專利名稱：生長調(diào)控蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有生長抑制活性的蛋白質(zhì)新家族及其診斷和治療用途。
背景技術(shù)：
生長不僅與正常發(fā)育而且與異常狀況諸如腫瘤發(fā)生和癌癥密切相關(guān)。盡管它重要，然而我們對生長如何在細胞水平、組織和器官水平、或者整個生物體水平得到調(diào)控仍然了解得較少。由于生長通常與細胞增殖有關(guān)，因此為了理解調(diào)控生長的機制而進行的許多努力集中于細胞周期調(diào)控的機制。事實上，我們關(guān)于細胞如何進行細胞周期的知識已經(jīng)大大增加(Nurse，2000)。對細胞分裂控制的專注導(dǎo)致推測生長受到控制細胞周期的因素的調(diào)控。然而，在果蠅成蟲盤中進行的精致實驗提醒了我們過去在酵母中的發(fā)現(xiàn)，即是生長調(diào)控著細胞周期而非相反(Nurse，1975)。果蠅實驗顯示，在細胞克隆中加速細胞周期時間并不刺激凈生長(通過克隆占據(jù)的面積進行測量)，而是生成了更多但更小的細胞來占據(jù)與對照克隆相同的面積。相反，通過過度表達RB同系物RBF來減緩細胞周期則生成了更少但更大的細胞，同樣占據(jù)相同面積(Neufeld、de la Cruz等人，1998)。因此，理解正常和異常發(fā)育過程中的生長調(diào)控需要的不僅是對細胞周期控制的理解。理解生長如何在細胞和組織水平得到調(diào)控也將為癌癥治療提供新方法和目標(biāo)。事實上，阻斷細胞生長的抑制劑諸如雷帕霉素目前在臨床試驗中作為抗癌藥物使用(Hidalgo和Rowinsky，2000)。因此，迫切需要能夠診斷和治療過度增殖病的方法。

發(fā)明內(nèi)容
由此，本發(fā)明的一般目的是提供包含ENTH結(jié)構(gòu)域且具有生長抑制活性的蛋白質(zhì)。
術(shù)語ENTH結(jié)構(gòu)域(Epsin氨基末端同源性結(jié)構(gòu)域)在用于本文時指首先在epsin家族的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的保守蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。通常，該結(jié)構(gòu)域位于蛋白質(zhì)的氨基末端，所述結(jié)構(gòu)域的特征為16個絕對保守的殘基N-x(11-13)-V-x2-A-T-x(34-36)-R-x(7-8)-W-R-x3-K-x12-G-x-E-x15-L-x11-12-D-x-G-R-x11-D-x7-R。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述蛋白質(zhì)缺乏與Eps15相互作用的NPF結(jié)構(gòu)域，且缺乏結(jié)合網(wǎng)格蛋白接頭AP2的DPW結(jié)構(gòu)域。
在另一個優(yōu)選實施方案中，所述蛋白質(zhì)具有與SEQ ID NO2(人ELP)、SEQ ID NO5(hELP18aa)、或SEQ ID NO4(果蠅ELP)所列氨基酸序列至少40％、優(yōu)選50％、更優(yōu)選60％、甚至更優(yōu)選80％且最優(yōu)選90％相同的氨基酸序列。
在一個特別優(yōu)選實施方案中，所述蛋白質(zhì)具有與SEQ ID NO2(人類)、SEQ ID NO4(黑腹果蠅(Drosophila melanogaster))、或SEQ ID NO5(人類hELP18aa)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一個目的是編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸序列。在一個優(yōu)選實施方案中，所述核酸選自SEQ ID NO1(hELP)和SEQ ID NO3(dELP)。
本發(fā)明的另一個目的是確定受試者如人患者是否有風(fēng)險患上特征為有害細胞增殖或異常分化控制的疾病的方法。
本發(fā)明的另一個方面提供了與epsin樣蛋白質(zhì)的表位特異反應(yīng)的抗體和抗體制劑。
本發(fā)明的另一個目的是本發(fā)明的蛋白質(zhì)和/或核酸用于基因療法目的的用途。
在另一個方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的蛋白質(zhì)和/或核酸用于治療過度增殖病諸如癌癥的用途。
在另一個方面，本發(fā)明涉及包含編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核苷酸序列的載體。通常，載體包含在宿主細胞中實現(xiàn)表達所需要的調(diào)控序列，它可以包含進行質(zhì)粒復(fù)制所需要的必需序列，以便以附加體狀態(tài)存在，或者它可以設(shè)計用于染色體整合。術(shù)語調(diào)控序列在用于本文時涵蓋本發(fā)明基因的天然調(diào)控序列以及異源調(diào)控序列。
另外，本發(fā)明提供了經(jīng)過載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，所述載體包含編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核苷酸序列。可以使用能夠表達本發(fā)明蛋白質(zhì)的任何宿主細胞，如細菌、脊椎動物和無脊椎動物細胞。例如，所述細胞可用于生成epsin樣蛋白質(zhì)。
在另一個方面，本發(fā)明涉及用于生成epsin樣蛋白質(zhì)的方法，其中用包含編碼epsin樣蛋白質(zhì)的核酸序列的載體轉(zhuǎn)化合適宿主細胞，在容許蛋白質(zhì)表達的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞，并分離生成的epsin樣蛋白質(zhì)?？梢允褂媚軌虮磉_本發(fā)明蛋白質(zhì)的任何宿主細胞，如細菌、脊椎動物和無脊椎動物細胞。
附圖描述考慮下文的發(fā)明詳述后，將更好的理解本發(fā)明，而且上文所列以外的目的將變得清晰。這些描述提到了附圖，其中

圖1A顯示了作為對照的野生型黑腹果蠅眼的電子掃描顯微照片。
圖1B顯示了主要由純合dELP突變體組織組成的復(fù)眼的電子掃描顯微照片。該眼的大小顯著增加。照片來自基因型為y w ey-flp/y w；FRT82dELP4K2/FRT82 w+c13R3的雌蠅。
圖2顯示了dELP(SEQ ID NO4)和hELP(SEQ ID NO2)的序列比對。黑盒相同殘基?；液斜Ｊ貧埢?。
圖3顯示了2種h-ELP異構(gòu)體h-ELP(SEQ ID NO2)(來自數(shù)據(jù)庫的序列)和h-ELP18aa(SEQ ID NO5)(來自EST的序列)的ClustalW比對。比對下面的星號指示相同氨基酸。
圖4A顯示了h-ELP轉(zhuǎn)錄本在人組織中的表達；而圖4B顯示了h-ELP轉(zhuǎn)錄本在多種細胞系中的表達。將Northern印跡(Clonetech)與32P標(biāo)記的h-ELP探針(第751-1951位核苷酸)進行雜交。雜交使用ExpressHyb(Clonetech)在68℃進行，最后一次清洗使用0.1x SSC和0.1％SDS在68℃進行10分鐘。
圖5顯示了hELP轉(zhuǎn)錄本的表達。將癌癥表征陣列(Cancer ProfilingArray)(BD Biosciences，目錄編號7841-1)膜與5′標(biāo)記的hELP探針(第751-1951位核苷酸)進行雜交。雜交在68℃進行，依照制造商的建議，最后一次清洗使用0.2x SSC和0.5％SDS在68℃進行15分鐘。樣品參考見BD Bioscience產(chǎn)品目錄。
圖6顯示了由delp在成年果蠅的眼和翅中的過度表達引起的生長表型。A)dELP在正在發(fā)育的眼中的過度表達在成年眼中誘導(dǎo)了生長抑制表型，而在翅中的過度表達引起嚴重的翅形減小，這可能還涉及凋亡效應(yīng)。B)和D)為delp UAS系對照?；蛐虯)y w UAS-delp3.15；ey Gal4/+；B)y w UAS-delp 3.15；+/+；C)y w MS 1096/UAS-delp 3.15；D)y w3.15 UAS-delp；+/+；MKRS/TM3。
具體實施例方式
為了鑒定在細胞、組織和生物體水平上特異性地參與生長的基因，發(fā)明人在果蠅中采用了遺傳方法。他們在基因組范圍內(nèi)篩選阻礙或促進細胞生長且不影響細胞分化的隱性突變。這些篩選利用了生成遺傳嵌合果蠅的組織特異性重組系統(tǒng)(Newsome、Asling等人，2000)。這些果蠅在頭部組織中對隨機誘導(dǎo)的突變而言是純合的，但是在身體和種系中對相同突變而言是雜合的。其產(chǎn)物選擇性促進生長的基因(潛在的致癌基因)中的突變將生成小頭果蠅，而其產(chǎn)物發(fā)揮生長抑制功能的基因(潛在的腫瘤抑制基因)中的突變將生成大頭果蠅。通過這種篩選找到涉及腫瘤發(fā)生的基因的有效性由下面的鑒定得到了例證，即已知致癌基因的果蠅同系物像雷帕霉素的作用靶TOR、Myc、Ras中的突變引起小頭表型，而已知腫瘤抑制基因同系物像PTEN、LATS和TS1中的突變引起大頭表型(Huang、Potter等人，1999；Oldham、Montagne等人，2000)。
本發(fā)明所描述的基因中的突變生成頭比正常更大的果蠅(圖1)，有力地說明了它具有實質(zhì)性的生長抑制功能。該基因稍后經(jīng)鑒定是全新的，并由于與果蠅Epsin蛋白質(zhì)享有共同結(jié)構(gòu)域而被命名為Epsin樣蛋白質(zhì)(ELP)。在涉及由受體介導(dǎo)的內(nèi)吞和生長受體的調(diào)控(Carbone，1997；Nakashima、Morinaka等人，1999)的所有Epsin家族蛋白質(zhì)中都發(fā)現(xiàn)有(Rosenthal，Chen等人，1999)這個結(jié)構(gòu)域，稱為Epsin氨基末端同源性(ENTH)結(jié)構(gòu)域(Kay、Yamabhai等人，1999)。然而，ELP缺乏Epsin中涉及內(nèi)吞的兩個重要結(jié)構(gòu)域與Eps15相互作用的C末端NPF結(jié)構(gòu)域(Chen，F(xiàn)re等人，1998)和結(jié)合網(wǎng)格蛋白接頭AP2(Robinson，PJ、Liu，JP，Trends in neuroscience，1994)和網(wǎng)格蛋白(Rosenthal、Chen等人，1999)的DPW中心基序。由于ENTH結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)與犰狳重復(fù)片段之一類似，因此推測該結(jié)構(gòu)域可能也介導(dǎo)核-胞質(zhì)穿梭(Hyman、Chen等人，2000；Vecchi、Polo等人，2001)。
據(jù)稱ENTH結(jié)構(gòu)域據(jù)可結(jié)合磷脂酰肌醇-4，5-磷酸二酯(PIP2)(Itoh、Koshiba等人，2001)，即膜磷脂PI(3，4，5)P3的脫磷酸化形式，它在由膜受體至下游成分的信號傳播中發(fā)揮中樞作用(Martin，2001)。由此，與含PH結(jié)構(gòu)域(已知結(jié)合PIP3且受PIP3水平調(diào)控)的蛋白質(zhì)類似，含ENTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的定位和功能可能受到PIP2水平的調(diào)控。
在缺失腫瘤抑制基因LATS的細胞中觀察到的生長表型與對于本文所述基因中的突變而言是純合的細胞中的生長表型非常相似的事實指示ELP可能也構(gòu)成腫瘤抑制基因。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，鑒定了黑腹果蠅ELP蛋白質(zhì)和兩種人ELP異構(gòu)體以及相應(yīng)基因。
本發(fā)明的第一個方面涉及特征為存在ENTH結(jié)構(gòu)域及其生長抑制活性的epsin樣蛋白質(zhì)(ELP)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，克隆并鑒定了黑腹果蠅和人的epsin樣蛋白質(zhì)。
可以顯示dELP過度表達在果蠅翅中誘導(dǎo)了細胞死亡，并劇烈縮小了復(fù)眼的大小(再次指示其對生長的負作用)，而且hELP和dELP轉(zhuǎn)基因在反式雜等位基因突變型黑腹果蠅背景中的過度表達部分挽救了純合突變體由幼蟲晚期至蛹階段的致死性。這些發(fā)現(xiàn)證明果蠅和人蛋白質(zhì)具有相同功能。
所述蛋白質(zhì)的生長抑制活性指示epsin樣蛋白質(zhì)發(fā)揮著腫瘤抑制功能。
術(shù)語ELP蛋白質(zhì)還包括上文所定義的任何蛋白質(zhì)的功能片段、變體、或衍生物。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以以嵌合蛋白的形式提供，例如重組融合蛋白。
“嵌合蛋白”或“融合蛋白”指編碼目的ELP多肽之一的第一氨基酸序列與確定對于該ELP蛋白質(zhì)之一的任何結(jié)構(gòu)域而言是外來的且非實質(zhì)性同源的結(jié)構(gòu)域的第二氨基酸序列的融合體。嵌合蛋白中可以存在在同樣表達該第一種蛋白質(zhì)的生物體中(雖然在不同蛋白質(zhì)中)發(fā)現(xiàn)的外來結(jié)構(gòu)域，或者它可以是由不同種類的生物體表達的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的“物種間”、“基因間”等的融合。一般而言，融合蛋白可以表述成通式X-ELP-Y，其中ELP表示由一種ELP蛋白質(zhì)衍生的蛋白質(zhì)片段，而X和Y獨立地不存在或表示與生物體中的一種ELP序列(包括天然存在的突變體)無關(guān)的氨基酸序列。
在第二個方面中，本發(fā)明涉及編碼ELP蛋白質(zhì)的核酸序列。本發(fā)明還包括確實導(dǎo)致ELP氨基酸序列變化的DNA序列多態(tài)性。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將認識到，由于天然等位基因變異，在指定物種的個體中，編碼具有ELP多肽活性的多肽的核酸中可以有一個或多個核苷酸(可多達大約3-5％的核苷酸)中存在這些變異。編碼epsin樣蛋白質(zhì)的活性片段的核酸片段也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在用于本文時，elp基因片段指核苷酸數(shù)目少于編碼SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所列ELP完整氨基酸序列的核苷酸序列的核酸，然而優(yōu)選編碼保留全長蛋白質(zhì)的一些生物學(xué)活性或者在存在合適激動劑/拮抗劑時恢復(fù)一些生物學(xué)活性的肽。本發(fā)明范圍內(nèi)的核酸片段包括那些能夠在高或中嚴謹條件下與來自其它物種的核酸雜交的核酸片段，用于在篩選方案中檢測并分離其它elp等位基因和/或同系物，以及那些能夠與來自人樣品的核酸雜交的核酸片段，用于檢測編碼ELP蛋白質(zhì)(包括其它異構(gòu)體，如mRNA剪接變體)的核酸的存在。本發(fā)明范圍內(nèi)的核酸還可包含接頭序列、經(jīng)修飾的限制性內(nèi)切核酸酶位點、以及對選定多肽的重組形式的分子克隆、表達或純化有用的其它序列。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于確定受試者如人患者是否有風(fēng)險患上特征為有害細胞增殖或異常分化控制的疾病的方法。該方法包括在受試者的組織樣品中檢測特征為epsin樣基因中的至少一處突變或epsin樣基因錯誤表達的遺傳損傷的存在與否。
作為例證，可以由本發(fā)明的基因生成核苷酸探針以便于對完整組織和組織樣品進行組織學(xué)篩選，以確定ELP編碼轉(zhuǎn)錄本存在與否。針對ELP信使或基因組ELP序列的探針可用于在腫瘤或增生性疾病(如有害細胞生長)中可能顯示的等位基因突變的預(yù)測性和治療性評估。寡核苷酸探針可有助于確定可能涉及與epsin樣蛋白質(zhì)表達(或其缺乏)有關(guān)的一些異常的發(fā)育紊亂的分子基礎(chǔ)。例如，可以將多肽合成中的變化與編碼序列中的變異區(qū)分開。
例如，通過比較腫瘤組織與正常組織中ELP RNA表達的點印跡實驗，可以在幾種癌癥，特別是肺癌樣品、腎癌樣品、和胃癌樣品中發(fā)現(xiàn)ELP RNA的顯著下調(diào)。
在優(yōu)選實施方案中，診斷方法的特征是包括在受試者(如人患者)的組織樣品中檢測特征為下述中至少其一的遺傳損傷的存在與否(1)編碼epsin樣蛋白質(zhì)的基因的突變或(2)epsin樣蛋白質(zhì)的錯誤表達。作為例證，可以通過確定下述中至少一項的存在與否來檢測這些遺傳損傷(1)編碼epsin樣蛋白質(zhì)的基因中一個或多個核苷酸的刪除、(2)編碼epsin樣蛋白質(zhì)的基因中一個或多個核苷酸的添加、(3)編碼epsin樣蛋白質(zhì)的基因中一個或多個核苷酸的替代、(4)編碼epsin樣蛋白質(zhì)的基因的總?cè)旧w重排、(5)編碼epsin樣蛋白質(zhì)的基因的信使RNA轉(zhuǎn)錄本水平的總改變、(6)編碼epsin樣蛋白質(zhì)的基因的信使RNA轉(zhuǎn)錄本的非野生型剪接模式的存在、(7)epsin樣蛋白質(zhì)的非野生型水平、和(8)elp基因5′非翻譯區(qū)或3′非翻譯區(qū)中的突變。
在本發(fā)明的一個方面中，提供了探針/引物，其中包含含有能夠與SEQ ID NO1的有義或反義序列或其天然突變體或者與本發(fā)明基因天然有關(guān)的5′或3′側(cè)翼序列或內(nèi)含子序列雜交的核苷酸序列區(qū)域的寡核苷酸。將探針暴露于組織樣品的核酸；并檢測探針與樣品核酸的雜交。在某些實施方案中，損傷的檢測包括在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(參閱如美國專利號4,683,195和4,683,202)中或者在連接鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(Landegren、Kaiser等人，1988；Nakazawa、English等人，1994)中使用探針/引物，其中后者可能對于檢測基因中的點突變特別有用?；蛘?，可以采用免疫測定法來測定蛋白質(zhì)水平。
在一個優(yōu)選實施方案中，elp基因中的突變位于ENTH結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)域、elp基因的5′非翻譯區(qū)、或與ENTH結(jié)構(gòu)域緊鄰的基因區(qū)域中。
本發(fā)明的另一個方面提供了與epsin樣蛋白質(zhì)的表位特異反應(yīng)的抗體和抗體制劑。
例如，通過使用由ELP蛋白質(zhì)衍生的免疫原，如基于cDNA序列，可以通過標(biāo)準(zhǔn)方案生成抗蛋白質(zhì)/抗肽抗血清或單克隆抗體(Harlow和Lane，1988)?？梢杂妹庖咴孕问降碾?如脊椎動物多肽或能夠引發(fā)抗體應(yīng)答的抗原性片段)免疫哺乳動物，諸如小鼠、倉鼠、或兔。用于賦予蛋白質(zhì)或肽以免疫原性的技術(shù)包括與載體的綴合或本領(lǐng)域眾所周知的其它技術(shù)?？梢栽诖嬖谧魟r施用ELP蛋白質(zhì)的免疫原性片段?？梢酝ㄟ^檢測血漿或血清中的抗體滴度來監(jiān)測免疫過程?？梢悦庖咴鳛榭乖?，使用標(biāo)準(zhǔn)ELISA或其它免疫測定法來評估抗體水平。
在一個優(yōu)選實施方案中，抗體對于脊椎動物諸如哺乳動物的ELP蛋白質(zhì)的抗原性決定簇具有免疫特異性。用ELP蛋白質(zhì)的抗原性制劑免疫動物后，可以獲得抗ELP抗血清，如果需要，還可以由血清分離多克隆抗ELP抗體。為了生成單克隆抗體，可以由免疫動物收獲抗體生成細胞(淋巴細胞)，并通過標(biāo)準(zhǔn)體細胞融合流程與永生化細胞諸如骨髓瘤細胞融合以生成雜交瘤細胞。這些技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的，包括例如雜交瘤技術(shù)(最初由(Kohler和Milstein，1983)開發(fā))、人B細胞雜交瘤技術(shù)(Kozbar，1983)、和用于生成人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole，1985)?？梢栽诿庖呋瘜W(xué)上對雜交瘤細胞篩選與ELP蛋白質(zhì)特異反應(yīng)的抗體的生成，并由包含這些條交瘤細胞的培養(yǎng)物分離單克隆抗體。
術(shù)語抗體在用于本文時意欲包括其也可與一種ELP多肽特異反應(yīng)的片段?？梢允褂贸Ｒ?guī)技術(shù)將抗體片段化，并以與上文關(guān)于完整抗體所述相同的方式對片段篩選效用。例如，可以通過用胃蛋白酶處理抗體來生成F(ab)2片段?？梢蕴幚碛纱松傻腇(ab)2片段，以還原二硫鍵而生成Fab片段。本發(fā)明的抗體還意欲包括雙重特異性嵌合分子，它具有由該抗體的至少一個CDR區(qū)賦予的對ELP蛋白質(zhì)的親和力。
針對ELP多肽或ELP變體的單克隆和多克隆抗體(Ab)以及抗體片段諸如Fab和F(ab)2可用于阻斷一種或多種ELP蛋白質(zhì)的作用，并能夠用于研究這些蛋白質(zhì)在例如胚胎發(fā)生和/或不同組織維持中的作用。在一種相似方法中，可以將生成抗ELP單克隆抗體的雜交瘤或其中懸浮有抗ELP抗體的生物可降解凝膠植入意欲阻斷ELP作用的區(qū)域內(nèi)或其附近部位。這種性質(zhì)的實驗有助于闡述可能涉及生長調(diào)控的這種和其它因素的作用。抗體也非常適合于作為工具用于鑒定與ELP蛋白質(zhì)有關(guān)的疾病或其素質(zhì)的診斷測定法中，如通過檢測ELP蛋白質(zhì)表達的減弱或增強，通過檢測ELP蛋白質(zhì)的細胞錯誤定位，或者通過檢測個體的組織或體液樣品如血液中的異常ELP蛋白質(zhì)來進行。所述異常形式的ELP蛋白質(zhì)可能是例如不完全或不同剪接的結(jié)果，所生成的較短或較長的ELP蛋白質(zhì)具有與野生型ELP蛋白質(zhì)相比有所增強或減弱或不同的活性。此外，所述異常ELP蛋白質(zhì)形式可以是嵌合蛋白，其中全長ELP蛋白質(zhì)或其片段與另一種蛋白質(zhì)或其片段融合。所述嵌合蛋白可以來自例如兩種基因之間的刪除，或者是基因組重排的結(jié)果。本領(lǐng)域熟煉技術(shù)人員知道使用抗體在組織和/或體液樣品中檢測蛋白質(zhì)的合適方法。所述方法包括但不限于Western印跡、酶聯(lián)免疫吸收測定法(ELISA)、基于細胞的ELISA、免疫沉淀、帶或點印跡、放射免疫測定法、和熒光免疫測定法。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的蛋白質(zhì)和/或核酸(無論是全長或是期望片段)用于與ELP有關(guān)的過度增殖疾病的基因療法的用途。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易的選擇用于投遞的適當(dāng)載體。可以容易的由多種來源獲得基因治療載體，包括例如腺伴隨病毒(國際專利申請?zhí)朠CT/US91/03440)、腺病毒載體(Ishibashi、Brown等人，1993；Kay、Landen等人，1994)、或其它病毒載體，如各種痘病毒、牛痘、等。用于插入期望基因如BAP-1并獲得所編碼蛋白質(zhì)的體內(nèi)表達的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)和/或核酸也適合于過度增殖疾病的治療，如采取藥物制劑的形式。如果需要，藥物制劑可以與輔助性試劑混合，如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、用于調(diào)整滲透壓的鹽、緩沖劑、染料、香料和/或芳香劑等等不與活性化合物發(fā)生有害反應(yīng)的物質(zhì)。
可以通過注射(即皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腫瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)，優(yōu)選肌肉內(nèi))、口服、吸入、經(jīng)皮應(yīng)用、局部施用、或直腸施用來施用蛋白質(zhì)，優(yōu)選注射、經(jīng)皮或局部施用。根據(jù)施用路徑，可以將制藥學(xué)組合物中的肽包被在某種材料中以保護它們免于某些酶的作用。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟悉適合于將肽投遞至特定部位的包被層。組合物中還可以包含有機物以延長肽的藥理學(xué)作用。這些有機物的范例包括非抗原性明膠、羧甲基纖維素、藻酸的磺酸或磷酸酯、葡聚糖、聚乙二醇和其它乙二醇、植酸、聚谷氨酸、和魚精蛋白。
出于治療目的，同樣可以以與適當(dāng)載體分子的綴合物的形式施用活性ELP肽或其片段。載體分子能夠增強細胞對ELP肽的攝取而進入細胞和/或?qū)LP肽投遞至特定靶細胞如腫瘤細胞。合適的載體分子是例如轉(zhuǎn)鐵蛋白或病毒的細胞侵入蛋白。
本發(fā)明還涉及可用于下調(diào)ELP分子在細胞中的表達的反義分子。反義試劑可以是反義寡核苷酸(ODN)、尤其是具有來自天然核酸的化學(xué)修飾的合成ODN、或?qū)⑦@些反義分子表達成RNA的核酸構(gòu)建物。反義序列與靶基因的mRNA互補，并抑制靶基因產(chǎn)物的表達。反義分子通過多種機制抑制基因表達，如通過降低可用于翻譯的mRNA的量、通過激活RNA酶H、或者通過空間位阻?？梢允┯梅戳x分子之一或組合，其中組合可以包含多種不同序列。
可以通過在適當(dāng)載體中表達所有或部分靶基因序列來生成反義分子，其中轉(zhuǎn)錄起始的朝向使得將反義鏈生成RNA分子?；蛘?，反義分子是合成寡核苷酸。反義寡核苷酸的長度一般是至少大約7個、常常是至少大約12個、更常見的是至少大約20個核苷酸，而且長度不超過大約500個、常常不超過大約50個、更常見的是不超過大約35個核苷酸，其中長度受到抑制效率、特異性(包括交叉反應(yīng)性的缺乏)、等等的限制。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)長度為7-8個堿基的短寡核苷酸可以是基因表達的有效選擇性抑制劑(參閱(Wagner、Matteucci等人，1996))。
本發(fā)明的另一個方面涉及通過RNA干擾(RNAi)手段使elp基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄后沉默。RNAi是已經(jīng)在植物、線蟲、無脊椎動物生物體和哺乳動物細胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的由短雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的一種形式(Ngo、Tschudi等人，1998；Vaucheret和Fagard，2001；Kennerdell和Carthew，1998；Caplen、Fleenor等人，2000；Elbashir、Harborth等人，2001；Timmons、Court等人，2001)。雙鏈RNA(dsRNA)顯示可誘導(dǎo)降解反應(yīng)，其中與短dsRNA互補的單鏈RNA快速降解(Montgomery和Fire，1998；Montgomery、Xu等人，1998)。RNAi由此可用于降低基因表達，例如在完整生物體或者無脊椎動物和脊椎動物細胞系中的基因表達(Kennerdell和Carthew，1998；Caplen、Fleenor等人，2000；Clemens、Worby等人，2000；Elbashir、Harborth等人，2001)?？梢杂蒫DNA或基因組DNA模板生成ELP dsRNA，只要dsRNA中的大部分對應(yīng)于外顯子區(qū)域即可。通常，700-800堿基對的靶區(qū)域是活性最高的。然而，已知短至200堿基對和長至2000堿基對的dsRNA也具有有力的干擾活性?？梢杂擅恳欢硕及鏣7、SP6、或T3啟動子的PCR片段同時合成RNA的兩條鏈。可以通過用包含例如T7聚合酶結(jié)合位點的2種引物擴增ELP cDNA或基因組DNA來生成這種PCR片段。然后可以用包含ELP序列的合適模板進行PCR反應(yīng)。Taq聚合酶生成最高產(chǎn)量，但是也可以使用另一種聚合酶像Pfu。前10個循環(huán)應(yīng)當(dāng)包含40℃退火步驟，隨后的35個循環(huán)包含55℃退火步驟。需要時，可以添加DMSO至終濃度5％。苯酚-氯仿抽提和NH4OAc中的乙醇沉淀可用于將PCR模板與反應(yīng)混合物分離，然而也可以使用其它商品化PCR純化試劑盒?？梢栽诤?μg PCR DNA模板的50μl體積中使用適當(dāng)?shù)腞NA聚合酶進行RNA合成反應(yīng)。購自Ambion的MEGAscriptTM試劑盒效果很好。RNA在合成反應(yīng)過程中變成雙鏈。可以用不含RNA酶的DNA酶除去DNA模板，并且可以通過酚-氯仿抽提和乙醇沉淀來純化dsRNA。來自1μgDNA模板的常規(guī)RNA產(chǎn)量范圍為80-120μg。dsRNA可以作為NaOAc/乙醇沉淀保存于-80℃直至使用。
可以通過在TBE中進行非變性瓊脂糖凝膠電泳來監(jiān)測dsRNA的質(zhì)量。只能使用其中大部分RNA的電泳遷移率都轉(zhuǎn)變成適當(dāng)長度dsRNA的期望遷移率(非常接近雙聯(lián)體DNA遷移率)的制劑。為了降低哺乳動物細胞中的ELP表達，應(yīng)當(dāng)優(yōu)先使用20-23mer的短dsRNA(Elbashir、Harborth等人，2001；Elbashir、Lendeckel等人，2001)。這些短dsRNA具有(Elbashir、Harborth等人，2001)中描述的3′突出，而且可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法在體外合成。
可以在文獻中找到用于將dsRNA導(dǎo)入細胞的幾種方法，而且所述方法對于本領(lǐng)域熟煉技術(shù)人員而言是知道的。
現(xiàn)在通過實施例的手段進一步例示本發(fā)明。
提供這些實施例只是作為本發(fā)明各個方面的例示，而不應(yīng)當(dāng)認為是以任何方式限制本發(fā)明。
實施例為了鑒定特異性地參與細胞、組織和生物體水平上的生長的基因，發(fā)明人在果蠅中采用了遺傳方法。他們在基因組范圍內(nèi)篩選阻礙或促進細胞生長且不影響細胞分化的隱性突變。這些篩選利用了生成遺傳嵌合果蠅的組織特異性重組系統(tǒng)(Newsome、Asling等人，2000)。這些果蠅對于頭部組織中的隨機誘導(dǎo)突變而言是純合的，但是對于身體和種系中的相同突變而言是雜合的。其產(chǎn)物選擇性促進生長的基因(致癌基因)中的突變將生成小頭果蠅，而其產(chǎn)物發(fā)揮生長抑制功能的基因(腫瘤抑制基因)中的突變將生成頭比正常大的果蠅。
這種篩選的有效性通過鑒定編碼雷帕霉素作用靶(TOR)的基因中引起小頭表型的突變和編碼腫瘤抑制基因PTEN的基因中引起大頭表型的突變而得到例證(Huang、Potter等人，1999；Oldham、Montagne等人，2000)。
實施例1針頭篩選(pinhead screening)胰島素受體信號途徑的成分中的突變以細胞自主方式削弱細胞生長(Bohni、Riesgo-Escovar等人，1999；Verdu、Buratovich等人，1999；Weinkove、Neufeld等人，1999；Brogiolo、Stocker等人，2001)。突變細胞的克隆具有嚴重的生長缺陷，而且與它們的野生型姐妹克隆相比顯得較小。如果通過持續(xù)提供flp重組酶來促使有絲分裂重組的發(fā)生而且通過細胞致死突變的手段消除姐妹克隆，那么這些克隆可能覆蓋整個器官的實質(zhì)部分。在無眼調(diào)控序列的控制下驅(qū)動flp重組酶的表達導(dǎo)致只在眼成蟲盤中形成組織特異性克隆。聯(lián)合同源染色體上的細胞致死突變后，該系統(tǒng)能夠生成主要由對于目的基因而言是純合突變體的細胞組成的眼和頭殼(Newsome、Asling等人，2000)。這些在眼成蟲盤的后代中特異缺乏IRS同系物Chico或胰島素受體(Inr)的功能的嵌合果蠅顯示非常有特點的表型。盡管它們的身體是正常大小的，但是眼和頭顯著縮小(Bohni、Riesgo-Escovar等人，1999；Brogiolo、Stocker等人，2001)。為了根據(jù)相似表型鑒定生長調(diào)控基因中的突變，將在第3條染色體右臂基部附近攜帶flp重組酶靶位點的雄性果蠅(82FRT)進行EMS誘變并與引入以下四種元素的雌性果蠅進行雜交重組酶(ey-flp)來源、對應(yīng)位置的FRT位點、顯性眼標(biāo)記(w+)和細胞致死突變(c13R3)。在F1代的嵌合果蠅中，可以在頭和眼中觀察到在3R上最新誘導(dǎo)的突變的純合性的結(jié)果。易于通過喪失色素標(biāo)記w+而導(dǎo)致白眼組織來顯現(xiàn)純合突變組織的存在。
篩選嵌合果蠅依照標(biāo)準(zhǔn)方案，用33mM EMS喂養(yǎng)第3條染色體右臂攜帶FRT位點的雄性果蠅(FRT82；Xu和Rubin，1993)，并與基因型y w ey-flp；FRT82w+c13R3/TM6B y+的雌性果蠅交配。c13R3是已經(jīng)在FRT82 w+染色體上生成的隱性細胞致死突變(Newsome、Asling等人，2000)。半數(shù)F1后代的基因型是y w ey-flp/+或Y；FRT82*/FRT82 w+c13R3，并對異常大小的眼和頭進行評分。將陽性后代與y w ey-flp；FRT82 w+c13R3/TM6B y+回交以檢查種系傳遞。篩選了大約50,000只嵌合果蠅以達到飽和，鑒定了引起大頭表型的69種突變。
互補組分析引起大頭表型的69種突變中的52種歸入9個互補組。互補組定義為一些(至少兩個)等位基因，它們的任何成對組合都不能彌補與每個等位基因的純合性有關(guān)的致死性。屬于這些互補組中四個組的突變導(dǎo)致過度增殖表型超額數(shù)小眼引起褶的形成，使眼產(chǎn)生腫瘤外觀(圖1，右圖)。
減數(shù)分裂和SNP作圖顯示過度增殖表型的四個互補組之一由四個等位基因組成。使用下面的遺傳標(biāo)記對一個代表性等位基因進行減數(shù)分裂作圖在細胞學(xué)位置87E攜帶P元件的微型w+、在90E攜帶P元件的w+、和在96E攜帶P元件的y+(Xu和Rubin，1993)。使用相同區(qū)域內(nèi)的缺陷通過互補分析確認該粗略的作圖定位并精制。通過評估等位基因與附近經(jīng)標(biāo)記P元件插入片段之間的重組頻率來進行更高限制性的作圖。用于作圖的P元件是EP(3)0738(94A1-2)、1(3)j5B5(94A1-2)和1(3)L3560(94A5-7)。通過這種方式，能夠?qū)⑼蛔兊倪z傳位置縮小至染色體位置94A，極其接近P元件插入點1(3)L3560。
遺傳分析將突變位點定位于支架AE003738內(nèi)大約120kb(第344000-464000位核苷酸)的300kb間隔中。為了明確測定突變的分子位點，使用SNP作為該特定區(qū)域內(nèi)的分子標(biāo)記對重組體作圖。使用WAVE系統(tǒng)(Underhill，Jin等人，1996)通過變性HPLC分析來解析SNP。將突變位點縮小至30kb間隔。使用WAVE系統(tǒng)通過分析候選基因及隨后的測序鑒定了突變的準(zhǔn)確位置。
實施例2ELP在黑腹果蠅中的表達可以在果蠅中在整個生物體中、在特定器官中、或在特定細胞類型中在整個生命過程中或只在特定發(fā)育階段以不同水平表達特定轉(zhuǎn)基因?？梢栽?Brand，1993；Perrimon，1998；Perrimon，1998)中找到果蠅遺傳學(xué)中所使用的標(biāo)準(zhǔn)方法的綜述。作為推定的腫瘤抑制基因，預(yù)計野生型或突變型ELP蛋白質(zhì)的過度表達會干擾生長。為了證明這個假設(shè)，將攜帶UAS轉(zhuǎn)基因(編碼野生型果蠅ELP蛋白質(zhì))的轉(zhuǎn)基因果蠅與在不同組織特異性啟動子控制下表達Gal4的果蠅交配(圖6和表2)。Gal4驅(qū)動的構(gòu)建物包括但不限于無眼-Gal4、殘翅-Gal4(vestigal-Gal4)、MS1096-Gal4(Capdevila和Guerrero，1994)。通過相似方式，有可能測試具有氨基酸替代或內(nèi)部刪除的突變型蛋白質(zhì)的功能。

表2DELP在不同組織中的過度表達將攜帶delp的兩個獨立插入片段的轉(zhuǎn)基因果蠅分別與第一行所示Gal4來源交配，從而在各種組織中過度表達dELP?？s寫vs eye omm#↓眼很小，復(fù)眼數(shù)目減少；+/-veins翅脈增加或減少；ru.wings殘翅，很??；no vis.ph.無可見表型。
根據(jù)通過過度表達野生型(見圖6)或突變型ELP獲得的可見表型，該系統(tǒng)可用于進行ELP蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)/功能分析。這種表型還可用于篩選其它基因中導(dǎo)致表型抑制的功能突變的顯性或隱性喪失?；蛘撸梢允褂迷鰪娮?啟動子(EP)元件(Rorth，1996)篩選過度表達時抑制表型的基因。在這種情況中，隨機基因的過度表達是通過將EP元件整合到該基因的5′端引起的。
實施例3人同源物的克隆通過使用程序Blastp(http//www.ch.embnet.org/software/aBLAST.html)對公開的序列數(shù)據(jù)庫搜索與dELP序列具有同源性的預(yù)測編碼序列和表達序列標(biāo)簽(EST)，鑒定了人ELP(hELP)(SEQ IDNO1、2、5)。dELP對染色體V上的預(yù)測基因和幾個EST顯示統(tǒng)計學(xué)上顯著的相似性。由來自Resgen(編號AL529948克隆IDCD0DD005YJ09文庫LTI NFL001 NBC4)的全長人cDNA克隆集合獲得了hELP全長cDNA。這些cDNA集合衍生自使用寡聚dT引物和SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶構(gòu)建的文庫。裝配過程之后，通過與基因組DNA序列和公開數(shù)據(jù)的交叉檢查而確認了序列。
為了確認果蠅與人ELP之間的功能同源性，將人和果蠅全長ELPcDNA克隆到果蠅表達載體中，像pUAS轉(zhuǎn)化載體(Phelps和Brand，1998)?？梢砸勒?Basler和Hafen，1988)中描述的方法生成轉(zhuǎn)基因果蠅。轉(zhuǎn)基因交配到對于兩個elp突變型等位基因之任一而言為反式雜合的果蠅中，其中還包含能夠普遍或組織和/或階段特異表達UAS-轉(zhuǎn)基因的Gal4轉(zhuǎn)基因。該Gal4轉(zhuǎn)基因包括但不限于肌動蛋白-Gal4、微管蛋白-Gal4、和熱休克-Gal4。如表1所示，由幼蟲晚期至蛹階段，果蠅和人轉(zhuǎn)基因的普遍表達確實至少部分挽救了與elp突變型等位基因的反式雜合性有關(guān)的致死性。這說明help基因是果蠅elp基因的功能同源物(見圖6)。

表1通過普遍存在的ELP過度表達對delp等位基因的挽救分析將UAS-Elp轉(zhuǎn)基因用于在反式雜等位基因純合突變的情況中過度表達Elp。所用UAS-Elp轉(zhuǎn)基因2.4aUAS-hElp18aa；5.20dUAS-DElp-ENTH。所用Elp等位基因Delp1G1V266F突變；Delp4K2E27G突變；Delp1U15′UTR轉(zhuǎn)變；Delp2W25′UTR轉(zhuǎn)變。所用Gal4來源armGal4犰狳Gal4；hsGal4熱休克Gal4；Act5CGal4肌動蛋白5C-Gal4。UAS轉(zhuǎn)基因和Gal4株用w+標(biāo)記。
或者，可以在包含微管蛋白啟動子的轉(zhuǎn)化載體的下列序列中插入果蠅和人全長cDNA微管蛋白啟動子-FRT-cDNA終止子-FRT-Gal4(縮寫tub＞cDNA＞Gal4)。通過這種方式，挽救轉(zhuǎn)基因受到微管蛋白啟動子的直接控制，導(dǎo)致ELP表達的生理學(xué)水平低于或可能高于Gal4體系。另外，在ELP突變體背景中，可以通過在熱休克誘導(dǎo)型啟動子或組織特異性啟動子的控制下表達FLP重組酶而在細胞克隆中切除elpcDNA。以這種方式生成的突變細胞可以通過UAS-GFP報道分子的手段得到識別，因為在這些細胞中Gal4是由微管蛋白啟動子驅(qū)動的。Kramps等人(Cell，10947-60，2002)最近描述了這種方法。
實施例4ELP DNA作為雜交探針的用途下面的方法描述了elp的非重復(fù)性核苷酸序列作為雜交探針的用途。該方法還可用于篩選ELP同系物。采用包含elp序列(如SEQ ID NO1和3所示)的DNA作為探針，用于篩選同源DNA(諸如cDNA或基因組文庫中所包含的)。
在標(biāo)準(zhǔn)的高嚴謹度條件(Sambrook、Fritsch等人，1989)下進行包含文庫DNA的濾膜的雜交和清洗。陽性克隆可用于進一步篩選更大的cDNA文庫平板。隨后將代表性cDNA克隆克隆到pBluescript(pBS，Stratagene)或相似克隆載體中，并測序。
實施例5elp作為雜交特征用于原位雜交的用途可以如(Tautz和Pfeifle，1989)所述在胚胎中進行果蠅elp mRNA的原位雜交。然而，進行微小修改后，它還可用于在果蠅或脊椎動物組織切片中檢測任何mRNA轉(zhuǎn)錄本。例如使用DIG RNA標(biāo)記試劑盒(SP6/T7)(Boehringer Mannheim)或32P標(biāo)記法，遵循制造商的建議，可以由線性化elp cDNA或其片段制備經(jīng)標(biāo)記RNA探針。使用help作為雜交探針，可用類似方法篩選人組織(見圖4和5)。
實施例6ELP蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達下面的方法描述了ELP在細菌細胞中的重組表達?；蛘?，可以由昆蟲和哺乳動物細胞生成并分離重組蛋白(Sambrook、Fritsch等人，1989)。將編碼全長或截短ELP形式的DNA融合在誘導(dǎo)型細菌表達載體所包含的表位標(biāo)簽或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)cDNA和凝血酶切割位點的下游。這些表位標(biāo)簽包括聚組氨酸、S蛋白質(zhì)、硫氧還蛋白、和免疫球蛋白標(biāo)簽?？梢圆捎枚喾N質(zhì)粒，包括商品化的質(zhì)粒，諸如pGEX-4T(Pharmacia)。
簡而言之，通過常規(guī)方法將包含ELP序列(例如與GST序列融合)的細菌表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到蛋白酶缺陷的大腸桿菌中，諸如BL21(如Stratagene)。然后將包含質(zhì)粒的細菌菌落在選擇培養(yǎng)基中擴增過夜以達到飽和。第二天上午，將此培養(yǎng)物1∶100稀釋，并使細菌生長至光密度(OD600)為0.6。添加控制GST-ELP融合蛋白表達的啟動子的誘導(dǎo)劑來啟動蛋白質(zhì)生成。根據(jù)所用表達載體可以采用多種誘導(dǎo)劑，包括IPTG。
然后可以純化表達的GST標(biāo)記-ELP，例如使用親和珠或親和層析，諸如谷胱甘肽珠(如購自Pharmacia)。如下通過裂解表達Lgs的細菌來制備提取物，即將細胞懸浮于超聲處理緩沖液(10mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、1mM EDTA、1.5％肌氨酰、2％屈力通-X-100、1mMDTT和蛋白酶抑制劑)中，隨后在冰上短暫超聲處理(如3次，每次20秒，中等力度)，并離心。然后將澄清的上清液在溫和旋轉(zhuǎn)下例如與谷胱甘肽珠一起于4℃保溫1小時。接著將珠用清洗緩沖液(20mMTris-HCl pH8.0、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、1mM MgCl2、0.5％NP40)清洗幾次，并最終保存于儲存緩沖液(20mM Tris-HClpH8.0、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、1mM MgCl2、10％甘油、0.5％NP40、和蛋白酶抑制劑)中?；蛘撸梢允褂肗i2+螯合物親和層析或者使用蛋白A或蛋白G柱層析而分別純化組氨酸標(biāo)記或IgG標(biāo)記的ELP。
可以通過例如SDS凝膠電泳和銀染或Western印跡來檢查制劑的質(zhì)量。
在必須切除所標(biāo)記的表位的情況下，根據(jù)標(biāo)記的表位與ELP蛋白質(zhì)之間存在的切割位點可以使用幾種方法。例如，有可能生成正好在ELP第一個氨基酸之前包含凝血酶切割位點的GST-ELP融合蛋白。簡而言之，將谷胱甘肽親和珠上的GST-ELP制劑用切割緩沖液(50mMTris-HCl pH7.0、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT)清洗幾次。然后添加凝血酶，并將樣品于室溫保溫超過16小時。然后收集上清液，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染或Western印跡分析對來自珠的ELP的成功切割。如(Harlw和Lane，1988)中所述，純化的蛋白質(zhì)可用于例如生成抗ELP抗體。
實施例7涉及ELP的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用體外免疫共沉淀測定法可用于尋找或確認ELP相互作用配偶體。例如，通過脂轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)化50％匯合的HEK293細胞。為此目的，遵循制造商的建議，將包含編碼經(jīng)標(biāo)記的ELP和潛在相互作用配偶體的cDNA的哺乳動物表達載體與Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑(Life Technologies公司)混合，并覆蓋到細胞單層上。轉(zhuǎn)染25小時后，在co-IP緩沖液(20mMTris-HCl pH7.5、140mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM EDTA、1mM DTT、1％屈力通-X-100、10％甘油、1mM釩酸鈉、50mM NaF、和蛋白酶抑制劑)中裂解細胞。在co-IP中使用與蛋白質(zhì)G-瓊脂糖(BoehringerMannhaim)綴合的抗標(biāo)記抗體(如抗HA，克隆3F10，BoehringerMannheim)進行免疫沉淀。使用大鼠或小鼠IgG(Sigma-Aldrich)進行對照免疫沉淀。于4℃保溫3小時后，將珠用清洗緩沖液(20mMTris-HCl pH7.5、140mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM EDTA、1mM DTT、1％屈力通-X-100、1mM釩酸鈉、50mM NaF)清洗4次，并重懸于25μlLaemmli緩沖液中。通過SDS-PAGE/免疫印跡測定法使用由本發(fā)明提供的抗ELP多克隆抗體或抗標(biāo)簽抗體及隨后的與辣根過氧化物酶綴合的二抗(Amersham Pharmacia Biotech)分析免疫復(fù)合物?？梢允褂迷鰪姷幕瘜W(xué)發(fā)光檢測方法(如ECL，Amersham Pharmacia Biotech)來進行檢測。
可以進行GST融合蛋白體外結(jié)合測定法來例如對結(jié)合結(jié)構(gòu)域作圖、確認相互作用配偶體、或?qū)ふ翌~外的相互作用蛋白質(zhì)。為此目的，遵循制造商提供的指示，使用包含[35S]甲硫氨酸的網(wǎng)織紅細胞裂解物(TNT-裂解物，Promega Corporation)在體外翻譯(IVT)蛋白質(zhì)。將如實施例6所述生成的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白固定在谷胱甘肽-Sepharose上并在結(jié)合緩沖液(20mM Tris pH8.0、200mM NaCl、1mMEDTA、1mM DTT、1mM MgCl2、10％甘油、0.5％NP40、0.05％BSA、和蛋白酶抑制劑)中封閉45分鐘。然后將2μg固定化的GST蛋白質(zhì)與0.5-4μl IVT蛋白質(zhì)在結(jié)合緩沖液中一起保溫1.5小時。將珠用清洗緩沖液(20mM Tris pH8.0、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、1mMMgCl2、0.5％NP40)清洗4次，并在Laemmli SDS樣品緩沖液中煮沸。必須通過SDS-PAGE分析分別使用考馬斯染色或放射自顯影確認使用了等量的完整GST融合蛋白與cDNA的成功IVT。
可額外進行酵母雙雜交測定法，以確認上文所述體外結(jié)合測定法的結(jié)果，或者用于對cDNA文庫篩選新的相互作用配偶體(Fields和Sternglanz，1994)。為了確認特異結(jié)合或定位ELP與相互作用配偶體之間的結(jié)合區(qū)域，將期望cDNA亞克隆到將其連接Lex DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(如pLexA，Clontech)或酸激活結(jié)構(gòu)域(如pGJ4-5，Clontech)的適當(dāng)酵母表達載體中。然后通過醋酸鋰-聚乙二醇法將適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒對與報道質(zhì)粒(如pSH18-34，Clontech)一起轉(zhuǎn)化到適當(dāng)酵母菌株(如EGY48)中并在選擇性培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)(Sambrook、Fritsch等人，1989)。如所用載體-報道質(zhì)粒的制造商所述分析轉(zhuǎn)化子的報道基因活性。為了確定重復(fù)性，在兩個方向上都測試相互作用。
為了分離新的ELP結(jié)合蛋白(Bartel、Fields，《The Yeast two-HybridSystem》即《酵母雙雜交系統(tǒng)》，Oxford UP，1997)，用β-半乳糖苷酶報道質(zhì)粒、與LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列融合的包含ELP cDNA或其部分的酵母表達載體(“誘餌載體”)以及包含與cDNA序列集合融合的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的第二種酵母表達載體(“獵物載體”庫，如RFLY10-12h胚胎文庫，PNAS，93，3011及其后中所述)轉(zhuǎn)化適當(dāng)酵母菌株。然后將包含報道質(zhì)粒以及誘餌和獵物載體的三重轉(zhuǎn)化子在選擇性培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，并選擇營養(yǎng)缺陷型和β-半乳糖苷酶報道分子的相互作用依賴性激活。由選擇的克隆再次分離各個獵物構(gòu)建物，并通過檢查不存在與無關(guān)誘餌構(gòu)建物的相互作用來評估誘餌/獵物相互作用的特異性。最后，將經(jīng)過確認的相互作用物測序，裝配全長cDNA，并再次測試與誘餌的特異相互作用。
實施例8免疫組織化學(xué)可以使用本發(fā)明提供的抗ELP抗體在果蠅胚胎、成蟲盤、成熟組織切片、脊椎動物腫瘤細胞系、或脊椎動物組織上進行ELP蛋白質(zhì)的定位。例如，若使用經(jīng)轉(zhuǎn)化細胞系像HEK293細胞(ATCC)，則將細胞接種到用聚賴氨酸包被的8孔板(Nalge-Nunc國際公司)中，并于37℃培養(yǎng)過夜。第二天，將細胞用3.7％甲醛在PBS中固定10分鐘，在0.5％屈力通-X-100中透化處理10分鐘，并用1∶1000稀釋的預(yù)免疫血清在2％BSA-PBS中于室溫封閉1小時。然后將細胞與1∶2000稀釋的由本發(fā)明提供的抗ELP多克隆兔免疫血清于室溫保溫2小時。將載玻片用PBS清洗3次，每次5分鐘，并與1∶200稀釋(v/v)的與TRITC綴合的豬抗兔免疫球蛋白(Dako公司)一起保溫。重復(fù)清洗步驟后，使用Vectashield封裝介質(zhì)(Vector Laboratories公司)覆蓋蓋玻片。作為特異染色的陽性對照，可以通過例如脂轉(zhuǎn)染法用ELP表達質(zhì)粒諸如pcDNA3.1(Invitrogen)轉(zhuǎn)染部分細胞。轉(zhuǎn)染后兩天，如上所述用抗ELP抗體將對照細胞染色。
實施例9RNA干擾實驗
RNA干擾(RNAi)是已經(jīng)在植物、線蟲、無脊椎動物生物體和哺乳動物細胞培養(yǎng)物中得到描述的、由短雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的一種形式(Ngo、Tschudi等人，1998；Vaucheret和Fagard，2001；Kennerdell和Carthew，1998；Caplen、Fleenor等人，2000；Elbashir、Harborth等人，2001；Timmons、Court等人，2001)。dsRNA顯示可誘導(dǎo)降解反應(yīng)，其中與短dsRNA互補的單鏈RNA快速降解(Montgomery和Fire，1998；Montgomery、Xu等人，1998)。RNAi由此可用于降低基因表達，例如用于降低完整生物體或者無脊椎動物和脊椎動物細胞系中的基因表達(Kennerdell和Carthew，1998；Caplen、Fleenor等人，2000；Clemens、Worby等人，2000；Elbashir、Harborth等人，2001)?？梢栽谖墨I中找到用于將dsRNA導(dǎo)入細胞的幾種方法。作為范例，我們在本文中描述了用delp dsRNA處理果蠅細胞。
制備ELP dsRNA可以由cDNA或基因組DNA模板生成ELP dsRNA，只要大部分dsRNA對應(yīng)于外顯子區(qū)域即可。通常，700-800堿基對的靶區(qū)域是活性最高的。然而，已知短至200堿基對和長至2000堿基對的dsRNA也具有有力的干擾活性?？梢杂擅恳欢硕及鏣7、SP6、或T3啟動子的PCR片段同時合成RNA的兩條鏈?？梢酝ㄟ^用包含例如T7聚合酶結(jié)合位點的2種引物擴增ELP cDNA或基因組DNA來生成這種PCR片段。引物互補序列的長度應(yīng)當(dāng)是20-24個核苷酸，22個核苷酸是最佳的，且Tm為60℃是最佳的。每種引物的5′端應(yīng)當(dāng)對應(yīng)于例如27個核苷酸的T7啟動子序列。然后可以用包含ELP序列的合適模板進行PCR反應(yīng)。Taq聚合酶生成最高產(chǎn)量，但是也可以使用另一種聚合酶像Pfu。前10個循環(huán)應(yīng)當(dāng)包含40℃退火步驟，隨后的35個循環(huán)包含55℃退火步驟。需要時，可以添加DMSO至終濃度5％。苯酚-氯仿抽提和NH4OAc中的乙醇沉淀可用于將PCR模板與反應(yīng)混合物分離，然而也可以使用其它商品化PCR純化試劑盒?？梢栽诤?μg PCR DNA模板的50μl體積中使用適當(dāng)?shù)腞NA聚合酶進行RNA合成反應(yīng)。購自Ambion的MEGAscriptTM試劑盒效果很好。RNA在合成反應(yīng)過程中變成雙鏈?？梢杂貌缓琑NA酶的DNA酶除去DNA模板，并且可以通過酚-氯仿抽提和乙醇沉淀來純化dsRNA。來自1μg DNA模板的常規(guī)RNA產(chǎn)量范圍為80-120μg。dsRNA可以作為NaOAc/乙醇沉淀保存于-80℃直至使用。
可以通過TBE中的非變性瓊脂糖凝膠電泳來監(jiān)測dsRNA的質(zhì)量。只能使用其中大部分RNA的電泳遷移率都轉(zhuǎn)變成適當(dāng)長度dsRNA的期望遷移率(非常接近雙聯(lián)體DNA遷移率)的制劑。
將ELP dsRNA轉(zhuǎn)染到果蠅S2細胞中在補充10％FCS的Schneider S2果蠅培養(yǎng)基(GIBCO)中擴增S2細胞。轉(zhuǎn)染前一天，將1百萬個細胞接種到6孔板中，并于25℃培養(yǎng)過夜。然后使用陽離子脂質(zhì)CellFectine(GIBCO)使用制造商方案的改版轉(zhuǎn)染細胞。簡而言之，將合計5μg DNA和dsRNA與20μl CellFectine脂質(zhì)混合物在1.2ml無血清生長培養(yǎng)基(如DES表達培養(yǎng)基，Invitrogen，卡爾斯巴德，美國)中復(fù)合。將復(fù)合物于室溫保溫15分鐘，然后加到細胞中，并用1ml無血清培養(yǎng)基更換普通的生長培養(yǎng)基。4小時后，向細胞中加入1.2ml補充30％FCS的生長培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后一天，用含10％FCS的新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后2天開始可以對細胞進行測定(如ELP蛋白質(zhì)水平或Tcf轉(zhuǎn)錄活性)。
類似的，可以使用(Elbashir、Harborth等人，2001)中描述的方法降低哺乳動物的ELP表達。
實施例10候選輔助剪接變體和嵌合est的鑒定和克隆在公開的est數(shù)據(jù)庫中找到了ELP的兩種人est異構(gòu)體短和長的形式。短的那種缺乏接近C末端的54個堿基，可能是由于不同或不全的剪接(圖3)。通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)使用基因特異引物和est/cDNA克隆(短BE615647、BE61693、BG528377；長cDNA克隆AL529948)克隆這兩種異構(gòu)體。
help位于在一些類型的癌癥中頻繁刪除的染色體區(qū)域5q中(Genomics，2000年5月15日，66(1)26-34)。推測與特定綜合癥有關(guān)的這個染色體區(qū)域中遺傳材料的丟失提示腫瘤發(fā)生的隱性機制，而且刪除的染色體條帶包含腫瘤抑制基因。ELP的生長抑制活性指示ELP可能是該區(qū)域中的腫瘤抑制基因。
為了支持這種假說，發(fā)明人通過對由公開數(shù)據(jù)庫訂購的一種hELPest進行完整測序找到了由h-ELP的C端與AF156165融合而組成的一種嵌合est，即通過對5q染色體區(qū)域作圖而發(fā)現(xiàn)的一種基因(Genomics，2000年5月15日，66(1)26-34)。h-ELP和AF156165分別位于區(qū)域5q23與5q33之間和5q31與5q32之間。嵌合est可能來自這兩種基因之間的刪除，并生成缺乏ENTH結(jié)構(gòu)域的不全ELP蛋白質(zhì)。
實施例11正常與腫瘤組織中的ELP RNA表達將癌癥表征陣列(BD Biosciences目錄編號7841-1)膜與5′標(biāo)記的hELP探針(第751-1951位核苷酸)進行雜交。雜交在68℃依照制造商的建議進行，最后一次清洗使用0.2x SSC和0.5％SDS在68℃進行15分鐘。樣品參考見BD Bioscience產(chǎn)品目錄。圖5中顯示了一組正常與腫瘤組織中ELP RNA表達的斑點印跡，顯示hELP轉(zhuǎn)錄本的表達，下文表3概述了ELP表達升高或降低的腫瘤的百分比。

*腫瘤與正常組織相比表3圖5數(shù)據(jù)的概述在大多數(shù)肺、腎、和胃癌樣品中觀察到help mRNA表達相對于它們各自正常組織顯示降低。在所有肺癌的3/4左右和超過1/2的腎和胃癌樣品中發(fā)現(xiàn)ELP RNA下調(diào)(指示潛在的腫瘤抑制功能“腫瘤希望擺脫它”)。
盡管顯示并描述了本發(fā)明的當(dāng)前優(yōu)選實施方案，需要清楚理解的是本發(fā)明不限于這些實施方案，而是可以在下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)以其它方式多種多樣的體現(xiàn)和實踐本發(fā)明。
本文完整收錄貫穿整篇說明書所引用的所有文獻/發(fā)表物的公開內(nèi)容作為參考。
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<400> 1ggcacgaggc ggaagtgttc cggggtccgt ggggagcagg agagggaggc ggcggaccgt 60cccgcgcggg gcacg atg ttg aac atg tgg aag gtg cgc gag ctg gtg gac 111Met Leu Asn Met Trp Lys Val Arg Glu Leu Val Asp1 5 10aaa gcc acc aat gtt gtt atg aat tat tca gag atc gag tct aag gtt159Lys Ala Thr Asn Val Val Met Asn Tyr Ser Glu Ile Glu Ser Lys Val15 20 25cga gag gca acg aac gat gat cct tgg gga cct tct ggg caa ctc atg207Arg Glu Ala Thr Asn Asp Asp Pro Trp Gly Pro Ser Gly Gln Leu Met30 35 40gga gag att gcc aag gct aca ttt atg tat gaa caa ttt cca gaa ctt255Gly Glu Ile Ala Lys Ala Thr Phe Met Tyr Glu Gln Phe Pro Glu Leu45 50 55 60atg aac atg ctt tgg tca cga atg tta aaa gac aac aaa aag aat tgg303Met Asn Met Leu Trp Ser Arg Met Leu Lys Asp Asn Lys Lys Asn Trp65 70 75aga aga gtt tat aag tcg ttg ctg ctc cta gct tac ctc ata agg aat351Arg Arg Val Tyr Lys Ser Leu Leu Leu Leu Ala Tyr Leu Ile Arg Agn80 85 90gga tca gag cgt gtt gtt aca agt gcc aga gaa cac att tat gat tta399Gly Ser Glu Arg val Val Thr Ser Ala Arg Glu His Ile Tyr Asp Leu95 100 105cga tcc ctg gaa aat tac cac ttt gta gat gag cat ggt aag gat caa447Arg Ser Leu Glu Asn Tyr His Phe Val Asp Glu His Gly Lys Asp Gln110 115 120ggt ata aat att cga cag aag gtg aag gaa ttg gtt gaa ttt gcc cag495Gly Ile Asn Ile Arg Gln Lys Val Lys Glu Leu Val Glu Phe Ala Gln125 130 135 140gat gac gac agg ctt cgt gaa gag cga aag aaa gca aag aag aac aaa543Asp Asp Asp Arg Leu Arg Glu Glu Arg Lys Lys Ala Lys Lys Asn Lys145 150 155
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權(quán)利要求
1.包含ENTH結(jié)構(gòu)域且具有生長抑制活性的分離蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)缺乏與Eps15相互作用的NPF結(jié)構(gòu)域，且缺乏結(jié)合網(wǎng)格蛋白接頭AP2的DPW結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求1或2的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有與SEQ ID NO2、4和5所列氨基酸序列之一至少40％、優(yōu)選50％、更優(yōu)選70％、甚至更優(yōu)選80％且最優(yōu)選90％相同的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1-3任一項的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有與SEQID NO2、4或5的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
5.編碼權(quán)利要求1-4任一項的蛋白質(zhì)的分離核酸，優(yōu)選SEQ IDNO1或3所列核酸序列。
6.包含權(quán)利要求5中定義的核酸的載體。
7.包含權(quán)利要求6的載體的宿主細胞。
8.權(quán)利要求7的宿主細胞，其中所述細胞是真核細胞。
9.用于鑒定過度增殖病(特別是良性和惡性腫瘤)或其遺傳素質(zhì)的方法，包括對受試者的體液或組織樣品檢測編碼ELP蛋白質(zhì)的核酸序列的表達水平的變化和/或其中至少一處突變或者檢測基因組elp基因座中的重排。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述突變位于編碼ENTH結(jié)構(gòu)域的DNA區(qū)域、5′非翻譯區(qū)、編碼進化保守氨基酸的密碼子、啟動子或剪接位點內(nèi)。
11.權(quán)利要求9-10任一項的方法，其中所述突變導(dǎo)致無功能ELP蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)表達降低或沒有蛋白質(zhì)、或者融合蛋白。
12.權(quán)利要求9-11任一項的方法，其中所述核酸序列是SEQ IDNO1的核酸序列。
13.權(quán)利要求9-12任一項的方法，其中疾病是肺癌。
14.權(quán)利要求9-12任一項的方法，其中疾病是腎癌。
15.權(quán)利要求9-12任一項的方法，其中疾病是胃癌。
16.用于生成ELP蛋白質(zhì)的方法，包括用處于表達構(gòu)建物中的編碼權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)化合適宿主細胞，在容許所述蛋白質(zhì)表達的條件下培養(yǎng)所述細胞，并分離生成的蛋白質(zhì)。
17.能夠特異結(jié)合權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的表位的抗體。
18.權(quán)利要求17的抗體在用于鑒定過度增殖病或其遺傳素質(zhì)的方法中的用途。
19.權(quán)利要求5的核酸用于與ELP蛋白質(zhì)有關(guān)的過度增殖病的基因療法的用途。
20.用于治療過度增殖病(特別是良性和惡性腫瘤)的制藥學(xué)組合物，包括權(quán)利要求1-4任一項的蛋白質(zhì)和/或權(quán)利要求5的核酸。
21.權(quán)利要求20的制藥學(xué)組合物，其中過度增殖病是肺癌。
22.權(quán)利要求20的制藥學(xué)組合物，其中過度增殖病是腎癌。
23.權(quán)利要求20的制藥學(xué)組合物，其中過度增殖病是胃癌。
24.用于下調(diào)基因表達的寡核苷酸，它與編碼epsin樣蛋白質(zhì)的mRNA中的區(qū)域特異雜交。
25.權(quán)利要求24的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含化學(xué)修飾。
26.用于基因沉默的雙鏈RNA(dsRNA)，其中所述RNA具有與編碼ELP蛋白質(zhì)的基因的外顯子區(qū)互補的核苷酸序列。
27.權(quán)利要求26的dsRNA，它具有大約200-2000個堿基對、優(yōu)選700-800個堿基對的長度。
28.權(quán)利要求21的dsRNA，它具有大約18-25個堿基對、優(yōu)選20-22個堿基對的長度。
29.權(quán)利要求26的dsRNA，其中所述epsin樣蛋白質(zhì)是人ELP。
30.權(quán)利要求24-29任一項的寡核苷酸或dsRNA用于治療過度增殖病和/或特征為細胞分化不正確的疾病的用途。
全文摘要
本申請公開了稱為epsin樣蛋白質(zhì)(ELP)的蛋白質(zhì)新家族。所述蛋白質(zhì)包含ENTH結(jié)構(gòu)域(Epsin氨基末端同源性結(jié)構(gòu)域)，且具有生長抑制活性。該公開的蛋白質(zhì)可用于過度增殖疾病的診斷以及基因療法目的。
文檔編號C12Q1/68GK1646688SQ03808830
公開日2005年7月27日 申請日期2003年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月28日
發(fā)明者E·哈芬, H·斯托克, P·德拉姆, B·辛德爾霍茨, S·布魯爾 申請人:遺傳學(xué)公司, 蘇黎士大學(xué)