專利名稱：擴(kuò)增雙陰性t細(xì)胞的方法
擴(kuò)增雙陰性T細(xì)胞的方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種離體(ex vivo)擴(kuò)增雙陰性(double negative) T細(xì)胞的方法。發(fā)明背景腫瘤的過(guò)繼免疫療法涉及免疫細(xì)胞的分離、離體活化和擴(kuò)增，以及后 續(xù)注射進(jìn)癌癥患者體內(nèi)。自從Rosenberg等人首先將過(guò)繼免疫療法引入人 類(lèi)癌癥的治療(Rosenberg等人，1985; Rosenberg等人，1988)，數(shù)種類(lèi)型的 免疫細(xì)胞包括淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞(LAK)、 CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞 (CTL)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、NK T細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)已經(jīng)被 用于臨床試驗(yàn)(Verneris等人2002; Toh等人2005; Leemhuis等人2005; Yee 等人2002; Dudley and Rosenberg 2003; Dudley等人2005)。目前離體活化 和擴(kuò)增的自體腫瘤特異性CD8+ CTL的輸注可以在大量患者中誘導(dǎo)出預(yù)期 的臨床腫瘤免疫應(yīng)答(Gattinoni等人2005; Rosenberg, Yang，和Restifo 2004; Dudley and Rosenberg 2003; Childs和Barrett 2004; Ridddl 2004; Yee 等人2002)，并被認(rèn)為是目前免疫療法的最有效方法(Pure， Allison,和 Schreiber2005)。但是，該治療因?yàn)樾枰b定相關(guān)的腫瘤抗原而受到嚴(yán)重限 帝U。此外，在反復(fù)注射后還存在癌癥復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)(Meidenbauer等人2003)。 這可能是因?yàn)樵S多體外培養(yǎng)的CTL在過(guò)繼輸注后數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡，大部分存 活不超過(guò)數(shù)天(Gattinoni等人2005; Riddell 2004; Speiser和Romero 2005; Zhang, Miller,和Zhang 1996; Khan等人1999)。該方法還可能在被治療患 者中導(dǎo)致嚴(yán)重的自身免疫病(Dudley and Rosenberg 2003)?；罨耐N異體 淋巴細(xì)胞的過(guò)繼輸注能夠引起有效的抗腫瘤應(yīng)答，但輸注的同種異體細(xì)胞 還可能攻擊宿主組織和器官，引起移植物抗宿主疾病(GVHD)。最近的研 究，包括本發(fā)明人的工作，在動(dòng)物模型和癌癥患者中均顯示識(shí)別宿主次要組織相容性抗原(MiHA)或者單一I型MHC抗原的同種異體淋巴細(xì)胞的 過(guò)繼輸注能夠介導(dǎo)有效的針對(duì)造血惡性腫瘤的抗腫瘤活性而不引起 GVHD(Young等人2003b; Perreault和Brochu 2002; Fontaine等人2001; Marijt等人2003)。因?yàn)殍b定單一 I型MHC尤其是在患者中存在但供體中 不存在的顯性MiHA是困難的，所以其臨床應(yīng)用于患者是復(fù)雜的。過(guò)繼腫 瘤免疫療法的當(dāng)前目標(biāo)是開(kāi)發(fā)新的能夠產(chǎn)生大量T細(xì)胞的策略，所述T細(xì) 胞能夠維持并遷移到腫瘤部位，有效地消除腫瘤細(xì)胞而不引起GVHD或者 自身免疫病。人外周血中的大部分T細(xì)胞表達(dá)CD4或者CD8分子。它們中的大約 1-3%表達(dá)CD3但缺失CD4和CD8共同受體。根據(jù)自然殺傷(NK)細(xì)胞標(biāo)記 物的表達(dá)，這些細(xì)胞可以進(jìn)一步被分為兩個(gè)亞群表達(dá)NK細(xì)胞表面標(biāo)記 例如CD56和CD16的NKT細(xì)胞，和不表達(dá)這些NK標(biāo)記物的雙陰性(DN) 細(xì)胞。先前本發(fā)明人已經(jīng)在小鼠模型中證明DN T細(xì)胞表達(dá)一組獨(dú)特的細(xì) 胞表面標(biāo)記物和細(xì)胞因子譜(profile),使它們區(qū)別于先前描述的淋巴細(xì)胞 (Zhang等人2000)。與CD4或者CD8 T細(xì)胞不同，體外活化的同種異體 DNT細(xì)胞的輸注不造成GVHD。此外，注射的同種異體DNT細(xì)胞還能夠 預(yù)防受體中CD8T細(xì)胞誘導(dǎo)的GVHD。此外，該治療能夠在超過(guò)75%的全 身或者局部接種致死劑量的自體A20淋巴瘤細(xì)胞的受體中預(yù)防死亡 (Young等人2003b; Young等人2001)。數(shù)個(gè)研究顯示自體和同系基因CD8+ T細(xì)胞能夠被操縱以誘導(dǎo)抗腫瘤 應(yīng)答(Lan等人2001 ; Dudley等人2002; Dudley和Rosenberg 2003)。盡管 同種異體DN T細(xì)胞的輸注看起來(lái)不會(huì)在小鼠中引起GVHD (Young等人 2003a)，但利用患者腫瘤抗原活化的自體DN T細(xì)胞相對(duì)于同種異體T細(xì) 胞的使用具有以下優(yōu)點(diǎn)1)自體細(xì)胞的輸注沒(méi)有引起GVHD或者傳播其 他疾病的風(fēng)險(xiǎn)；2)它們可以誘導(dǎo)特別針對(duì)個(gè)體癌癥患者的受控和特異性的 免疫應(yīng)答；3)自體細(xì)胞更易于用于I和II期臨床試驗(yàn)。人體DN T細(xì)胞最近被表征。按照細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)、細(xì)胞因子譜 和作用機(jī)理，它們與小鼠的DNT細(xì)胞具有相似的特征(Fischer等人2005; zhang等人2000)。但是，由于能夠獲得的DN T細(xì)胞的數(shù)量有限，人體DNT細(xì)胞在腫瘤免疫中的功能以前還沒(méi)有被研究。考慮到上述情況，本領(lǐng)域需要發(fā)明一種體外擴(kuò)增雙陰性T細(xì)胞的方法。發(fā)明概述本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種方案，通過(guò)其能夠從人外周血純化雙陰性(DN) T 細(xì)胞并進(jìn)行離體擴(kuò)增。這些離體擴(kuò)增的DN T細(xì)胞的抗腫瘤效果與從相同 供體獲得的CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)進(jìn)行了比較。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人DN T細(xì)胞比CTL更有效的在體外抑制腫瘤生長(zhǎng)。更重要地，當(dāng)過(guò)繼輸注到免 疫缺陷小鼠時(shí)，DNT細(xì)胞比CD8+T細(xì)胞顯示更強(qiáng)的抗腫瘤效果。本發(fā)明提供一種擴(kuò)增雙陰性(DN)T細(xì)胞的方法，包括(a) 提供包括DNT細(xì)胞或者其前體的起始樣品；(b) 從起始樣品基本上去除(depleting) CD8+和CD4+T細(xì)胞；(c) 在包括能夠刺激DN T細(xì)胞生長(zhǎng)的試劑的培養(yǎng)基中利用固定的T細(xì) 胞促分裂原培養(yǎng)來(lái)自步驟(b)的樣品；(d) 洗滌步驟(c)中得到的細(xì)胞，并重懸于包括所述試劑但無(wú)T細(xì)胞促分 裂原的培養(yǎng)基中；和(e) 洗滌步驟(d)中得到的細(xì)胞，并重懸于包括所述試劑和可溶性T細(xì)胞 促分裂原的培養(yǎng)基中。通過(guò)本發(fā)明方法獲得的DNT細(xì)胞可用于各種實(shí)驗(yàn)、治療和商業(yè)應(yīng)用。 根據(jù)下面的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢(shì)將非常清楚。但是應(yīng) 當(dāng)理解，當(dāng)表現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案時(shí)，給出詳細(xì)說(shuō)明和特定實(shí)施例只 是為了說(shuō)明，因?yàn)楦鶕?jù)該詳細(xì)說(shuō)明，在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的不同變化和 改變對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是顯而易見(jiàn)的。附圖簡(jiǎn)述現(xiàn)在將根據(jù)附圖來(lái)描述本發(fā)明，其中

圖1A-C: DN T細(xì)胞克隆而不是它們的CD8+突變體能夠在過(guò)繼輸注后 在體外殺死A20腫瘤細(xì)胞并根除淋巴瘤的圖表。圖2:過(guò)繼輸注后體外活化的DNT細(xì)胞能夠抑制腫瘤進(jìn)展的圖表。圖3:體外激活的(primed)非naiVe DNT細(xì)胞能夠殺傷自體腫瘤細(xì)胞 的圖表。
圖4:離體擴(kuò)增前后人DN T細(xì)胞的表型和百分比。
圖5A和B: DN T細(xì)胞在5個(gè)供體中的離體擴(kuò)增的圖表。
圖6A-C:健康供體中DNT細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線的圖表。
圖7A-F:離體擴(kuò)增的人DN T細(xì)胞體外殺傷人腫瘤細(xì)胞系的圖表。
圖8A: DN T細(xì)胞或者CD8 T細(xì)胞抗腫瘤細(xì)胞系U937的細(xì)胞毒性的圖
表。圖8B: DNT或者CD8 T細(xì)胞抗腫瘤細(xì)胞系H460的細(xì)胞毒性的圖片。 圖9:離體擴(kuò)增的人DN T細(xì)胞能夠在SCID小鼠中抑制人
NSCLC(H460細(xì)胞系)生長(zhǎng)的圖表。
圖10:離體擴(kuò)增的人DN T細(xì)胞能夠在SCID小鼠中抑制人NSCLC生
長(zhǎng)的圖表。
發(fā)明詳述
I.擴(kuò)增DNT細(xì)胞的方法
如先前所述，本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種在體外擴(kuò)增雙陰性T細(xì)胞的方法。 因此，本發(fā)明提供一種擴(kuò)增樣品中雙陰性(DN)T細(xì)胞的方法，包括
(a) 提供包括DN T細(xì)胞或者其前體的起始樣品；
(b) 從起始樣品基本上去除CD8+和CD4+ T細(xì)胞；
(c) 在包括能夠刺激DN T細(xì)胞生長(zhǎng)的試劑的培養(yǎng)基中利用固定的T細(xì) 胞促分裂原培養(yǎng)來(lái)自步驟(b)的樣品；
(d) 洗滌步驟(c)中得到的細(xì)胞，并重懸于包括所述試劑但無(wú)T細(xì)胞促分 裂原的培養(yǎng)基中；和
(e) 洗滌步驟(d)中得到的細(xì)胞，并重懸于包括所述試劑和可溶性T細(xì)胞 促分裂原的培養(yǎng)基中。
術(shù)語(yǔ)"雙陰性T細(xì)胞"或者"DN T細(xì)胞"是指一種T淋巴細(xì)胞，其 表達(dá)CD3但缺乏CD4、 CD8分子以及CD16的細(xì)胞表面表達(dá)，CD16是中 性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的常見(jiàn)標(biāo)記物。DNT細(xì)胞將表達(dá)T細(xì)胞受 體(TCR)，其可以是aP或者Y5TCR。通過(guò)本發(fā)明方法擴(kuò)增的DNT細(xì)胞群可以包括一+和^+ T細(xì)胞的混合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNT細(xì) 胞是人類(lèi)細(xì)胞。
起始樣品可以來(lái)源于含有雙陰性T細(xì)胞或者其前體的任何生物學(xué)樣 品。這類(lèi)樣品包括但不限于新鮮或者冷藏保存的血液、骨髓、淋巴組織、 胸腺、肝、脾、淋巴結(jié)組織、腫瘤組織、胎兒組織和其級(jí)分或者富集的部 分。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，起始樣品是血液，優(yōu)選人血液，更優(yōu)選人 外周血。
在培養(yǎng)起始樣品或者其級(jí)分前，起始樣品基本上去除CD4+和CD8+ T 細(xì)胞。"基本上"是指這些細(xì)胞中的大部分被去除但不排除這些細(xì)胞中的小 部分仍然殘留?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)去除樣品中的這些細(xì)胞類(lèi)型。 具體地，可以向起始樣品中添加抗體，所述抗體結(jié)合待去除的CD8和CD4 細(xì)胞但不結(jié)合雙陰性T細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，向樣品中添加特 異結(jié)合CD4和CD8的標(biāo)記的抗體。一旦起始樣品中己經(jīng)去除CD4+和CD8+ T細(xì)胞，本發(fā)明的方法可以立即繼續(xù)或者該樣品可以被冷凍并保存用于以 后的使用。因此當(dāng)需要DN細(xì)胞時(shí)，DNT細(xì)胞的擴(kuò)增可以從這個(gè)時(shí)間的冷 凍樣品開(kāi)始。
在培養(yǎng)基中培養(yǎng)已經(jīng)基本上去除CD4+和CD8+細(xì)胞的樣品，所述培養(yǎng) 基包括固定的T細(xì)胞促分裂原以及能夠刺激DN T細(xì)胞生長(zhǎng)的試劑。
固定的T細(xì)胞促分裂原可以是能夠刺激雙陰性T細(xì)胞的任意試劑，包 括但不限于結(jié)合CD3或者T細(xì)胞受體的抗體以及凝集素包括植物凝集素伴 刀豆球蛋白A (ConA)和植物凝集素(PHA)或者能夠刺激DNT細(xì)胞擴(kuò) 增的任意化合物例如但不限于IPP、帕米膦酸(Pamidronate)和唑來(lái)膦酸 (Zoledronate)。優(yōu)選的，T細(xì)胞促分裂原是CD3的抗體例如OKT3。
可以利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)固定T細(xì)胞促分裂原。優(yōu)選的，T細(xì)胞促 分裂原被包被到固相支持物，包括但不限于微孔板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)袋或者 瓶。優(yōu)選的，T細(xì)胞促分裂原是固定的抗CD3抗體，更優(yōu)選的固定在微孔 板上。
能夠刺激DN T細(xì)胞生長(zhǎng)的試劑可以是任意合適的試劑，優(yōu)選是細(xì)胞因子例如白介素。優(yōu)選的，細(xì)胞因子包括白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、 白介素-7(IL-7)、白介素-15(IL-15)、白介素-12(IL-12)或者這些中兩種或更 多種的混合物。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，使用IL-2和IL-4。
試劑的濃度應(yīng)當(dāng)適于促進(jìn)雙陰性細(xì)胞的擴(kuò)增。優(yōu)選的，細(xì)胞因子給藥 范圍從大約0.1 ng/mL到大約50 ng/mL。更具體地，IL-2給藥量為1-20 ng/ mL， IL-4給藥量為0-1 ng/mL。
培養(yǎng)基可以是適于T細(xì)胞培養(yǎng)的任意培養(yǎng)基，包括但不限于RPMI培 養(yǎng)基、無(wú)血清培養(yǎng)基、X-VIVO10和X-VIVO15。培養(yǎng)基優(yōu)選的含有其他合 適試劑包括胎牛血清(FBS)和抗生素。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在用能夠刺激DN T細(xì)胞生長(zhǎng)的試劑和固定的T 細(xì)胞促分裂原培養(yǎng)前，細(xì)胞將用抗原和細(xì)胞因子刺激。在抗腫瘤DN T細(xì) 胞的制備中，可以使用滅活的腫瘤細(xì)胞或者來(lái)自腫瘤特異的或者腫瘤相關(guān) 的抗原的肽。在臨床情況下，來(lái)自患者腫瘤的細(xì)胞可用于制備來(lái)自患者血 液的自體DNT細(xì)胞。
細(xì)胞優(yōu)選的在步驟(b)-(d)中的任意一個(gè)步驟培養(yǎng)一段時(shí)間，范圍從1 到大約10天。優(yōu)選的，每個(gè)步驟進(jìn)行大約3-7天，更優(yōu)選3-4天。
為了增加通過(guò)本發(fā)明方法制備的DN T細(xì)胞的純度，可以對(duì)步驟(e)后 獲得的樣品進(jìn)行進(jìn)一步富集，通過(guò)去除不是DN T細(xì)胞的任意細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。 在一個(gè)特定實(shí)施方案中，樣品被進(jìn)一步去除CD8+、 CD4+和CD56+細(xì)胞。
通過(guò)本方法分離的DN T細(xì)胞的純度可以利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)例如 流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行證實(shí)。
II.DNT細(xì)胞的用途
本發(fā)明還包括通過(guò)本發(fā)明方法獲得的雙陰性T細(xì)胞在任意和所有應(yīng)用 中的用途。
如實(shí)施例所示，通過(guò)本發(fā)明方法擴(kuò)增的雙陰性T細(xì)胞具有強(qiáng)抗腫瘤作 用。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療腫瘤的方法，包括給 予需要其的動(dòng)物有效量的通過(guò)本發(fā)明方法獲得的雙陰性T細(xì)胞。本發(fā)明還 包括通過(guò)本發(fā)明方法獲得的有效量的雙陰性T細(xì)胞用于治療腫瘤的用途。
10本發(fā)明還包括有效量的通過(guò)本發(fā)明方法獲得的雙陰性T細(xì)胞在制備治療腫 瘤的藥物中的用途。
此處使用的術(shù)語(yǔ)"有效量"是指能夠在劑量和需要的時(shí)間內(nèi)有效地實(shí) 現(xiàn)所需結(jié)果例如治療癌癥的量。
此處使用的術(shù)語(yǔ)"動(dòng)物"包括動(dòng)物界的所有成員，包括人。在一個(gè)優(yōu) 選的實(shí)施方案中，所述動(dòng)物是人。
術(shù)語(yǔ)"治療"包括但不限于疾病或者病癥(例如癌癥、自身免疫病、 變態(tài)反應(yīng)、感染等等)的一或多種癥狀的減輕或者改善、疾病程度的減輕、 疾病的穩(wěn)定化狀態(tài)、預(yù)防疾病傳播、疾病進(jìn)展的延遲或者減緩和疾病狀態(tài) 的改善或者緩解，可檢測(cè)的或者不能檢測(cè)的癥狀緩解和/或與如果不接受治 療的預(yù)期存活相比延長(zhǎng)的存活。
在腫瘤或者癌癥的治療中，能夠治療的腫瘤是可以單獨(dú)用雙陰性T細(xì) 胞或者與其他治療例如手術(shù)、放療或者化療等聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行治療的任何腫 瘤。根據(jù)本發(fā)明可以治療的腫瘤實(shí)例包括但不限于白血病包括慢性髓性白 血病、急性髓性白血病、急性成淋巴細(xì)胞白血病和T細(xì)胞和B細(xì)胞白血病， 淋巴瘤(Hodgkins和非Hodgkins)，淋巴細(xì)胞增生癥，漿細(xì)胞瘤，組織細(xì) 胞瘤，黑素瘤，腺瘤，肉瘤，實(shí)體組織瘤，鱗狀細(xì)胞癌，泌尿生殖系統(tǒng)腫 瘤例如宮頸和膀胱癌，乳腺癌和肺癌，白血病、頭頸癌和神經(jīng)系統(tǒng)癌癥。
本發(fā)明還包括本發(fā)明DN T細(xì)胞的其他治療用途，例如感染性疾病的 治療和例如在自身免疫疾病、變態(tài)反應(yīng)、移植排斥和移植物抗宿主疾病的 治療中用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。在這種情況下，制備DN T細(xì)胞的方法可以包 括添加合適的感染物、變態(tài)反應(yīng)原細(xì)胞或者組織作為抗原。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療感染性疾病的方法， 包括給予需要其的動(dòng)物有效量的通過(guò)本發(fā)明方法獲得的雙陰性T細(xì)胞。本 發(fā)明還包括用有效量的通過(guò)本發(fā)明方法獲得的雙陰性T細(xì)胞治療感染性疾 病的用途。本發(fā)明還包括通過(guò)本發(fā)明方法獲得的有效量的雙陰性T細(xì)胞在 制備治療感染性疾病的藥物中的用途。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法，包括 給予需要其的動(dòng)物有效量的通過(guò)本發(fā)明方法獲得的雙陰性T細(xì)胞。本發(fā)明還包括有效量的通過(guò)本發(fā)明方法獲得的雙陰性T細(xì)胞用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的 用途。本發(fā)明還包括有效量的通過(guò)本發(fā)明方法獲得的雙陰性T細(xì)胞在制備 調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
在一個(gè)實(shí)施方案中，DNT細(xì)胞用于治療自身免疫病。根據(jù)本發(fā)明可以 治療的自身免疫疾病包括但不限于糖尿病、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、紅斑狼 瘡、炎癥性腸病、皮炎、腦膜炎、血栓性血小板減少性紫癜、Sj6gren's綜 合癥、腦炎、眼葡萄膜炎、白細(xì)胞粘附缺陷、風(fēng)濕熱、Reiter's綜合征、進(jìn) 行性全身性硬化、原發(fā)性膽汁性肝硬變、壞死性脈管炎、重癥肌無(wú)力、多 發(fā)性肌炎、結(jié)節(jié)病、肉芽腫病、血管炎、惡性貧血、CNS炎性病癥、抗原 抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病、自身免疫溶血貧血、淋巴瘤性甲狀腺腫、突眼性 甲狀腺腫、習(xí)慣性自發(fā)流產(chǎn)、Raynaud's綜合征、腎小球性腎炎、皮肌炎、 慢性活動(dòng)性肝炎、乳糜瀉、組織特異性自身免疫、退行性自身免疫遲發(fā)性 超敏反應(yīng)、AIDS的自身免疫并發(fā)癥、萎縮性胃炎、強(qiáng)直性脊柱炎和Addison's 病。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，DNT細(xì)胞可用于治療移植物抗宿主疾病，其中 移植物中的免疫細(xì)胞引起對(duì)受體免疫系統(tǒng)的免疫攻擊。當(dāng)被移植的組織含 有免疫細(xì)胞時(shí)這種情況可能存在，例如當(dāng)治療白血病、再生障礙性貧血和 酶或者免疫缺陷而移植骨髓或者淋巴組織時(shí)。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，DNT細(xì)胞可用于治療變態(tài)反應(yīng)。在變態(tài)反應(yīng) 中，免疫系統(tǒng)引起對(duì)通常無(wú)毒無(wú)害的抗原或者變態(tài)反應(yīng)原的攻擊。利用本 發(fā)明方法可以預(yù)防或者治療的變態(tài)反應(yīng)包括但不限于枯草熱、哮喘、異位 性濕疹和對(duì)槲葉毒葛和常春藤、室內(nèi)塵螨、蜂花粉、堅(jiān)果、甲殼類(lèi)動(dòng)物、 青霉素和許多其他物質(zhì)的變態(tài)反應(yīng)。
通過(guò)本發(fā)明方法制備的DN T細(xì)胞可以配制成以適于體內(nèi)給藥的生物 相容性形式給予對(duì)象的藥物組合物。"適于體內(nèi)給藥的生物相容性形式"是 指被給予物質(zhì)的一種形式，其中治療效果超過(guò)任意毒性作用。物質(zhì)可以給 予活的生物，包括人和動(dòng)物。組合物可以適當(dāng)?shù)姆绞浇o藥，優(yōu)選通過(guò)注射 例如靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)等等。
此處描述的組合物可以通過(guò)本來(lái)已知的用于制備藥學(xué)上可接受的組合物的方法制備，所述組合物能夠給予對(duì)象，這樣有效量的細(xì)胞與藥學(xué)上可
接受載體組合為混合物。例如Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed.， Mack Publishing Company, ￡&31011, 3.,1;8八2000)中描述了合適的載體。在此基礎(chǔ)上，組合物包括但不 限于物質(zhì)與一或多種藥學(xué)上可接受的載體或者稀釋劑結(jié)合的溶液，在具有 合適pH和等滲的緩沖溶液中含有生理溶液。
根據(jù)因素例如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重和細(xì)胞在個(gè)體引發(fā) 所需應(yīng)答的能力，組合物的有效量可能不同?？梢哉{(diào)節(jié)劑量方案以提供最 適治療應(yīng)答。例如，數(shù)個(gè)分開(kāi)的劑量可以每日給藥，或者劑量可以按照治 療情況需要所示按比例減少。
可以和本發(fā)明聯(lián)合應(yīng)用的藥物包括可用于治療待治疾病或者病癥的其 他活性物質(zhì)。例如，在腫瘤治療中，其他抗癌劑可以在相同組合物或者分 離的組合物中給予。
下列非限制性實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明
實(shí)施例 實(shí)施例1
鼠DN細(xì)胞
本發(fā)明人產(chǎn)生一組小鼠DN T細(xì)胞克隆。在長(zhǎng)期培養(yǎng)期間，出現(xiàn)數(shù)個(gè) 表達(dá)CD8的自然突變T細(xì)胞克隆(圖1A)。在圖1A中，Ld—DNT細(xì)胞克 隆CN04和L12.2和它們的自然突變體CN4.8和TN12.8用CD8-FITC染色， 并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析。兩個(gè)突變克隆均是CD8+。突變克隆在體外對(duì)A20 腫瘤具有降低的細(xì)胞毒性(圖1B)。在圖IB中，DN T細(xì)胞克隆CN04和 其CD8突變克隆CN48以所示比例被用作效應(yīng)細(xì)胞丄(1+A20腫瘤細(xì)胞被用 作耙。在細(xì)胞毒性測(cè)定中測(cè)量靶細(xì)胞的特異裂解。盡管DN T細(xì)胞克隆的 單次輸注能夠防止淋巴瘤細(xì)胞致死注射引起的受體腫瘤進(jìn)展，相同數(shù)量的 CD8+突變克隆的過(guò)繼轉(zhuǎn)移卻沒(méi)有保護(hù)作用(圖1C)。在圖1C中， (B6xBALB/c)Fl小鼠(1^+)按照所示單獨(dú)輸注105/小鼠A20腫瘤細(xì)胞或者與 5 X 105 DN T細(xì)胞克隆或者它們的CD8+突變體一起輸注。顯示每組中的無(wú)
13瘤存活百分比。每組包括5-12只小鼠。
為了研究通過(guò)同種異體細(xì)胞體外活化的DN T細(xì)胞是否能夠抑制己確 定腫瘤的進(jìn)展，給首次用于實(shí)驗(yàn)的(B6xBALB/c)Fl小鼠注射105 A20B淋巴 瘤細(xì)胞。腫瘤接種后3天，給每只小鼠注射106體外活化的DNT或CD8T 細(xì)胞。單獨(dú)注射A20的小鼠被用作對(duì)照。顯示無(wú)瘤存活百分比。與單獨(dú)注 射腫瘤或者CD8 T細(xì)胞的那些相比，DN T細(xì)胞的注射導(dǎo)致顯著延長(zhǎng)的無(wú) 瘤存活(PO.05)(圖2)。
此外，本發(fā)明人已經(jīng)證明DNT細(xì)胞在體外和體內(nèi)比CD8+T細(xì)胞對(duì)凋 亡更具抗性(Khan等人1999; Marra等人2004)，這是對(duì)于過(guò)繼細(xì)胞療 法來(lái)說(shuō)DNT細(xì)胞可能優(yōu)于CD8+T細(xì)胞的另一個(gè)特征。
本發(fā)明人在小鼠中發(fā)現(xiàn)盡管naiive DN T細(xì)胞無(wú)法殺死同系基因型A20 腫瘤細(xì)胞，1%多聚甲醛固定的A20細(xì)胞對(duì)純化DNT細(xì)胞的刺激導(dǎo)致在體 外同系基因型A20細(xì)胞的擴(kuò)增和有效殺傷(圖3)。在圖3中，從首次用于 實(shí)驗(yàn)的(B6xBalb/c)n小鼠純化DNT細(xì)胞，在細(xì)胞毒性測(cè)定中作為效應(yīng)細(xì)胞 立即使用或者在用1% PFA固定的自體A20腫瘤細(xì)胞刺激3天后使用。按 照指定比例使用活的A20腫瘤細(xì)胞作為靶。顯示的結(jié)果是A20細(xì)胞的特異 性殺傷百分比土SD，代表2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，其中每個(gè)3次重復(fù)。該發(fā)現(xiàn)表明 體外利用被操縱的自體DNT細(xì)胞作為新的過(guò)繼癌癥療法的可能性。
本發(fā)明人在小鼠模型中證明體外活化的同種異體DN T細(xì)胞的輸注不 僅不引起GVHD而且還可以預(yù)防受體中CD8 T細(xì)胞誘導(dǎo)的GVHD(Young 等人2003b; Young等人2001; Young等人2003a)。此外，該治療能夠在 超過(guò)75%的被全身性或者局部給予地致死量的自體A20淋巴瘤細(xì)胞攻擊的 受體中預(yù)防死亡(Young等人2003b; Young等人2001)。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn) 在外源IL-2和IL-4存在的條件下，通過(guò)用同種異體細(xì)胞進(jìn)行體外刺激， DNT細(xì)胞能夠被活化、擴(kuò)增和克隆(Zhang等人2000; Ford等人2002)。 體外活化的DN T細(xì)胞和它們的克隆能夠殺死表達(dá)用于DN T細(xì)胞活化的同 種異體抗原的腫瘤細(xì)胞(Young等人2003b)。此外，當(dāng)與CD8 T細(xì)胞比 較時(shí)，體外活化的同種異體DN T細(xì)胞顯著抑制腫瘤進(jìn)展并增加無(wú)瘤存活 的百分比(原稿準(zhǔn)備中)。綜合起來(lái)，這些結(jié)果證明在小鼠中，與CD4或者CD8 T細(xì)胞不同，同種異體DN T細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移導(dǎo)致腫瘤消退而不造 成GVHD。該發(fā)現(xiàn)打開(kāi)了利用DN T細(xì)胞作為新的過(guò)繼腫瘤免疫療法的新 窗口。
本發(fā)明人顯示體外活化的DN T細(xì)胞和它們的克隆能夠在體外殺死腫 瘤細(xì)胞。此外，體外活化的同種異體DN T細(xì)胞顯著抑制腫瘤進(jìn)展并增加 無(wú)瘤存活的百分比。綜合起來(lái)，這些結(jié)果證明在小鼠中，與CD4或者CD8 T細(xì)胞不同，同種異體DN T細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移導(dǎo)致腫瘤消退而不發(fā)生 GVHD。
與CD4+CD25+T調(diào)控細(xì)胞類(lèi)似，DN T細(xì)胞具有有效的免疫調(diào)節(jié)功能， 包括皮膚和心臟同種異體移植和異種移植存活的延長(zhǎng)和GVHD的抑制 (Zhang等人2000; Young等人2002; Young and Zhang 2002; Young等人 2003a; Chen等人2003; Chen等人2005; Young等人2001; Ford等人 2002)。 DNT細(xì)胞還在自身免疫和感染性疾病中起作用(Priatel, Utting,和 Teh 2001; Johansson和Lycke 2003)。但是在腫瘤免疫中，DNT細(xì)胞看起來(lái) 起著與004亇025+ Treg細(xì)胞不同的作用。大部分研究顯示CD4+CD25+ T 細(xì)胞對(duì)抗腫瘤應(yīng)答是不利的，因?yàn)樗鼈円种颇[瘤浸潤(rùn)C(jī)TL的功能(Turk等 人2004;Viguier等人2004; Zou 2005)。更差的預(yù)后和降低的存活率與癌癥 患者中更高數(shù)量的CD4+CD25+T相關(guān)(Sasada等人2003; Curiel等人2004; Blattman and Greenberg 2004)。相反，本發(fā)明人在小鼠模型和人中均證明(參 見(jiàn)實(shí)施例2) DNT細(xì)胞在體外和體內(nèi)均具有有效的抗腫瘤活性。
實(shí)施例2 人DN細(xì)胞
人外周血中的DNT細(xì)胞群是非常低的(圖4A)。為了確定人DNT細(xì) 胞是否可以用作新的癌癥過(guò)繼免疫療法，本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種方法，通過(guò) 這種方法人DN T細(xì)胞能夠離體擴(kuò)增。從健康個(gè)體收集外周血樣品，裂解 紅細(xì)胞。剩余PBMC用CD3-Cy-Chrone、 CD4-FITC和CD8-FITC染色。 PBMC中CD3+CD《CD8- T細(xì)胞的百分比顯示于圖4A的G4區(qū)。利用人 CD4/CD8去除雞尾酒試劑盒(Stem Cell Technologies)去除紅細(xì)胞和CD4、CD8T細(xì)胞。在重組人白介素-2 (rhlL-2， 50U/mL)和rhlL-4 (30U/mL)存在 的條件下，剩余的DN T細(xì)胞富集群然后在抗CD3 mAb預(yù)包被的24孔板 中培養(yǎng)3天。洗滌活化的T細(xì)胞，在rfiIL-2和rhlL-4存在的條件下再培養(yǎng) 4天。第7天，分離活細(xì)胞，在添加rhlL-2、 rhlL-4和可溶性抗-CD3 mAb 的新鮮培養(yǎng)基中再培養(yǎng)3天。第10天收集活細(xì)胞，等份用CD3-PE、 CD4-FTTC、 CD8-FTTC和CD56-FITC染色。利用抗FTTC磁珠去除剩余 的CD4+、 CD8+T細(xì)胞以及CD56+NK細(xì)胞。根據(jù)到目前為止進(jìn)行的18次 實(shí)驗(yàn)，平均起來(lái)，本發(fā)明人從20mL血液能夠獲得活性和純度>95%的1-2 X108 DN T細(xì)胞。CD3+CD4-CD8- T細(xì)胞和DN T細(xì)胞(CD3+CD4-CD8—CD 16， 的百分比分別顯示于圖4B和圖4C的G4區(qū)。獲得大量高度純化的活的人 DNT細(xì)胞的成功使利用這些細(xì)胞進(jìn)行過(guò)繼癌癥免疫療法成為可能。圖5證明了來(lái)自健康供體和癌癥患者的DN細(xì)胞的擴(kuò)增。從健康供體 或者肺癌患者中收集5至10ml全血到肝素化管中。按照廠商的說(shuō)明書(shū)，利 用i owetoe; ⑧試劑盒(Stemce11 Technologies Inc)，通過(guò)與RBC的Rosetting 去除CD4+ CD8+ T細(xì)胞。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，血液樣品用抗人CD4和CD8去除雞 尾酒標(biāo)記，在室溫下孵育20分鐘，然后血液與含有2%胎兒牛血清(FBS) 的磷酸鹽緩沖液(PBS) 1:1稀釋，在50ml錐形管中與等體積的密度梯度 培養(yǎng)基(Ficol-Hypaque)分層。在1200X g離心20分鐘后，在ficoll和血 漿的界面收集CD4 CD8-去除的PBMC，用PBS+2% FBS洗滌3次。然后 細(xì)胞在24孔板以每孔0.5-1.0E+06細(xì)胞每ml的濃度在RPMI培養(yǎng)基中在 37。C和5% C02下培養(yǎng)3天，所述24孔板己經(jīng)用5pg/ml的抗CD3單克隆 抗體(克隆OKT3)包被，所述RPMI培養(yǎng)基包含10%FBS、 50piM2-ME、 100單位/ml青霉素、100ng/ml鏈霉素、0.1ng/ml IL-4和50 IU/ml IL-2。在 T細(xì)胞受體交聯(lián)和T細(xì)胞刺激的第一階段后，細(xì)胞用完全培養(yǎng)基洗滌，從 24孔板的每孔轉(zhuǎn)移到6孔板的孔，在相同條件下(完全RPMI加上10% FBS、 0.1ng/mlIL-4和50IU/mlIL-2)繼續(xù)培養(yǎng)4天。第7天，細(xì)胞被洗漆、 計(jì)數(shù)，并在0.1pg/ml可溶性抗CD3抗體(克隆OKT3)加細(xì)胞因子存在的條 件下在新鮮完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。3天后，收集、計(jì)數(shù)DNT細(xì)胞，并通過(guò)臺(tái) 盼藍(lán)排除法檢驗(yàn)存活。 一等份細(xì)胞用抗CD3e、 CD4、 CD8、 CD16表面標(biāo)記物的單克隆抗體染色以檢查DN T細(xì)胞的純度。5個(gè)健康供體在10天培 養(yǎng)前和結(jié)束時(shí)總?cè)褐蠨NT細(xì)胞的百分比顯示于圖5A， IO天培養(yǎng)開(kāi)始和結(jié) 束時(shí)DNT細(xì)胞的總數(shù)和產(chǎn)量顯示于圖5B。圖6顯示健康供體中DNT細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。按圖5所述培養(yǎng)DNT細(xì) 胞。利用臺(tái)盼藍(lán)排除法檢查培養(yǎng)物中存在的DN T細(xì)胞的數(shù)量和存活，利 用抗表面標(biāo)記物的單克隆抗體染色和流式細(xì)胞術(shù)在第0、 3、 7和0天進(jìn)行 確認(rèn)。DNT細(xì)胞從第0到7天穩(wěn)定擴(kuò)增，因?yàn)樵诘?天這個(gè)時(shí)間點(diǎn)它們占 總細(xì)胞的50-60%，但是在通過(guò)抗CD3抗體的第二輪TCR刺激后，與培養(yǎng) 物中存在的其他T細(xì)胞相比，從第7到IO天DNT細(xì)胞的生長(zhǎng)速度顯示巨 大的增加。到第10天，幾乎900/。的總細(xì)胞是DNT細(xì)胞，它們擴(kuò)增超過(guò)IOO 倍(圖6A)。當(dāng)在完全RPMI加10%FBS、 50ng/ml抗-CD3、 O.lng/mlIL-4 和50 IU/ml IL-2中在37。C和5% 032條件下延長(zhǎng)培養(yǎng)期從10天到3周， DNT細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)。每隔3-4天給細(xì)胞添加新鮮培養(yǎng)基和完全相同濃度的 細(xì)胞因子和抗CD3抗體。本發(fā)明人觀察到盡管DN T細(xì)胞生長(zhǎng)的頂峰在第 18天，但在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)還觀察到相當(dāng)程度的生長(zhǎng)中的CD4+CD8+T細(xì)胞污 染，這顯著地降低了細(xì)胞的純度(圖6B)。本發(fā)明人還檢査了是否能夠使用冷凍細(xì)胞作為離體擴(kuò)增的起始群。 CD4 CD8去除的PBMC在10% DMSO、 10% RPMI和80% FBS中冷凍至 少一周和至多3個(gè)月，在水浴中快速解凍。洗滌兩次后，計(jì)數(shù)細(xì)胞并按前 述進(jìn)行培養(yǎng)。DNT細(xì)胞的最終產(chǎn)量和生長(zhǎng)速度比新鮮細(xì)胞稍低，但仍然在 可接受的范圍內(nèi)(圖6C)。我們檢測(cè)了離體擴(kuò)增的人DN T細(xì)胞在體外殺傷人不同腫瘤細(xì)胞系的 功能。數(shù)種人腫瘤細(xì)胞系，包括(a)H460SM(轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞癌)、(b)H460 (b非小細(xì)胞癌)，(c) K562 (慢性髓細(xì)胞白血病，(d) A648 (鱗狀細(xì)胞癌)，(e, f) U937(組織細(xì)胞淋巴瘤)，用51Cr標(biāo)記，在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞毒測(cè)定中用作靶細(xì)胞。 效應(yīng)細(xì)胞是純化的DN T細(xì)胞。之前描述的培養(yǎng)10天后獲得的DN T細(xì)胞 首先通過(guò)用與MACS⑧微珠附著的CD4、 CD8和CD16單克隆抗體標(biāo)記而 純化，在4'C孵育20分鐘。在用PBS加0.5。/。BSA洗滌后，按照廠商的說(shuō) 明書(shū)利用AutoMACS (Miltenyi Biotech)通過(guò)將細(xì)胞穿過(guò)磁場(chǎng)去除標(biāo)記的細(xì)胞。然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢查獲得的DN T細(xì)胞純度大于95Q/。。耙細(xì)胞用 51Cr(在100ul體積中100pCi每1.0E+6細(xì)胞)標(biāo)記45分鐘。在洗滌數(shù)次后， 在96孔板中效應(yīng)細(xì)胞按所示比例添加到1.0E+3靶細(xì)胞中，重復(fù)3次。按 照下列公式根據(jù)從裂解的耙細(xì)胞釋放的鉻確定特異性殺傷百分比。/。裂解呵(cpm實(shí)驗(yàn)釋放-cpm自發(fā)釋放)/(cpm最大釋放-cpm自發(fā)釋放)〗 X歸。因?yàn)閁937細(xì)胞系的特異性殺傷看起來(lái)在10: 1-1.25: 1效應(yīng)物:靶比例 下被飽和，本發(fā)明人在更低的濃度下分析DN T細(xì)胞對(duì)這種腫瘤細(xì)胞系的 殺傷，觀察到即使在極低的E:T比例(f)下也具有較高的殺傷能力。如圖7A-F所示，離體擴(kuò)增的人DNT細(xì)胞能夠以劑量依賴方式非常有 效地殺傷這些腫瘤細(xì)胞。80X的H460SM肺癌細(xì)胞在10:1效應(yīng)物:靶比例 下被殺傷(圖7A)， 58%的U937細(xì)胞在1:2效應(yīng)物:靶比例下被殺傷(圖 7 )。為了確定離體擴(kuò)增的0>^丁細(xì)胞是否比目前用于過(guò)繼免疫療法的008+ CTL具有更強(qiáng)的抗腫瘤效果，從相同個(gè)體的外周血純化DNT和CD8+T細(xì) 胞并進(jìn)行離體擴(kuò)增。對(duì)它們殺傷人非小細(xì)胞肺癌上皮細(xì)胞系NCI-H460以 及白血病細(xì)胞系U937的能力進(jìn)行比較。DNT細(xì)胞與兩種類(lèi)型腫瘤細(xì)胞系 的共同培養(yǎng)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的顯著裂解，但CD8 T細(xì)胞的作用低得多(圖8A， B)。這些數(shù)據(jù)表明在該模型中，離體擴(kuò)增的人DNT細(xì)胞比常用的CTL更 具有抑制和殺傷腫瘤的能力。為了進(jìn)一步確定人DN T細(xì)胞在體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)，給嚴(yán)重聯(lián)合免疫 缺陷(SCID)小鼠單獨(dú)皮下注射10611460細(xì)胞/小鼠，或者與5乂106離體 擴(kuò)增的DN T或者與CD8 T細(xì)胞一起注射。在接種后15-34天之間所有單 獨(dú)注射H460細(xì)胞的所有小鼠(對(duì)照)形成1.5cm腫瘤。這不受與CD8 T 細(xì)胞共同注射的顯著影響。相反，在接受單一劑量DN T細(xì)胞的小鼠中， 腫瘤生長(zhǎng)被顯著延緩(圖9-10)。該組的存活期中值(MST)是46天，這 顯著長(zhǎng)于對(duì)照(MST-28.5天，P-0.01)或者CD8 T細(xì)胞治療組(MST-34天, P-0.039)。DNT細(xì)胞治療的12只小鼠中的4只從未發(fā)生腫瘤，保持健康狀 態(tài)超過(guò)4個(gè)月(圖IO)。所述結(jié)果與利用小鼠DNT細(xì)胞獲得的結(jié)果一致。 總之，這些研究顯示離體擴(kuò)增的人DN T細(xì)胞在體外和體內(nèi)均比CD8 T細(xì)胞更有效的抑制人腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，表明利用人DN T細(xì)胞作為新的過(guò)繼腫 瘤免疫療法的潛力。但人DN T細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞的分子機(jī)制目前仍在研 究中。盡管本發(fā)明己經(jīng)參考目前被當(dāng)作優(yōu)選實(shí)施例的內(nèi)容進(jìn)行了描述，應(yīng)當(dāng) 理解本發(fā)明不限于公開(kāi)的實(shí)施例。相反，本發(fā)明意在覆蓋包括在所附權(quán)權(quán) 利要求書(shū)的精神和范圍內(nèi)的不同改變和等同的方案。如果所有出版物、專利和專利申請(qǐng)?jiān)诒疚南嗤潭鹊囊匀囊胱鳛?參考，就如各個(gè)出版物、專利或者專利申請(qǐng)是具體和單獨(dú)的表明是以全文 引入作為參考。當(dāng)發(fā)現(xiàn)本申請(qǐng)的術(shù)語(yǔ)被定義為不同于本文引入作為參考的 文獻(xiàn)時(shí)，本文提供的定義作為所述術(shù)語(yǔ)的定義。說(shuō)明書(shū)中涉及的用于參考的完整引文1. 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權(quán)利要求
1. 一種擴(kuò)增樣品中雙陰性(DN)T細(xì)胞的方法，包括(a) 提供包括DNT細(xì)胞或者其前體的起始樣品；(b) 從起始樣品基本上去除CD8+和CD4+ T細(xì)胞；(c) 在包括能夠刺激DN T細(xì)胞生長(zhǎng)的試劑的培養(yǎng)基中利用固定的T細(xì) 胞促分裂原培養(yǎng)來(lái)自步驟(b)的樣品；(d) 洗滌步驟(c)中得到的細(xì)胞，并重懸于包括所述試劑但無(wú)T細(xì)胞促分 裂原的培養(yǎng)基中；和(e) 洗滌步驟(d)中得到的細(xì)胞，并重懸于包括所述試劑和可溶性T細(xì)胞 促分裂原的培養(yǎng)基中。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述T細(xì)胞促分裂原是結(jié)合CD3 的抗體。
3. 如權(quán)利要求1或者2所述的方法，其中所述試劑是細(xì)胞因子。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述細(xì)胞因子選自IL-2、 IL-4、 IL-7、 IL-12、 IL-15及其混合物。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述細(xì)胞因子包括白介素-2和白介 素-4。
6. 如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述起始樣品是人外周血。
7. 如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述方法，其中所述起始樣品是組織。
8. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，還包括在步驟(c)之前用抗原培養(yǎng)。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述抗原是腫瘤細(xì)胞或者腫瘤抗原。
10. 如權(quán)利要求2-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述固定的T細(xì)胞促分 裂原包括包被在微孔板或者培養(yǎng)袋上的CD3的抗體。
11. 如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(b)到(d)的每一 步驟中將所述樣品培養(yǎng)大約1到大約7天的時(shí)間。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中在步驟(b)中培養(yǎng)所述細(xì)胞大約3-4天。
13. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中在步驟(c)中培養(yǎng)所述細(xì)胞大約3-4天。
14. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中在步驟(d)中培養(yǎng)所述細(xì)胞大約 3-10天。
15. 有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法獲得的雙陰性T 細(xì)胞用于治療腫瘤的用途。
16. 有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法獲得的雙陰性T 細(xì)胞用于治療感染性疾病的用途。
17. 有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法獲得的雙陰性T 細(xì)胞用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的用途。
18. 有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法獲得的雙陰性T細(xì)胞用于治療移植物抗宿主疾病的用途。
19. 有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法獲得的雙陰性T 細(xì)胞用于治療自身免疫病的用途。
20. —種藥物組合物，其包括有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所 述的方法獲得的雙陰性T細(xì)胞和載體。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種離體培養(yǎng)擴(kuò)增雙陰性T細(xì)胞的方法。該方法包括(a)提供包括DN T細(xì)胞或者其前體的起始樣品；(b)從起始樣品基本上去除CD8⁺和CD4⁺T細(xì)胞；(c)在包括能夠刺激DN T細(xì)胞生長(zhǎng)的試劑的培養(yǎng)基中用固定的T細(xì)胞促分裂原培養(yǎng)來(lái)自步驟(b)的樣品；(d)洗滌步驟(c)中得到的細(xì)胞，并重懸于包括所述試劑但無(wú)T細(xì)胞促分裂原的培養(yǎng)基中；和(e)洗滌步驟(d)中得到的細(xì)胞，并重懸于包括所述試劑和可溶性T細(xì)胞促分裂原的培養(yǎng)基中。通過(guò)該方法獲得的DN T細(xì)胞可用于各種應(yīng)用，包括癌癥、感染性疾病、移植物抗宿主疾病和自身免疫病的治療。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101313061SQ200680043116
公開(kāi)日2008年11月26日 申請(qǐng)日期2006年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月18日
發(fā)明者P·多考哈基, 麗 張, 梅 韓 申請(qǐng)人:大學(xué)健康網(wǎng)絡(luò)