專利名稱：與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)用于增加3-羥基羧酸-CoA-變位酶的酶促活性的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)用于增加3_羥基羧酸-CoA-變位酶的酶促活性的用途、包含3-羥基羧酸-CoA-變位酶和與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的融合蛋白以及用于制備2-羥基異丁酸的酶促方法。
現(xiàn)有技術(shù)2-羥基異丁酸(2-HIB)可以作為反應(yīng)物通過脫水轉(zhuǎn)化為甲基丙烯酸，一種商業(yè)上 重要的原料，從而實現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用。W02007/110394描述了用于從3_羥基羧酸酶促制備2_羥基_2_甲基羧酸的方法，其中使用了具有3-羥基羧酸-CoA-變位酶活性的單元，所述單元既具有3-羥基羰基-CoA-酯產(chǎn)生活性，又擁有3-羥基羰基-CoA-酯異構(gòu)化活性，并且導(dǎo)致3-羥基羧酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的2-羥基-2甲基羧酸。鈷胺素依賴性變位酶(其作為合適的具有3-羥基羧酸-CoA-變位酶活性的單元而提及)是來自HCM-IO (DSM 18028)、Methylibiumpetroleiphilum PM1、Methylibium 物種 R8 (德國 UFZ Leipzig 的菌種保藏)、自養(yǎng)黃色桿菌(Xanthobacter autotrophicus) Py2、類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides) (ATCC17029)或類諾卡氏菌屬物種(Nocardioides sp. ) JS614的那些。在DE102008002715中描述了在W02007/110394中所描述的3-羥基羧酸-CoA-變位酶用于在細(xì)胞中制備2-羥基異丁酸的重組用途，在所述細(xì)胞中2-羥基-2-甲基羧酸經(jīng)由作為中間產(chǎn)物的乙酰乙?；o酶A和作為前體的3-羥基丁酰輔酶A來實現(xiàn)；在此，作為另外的、合適的3-輕基羧酸-CoA-變位酶將提及可以從AquincolatertiaricarbonisL108、Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512、棲藻海桿菌(Marinobacter algicola)DG893、苜猜中華根瘤菌(Sinorhizobium medicae) WSM419、玫瑰變色菌屬物種(Roseovarius sp. ) 217、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus) DSM 3638 分離出的那些。在A. Tertiaricarbonis基因組中在編碼3_輕基羧酸-CoA-變位酶的大亞基的基因hcmA的上游，有編碼具有迄今未知功能的假定蛋白質(zhì)(在下文也稱為MeaB)的基因。序列比較指出與具有ATPase/GTPase功能的酶的同源性。所描述的用于制備2-羥基異丁酸的酶促方法的共同特征在于產(chǎn)率低，這是因為酶促轉(zhuǎn)換率低。因此，本發(fā)明的任務(wù)是提供用于以較高產(chǎn)率制備2-羥基異丁酸的方法。發(fā)明描述令人意外地，發(fā)現(xiàn)在下文描述的與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的用途中以及在下文描述的融合蛋白為解決所述目的作出了貢獻(xiàn)。因此，本發(fā)明涉及與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)用于增加3-羥基羧酸-CoA-變位酶的酶促活性的用途。本發(fā)明還涉及包含3-羥基羧酸-CoA-變位酶和與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的融合蛋白。
本發(fā)明還涉及用于制備2-羥基異丁酸的酶促方法。應(yīng)用這樣的蛋白質(zhì)以增加3-羥基羧酸-CoA-變位酶的酶促活性為解決開頭提及的目的作出了貢獻(xiàn)，所述蛋白質(zhì)包含與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列，所述蛋白質(zhì)序列具有至少100個，優(yōu)選地至少200個，特別是至少300個氨基酸并且與MeaB蛋白具有至少60%，優(yōu)選地至少80%，特別優(yōu)選地至少95%，十分特別優(yōu)選地至少99%，特別是100%的序列同一性?！?-羥基羧酸-CoA-變位酶”，下文縮寫為Hcm，表示這樣的酶，其催化3_羥基羧基-CoA-酯產(chǎn)生相應(yīng)的2-羥基-2-甲基羧酸-CoA-酯，特別是3-羥基丁酰輔酶A產(chǎn)生2-羥基異丁酰輔酶A的反應(yīng)。

術(shù)語“MeaB蛋白”，在本發(fā)明的上下文中表示選自以下列登錄號所指示的蛋白質(zhì)SEQ ID No. I(Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512),YP_001023545(Methylibium petroleiphilum PMl),YP_001409454(自養(yǎng)黃色桿菌 Py2),ΥΡ_001045518(類球紅細(xì)菌 ATCC 17029),ΥΡ_002520048 (類球紅細(xì)菌)，AAL86727 [扭脫甲基桿菌(Methylobacterium extorquens) AMI],CAX21841 (扭脫甲基桿菌 DM4)，ΥΡ_001637793 (扭脫甲基桿菌 PAl)，ΑΑΤ28130 [紅霉素氣微菌(Aeromicrobium erythreum)),CAJ91091 [纖維多囊菌(Polyangium cellulosum)],AAM77O46 [紅色糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)]和NP_417393 [大腸桿菌(Escherichia coli ) K-12 菌株 MG1655 亞株]。所提及的序列同一性根據(jù)blastp算法來測定，其中采用10的期望閾值，3的字長，存在的缺口罰分為11和延伸的缺口罰分為I的blosum62矩陣，以及條件合成得分矩陣調(diào)整(conditional compositional score matrixa djustment)。與MeaB蛋白具有至少60%，優(yōu)選地至少80%，特別優(yōu)選地至少95%，十分特別優(yōu)選地至少99%，特別是100%的序列同一性的至少100個，優(yōu)選地至少200個，特別是至少300個氨基酸的蛋白質(zhì)序列，在下文也被稱為“與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列”。術(shù)語“2-羥基異丁酸”或“3-羥基丁酸”，特別地表示其鹽，也表示質(zhì)子化形式，以及由各個酸的單體組成的聚羥基鏈烷酸。所有指出的百分比(％)，除非另外指出，為質(zhì)量百分比。對技術(shù)人員顯而易見的是，通過本文指出的核苷酸序列或針對具體的已公開基因的參考使得能夠產(chǎn)生探針和引物，所述探針和引物可用于鑒定和/或克隆待產(chǎn)生的其他細(xì)胞類型或生物中的同源序列以便例如鑒定在此本文未明確提及的其他MeaB蛋白或hem。這樣的探針或引物通常包含核苷酸序列區(qū)，其在“嚴(yán)謹(jǐn)”條件(參見下文)與核酸序列的有義鏈或相應(yīng)反義鏈的至少大約12個，優(yōu)選地至少大約25個，例如大約40個、50個或75個連續(xù)的核苷酸雜交。核酸序列可以例如用傳統(tǒng)的雜交方法或PCR技術(shù)從其他生物分離出，例如通過基因組或cDNA文庫。這些DNA序列在標(biāo)準(zhǔn)條件下與所提及的序列雜交。為了進(jìn)行雜交，有利地使用保守區(qū)的，例如來自活性中心的短的寡核苷酸，其可以通過以技術(shù)人員已知的方法與根據(jù)本發(fā)明的變位酶或ATPase/GTPase進(jìn)行比較來決定。但是也可以使用所提及的核酸的較長片段或完整序列進(jìn)行雜交。依據(jù)所使用的核酸(寡核苷酸、較長的片段或完整序列)或依據(jù)使用何種核酸(DNA或RNA)進(jìn)行雜交，這些標(biāo)準(zhǔn)條件可以變化。因此例如，DNAiDNA雜交物的解鏈溫度比相同長度的DNA: RNA雜交物的低大約10°C。依據(jù)核酸，“標(biāo)準(zhǔn)條件”理解為例如，在42與58 °C之間的溫度，在具有
O.l-5xSSC(IXSSC=O. 15M NaCl，15mM檸檬酸鈉，pH7. 2)之間的濃度的水性緩沖溶液中，或者此外在50%甲酰胺存在下，例如，42°C，在5xSSC中，50%甲酰胺。DNA = DNA雜交物的雜交條件有利地為O. IxSSC和溫度在大約20°C至45°C之間，優(yōu)選地在大約30°C至45°C之間。DNA = RNA雜交物的雜交條件有利地為O. IxSSC和溫度在大約30°C至55°C之間，優(yōu)選地在大約45°C至55°C之間。這些指出的雜交溫度是例如在沒有甲酰胺下對具有大約100個核苷酸的長度和50%的G+C含量的核酸所計算出的解鏈溫度。DNA雜交的實驗條件描述于有關(guān)的遺傳學(xué)教科書，例如 Sambrook 等人，"Molecular Cloning" , Cold Spring Harbor Laboratory, 1989中，并且可以根據(jù)技術(shù)人員已知的公式(例如取決于核酸的長度、雜交物的類型或G+C含量)進(jìn)行計算?！皣?yán)謹(jǐn)條件”在Northern印跡技術(shù)例如表示使用在50_70°C，優(yōu)選地60_65°C的洗滌溶液，例如含有0. 1% SDS的0. IxSSC緩沖液(20xSSC:3M NaCl, 0. 3M檸檬酸鈉，pH7. 0)，以洗脫非特異性地雜交的cDNA探針或寡核苷酸。在這過程中，只有高度互補(bǔ)的核酸保持相互結(jié)合。設(shè)定嚴(yán)謹(jǐn)條件是技術(shù)人員已知的并且在例如Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989)，6. 3. 1-6. 3. 6 中作了描述。包含與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)的根據(jù)本發(fā)明的用途尤其表示在微生物或在其細(xì)胞提取物中的用途。為此優(yōu)選的是，包含與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)相比于微生物的野生型而言在該微生物中的存在得到增強(qiáng)。“得到增強(qiáng)”也表示在修飾之前，野生型不具有包含與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)。所述增強(qiáng)優(yōu)選地通過引入包含核酸序列的外源核酸而實現(xiàn)，所述核酸序列編碼包含與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)。因此，在本發(fā)明中的“野生型”表示在將外源核酸引入微生物之前的起始微生物。原則上，所述增強(qiáng)可以通過下述來實現(xiàn)，即增加一種或多種基因序列的拷貝數(shù)，所述基因序列編碼包含與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)；通過使用增強(qiáng)的啟動子；和任選地，組合這些方法。所述外源核酸優(yōu)選地是表達(dá)載體，特別是染色體外復(fù)制的表達(dá)載體，其中啟動子確保包含與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)。同樣優(yōu)選的是這樣的外源核酸，其能夠?qū)е戮幋a包含與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)的核酸序列整合入微生物的基因組中。在這種情況下可設(shè)想的是，包含與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)通過微生物自己的啟動子得以確保，或者也可以是所整合的核酸自身攜帶對包含與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)起積極作用的啟動子。
用于特定目標(biāo)生物的合適表達(dá)載體和整合盒是技術(shù)人員已知的。備選地，在根據(jù)本發(fā)明的用途中，包含與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)還可以在微生物的細(xì)胞提取物中的存在得到增強(qiáng)，例如通過向所述細(xì)胞提取物直接添加所述蛋白質(zhì)或通過添加適合于所述蛋白質(zhì)的體外翻譯混合物。包含與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)相比于野生型而言的增強(qiáng)可以用常規(guī)方法進(jìn)行測定。因此，可以通過下列方式來分析蛋白質(zhì)濃度用對于待檢測的蛋白質(zhì)特異的抗體來進(jìn)行 Western-印跡雜交(Sambrook 等人，Molecular Cloning a laboratorymanual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989)，隨后用用于濃度測定的合適軟件來進(jìn)行光學(xué)評價[Lohaus和Meyer(1989)Biospektrum, 5:32-39 ；Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111:2630-2647]。 根據(jù)本發(fā)明的用途在微生物或在其細(xì)胞提取物中，優(yōu)選地所述微生物以及如上文對包含與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)所描述的3_羥基羧酸-CoA-變位酶得到增強(qiáng)。同樣的情況適合于在細(xì)胞提取物中所述蛋白質(zhì)的增強(qiáng)。在這種情況下，優(yōu)選的微生物是在下文與用于制備2-羥基異丁酸的根據(jù)本發(fā)明的方法相關(guān)進(jìn)行描述的那些。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地使用3-羥基羧酸-CoA-變位酶，其可以從選自下述的微生物分離Aquincola tertiaricarbonis L108、Aquincola tertiaricarbonis DSM 18028、Aquincola tertiaricarbonis DSM18512、Methylibium petroleiphilum PMKMethylibium物種R8、自養(yǎng)黃色桿菌Py2、類球紅細(xì)菌ATCC 17029、類諾卡氏菌屬物種JS 614、棲藻海桿菌DG893、苜蓿中華根瘤菌WSM419、玫瑰變色菌屬物種217、激烈火球菌DSM 3638、肉桂地鏈霉菌(Streptomyces cinnamonensis)和天藍(lán)色鏈霉菌(Strep tomyces coelicolor),特別優(yōu)選的是在PCT/EP2007/052830中描述的輔酶B12依賴性變位酶。優(yōu)選的3-輕基羧酸-CoA-變位酶可以在美國國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)的數(shù)據(jù)庫中以下列登錄號找到ABM97311 和 ABM97308. I(M. petroleiphilum PMl)YP_001045519 和 ΥΡ_001045516 (類球紅細(xì)菌 ATCC 17029)ΥΡ_001409455 和 ΥΡ_001409452(自養(yǎng)黃色桿菌 Py2)ΥΡ_923327 和 ΥΡ_923324 (類諾卡氏菌屬物種 JS614)ΥΡ_001313797 和 ΥΡ_001313799 (苜蓿中華根瘤菌 WSM419)ΖΡ_01035346 和 ΖΡ_01035348 (玫瑰變色菌屬物種 217)ΝΡ_579206 (激烈火球菌 DSM 3638)ΖΡ_01892066 和 ΖΡ_01892069 (棲藻海桿菌 DG893)AAC08713 和 CAB59633 (肉桂地鏈霉菌)，CAB40912 和 ΝΡ_628957 (天藍(lán)色鏈霉菌 A3 (2))，以及特別是SEQ ID No. 21 和 SEQ ID No. 22 (以 ABD93936 和 ABD93937 不完整地列出，A. tertiaricarbonis DSM 18512)。在這方面，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的3-羥基羧酸-CoA-變位酶與在PCT/EP2007/052830中描述的變位酶的小或大亞基的氨基酸序列(SEQID No. 21和SEQ ID No. 22)具有在氨基酸水平上至少60%，優(yōu)選地至少80%，特別優(yōu)選地至少95%，十分特別優(yōu)選地至少99%，特別是100%的序列同一性。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列可以衍生自下列SEQ ID No. I(Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512),YP_001023545(Methylibium petroleiphilum PMl),YP_001409454(自養(yǎng)黃色桿菌 Py2),ΥΡ_001045518(類球紅細(xì)菌 ATCC 17029),ΥΡ_002520048 (類球紅細(xì)菌)， AAL86727 (扭脫甲基桿菌 AMl)。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的是，與MeaB同源的蛋白質(zhì)序列包含與相關(guān)MeaB蛋白本身相同的氨基酸數(shù)目。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地使用包含與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)作為下文描述的根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白，所述蛋白質(zhì)導(dǎo)致3-羥基羧酸-CoA-變位酶的酶促活性的增加。因此，包含3-羥基羧酸-CoA-變位酶和與MeaB蛋白具有至少60%，優(yōu)選地至少80%,特別優(yōu)選地至少95%，十分特別優(yōu)選地至少99%，特別是100%的序列同一性的至少100個，優(yōu)選地至少200個，特別是至少300個氨基酸的蛋白質(zhì)序列的融合蛋白為解決開頭提及的目的作出了貢獻(xiàn)。術(shù)語“融合蛋白”根據(jù)本發(fā)明表示，至少一條對于3-羥基羧酸-CoA-變位酶活性必需的多肽鏈包含有另外的蛋白質(zhì)序列，所述多肽鏈與MeaB蛋白具有的所需序列同一性。因為3-羥基羧酸-CoA-變位酶可以是寡聚蛋白質(zhì)，因此術(shù)語“融合蛋白”也表示蛋白質(zhì)復(fù)合體，其例如由3-羥基羧酸-CoA-變位酶的多個不同亞基構(gòu)成，其中所述亞基之一另外具有MeaB同源氨基酸序列。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白是經(jīng)分離的融合蛋白。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白包含3-羥基羧酸-CoA-變位酶，其對于上面提及的根據(jù)本發(fā)明的用途是優(yōu)選的；優(yōu)選地，這同樣適合于在根據(jù)本發(fā)明包含的與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列。可以將與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列這樣安排于融合蛋白中，使得它緊在3_羥基羧酸-CoA-變位酶上游(N-末端)，或在寡聚3-羥基羧酸-CoA-變位酶的情況下，緊在3-羥基羧酸-CoA-變位酶的一個亞基上游，或者在3-羥基羧酸-CoA-變位酶或其一個亞基下游(C-末端)。優(yōu)選地，與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列以N-末端與3_羥基羧酸-CoA-變位酶，優(yōu)選地與3-羥基羧酸-CoA-變位酶的大亞基相融合。在與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列和3_羥基羧酸-CoA-變位酶之間可以存在另外的氨基酸。這樣的“連接子”可以是有利地，因為它們可以影響蛋白質(zhì)的三維排列。位于與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列和3_羥基羧酸-CoA-變位酶之間的連接子具有4至20個，優(yōu)選地6至12個,特別是8個氨基酸。已經(jīng)證明由氨基酸序列Cys Ala Gly Ser Phe ProThr He (SEQ ID No. 2)組成的連接子是特別有利的。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的融合蛋白的特征在于選自下列的3-羥基羧酸-CoA-變位酶SEQ ID No. 21 和 22 (A. tertiaricarbonis DSM 18512)以及 ABM97311 和 ABM97308. I (M.petroleiphilum PMl),
并且，與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列與3_羥基羧酸-CoA-變位酶的大亞基以N-末端融合,所述與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列可以衍生自下列SEQ ID No I (A.tertiaricarbonis DSM 18512), ΥΡ_001023545(Μ. petroleiphilum PMl),其中所述連接子由氨基酸序列Cys Ala Gly Ser Phe Pro Thr Ile組成。特別地，優(yōu)選的融合蛋白的特征在于異源二聚體蛋白質(zhì)，所述異源二聚體蛋白質(zhì)包含 SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4，特別是由 SEQ IDNo. 3 和 SEQ ID No. 4 組成。用于產(chǎn)生編碼根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白的合適核酸構(gòu)建體的分子生物學(xué)方法是技術(shù)人員已知的并且例如在Joseph Sambrook等人的標(biāo)準(zhǔn)著作“Molecular Cloning ALaboratory Manual”(第三版)中可以獲悉。因此，可以通過例如PCR方法擴(kuò)增編碼待融
合的蛋白質(zhì)片段的核酸，提供核酸內(nèi)切酶切割位點并通過合適的限制酶切和連接的組合進(jìn)行連接。備選地，可以例如通過SOE-PCR[交錯延伸剪接一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(splicing byoverlap extension-polymerase cha in reaction))來產(chǎn)生核酸,其融合兩個編碼基因并且例如，此外測定連接子的長度。簡化地，如今這樣的核酸已經(jīng)被商業(yè)服務(wù)提供者人工地合成了，其中已經(jīng)可以針對待使用的生物對密碼子使用進(jìn)行優(yōu)化。因此，編碼根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白的分離的核酸序列(單鏈和雙鏈DNA和RNA序列，例如DNA、cDNA和mRNA)為解決開頭提及的目的作出了進(jìn)一步的貢獻(xiàn)?！熬幋a”在此表示具有密碼子使用的遺傳密碼，如例如在大腸桿菌(E. Coli)中可以發(fā)現(xiàn)的那樣；但是，也可以設(shè)想非常規(guī)的密碼子使用的情況，例如在四膜蟲屬(Tetrahymena)、痕原蟲屬(Plasmodium)、肺炎分支桿菌(Mycobacterium pneumoniae)或熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)中的,可以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白。這些核酸也被認(rèn)為“編碼根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白”。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的核酸編碼根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的融合蛋白。特別地，具有SEQ ID No. 5的核酸是特別優(yōu)選的。本發(fā)明還包括與所描述的核酸序列互補(bǔ)的核酸分子。一種用于酶促制備2-羥基異丁酸的方法為解決上面提出的目的作出了進(jìn)一步的貢獻(xiàn)，所述方法包括下列步驟a)使al)具有3-羥基羧酸-CoA-變位酶的酶促活性的微生物或所述微生物的細(xì)胞提取物，其中包含與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)相比于微生物的野生型而言在所述微生物中或在細(xì)胞提取物本身中的存在得到增強(qiáng)，或者a2)具有根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白的單元，與包含3-羥基異丁酸的水性介質(zhì)相接觸，以及任選地，b)從水性介質(zhì)或從具有融合蛋白的單元純化2-羥基異丁酸。顯而易見的是，也可以使用根據(jù)al)的各種微生物或其提取物的混合物，根據(jù)a2)的各種具有根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白的單元的混合物，以及其組合。優(yōu)選地，a2)中的具有融合蛋白的單元是微生物或其細(xì)胞提取物。通常，這些微生物如此地經(jīng)基因工程改造，從而它本身產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白。這例如通過用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化所述微生物來實現(xiàn)，所述表達(dá)載體包含根據(jù)本發(fā)明的核酸。
在al)或a 2)中合適的微生物是細(xì)菌、酵母或真菌，特別是以細(xì)菌、酵母或真菌菌株形式保藏于德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkul turen GmbH (DSMZ), Brauns chweig,德國)中的合適的那些細(xì)菌、酵母或真菌。根據(jù)本發(fā)明合適的細(xì)菌屬于在http://www. dsmz. de/species/bacteria, htm中所列出的那些種屬，根據(jù)本發(fā)明合適的酵母屬于在http://www. dsmz.de/species/yeasts, htm中所列出的那些種屬，和根據(jù)本發(fā)明合適的真菌屬于在http://www. dsmz. de/species/fungi, htm中所列出的那些種屬。在al)或a2)中的根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的微生物是下列屬的那些曲霉屬(Aspergillus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)λ 芽抱桿菌屬(Bacillus)、不動桿菌屬(Acine tobacter)、產(chǎn)減菌屬(Alcaligenes)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、副球菌屬(Paracoccus)、乳球菌屬(Lactococcus)、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、糖酵母屬(Saccharomyces)、埃希氏菌屬(Escherichia)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅螺菌屬(RhodospiriIIum)、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、梭菌屬(Clostridium)和貪銅菌屬(Cupriavidus)以及產(chǎn)乙酸微生物，其中構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑 曲霉(Aspergillus niger)、廣泛產(chǎn)減菌(Alcaligenes Iatus)、巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、黃色短桿菌(Brevibacteriumf lavum)、乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium Iactofermentum)Λ大腸桿菌、釀酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克魯維酵母(Kluveromyces Iactis)、布蘭克假絲酵母(Candida blankii)、皺落假絲酵母(Candida rugosa)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、有效棒桿菌(Corynebacterium efficiens)、運(yùn)動發(fā)酵假單胞菌(Zymomonas mobilis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、扭脫甲基桿菌、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、凱伍熱厭氧菌(Thermoanaerobacter kivui )、伍氏醋酸桿菌(Acetobacterium woodii )、潮濕厭氧醋酸菌(Acetoanaerobium notera)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、食甲基丁酸桿菌(Butyribacterium methylotrophicum)、丙酮丁酉享梭菌(Clostridium acetobutylicum)、熱醋穆爾氏菌(Moorella thermoacetica)、粘液真桿菌(Eubacterium limosum)、產(chǎn)生消化鏈球菌(Peptostreptococcus productus)、揚(yáng)氏梭菌(Clostridium I jungdahlii)和食羰基化物梭菌(Clostridium carboxidi vorans),特別是富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16PHB-4、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)、類球紅細(xì)菌、善變副球菌(Paracoccus versutus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、乙酸I丐不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是特別優(yōu)選的。al)或a2)中的微生物能夠優(yōu)選地從碳源合成3_羥基異丁酸。作為提供3_羥基異丁酸的微生物，特別合適的是在W02007/110394和DE102008002715中描述的那些。特別是在DE102008002715中，技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)這樣的指導(dǎo)，用其可以用重組方法提高來自碳源的
3-羥基異丁酸的產(chǎn)量。作為碳源，可以使用例如碳水化合物[例如單糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖)、寡糖(例如麥芽糖、蔗糖、乳糖)和多糖(例如淀粉、經(jīng)水解處理的淀粉、纖維素、經(jīng)水解處理的纖維素、半纖維素、經(jīng)水解處理的半纖維素)],以及其反應(yīng)產(chǎn)物,例如糖醇和多羥基酸；二氧化碳、一氧化碳、廢氣或合成氣；任選地攜帶I個或多個(例如1、2、3或4個)羥基的有機(jī)的單、二和三羧酸，例如乙酸、酒石酸、衣康酸、琥珀酸、丙酸、乳酸、3-羥基丙酸、富馬酸、馬來酸、2，5-呋喃二羧酸、戊二酸、乙酰丙酸、葡糖酸、烏頭酸、琥珀酸和二氨基庚二酸、檸檬酸；脂質(zhì)；油或脂肪，例如菜籽油、大豆油、棕櫚油、向日葵油、花生油和椰子油；具有優(yōu)選地10至22個碳的飽和和不飽和脂肪酸，例如Y -亞麻酸、二高-Y -亞麻酸、花生四烯酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、月桂酸、亞油酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸；烴，例如具有一個或多個雙或三鍵的具有I至22個碳的烴，例如甲烷、乙烷、乙烯(ethene)、乙烯(ethylene)、十二烷、十八烷；醇，例如具有I至22個碳的醇，例如丁醇、甲醇、乙醇；具有優(yōu)選地3至8個碳的二醇，例如丙二醇和丁二醇；具有3個或更多個(例如3、4、5或6個)OH基團(tuán)的多元(也稱為高價)醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇、木糖醇和阿拉伯糖醇；具有優(yōu)選地3至10個碳和任選地I個或多個羥基的酮，例如丙酮和3-羥基丁酮；內(nèi)酯，例如Y - 丁內(nèi)酯，環(huán)糊精，生物聚合物，例如聚羥基乙酸，聚酯，例如聚交酯，多糖，聚類異戊二烯，聚酰胺；芳香化合物，例如芳香胺、香草醛和靛藍(lán)；蛋白質(zhì)，例如酶，例如淀粉酶，果膠酶，酸性、雜合或中性纖維素酶，酯酶(例如脂肪酶)，胰酶，蛋白酶，木聚糖酶，和氧化還原酶(例如漆酶、過氧化氫酶和過氧化物酶)，葡聚糖酶，植酸酶；類胡蘿卜素，例如番茄紅素、胡蘿卜素、蝦青素、玉米黃素和角黃素；成蛋白質(zhì)性和非成蛋白質(zhì)性氨基酸，例如賴氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸和蘇氨酸；嘌呤和嘧啶堿基；核苷和核苷酸，例如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和腺苷-5丨-單磷酸(AMP);以及上述化合物的前體和衍生物，例如在所述酸的情況下為其鹽。這些物質(zhì)可以單獨地或者作為混合物進(jìn)行使用。特別優(yōu)選的是使用碳水化合物，特別是單糖、寡糖或多糖(如例如在US6，136，576中所描述的);使用C5-糖；或者使用甘油。甲醇是優(yōu)選的待使用的醇，這是因為它可以由許多各種不同來源例如沼氣、生物質(zhì)、天然氣或煤來制備?？梢栽谔幚?蒸汽爆破、酸預(yù)處理、酶預(yù)處理)之前或之后，從不同的加工階段(例如甘蔗汁，糖漿，糖蜜，粗糖，砂糖；玉米粒，面粉，淀粉，糊精，葡萄糖)，以不同的形式(純的或者以溶液/懸浮液)和以不同的組成(純化的或作為粗產(chǎn)物)來使用碳源。 在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選的備選實施方案中，從其合成3-輕基異丁酸的碳源包括CO2或CO，特別是合成氣或廢氣。為此使用的al)或a2)中的微生物為產(chǎn)乙酸微生物，例如醋酸桿菌屬(Acetobacterium)的物種，例如伍氏醋酸桿菌(A. Woodii)和醋酸梭菌。更具體而言，所述產(chǎn)乙酸細(xì)胞選自潮濕厭氧醋酸菌、伍氏醋酸桿菌、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、食甲基丁酸桿菌、食甲基丁酸桿菌、Carboxydibrachium pacificus、 Carboxydocella sporoproducens、 Carboxydocellathermoautotrophica、生氫氧化碳嗜熱菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)、檸檬酸桿菌屬物種(CitiObacter sp. ) Y19、醋酸桿菌、丙酮丁醇梭菌、自養(yǎng)產(chǎn)乙烷梭 菌(Clostridium autoethanogenum)、食羰基化物梭菌、揚(yáng)氏梭菌、食羰基化物脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum carboxydivorans)Λ 庫氏脫硫腸狀菌(Desulfotomaculumkuznetsovii)、熱苯脫硫腸狀菌嗜熱互營亞種(Desulfotomaculum thermobenzoicumsubsp. thermosyntrophicum)、粘液真桿菌、卩遼乙酸甲燒八疊球菌(Methanosarcinaacetivorans) C2A、巴氏甲燒八疊球菌(Methanosarcina barkeri)、熱自養(yǎng)甲燒嗜熱桿菌(Methanothermobacter thermoautotrophicus)、穆爾氏菌屬(Moorella) AMP、熱醋穆爾氏菌(Moorella thermoacetica)、熱自養(yǎng)穆爾氏菌(Moorellathermoautotrophica)、普氏醋菌(Oxobacter pfennigii)、產(chǎn)生消化鏈球菌、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)P4、深紅紅螺菌、膠狀紅長命菌(Rubrivivax gelatinosus)、Thermincolacarboxydiphila、Thermincola ferriacetica、熱球菌屬(Thermococcus) AM4、食擬基化物熱石桿菌(Thermolithobacter carboxydi vorans)和凱伍熱厭氧菌。在這種情況下，特別合適的細(xì)胞為食羰基化物梭菌，特別是諸如“P7”和“PU”這樣的菌株。這樣的細(xì)胞例如在US2007/0275447和US2008/0057554中進(jìn)行了描述。進(jìn)一步的、在這種情況下特別合適的細(xì)胞為揚(yáng)氏梭菌，特別是選自揚(yáng)氏梭菌PETC、揚(yáng)氏梭菌ERI2、揚(yáng)氏梭菌COl和揚(yáng)氏梭菌0_52的菌株，并且它們在W098/00558和W000/68407中進(jìn)行了描述。根據(jù)本發(fā)明的方法是優(yōu)選的，其中從碳源合成3-羥基丁酸和從3-羥基丁酸合成2-羥基異丁酸在單一步驟中完成。
也可以將在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的、具有融合蛋白的單元以微生物的提取物，因此以從微生物純化的、濃縮的和/或分離的形式，引入反應(yīng)中。因此，對于本發(fā)明的目的，可以將具有融合蛋白的單元既以完整的微生物的形式，也以經(jīng)滲透化的微生物的形式用于根據(jù)本發(fā)明的方法中，作為催化劑。其它可能的用途是以來自微生物細(xì)胞提取物的成分(一種或多種)的形式，也以部分純化的或純化的形式。任選地，根據(jù)本發(fā)明，使用合成CoA-酯的酶，例如CoA-轉(zhuǎn)移酶或CoA-合成酶。酶催化劑可以經(jīng)固定化或者附著至溶解或未溶解的支持物質(zhì)。在一個優(yōu)選的變體實施方式中，使特定的細(xì)胞區(qū)室或其部分相互分開或聯(lián)合，即可以組合或分開能夠正向或負(fù)向地影響具有融合蛋白的單元的活性的碳水化合物結(jié)構(gòu)、月旨質(zhì)或蛋白質(zhì)和/或肽以及核酸。為了有意地利用這樣的影響，從微生物例如專業(yè)地制備粗提取物，其任選地，進(jìn)行離心以便能夠用沉淀或上清液進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)。通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的2-羥基異丁酸可以根據(jù)條件，以其鹽或者以聚羥基鏈烷酸的形式存在，其中2-羥基異丁酸作為功能單體而儲備。根據(jù)本發(fā)明制備的2-羥基異丁酸可以在去除未溶解的組成成分例如微生物細(xì)胞之后通過水性介質(zhì)的處理，用已經(jīng)知曉的方法進(jìn)行分離。這樣的方法特別是例如濃縮、離子交換、蒸餾、電滲析、抽提和結(jié)晶?？梢砸喳}或(在酸化后)以質(zhì)子化的2-羥基異丁酸分離產(chǎn)物。用于分離的方法是技術(shù)人員本身已知的，他可以在DE102008002715找到詳細(xì)的和特別的指導(dǎo)。有利地，可以使用根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的2-羥基異丁酸以制備甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯或其聚合物，通過脫水以及任選的酯化和任選的多聚化。用于脫水、酯化和多聚化的方法是技術(shù)人員本身已知的，他可以在DE102008002715中找到詳細(xì)的和特別的指導(dǎo)。在下文的實施例中示例性地描述了本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)把本發(fā)明限制在實施例中所提及的實施方案中，本發(fā)明的應(yīng)用范圍產(chǎn)生于全部說明書和權(quán)利要求書。
下面的附圖是實施例的組成部分圖I:雜合質(zhì)粒 pBBRlMCS-2::Mutase-Operon。圖2:雜合質(zhì)粒 pBBRlMCS-2: :Mut_At_delhcl。圖 3:雜合質(zhì)粒 pBBRlMCS-2: :meaBhcmA_hcmB。圖4:重組富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16PHB-4菌株的2D-聚丙烯酰胺凝膠(pH4_pH7)。圖5:在培養(yǎng)各種不同的重組富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16PHB-4菌株中培養(yǎng)上清液中的絕對2-HIB-濃度。在生產(chǎn)培養(yǎng)基中在6h、21h、24h、28h、48h、52h和120h后，獲取樣品并用離子交換色譜法(IC)進(jìn)行分析。圖6:在培養(yǎng)各種不同的重組富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16PHB-4菌株中培養(yǎng)上清液中的 2-HIB濃度/0D_。在生產(chǎn)培養(yǎng)基中在6h、21h、24h、28h、48h、52h和120h后，獲取樣品并用IC進(jìn)行分析。
實施例I.基因組DNA的分離和包含基因hcmB、hcl、meaB和hcmA的Mutase-Operon的擴(kuò)增根據(jù)制造商的說明用DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen GmbH, Hilden)從Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512菌株分離基因組DNA并且作為PCR的模板用于 Mutase-Operon 的擴(kuò)增。引物衍生自生物 Methylibium petroleiphilum PMl 質(zhì)粒RPMEOl (NCBI登錄號CP000556. I)的序列，這是因為在操縱子中包含的基因hcmA(icmA)和hcmB (icmB)的核苷酸序列與Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512的那些核苷酸序列的相似性 >97%。為此，使用寡核苷酸 UPicmB_fw5’ -CAGCGACTTGCAACCTTCTTCACCGG-3’(正向引物，SEQ ID No. 8)和 ICM5, 4-PMI_rev 5’ -GTATCAGTCGCTCCGACTTGCCGATCC-3’(反向引物，SEQ ID No. 9)以擴(kuò)增位于之間的基因。用Pfu聚合酶(Promega, Madison, USA)來進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR,根據(jù)SAIKI等人，1985，Enzymatic amplification of β -globin genomic SEQs and restrictionsite analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230:1350-1354·)。為此，進(jìn)行35個循環(huán)，每個循環(huán)在95°C下60秒，在65°C下30秒和在72°C下8分鐘。PCR的進(jìn)行在熱循環(huán)儀(Primus 96advanced;PEQLABBiotechnologie GMBH, Erlangen,德國)中實現(xiàn)。用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen GmbH, Hilden)根據(jù)制造商的說明來純化片段。2.富養(yǎng)羅爾斯通氏菌表達(dá)載體的制備根據(jù)制造商的說明，將經(jīng)純化的PCR片段“Mutase-Operon”(大約5. 4kbp)連接到pET101/D-T0P0載體(Invitrogen GmbH, Karlsruhe,德國)中。將所獲得的雜合質(zhì)粒 pET101/D-T0P0: : Mutase-Operon 轉(zhuǎn)移到感受態(tài)大腸桿菌 DH5 α 細(xì)胞(New EnglandBiolabs, Frankfurt,德國)中，并通過限制酶切和測序進(jìn)行檢查。此外，根據(jù)制造商(Invitrogen GmbH, Karl sruhe)的說明，將PCR產(chǎn)物克隆至IjpCR-BluntlΙΤ0Ρ0 質(zhì)粒中，將所獲得的雜合質(zhì)粒 pCR-BluntIIT0P0: :Mutase-Operon 轉(zhuǎn)移到感受態(tài)大腸桿菌DH5a細(xì)胞(New England Biolabs, Frankfurt)中，并通過限制酶切和測序進(jìn)行檢查。為了達(dá)到在富養(yǎng)羅爾斯通氏菌菌株中進(jìn)行表達(dá)，必須將構(gòu)建體克隆到合適的泛宿主性(broad-host-range)載體中。所使用的載體為pBBRlMCS-2，其描述于KOVACH等人，(1995). Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCScarrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166:175—176。為此，用酶EcoRV 和 SpeI 對質(zhì)粒 pCR-Blunt IITOPO: :Mutase-Operon 和pBBRlMCS-2進(jìn)行限制酶切，并將片段Mutase-Operon連接到目標(biāo)載體pBBRlMCS-2中，并且用所產(chǎn)生的雜合質(zhì)粒pBBRlMCS-2: =Mutase-Operon (

圖1，SEQ ID No. 6)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5 細(xì)胞(New England Biolabs, Frankfurt)。通過限制酶切和測序?qū)υ撡|(zhì)粒進(jìn)行檢查，并借助于電穿孔(2. 43kV, 25 μ F，200 Ω )將其引入感受態(tài)富養(yǎng)羅爾斯通氏菌H16PHB-4[重歸類為鉤蟲貪銅菌(Cupriavidusnecator), DSM 541]中。獲得包含質(zhì)粒 pBBRlMCS-2::Mutase-Operon 的轉(zhuǎn)化體。為了刪除hcl基因(其編碼假定的2-HIB-CoA-連接酶)，進(jìn)行突變PCR和隨后的融合 PCR。對于突變PCR，使用下列引物片段A(1228_pC0LAD_fplX1251_hcl_del_)用引物1228_pC0LAD_fpl: 5’_GGA ATTGTG AGC GGA TAA-3，SEQ ID No. 10 和 1251_hcl_del_:5，-CAG CGC CCC GGG ATA CTC GACCGG AAA GTT CC-3’ SEQ ID No. 11 進(jìn)行擴(kuò)增，片段B(1251_hcl_del+X1251_nach_StuI)用引物1251_hcl_del+5，-GAG TAT CCCGGG GCG CTG AAC CAG CAA CTG_3，SEQID No. 12 和 1251_nach_S tul 5，_ATG GCC TGG ATCTCG TCT C-3，SEQID No. 13 進(jìn)行擴(kuò)增。融合PCR (見上35個循環(huán)，每個循環(huán)95 °C 60秒，65 °C 30秒和72 °C 7分鐘)用引物 1228_pC0LAD_fpl 和 1251_nach_StuI 來進(jìn)行，并將 PCR 產(chǎn)物經(jīng)由 Hindlll/StuI 克隆回起始載體pBBRlMCS-2中。將所獲得的雜合質(zhì)粒pBBRlMCS-2: :Mut_At_delhcl (圖2)通過限制酶切和測序進(jìn)行檢查。3.片段hcmA、meaB和hcmB的擴(kuò)增；MeaB(N_末端)和HcmA(C_末端)的編碼區(qū)的
融合使用在實施例2中所描述的質(zhì)粒pBBRlMCS-2: :Mut_At_delhcl作為用于擴(kuò)增片段hcmA (I. 7kbp; DQ436456) ,hcmB (0. 4kbp; DQ436457)以及稱為 meaB 的片段(Ikbp)的 PCR 的模板。為了融合MeaB(N_末端)和HcmA(C_末端)的編碼區(qū)，必須修飾hcmA的起始密碼子和meaB的終止密碼子。寡核苷酸MeaB_Ns i I_fw5 ’ -ATAGCAATGCATGACCGGA ATGACTTACGTTCCC-3 ’(正向引物；Nsi I切割位點標(biāo)有下劃線；起始密碼子被加粗，SEQ IDNo. 14)和 MeaBFus_HindIII_rev 5，-ACTTTAAGCTTGGC GCA AGCCAGGTCATTCG-3’(反向引物；HindIII-切割位點標(biāo)有下劃線；經(jīng)修飾的終止密碼子被加粗，SEQ ID No. 15)用于擴(kuò)增meaB(Ikbp)。使用弓I 物 hcmAFus HindIII f w5 - A A A A A G C T T A C C ATAACCTGGCTTGAGCCG-3’ (HindIII切割位點標(biāo)有下劃線經(jīng)修飾的終止密碼子被加粗，SEQ IDNo. 16)和引物 hcmA SpeI rev5’_ATACCGACTAGTG( TCA GAAGACCGGCGTCTC-3’ (SpeI 切割位點標(biāo)有下劃線，經(jīng)修飾的終止密碼子被加粗，SEQ ID No. 17)講行hcmA (I. 7kbp)的擴(kuò)增。使用寡核苷酸hcmB_SpeI_fw5’ -AAATCTACTAGTTGGAGATCCCACC ATGGACCAAATCCCG-3 ’(正向引物；SpeI切割位點標(biāo)有下劃線，起始密碼子被加粗，SEQ IDNo. 18)和 hcmB_SacI_rev5，-TAGGCTGAGCTCCAAGCTTCGAATTGAGCTCGCCCTT TCA G-3’(反向引物；SacI切割位點標(biāo)有下劃線，終止密碼子被加粗，SEQ ID No. 19)來擴(kuò)增片段hcmB(O. 5kbp)。用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix (Finnzymes, Espoo, Finland)來進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR,根據(jù) SAIKI 等人，1985，Enzymatic amplification of β -globingenomic SEQs and restriction sitean alysis for diagnosis of sickle cell anemia.Science 230:1350-1354.) 在起始變性(30秒；98°C )后，進(jìn)行35個循環(huán)，每個循環(huán)為在98°C下10秒，在65°C下30秒和在72°C下I分鐘。對于最后的延伸，將混合物在72°C下溫育
10分鐘。PCR 在熱循環(huán)儀(Primus 96 advanced; PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen)上進(jìn)行。 借助于凝膠電泳分開PCR 混合物，用 QIAquick Gel Extraction Kit (QiagenGmbH, Hilden)根據(jù)制造商的說明從凝膠純化Ikbp的meaB片段，并且隨后用NsiI和HindIII 進(jìn)行限制酶切。借助于 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen GmbH, Hi I den)根據(jù)制造商的說明直接從PCR混合物純化I. 7kbp的hcmA片段，并且用HindIII和SpeI進(jìn)行限制酶切。將兩個混合物經(jīng)由HindIII-切割位點進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物meaBhcmA (2. 7kbp)作為S0E-PCR的模板使用，用寡核苷酸MeaB_Nsil_fw 5’ -ATAGCAATGCATGACCGGA ATG ACTTACGTTCCC-3’ (NsiI 切割位點標(biāo)有下劃線；起始密碼子被加粗，SEQ ID No. 14)和 hcmA_Spe I_rev 5，-ATACCGACTAGTGC TCAGAAGACCGGCGTCTC-3’ (SpeI切割位點標(biāo)有下劃線；終止密碼子被加粗，SEQ ID No. 17) (30秒，98 °C起始變性；35個循環(huán)，每個循環(huán)在98°C下10秒，在65 °C下30秒和在72°C下I分鐘；最終的延伸在72°C下10分鐘)。將所獲得的相應(yīng)大小的PCR產(chǎn)物借助于凝膠電泳分開、分離并用 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH, Hi I den)進(jìn)行純化。完成PCR 后，用 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen GmbH, Hi I den)純化 hcmB片段并用SpeI和SacI進(jìn)行限制酶切。4.富養(yǎng)羅爾斯通氏菌表達(dá)載體的制備將經(jīng)純化的meaBhcmA融合片段(2. 7kbp)連接入任選地用兩種限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行限制酶切的泛宿主性載體(broad-host-range Vector) pBBRlMCS-2中。將所獲得的雜合質(zhì)粒pBBRlMCS-2: :meaBhcmA轉(zhuǎn)移到感受態(tài)大腸桿菌DH5 α細(xì)胞(New EnglandBiolabs, Frankfurt)中，并通過限制酶切和測序進(jìn)行檢查。此外，將hcmB克隆到載體中。為此將載體pBBRlMCS-2: : meaBhcmA用SpeI和SacI進(jìn)行限制酶切。將所純化的hcmB片段連接到該載體中并隨后將一等份連接混合物轉(zhuǎn)移到DH5 α細(xì)胞(New EnglandBiolabs, Frankfurt)中。將所獲得的雜合質(zhì)粒pBBRlMCS-2: :meaBhcmA-hcmB-P通過限制酶切和測序進(jìn)行檢查。由于在pBBRlMCS-2的插入物中所包含的眾多切割位點，而另一方面在pBBRlMCS-2的多克隆位點(MCS)中少數(shù)的剩余獨特切割位點，作為產(chǎn)生雜合質(zhì)粒的切割位點必須使用Nsil。NsiI切割位點位于啟動子區(qū)的上游，以至于在克隆過程中，啟動子被從載體移除。為了進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，用寡核苷酸MeaB_RBS_fw5’ -AAATTTAGATCTGGAGACCGGA ATGACTTACGTTCCC-3’(起始密碼子被加粗，SEQ ID No. 20)和hcmB SacI rev5’-TAGGCTGAGCTCCMGCTTCGMTTGAGCTCGCCCTTTCAG-3’(SacI-切割位點加下劃線；終止密碼子被加粗，SEQ IDNo. 19)在借助于Phusion High-Fidelity PCR Master Mix (Finnzymes, Espoo, Finland)提供的PCR (30秒，98 °C起始變性；35個循環(huán)，每個循環(huán)在98°C下10秒，在65 °C下30秒和在72°C下I分鐘；最終的延伸，在72°C 10分鐘)中擴(kuò)增整個載體meaBhcmA-hcmB-P(3. Ikbp)。純化PCR產(chǎn)物并如空載體pBBRlMCS-2那樣，用EcoRV和SacI進(jìn)行限制酶切。在將線性化的載體與 meaBhcmA-hcmB 連接后，進(jìn)行大腸桿菌 DH5 a (New England Biolabs, Frankfurt)的轉(zhuǎn)化。將質(zhì)粒通過限制酶切和測序進(jìn)行檢查。將載體pBBRlMCS-2: :meaBhcmA-hcmB(圖 3，SEQ ID No. 7)借助于電穿孔(2. 43kV, 25 μ F, 200 Ω)引入富養(yǎng)羅爾斯通氏菌Η16ΡΗΒ-4 (重歸類為鉤蟲貪銅菌，DSM 541)中。通過該方法可以獲得攜帶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。5.在重組的富養(yǎng)羅爾斯通氏菌細(xì)胞中產(chǎn)生2-羥基異丁酸為了生產(chǎn)生物質(zhì)，將在實施例2至4中描述的攜帶質(zhì)粒的富養(yǎng)羅爾斯通氏菌在具有IOOml生物質(zhì)生產(chǎn)培養(yǎng)基(經(jīng)修飾的MSM-Schlegel-培養(yǎng)基O. 36 % (w/v)NH2HPO4;0. 15% (w/v)KH2PO4;0. 1% (w/v)NH4Cl; 1%(w/v)酵母提取物，0. 8mM MgSO4X7H20;0 ImMCaCl2 X 2H20; 37 μ MFeCl3;痕量元素溶液(10 X ; Pfennig 和 Lippert, 1966), 0. I % (v/V))的錐形瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。此外，給培養(yǎng)基另外補(bǔ)充I. 5% (w/v)果糖和300yg/ml卡那霉素。該培養(yǎng)在30°C和180rpm下在恒溫?fù)u床中進(jìn)行大約18小時。為了誘導(dǎo)氮限制，離心分離(20°C ;最大4000Xg, 15分鐘)生物質(zhì)并隨后在生產(chǎn)培養(yǎng)基[經(jīng)修飾的 MSM-Schlegel-培養(yǎng)基:0. 36 % (w/v)NH2HPO4;0. 15 % (w/v)KH2PO4; O. 8mM MgSO4X 7H20; 0. ImM CaCl2 X 2H20; 37 μ MFeCl3;微量元素溶液(10 X ; Pfennig和Lippert, 1966), 0. 1% (v/v)]中進(jìn)行洗漆,并在重新形成沉淀后,重懸浮于50ml生產(chǎn)培 養(yǎng)基中。為了生產(chǎn)2-羥基異丁酸，除了 1.5% (w/v)果糖和300 μ g/ml卡那霉素外，給培養(yǎng)基還補(bǔ)充76nM CoB120該培養(yǎng)在30°C，180rpm下進(jìn)行六小時，其后再補(bǔ)充I. 5% (w/v)果糖和76nM輔酶B12 (CoB12)。120小時后，通過在5000rpm(4°C )下離心收獲細(xì)胞并將培養(yǎng)上清液存放在-20°C下直至分析。在生產(chǎn)培養(yǎng)基(見上)中進(jìn)行培養(yǎng)期間，取出培養(yǎng)發(fā)酵液并離心沉淀(13，OOOrpm, 4°C )。然后借助于1C、高效液相色譜法(HPLC)和定量1H-NMR-光譜學(xué)(1H-NMR)進(jìn)行研究。此外，在生產(chǎn)培養(yǎng)基(見上)中24小時后，收獲(13，OOOrpm, 4 °C ) 2ml的培養(yǎng)物。將細(xì)胞沉淀在干冰上送至Toplab (Martinsried,德國)并借助于2D-聚丙烯酰胺電泳進(jìn)行研究。借助于MS，可以明確地檢測到融合蛋白MeaBhcmA(98kDa)和HcmB(14. 5kDa)兩者(圖3)。2-羥基異丁酸的檢測和定量借助于1C、HPLC和1H-NMR來進(jìn)行。任選地，借助于 IC 或 HPLC 分析用 ddH20 稀釋的培養(yǎng)上清液。在 ICS-2000RFIC(Dionex，Corporation,Synnyvale, USA)中進(jìn)行色譜分級，使用RFIC TonPac柱(2X250mm,柱溫度30°C +預(yù)柱 AG154X50mm,流速 0. 38ml/分鐘)。在 HPLC(Agilent Technologies 1200 Series,Ratingen,德國)中，使用Biorad (Hercules, USA ；0. 6ml/分鐘流速，最大400巴,注射體積20 μ I)的加溫至40°C的Aminex柱(HPX-87H，300 X 7. 8mm)。通過用純物質(zhì)校準(zhǔn)停留時間進(jìn)行2-羥基異丁酸峰的鑒定。為了估計2-羥基異丁酸的含量，使樣品摻雜有確定量的純物質(zhì)2-羥基異丁酸。在所分析的樣品中，檢測到I. lg/Ι (在生產(chǎn)培養(yǎng)基中120小時)的2-羥基異丁酸的最大濃度。這相應(yīng)于64mg/l/0D6QQ的濃度(圖5)。與此相反，在含有空質(zhì)粒(pBBRlMCS-2)的相應(yīng)的對照混合物中，未檢測到2-羥基異丁酸。通過添加純物質(zhì)2-羥基異丁酸定性和 定量地驗證IC-測量。
權(quán)利要求
1.包含與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)用于增加3_羥基羧酸-CoA-變位酶的酶促活性的用途，所述蛋白質(zhì)序列具有至少100個氨基酸并且與MeaB蛋白具有至少60%的序列同一'I"生。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的用途，在微生物或其細(xì)胞提取物中，其中所述包含與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)相比于所述微生物的野生型而言在所述微生物中或在所述細(xì)胞提取物本身中的存在得到增強(qiáng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其特征在于，所述微生物選自曲霉屬、棒桿菌屬、短桿菌屬、芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、乳桿菌屬、副球菌屬、乳球菌屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、糖酵母屬、埃希氏菌屬、發(fā)酵單胞菌屬、耶氏酵母屬、甲基桿菌屬、羅爾斯通氏菌屬、假單胞菌屬、紅螺菌屬、紅細(xì)菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、梭菌屬和貪銅菌屬以及產(chǎn)乙酸微生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中至少一項的用途，其特征在于，所述3-羥基羧酸-CoA-變位酶可以從選自下列的微生物中分離出Aquincola tertiaricarbonis L108、Aquincolatertiaricarbonis DSM 18028、Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512、Me thylibiumpetroleiphilum PM1、Methylibium 物種 R8、自養(yǎng)黃色桿菌 Py2、類球紅細(xì)菌 ATCC 17029、類諾卡氏菌屬物種JS 614、棲藻海桿菌DG893、苜蓿中華根瘤菌WSM419、玫瑰變色菌屬物種217、激烈火球菌DSM3638、肉桂地鏈霉菌和天藍(lán)色鏈霉菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中至少一項的用途，其特征在于，所述與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列可以衍生自由下列構(gòu)成的MeaB蛋白SEQ ID No. I(Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512),YP_001023545,來自 Methylibium petroleiphilum PMl, YP_001409454，來自自養(yǎng)黃色桿菌Py2， YP_001045518，來自類球紅細(xì)菌 ATCC 17029， ΥΡ_002520048，來自類球紅細(xì)菌， AAL86727，來自扭脫甲基桿菌AMl。
6.融合蛋白，其包含3-羥基羧酸-CoA-變位酶和與MeaB蛋白具有至少60%序列同一性的至少100個氨基酸的與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的融合蛋白，其特征在于，3-羥基羧酸-CoA-變位酶可以從選自下列的微生物中分離出Aquincola tertiaricarbonis L108、Aquincola tertiaricarbonisDSM 18028、Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512、Methylibium petroleiphilum PMl>Me thylibium物種R8、自養(yǎng)黃色桿菌Py2、類球紅細(xì)菌ATCC 17029、類諾卡氏菌屬物種JS 614、棲藻海桿菌DG893、苜蓿中華根瘤菌WSM419、玫瑰變色菌屬物種217、激烈火球菌DSM3638、肉桂地鏈霉菌和天藍(lán)色鏈霉菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的融合蛋白，其特征在于，所述與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列可以衍生自由下列構(gòu)成的MeaB蛋白SEQ ID No. 1，來自 Aquincola tertiaricarbonis DSM 18512,YP_001023545,來自 Methylibium petroleiphilum PMl, YP_001409454，來自自養(yǎng)黃色桿菌Py2， YP_001045518，來自類球紅細(xì)菌 ATCC 17029，YP_002520048，來自類球紅細(xì)菌， AAL86727，來自扭脫甲基桿菌AMl。
9.根據(jù)權(quán)利要求6至8中至少一項的融合蛋白，其特征在于，所述與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列以N-末端與3-羥基羧酸-CoA-變位酶相融合。
10.根據(jù)權(quán)利要求6至9中至少一項的融合蛋白，其特征在于，所述與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列以N-末端與寡聚3-羥基羧酸-CoA-變位酶的小亞基相融合。
11.根據(jù)權(quán)利要求6至10中至少一項的融合蛋白，其特征在于，所述3-羥基羧酸-CoA-變位酶選自SEQ ID No. 21 和 22 (A. tertiaricarbonis DSM 18512)以及 ABM97311和ABM97308. I (M. petroleiphilum PMl),與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列與所述3-輕基羧酸-CoA-變位酶的大亞基以N-末端相融合，所述與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列可以衍生自SEQ ID No I(A. tertiaricarbonis DSM18512)，和 YP_001023545(M. petroleiphilumPMl), 其中在所述與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列與所述3_羥基羧酸-CoA-變位酶之間存在由氨基酸序列Cys Ala Gly Ser Phe Pro Thr Ile組成的連接子。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的融合蛋白的異源二聚體融合蛋白，所述蛋白包含SEQID No. 3和 SEQ ID No. 4。
13.分離的核酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求6至12中至少一項的融合蛋白。
14.用于酶促制備2-羥基異丁酸的方法，其包括下列步驟 a)使 al)具有3-羥基羧酸-CoA-變位酶的酶促活性的微生物或所述微生物的細(xì)胞提取物，其中根據(jù)權(quán)利要求I的包含與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)相比于所述微生物的野生型而言在所述微生物中或在所述細(xì)胞提取物本身中的存在得到增強(qiáng)，或者 a2)具有根據(jù)權(quán)利要求6至12的融合蛋白的單元， 與包含3-羥基異丁酸的水性介質(zhì)相接觸，以及任選地， b)從水性介質(zhì)或從具有融合蛋白的單元純化2-羥基異丁酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于，具有融合蛋白的單元是微生物或其細(xì)胞提取物。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的方法，其特征在于，所述微生物選自包含下列屬的組曲霉屬、棒桿菌屬、短桿菌屬、芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、乳桿菌屬、副球菌屬、乳球菌屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、糖酵母屬、埃希氏菌屬、發(fā)酵單胞菌屬、耶氏酵母屬、甲基桿菌屬、羅爾斯通氏菌屬、假單胞菌屬、紅螺菌屬、紅細(xì)菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、梭菌屬和貪銅菌屬以及產(chǎn)乙酸微生物。
17.根據(jù)權(quán)利要求14至16中至少一項的方法，其特征在于，所述微生物從碳源合成3-羥基丁酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其特征在于，所述產(chǎn)乙酸微生物選自潮濕厭氧醋酸菌、伍氏醋酸桿菌、閃爍古生球菌、食甲基丁酸桿菌、食甲基丁酸桿菌、Carboxydibrachiumpacificusλ Carboxydocella sporoproducens、Carboxydocellathermoautotrophica、生氫氧化碳嗜熱菌、朽1檬酸桿菌屬物種Π9、醋酸桿菌、丙酮丁醇梭菌、自養(yǎng)產(chǎn)乙烷梭菌、食羰基化物梭菌、揚(yáng)氏梭菌、食羰基化物脫硫腸狀菌、庫氏脫硫腸狀菌、熱苯脫硫腸狀菌嗜熱互營亞種、粘液真桿菌、噬乙酸甲烷八疊球菌C2A、巴氏甲烷八疊球菌、熱自養(yǎng)甲烷嗜熱桿菌、穆爾氏菌屬AMP、熱醋穆爾氏菌、熱自養(yǎng)穆爾氏菌、普氏醋菌、產(chǎn)生消化鏈球菌、產(chǎn)生消化鏈球菌、沼澤紅假單胞菌P4、深紅紅螺菌、膠狀紅長命菌、Thermincola carboxydiphila、Thermincola ferriacetica、熱球菌屬 AM4、食擬基化物熱石桿菌和凱伍熱厭氧菌，并且所述3-羥基丁酸從碳源合成，其中所述碳源選自一氧化碳、二氧化碳、廢氣和合成氣。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其特征在于，從碳源合成3-羥基丁酸和從3-羥基丁酸合成2-羥基異丁酸在單一步驟中完成。
20.根據(jù)權(quán)利要求14至19中至少一項的方法所獲得的2-羥基異丁酸的用途，所述用途為通過脫水以及任選地酯化和任選地多聚化來制備甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯或其聚合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及是與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)用于增加3-羥基羧酸-CoA-變位酶的酶促活性的用途、包含3-羥基羧酸-CoA-變位酶和與MeaB蛋白同源的蛋白質(zhì)序列的融合蛋白以及用于制備2-羥基異丁酸的酶促方法。
文檔編號C07K14/47GK102770445SQ201080051033
公開日2012年11月7日 申請日期2010年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月11日
發(fā)明者A·蒂森胡森, A·馬克思, L·賴內(nèi)克, M·布赫豪普特, S·沙費(fèi)爾, T·克勒 申請人:贏創(chuàng)羅姆有限公司