臍帶血造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種臍帶血造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，人民試圖用人類臍帶血造血干細(xì)胞(HSC)代替成年人骨髓進(jìn)行移植，以治療一些惡性疾病。但是按骨髓及外周血移植所需的最低標(biāo)準(zhǔn)(1-2X 18CelVkg體重或0.5-1.0X 16⑶34+細(xì)胞/體重)計(jì)算，每10ml臍血所含的干細(xì)胞量只能滿足不大于30kg的兒童，而對(duì)成人應(yīng)用因素量有限而受到限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是:提供一種臍帶血造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，經(jīng)過該方法擴(kuò)增后的HSCA，不僅能夠滿足大量級(jí)的人群需要同時(shí)還具有比骨髓移植后擁有更長的壽命且移植物抗宿主病的發(fā)生率低。
[0004]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:臍帶血造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，包括如下步驟:
1)將臍帶血和無血清培養(yǎng)基按1:1的體積比進(jìn)行混合；用比重為1.077的淋巴細(xì)胞分離液分離臍帶血中的單個(gè)核細(xì)胞，用50ml離心管分離淋巴細(xì)胞分離液與臍帶血混合液混合，其體積比為10:35，室溫下2000rpm離心20分鐘；
2)吸取單個(gè)核細(xì)胞懸液，將所取單個(gè)核細(xì)胞懸液用30ml生理鹽水洗兩次，每次100rpm離心10分鐘，棄上清；
3)將所得單個(gè)核細(xì)胞的1/3量進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，另2/3細(xì)胞量進(jìn)行液氮保存；
4)體外細(xì)胞培養(yǎng)用無血清培養(yǎng)基，并加入干細(xì)胞生長因子100ng/ml、促血小板生成素100ng/ml以及粒細(xì)胞刺激因子100ng/ml，細(xì)胞濃度調(diào)整為5xl05/ml ;在37°C，質(zhì)量百分比濃度為5% C0J?育箱中培養(yǎng)5天；
5)將凍存的另外2/3量的單個(gè)核細(xì)胞復(fù)蘇，加入到已經(jīng)體外培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞中繼續(xù)共同培養(yǎng)；同時(shí)補(bǔ)足干細(xì)胞生長因子的濃度，培養(yǎng)時(shí)間為10天；在這10天細(xì)胞培養(yǎng)過程當(dāng)中，每3-4天換液一次，補(bǔ)足干細(xì)胞生長因子；
6)培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞用生理鹽水洗2次，檢測(cè)⑶34+細(xì)胞數(shù)，并進(jìn)行生物安全監(jiān)測(cè)。
[0005]為了驗(yàn)證本發(fā)明的技術(shù)效果:申請(qǐng)人采用根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的產(chǎn)品進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):
臍血細(xì)胞重建小鼠造血功能實(shí)驗(yàn) 1、小鼠移植模型的建立
小鼠24只，8 — 10周齡，體重25 — 289,移植前一周始，高壓滅菌飲用水中添加慶大霉素(40萬單位/L)和兩性霉素B(50mg/L)小鼠接受總劑量為
2.75Gy半致死量全身照射，劑量率為0.2Gy/min
照射時(shí)間為I小時(shí)，照射小鼠均在輻照后4小時(shí)內(nèi)回輸移植細(xì)胞，
小鼠存活10周后斷頸處死，其中每7天抽取血液作檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血液中紅細(xì)胞及白細(xì)胞數(shù)穩(wěn)步上升，特別是⑶34+細(xì)胞也是穩(wěn)步回升。
[0006]然后臍血細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，⑶34+陽性百分率均值為92%，最高為98%。純化細(xì)胞CD45抗原的表達(dá)較弱，CD34抗原表達(dá)為弱至中等，細(xì)胞體積小，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，為一較集中分布的細(xì)胞群。純化的臍血CD34+細(xì)胞經(jīng)瑞氏染色后觀察，細(xì)胞大小均一，細(xì)胞體積較小，細(xì)胞核的染色質(zhì)深、粗，呈條塊狀，胞漿很少，核漿比值大，胞漿中見不到顆粒。
[0007]由于采用了以上技術(shù)方案，本發(fā)明對(duì)培養(yǎng)過程進(jìn)行了優(yōu)化篩選，使其培養(yǎng)獲得的HSCA不僅能夠滿足大量級(jí)的人群需要，同時(shí)還具有比骨髓移植后擁有更長的壽命且移植物抗宿主病的發(fā)生率低。本發(fā)明簡單易行，成本低廉，使用效果好。
【具體實(shí)施方式】
[0008]本發(fā)明的實(shí)施例:臍帶血造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，包括如下步驟:
1)將臍帶血和無血清培養(yǎng)基按1:1的體積比進(jìn)行混合；用比重為1.077的淋巴細(xì)胞分離液分離臍帶血中的單個(gè)核細(xì)胞，用50ml離心管分離淋巴細(xì)胞分離液與臍帶血混合液混合，其體積比為10:35，室溫下2000rpm離心20分鐘；
2)吸取單個(gè)核細(xì)胞懸液，將所取單個(gè)核細(xì)胞懸液用30ml生理鹽水洗兩次，每次100rpm離心10分鐘，棄上清；
3)將所得單個(gè)核細(xì)胞的1/3量進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，另2/3細(xì)胞量進(jìn)行液氮保存；
4)體外細(xì)胞培養(yǎng)用無血清培養(yǎng)基，并加入干細(xì)胞生長因子100ng/ml、促血小板生成素TP0100ng/ml以及粒細(xì)胞刺激因子100ng/ml，細(xì)胞濃度調(diào)整為5xl05/ml ;在37°(:，質(zhì)量百分比濃度為5% C0J?育箱中培養(yǎng)5天；
5)將凍存的另外2/3量的單個(gè)核細(xì)胞復(fù)蘇，加入到已經(jīng)體外培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞中繼續(xù)共同培養(yǎng)；同時(shí)補(bǔ)足干細(xì)胞生長因子的濃度，培養(yǎng)時(shí)間為10天；在這10天細(xì)胞培養(yǎng)過程當(dāng)中，每3-4天換液一次，補(bǔ)足干細(xì)胞生長因子。
[0009]6)培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞用生理鹽水洗2次，檢測(cè)⑶34+細(xì)胞數(shù)，并進(jìn)行生物安全監(jiān)測(cè)。
[0010]根據(jù)本發(fā)明制得的產(chǎn)品輸給病人時(shí)，常用量為單個(gè)核細(xì)胞數(shù)1Vkg體重，或⑶34+細(xì)胞105/kg體重，采用一次性靜脈緩慢點(diǎn)滴輸注。
[0011]本發(fā)明所述并不限于【具體實(shí)施方式】中所述的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案得出其他的實(shí)施方式，同樣屬于本發(fā)明的技術(shù)創(chuàng)新范圍。顯然本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)范圍內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種臍帶血造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，其特征在于:包括如下步驟: 1)將臍帶血和無血清培養(yǎng)基按1:1的體積比進(jìn)行混合；緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液上層；用比重為1.077的淋巴細(xì)胞分離液分離臍帶血中的單個(gè)核細(xì)胞，50ml離心管中其體積比為10:35，室溫下2000rpm離心20分鐘； 2)吸取單個(gè)核細(xì)胞懸液，將所取單個(gè)核細(xì)胞懸液用30ml生理鹽水洗兩次，每次100rpm離心10分鐘，棄上清； 3)將所得單個(gè)核細(xì)胞的1/3量進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，另2/3細(xì)胞量進(jìn)行液氮保存； 4)體外細(xì)胞培養(yǎng)用無血清培養(yǎng)基，并加入干細(xì)胞生長因子100ng/ml、促血小板生成素100ng/ml以及粒細(xì)胞刺激因子100ng/ml，細(xì)胞濃度調(diào)整為5xl05/ml ;在37°C，質(zhì)量百分比濃度為5% COJ?育箱中培養(yǎng)5天； 5)將凍存的另外2/3量的單個(gè)核細(xì)胞復(fù)蘇，加入到已經(jīng)體外培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞中繼續(xù)共同培養(yǎng)；同時(shí)補(bǔ)足干細(xì)胞生長因子的濃度，培養(yǎng)時(shí)間為10天；在這10天細(xì)胞培養(yǎng)過程當(dāng)中，每3-4天換液一次，補(bǔ)足干細(xì)胞生長因子； 6)培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞用生理鹽水洗2次，檢測(cè)⑶34+細(xì)胞數(shù)，并進(jìn)行生物安全監(jiān)測(cè)。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種率臍帶血造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法。本發(fā)明對(duì)培養(yǎng)過程進(jìn)行了優(yōu)化篩選，使其培養(yǎng)獲得的HSCA不僅能夠滿足大量級(jí)的人群需要，同時(shí)還具有比骨髓移植后擁有更長的壽命且移植物抗宿主病的發(fā)生率低。本發(fā)明簡單易行，成本低廉，使用效果好。
【IPC分類】C12N5/0789
【公開號(hào)】CN105018428
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510277206
【發(fā)明人】邊曙光
【申請(qǐng)人】貴州北科泛特爾生物科技有限公司
【公開日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年5月27日