體的人血漿得到的液體培 養(yǎng)基;所述培養(yǎng)基2與所述培養(yǎng)基1相比，所述培養(yǎng)基2中無所述植物血凝素和所述抗人Τ細 胞CD3單克隆抗體，其它成分均與所述培養(yǎng)基1的相同；所述培養(yǎng)基3與所述培養(yǎng)基2相比，所 述培養(yǎng)基3將所述培養(yǎng)基2中的所述離體的人血漿替換為離體的人ΑΒ血清，其它成分均與所 述培養(yǎng)基2的相同。CN 103849599 Α公開了一種高效擴增自體ΝΚ細胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。 所述培養(yǎng)基內含有白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素15(IL-15)、白細胞介素7(IL-7)、白細 胞介素12(IL_12)、腫瘤壞死因子a(TNFa)和抗CD3抗體，可以高效擴增和活化NK細胞，從而 獲得大量高活性的以NK細胞為主的免疫細胞回輸人體，在抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節(jié) 相關疾病的治療中具有顯著療效。根據本發(fā)明的高效擴增自體NK細胞的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方 法，其由細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基和添加于所述細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基的添加因子構成，用于大量培 養(yǎng)擴增自體活化的NK細胞，其特征在于，所述添加因子包含有白細胞介素2(IL-2)、白細胞 介素15(IL-15)、白細胞介素7(IL-7)、白細胞介素12(IL-12)、腫瘤壞死因子a(TNFa)和抗 CD3抗體。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種殺傷能力大于90%的新型的用于NK細胞體外擴 增的培養(yǎng)基及NK細胞體外擴增的方法；
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種培養(yǎng)規(guī)模達到20L且可平行放大用于規(guī)?；a 的用于NK細胞體外擴增的培養(yǎng)基及NK細胞體外擴增的方法；
[0007] 本發(fā)明的目的之三在于提供一種能實現(xiàn)NK細胞短時間內爆發(fā)性增殖的用于NK細 胞體外擴增的培養(yǎng)基及NK細胞體外擴增的方法。
[0008] 第一方面，本發(fā)明提供一種用于NK細胞體外擴增的培養(yǎng)基，按體積百分含量包括 如下組分:淋巴細胞無血清培養(yǎng)基100 %或RPMI1640培養(yǎng)基1~90 %和淋巴細胞無血清培養(yǎng) 基10~99%的混合物，以及血清替代物和白介素2;其中，所述血清替代物的濃度為0.5~ 4g/L，例如可以是 0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、lg/L、1.2g/L、1.5g/L、2g/L、 2.2g/L、2.5g/L、3g/L、3.2g/L、3.5g/L、3.8g/L、3.9g/L 或 4g/L，所述白介素 2的濃度為 50~ 500yg/mL，例如可以是 50yg/mL、5 lyg/mL、52yg/mL、53yg/mL、55yg/mL、56yg/mL、58yg/mL、60 yg/mL、65yg/mL、70yg/mL、75yg/mL、80yg/mL、85yg/mL、90yg/mL、95yg/mL、100yg/mL、110yg/ mL、120yg/mL、130yg/mL、140yg/mL、150yg/mL、160yg/mL、170yg/mL、180yg/mL、200yg/mL、 220yg/mL、240yg/mL、250yg/mL、280yg/mL、300yg/mL、320yg/mL、350yg/mL、380yg/mL、400μ g/mL、420yg/mL、450yg/mL、480yg/mL或 500yg/mL。
[0009] 本發(fā)明中，白介素2的作用是刺激淋巴細胞的生長，血清替代物、淋巴細胞無血清 培養(yǎng)基以及RPMI1640培養(yǎng)基的作用均為供給和補充細胞營養(yǎng)物質。
[0010] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基按體積百分含量包括如下組分:淋巴細胞無血清培養(yǎng)基:4〇~ 50%和RPMI1640培養(yǎng)基:50~60%，以及血清替代物和白介素2。
[0011]優(yōu)選地，所述血清替代物的濃度為1~3g/L。
[0012] 優(yōu)選地，所述白介素2的濃度為200~300yg/mL。
[0013] 第二方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的培養(yǎng)基進行NK細胞體外擴增的方法，包 括制備跨膜結合蛋白為白介素15或白介素21的K562細胞的步驟，所述K562細胞包括引導 肽、跨膜結合蛋白、分子膜定位蛋白和膜蛋白；所述引導肽為非病毒引導肽;所述分子膜定 位蛋白為004;所述膜蛋白為001371^、0086、0019和0064的混合物;所述跨膜結合蛋白與膜蛋 白的相應序列通過2A序列串聯(lián)。
[0014] 本發(fā)明K562細胞的跨膜結合蛋白與膜蛋白的序列連接方式采用2A方式串聯(lián)，而現(xiàn) 有技術均采用病毒相連，使得本發(fā)明在臨床細胞制備和應用上更安全。其中，CD137L能與T 細胞的CD137特異性結合，刺激分泌IFN-，從而刺激淋巴細胞的增殖;CD19能提升NK細胞活 性，激活NK細胞靶向功能;CD64和CD86起到誘導NK細胞增殖的作用。
[0015] 在本發(fā)明中，制備所述K562細胞的具體步驟如下：
[0016] (1)人工合成GM-CSF序列、IL-21/15序列、CD4序列、CD137L序列、CD86序列、CD19序 列和CD64序列，并將IL-21/15序列、CD137L序列、CD86序列、CD19序列和CD64序列通過2A序 列串聯(lián)，插入到帶有抗生素標記的真核表達載體中；
[0017] (2)將步驟（1)得到的真核表達載體測序，正確后進行純化，再與帶有轉座酶的質 粒共轉染到K562細胞中，加入抗生素進行加藥處理，獲得陽性轉染細胞；
[0018] (3)將步驟（2)得到的陽性轉染細胞再加入抗生素進行加藥處理，流式細胞儀分 選，獲得高純度轉染K562細胞；
[0019] (4)再經過加藥處理和5~20次的流式細胞儀分選，獲得100%陽性轉染的K562細 胞，陽性細胞經穩(wěn)定傳代20代以上，獲得基因組整合外源基因的穩(wěn)定轉染細胞系；
[0020] (5)將步驟(4)獲得的穩(wěn)定轉染細胞系再進行流式細胞儀分選，獲得基因組整合外 源基因高表達的穩(wěn)定轉染細胞系。
[0021] 作為優(yōu)選技術方案，所述方法包括以下步驟：
[0022] (1)制備所述跨膜結合蛋白為白介素15的K562細胞；
[0023] (2)將所述NK細胞培養(yǎng)基、CD16單克隆抗體與外周血單個核細胞共培養(yǎng)；
[0024]任選地，步驟(2'）：將所述NK細胞培養(yǎng)基、⑶16單克隆抗體、步驟（1)所述跨膜結合 蛋白為白介素15的K562細胞與外周血單個核細胞共培養(yǎng)；
[0025] (3)在培養(yǎng)的后續(xù)過程中，添加所述NK細