專利名稱：：通過擴(kuò)增和檢測核殼rna序列分析sars冠狀病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)8月涉及通過擴(kuò)增和檢測核殼RNA序列分析嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒的存在的方法。嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)是最近出現(xiàn)的與感染患者中的非典型肺炎有關(guān)的疾病。該疾病非常嚴(yán)重，并且沒有已知的治療方法。SARS的潛伏期一般為2至10天。Sympathkumar等，MayoClin.Proc.78:882-890(2003)。SARS的身體表現(xiàn)包括發(fā)燒，之后為無痰干咳及呼吸短促。在大約3°/。至10°/。的SARS病例中出現(xiàn)因呼吸衰竭導(dǎo)致的死亡。疾病控制和預(yù)防中心(CDC)，Morb.Mortal.Wkly.Report.52:357(2003)。SARS的臨床診斷常常是一個(gè)緩慢的過程，因?yàn)镾ARS疑似患者的初步診斷檢查包括胸部X光片、脈搏血氧定量、血液培養(yǎng)、痰的革蘭氏染色和培養(yǎng)、以及針對其它病毒性呼吸道感染的檢查。CDC，GuidelinesandRecommendations:InterimGuidelinesforLaboratoryDiagnosisofSARS-CoVInfection,Jul.(2003)。這一困難也反映在如下事實(shí)上兩種最常用的診斷程序一一檢測SARS病毒的血清抗體和在細(xì)胞培養(yǎng)中從臨床標(biāo)本分離病毒——常?；ㄙM(fèi)數(shù)日或甚至數(shù)周來完成。CDC，GuidelinesandRecommendations:InterimGuidelinesforLaboratoryDiagnosisofSARS-CoVInfection,Jul.(2003)。因此，重要的是，需要建立快速的非侵入性SARS檢查法以監(jiān)測和控制該疾病。在2003年初，一種新的冠狀病毒被鑒定為SARS的病原體。Drosten
背景技術(shù)：
：等，N.Engl.J.Med.348:1967-76(2003)。冠狀病毒是一組多樣的RNA病毒，其在人類和其它動物中引起呼吸道和腸道疾病。它們是最大的RNA病毒，具有大約30，000個(gè)核苷酸的基因組。Rota等，Science300:1394-1399(2003)。SARS-冠狀病毒(SARS-CoV)是一種有包膜的、正鏈RNA病毒?；谛蛄蟹治?，SARS-CoV是新冠狀病毒組中的一個(gè)成員(尼多病毒目(固ovirale)，冠狀病毒科(Coronaviridae)，冠狀病毒屬(Coronavirus))。Rota等，同上引文。核殼(N)基因的位置接近SARS-CoV基因組的3，末端。編碼N蛋白的亞基因組RNA在病毒感染后大量表達(dá)，為該疾病的檢測提供了良好的靶基因。Rota等，同上引文。用于檢查該病毒核酸存在的試驗(yàn)將允許快速靈敏地檢測SARS-CoV。該試驗(yàn)將提供替代血清學(xué)檢查、直接熒光抗體染色或尿抗原檢查的更靈敏方法。
發(fā)明內(nèi)容一方面，本發(fā)明提供包含第一擴(kuò)增引物和第二擴(kuò)增引物的寡核苷酸組，其中第一擴(kuò)增引物選自SEQIDNO.:4和18，而第二擴(kuò)增引物選自SEQIDNO.:5和19。另一方面，第一擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:4組成，而第二擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:5組成。在本發(fā)明的再一方面，第一擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:18組成，第二擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:19組成。另一方面，本發(fā)明提供包含第一擴(kuò)增引物和第二擴(kuò)增引物的寡核苷酸組，第一擴(kuò)增引物選自SEQIDNO.:4和18的靶結(jié)合序列，第二擴(kuò)增引物選自SEQIDNO.:5和19的靶結(jié)合序列。另一方面，第一擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:4的靶結(jié)合序列組成，第二擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:5的乾結(jié)合序列組成。在本發(fā)明的再一方面，第一擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:18的靶結(jié)合序列組成，第二擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:19的靶結(jié)合序列組成。再一方面，該寡核苷酸組還包含信號引物和報(bào)道探針，其中信號引物選自SEQIDNO.:6，8，20和21的耙結(jié)合序列，報(bào)道探針選自SEQIDNO.:13和15。一方面，信號引物基本上由SEQIDNO.:6的靼結(jié)合序列組成，報(bào)道探針基本上由SEQIDN0.:13組成。另一方面，信號引物基本上由SEQIDNO.:8的靶結(jié)合序列組成，報(bào)道探針基本上由SEQIDN0.:15組成。再一方面，該寡核苷酸組還包含第二信號引物和第二報(bào)道探針，該笫二信號引物基本上由SEQIDNO.:25組成，該第二報(bào)道探針基本上由SEQIDNO.:14組成。在再一實(shí)施方案中，具有第二信號引物和第二報(bào)道探針的該寡核苷酸組還包含一個(gè)或多個(gè)選自SEQIDNO.:1，2，3和17的緩沖引物(bumperprimer)。在其它實(shí)施方案中，信號引物基本上由SEQIDNO.:20的耙結(jié)合序列組成，報(bào)道探針基本上由SEQIDNO.:13組成。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，信號引物基本上由SEQIDNO.:21的靶結(jié)合序列組成，報(bào)道探針基本上由SEQIDNO.:15組成。再一方面，該寡核苷酸組還包含第二信號引物和第二報(bào)道探針，該第二信號引物基本上由SEQIDNO.:7組成，該第二報(bào)道探針基本上由SEQIDNO.:16的雜交序列組成。在再一方面，包含第二信號引物和第二報(bào)道探針的該寡核苷酸組還包含一個(gè)或多個(gè)選自SEQIDNO.:1，2，3和17的緩沖引物。再一方面，SEQIDNO.:4,5，18和19的乾結(jié)合序列包含擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列。本發(fā)明另一實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列包含可以被限制性核酸內(nèi)切酶切割的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。在再一實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列包含被RM聚合酶識別的啟動子。在另一實(shí)施方案中，SEQIDNO.:6，8，13，15，20和21的雜交序列還包含可間接檢測的標(biāo)記物。另一方面，該可間接檢測的標(biāo)記物包含銜接序列。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含選自SEQIDNO.:9，10，22和23的SARS-CoV耙序列的寡核苷酸。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供檢測樣品中SARS-CoV存在與否的方法，該方法包括(a)在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中用多個(gè)核酸引物處理樣品，其中第一引物選自SEQIDNO.:4和SEQIDNO.:18的靶結(jié)合序列，第二引物選自SEQIDNO.:5和SEQIDNO.:19的耙結(jié)合序列；和(b)檢測任何擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物，其中檢測到該擴(kuò)增產(chǎn)物指示存在SARSCoV。另一實(shí)施方案中，第一引物基本上由SEQIDNO.:4組成，第二引物基本上由SEQIDNO.:5組成。另一實(shí)施方案中，第一引物基本上由SEQIDNO.:18組成，第二引物基本上由SEQIDNO.:19組成。再一實(shí)施方案中，步驟(a)包括鏈置換擴(kuò)增(SDA)反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，SDA反應(yīng)利用一個(gè)或多個(gè)選自SEQIDNO.:1，2，3和17的緩沖引物。在另一實(shí)施方案中，SDA反應(yīng)包括耐熱鏈置換擴(kuò)增(tSDA)反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，tSDA反應(yīng)是一種均相熒光(homogeneousfluorescent)實(shí)時(shí)tSDA反應(yīng)。在再一實(shí)施方案中，步驟(b)包括所述擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物與選自SEQIDNO.:6，8，20和21的信號引物雜交的步驟。才艮據(jù)再一方面，本發(fā)明提供擴(kuò)增SARS-CoV的靶核酸序列的方法，包括(a)使該核酸與(i)選自SEQIDNO.:4和18的靶結(jié)合序列的第一擴(kuò)增引物；和(ii)選自SEQIDNO.:5和19的靶結(jié)合序列的第二擴(kuò)增引物雜交；和(b)在靶核酸序列上延伸雜交的第一和第二擴(kuò)增引物，由此擴(kuò)增該靶核酸序列。根據(jù)該方法的再一方面，第一擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:4的靶結(jié)合序列組成，第二擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:5的靼結(jié)合序列組成。根據(jù)該方法的再一方面，第一擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:18的靶結(jié)合序列組成，第二擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:19的靼結(jié)合序列組成。在該方法的另一方面，SEQIDNO.:4和SEQIDNO.:5的靶結(jié)合序列包含擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列。在另一實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列包含可以被限制性核酸內(nèi)切酶切割的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。在另一實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列包含RM聚合酶所識別的啟動子。在本發(fā)明的另一方面，SEQIDNO.:18和SEQIDNO.:19的靶結(jié)合序列包含擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列。在再一方面，擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列包含可以被限制性核酸內(nèi)切酶切割的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。在再一實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列包含RNA聚合酶所識別的啟動子。在再一方面，該方法還包括通過與信號引物雜交，間接地檢測擴(kuò)增的耙核酸。在另一方面，信號引物選自SEQIDNO.:6，8，20和21。根據(jù)再一方面，靶核酸序列選自SEQIDNO.:9，10，22和23。根據(jù)再一方面，本發(fā)明提供定量靶樣品中SARS-CoV核酸的量的方法，包括步驟a)將靼樣品與已知濃度的SARS-CoV內(nèi)對照核酸混合；b)在擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增靶核酸和內(nèi)對照核酸；c)檢測擴(kuò)增的核酸；和d)分析擴(kuò)增的SARS-CoV靶核酸和內(nèi)對照核酸的相對量。在另一實(shí)施方案中，步驟(b)包括鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)。在再一實(shí)施方案中，SDA反應(yīng)包括tSDA反應(yīng)。在再一方面，所述擴(kuò)增反應(yīng)利用一個(gè)或多個(gè)選自SEQIDNO.:6，7，8，20，21和25的雜交序列的信號引物和一個(gè)或多個(gè)選自SEQIDNO.:13，14，15和16的雜交序列的報(bào)道探針。在再一方面，SEQIDNO.:6，7，8，13，14，15，16，20，21和25的雜交序列包括可間接檢測的標(biāo)記物。在另一實(shí)施方案中，該可間接檢測的標(biāo)記物包含銜接序列。實(shí)施本發(fā)明的具體方式本發(fā)明方法可通過擴(kuò)增和檢測SARS-CoV核殼(N)序列用于分析SARS-CoV的存在。本發(fā)明的引物和探針以SARS-CoV核殼基因的部分為基礎(chǔ)。本發(fā)明還提供可以用于擴(kuò)增、檢測和/或定量N基因的寡核苷酸。該寡核苷酸可以用于所有類型的擴(kuò)增反應(yīng)，例如，鏈置換擴(kuò)增(SDA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)和QB復(fù)制酶介導(dǎo)的擴(kuò)增。本發(fā)明還提供可以足夠的特異性和靈敏度用于擴(kuò)增、檢測和/或定量N基因的寡核苷酸。本發(fā)明方法可用于，例如但不限于，檢查從SARS疑似患者獲得的臨床標(biāo)本。該標(biāo)本或測試樣品可以從懷疑含有SARS核酸的任何來源收集。對于動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人類，該測試樣品的來源可以包括血液、骨髓、淋巴、硬組織(例如，肝、脾、腎、肺、卵巢等)、痰、糞便、尿、上和下呼吸道標(biāo)本和其它臨床樣品。其它來源可以包括獸醫(yī)和環(huán)境樣品，以及體外培養(yǎng)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定可以在SARS-CoV感染診斷中使用的適當(dāng)臨床來源。定義為了清楚的目的，提供以下定義，這些定義不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是限制性的。除非另行指出，本文所用技術(shù)和科學(xué)術(shù)語旨在具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義。"擴(kuò)增引物"是用于擴(kuò)增靶序列的寡核苷酸，其中該靶序列通過該寡核苷酸與靶序列雜交后寡核苷酸的延伸得以擴(kuò)增或通過與靶序列雜交后相鄰的多個(gè)寡核苷酸的連接得以擴(kuò)增。擴(kuò)增引物的至少一部分與靶雜交。該部分稱作靶結(jié)合序列，其確定引物的耙特異性。除了靶結(jié)合序列外，某些擴(kuò)增方法還需要在擴(kuò)增引物中存在專門的非靶結(jié)合序列。這些專門序列是擴(kuò)增方法進(jìn)行所必需的，并且典型地起著將該專門序列添加至靶上的作用。例如，但不限于，SDA中使用的擴(kuò)增引物包括位于耙結(jié)合序列5'的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，參見美國專利5，455，166和5，270，184，這兩份專利并入此處作為參考。MSBA、自動維持序列擴(kuò)增(3SR)和基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增的引物需要與引物的靶結(jié)合序列連接的RNA聚合酶啟動子。將此專門序列與靶結(jié)合序列連接以便在選定的擴(kuò)增反應(yīng)中使用，是本領(lǐng)域常規(guī)的。相反，在靶的末端不需要專門序列的擴(kuò)增方法，例如PCR，一般使用僅由靶結(jié)合序列組成的擴(kuò)增引物。在本文中，術(shù)語"引物"和"探針，，指寡核苷酸的功能。引物典型地在與靶雜交后通過聚合酶或連接來延伸，而探針可以通過與耙雜交或通過雜交后基于聚合酶的延伸來發(fā)揮作用。雜交的寡核苷酸如果用于捕獲或檢測靶序列則可以作為探針起作用，而如果該寡核苷酸用作擴(kuò)增引物中的靶結(jié)合序列，則其可以作為引物起作用。因此，可以理解，本文公開的用于擴(kuò)增、檢測或定量SARS-CoV的任何靶結(jié)合序列都可以用作雜交探針或用作引物中的耙結(jié)合序列以進(jìn)行檢測或擴(kuò)增，并任選地與專門序列連接。"緩沖引物"或"外引物"是與擴(kuò)增引物上游(即，5，端)的靶序列退火的引物，這樣該外引物的延伸將置換下游引物和其延伸產(chǎn)物，即，置換包含SDA限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的靶序列拷貝。因此，緩沖引物僅僅由靶結(jié)合序列組成，并且設(shè)計(jì)為可以在擴(kuò)增引物上游退火并在延伸時(shí)置換擴(kuò)增引物。G.Walker等在Nuc,AcidsRes.20:1692-1696中將外引物命名為B,和B2。外引物的延伸是置換擴(kuò)增引物的延伸產(chǎn)物的一種方法，但是在某些情況中加熱也可能是適宜的。"逆轉(zhuǎn)錄引物，，也僅由靶結(jié)合序列組成。其在RNA把序列的3，端雜交以引發(fā)靶的逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄引物的延伸產(chǎn)生包含RM靶和通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的該RM耙的cDNA拷貝的異源雙鏈體。使cDNA與RNA鏈分離(例如，通it^口熱、RNA酶H或鏈置換)成為單鏈并可用于擴(kuò)增。任選地，可以在該cDNA的耙序列3，端雜交第二逆轉(zhuǎn)錄引物，以便在擴(kuò)增前引發(fā)第二鏈的合成。任選地，逆轉(zhuǎn)錄引物也可以作為擴(kuò)增引物或緩沖引物起作用。術(shù)語"靶"和"靶序列"指待擴(kuò)增、復(fù)制或檢測的核酸序列(DNA和/或RNA)。這些序列包括待擴(kuò)增的原始核酸序列和其互補(bǔ)第二鏈，以及通過擴(kuò)增或復(fù)制該靼序列產(chǎn)生的該原始靶序列的拷貝的任一鏈。"擴(kuò)增產(chǎn)物"、"延伸產(chǎn)物"或"擴(kuò)增子"是包含在擴(kuò)增或復(fù)制靶序列期間產(chǎn)生的該耙序列的拷貝的寡核苷酸或多核苷酸。術(shù)語"聚合酶"指各種在已有核酸模板上催化核酸合成的酶，例如DM聚合酶、RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶。DM聚合酶從脫氧核糖核苷酸裝配DNA，而RM聚合酶自核糖核苷酸裝配RNA?；?5個(gè)SARS-CoV核苷酸序列的比對(aligmnent)，選擇兩個(gè)區(qū)域作為靶序列用于核殼區(qū)域的擴(kuò)增，參見表1和表3所示。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，已經(jīng)適應(yīng)性地修改了逆轉(zhuǎn)錄酶-鏈置換擴(kuò)增(RT-SDA)用于檢測基因組和亞基因組RM序列中的SARS-CoV核殼RNA。SDA是等溫的(恒定溫度)核酸擴(kuò)增方法。在SDA中，單鏈延伸產(chǎn)物的置換、引物與延伸產(chǎn)物(或原始耙序列)的退火和引物的隨后延伸同時(shí)在該反應(yīng)混合中發(fā)生。常規(guī)的SDA(在較低溫度，通常大約35-45'C進(jìn)行)描述于G.Walker等，Proc.NaU.Acad.Sci.USA89:392-396(1992)和Walker等，Nuc.AcidsRes.，同上。通過SDA檢測核酸的詳細(xì)描述參見美國專利5，455，166;5，523，204;和5,916，779，這些專利完整并入此處作為參考。這些專利提供了通過核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的鏈置換擴(kuò)增樣品中靶核酸序列(和其互補(bǔ)鏈)的方法。此外，美國專利5，916，779還適應(yīng)性地修改了SDA以逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增RNA耙。根據(jù)本發(fā)明，從測試樣品提取SARS-CoV靶核殼RNA?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法分離該SARS-CoV核殼RM。然后在例如RT-SDA方法中擴(kuò)增該核殼RNA。RT-SDA可以以一步法或兩步法的方式實(shí)施。一步法同時(shí)產(chǎn)生和擴(kuò)增SARS-CoV靶序列的cDNA拷貝。在一個(gè)實(shí)施方案中，一步RT-SDA法利用設(shè)計(jì)以允許并入限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)和置換單鏈cDNA的第一擴(kuò)增引物和緩沖引物。得到的cDNA隨后通過第二擴(kuò)增引物和任選地一個(gè)或多個(gè)緩沖引物的退火進(jìn)行擴(kuò)增。在另一實(shí)施方案中，一步RT-SDA法利用第一反向引物和任選地一個(gè)或多個(gè)緩沖引物。DM依賴性DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶允許cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的延伸。在此一步法的另一實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄酶用于延伸一個(gè)或多個(gè)反向引物以及從RNA模板合成cDM。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到可以在本發(fā)明方法中使用的某些常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄酶(即，AMV，醒LV，Superscript11)。作為一個(gè)舉例說明性例子，前面描述的一步RT-SDA反應(yīng)使用SDA擴(kuò)增引物和緩沖引物。然而，如美國專利5，916，779中所述，逆轉(zhuǎn)錄酶能夠利用SDA引物或逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行鏈置換。因此，也可以存在逆轉(zhuǎn)錄引物，通過逆轉(zhuǎn)錄酶用于該反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄部分。下游逆轉(zhuǎn)錄引物作為逆轉(zhuǎn)錄引物起作用。上游逆轉(zhuǎn)錄引物類似于SDA緩沖引物，因?yàn)槠溲由炜梢灾脫Q下游逆轉(zhuǎn)錄引物的延伸產(chǎn)物(cDM)。備選地，RT-SDA可以是兩步擴(kuò)增法，其中在分開的步驟中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及之后的SDA。因此，在該反應(yīng)的第一逆轉(zhuǎn)錄步驟中存在逆轉(zhuǎn)錄引物。然后將cDNA與RM模板分開，之后進(jìn)行第二擴(kuò)增步驟。加熱反應(yīng)以分開DNA:RNA雜合體，或者通過化學(xué)或酶方法分開這兩條鏈。例如，但不限于，可以使用RNA酶H或RM酶H活性降解RM鏈，由此產(chǎn)生單鏈DNA。此外，可以通過利用缺乏5，—3，活性并能從一條鏈置換另一鏈的聚合酶，實(shí)現(xiàn)雜合體的分離。SDA引物在反應(yīng)的第二步中加入，進(jìn)行SDA擴(kuò)增以提供可檢測的擴(kuò)增產(chǎn)物。在此兩步法的一個(gè)實(shí)施方案中，反向引物是SDA引物，RNA酶H活性是逆轉(zhuǎn)錄酶的內(nèi)源活性。此外，反向引物可以是緩沖引物或隨機(jī)產(chǎn)生的DNA序列。在本發(fā)明的再一實(shí)施方案中，兩步RT-SDA法使用SDA引物和一個(gè)或多個(gè)緩沖引物用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。正向引物和擴(kuò)增及檢測所需的其它反應(yīng)成分，例如SDA酶、脫氧核糖核苷酸、信號引物、探針和緩沖.液成分，與RT反應(yīng)產(chǎn)物混合。近來研發(fā)了耐熱型SDA反應(yīng)(tSDA)，該型反應(yīng)在較高，但仍恒定的溫度下使用熱穩(wěn)定聚合酶和限制性核酸內(nèi)切酶來實(shí)施，參見并入此處作為參考的美國專利5,648,211和5，744，311。該反應(yīng)基本上如常規(guī)SDA一樣進(jìn)行，但替代使用熱穩(wěn)定聚合酶和熱穩(wěn)定限制性核酶內(nèi)切酶。反應(yīng)溫度調(diào)整至適于所選耐熱酶的較高溫度(典型地，大約45。C至60°C)，并用所選熱穩(wěn)定核酸內(nèi)切酶的適當(dāng)限制性核酸內(nèi)切酶識別/切割位點(diǎn)置換常規(guī)的限制性核酸內(nèi)切酶識別/切割位點(diǎn)。此外，與常規(guī)SDA不同，實(shí)施者還可以在初次的熱變性步驟前將酶包括在反應(yīng)混合物中，只要這些酶在該溫度充分穩(wěn)定即可。為了以和原位PCR相當(dāng)?shù)撵`敏度和特異性在懸浮液中、載玻片上或組織中于細(xì)胞中原位擴(kuò)增核酸靼序列，已經(jīng)對SDA進(jìn)行了適應(yīng)性的修改。該方法詳細(xì)描述于美國專利5,523,204中，該專利并入此處作為參考。由于SDA反應(yīng)在恒定的較低溫度下進(jìn)行，故SDA比PCR對細(xì)胞和組織更為溫和。此外，還可以保持優(yōu)良的標(biāo)本形態(tài)。通過SDA實(shí)施的原位擴(kuò)增與免疫化學(xué)技術(shù)相容，因此，可以在相同的標(biāo)本上進(jìn)行靶序列的擴(kuò)增和免疫學(xué)染色?？梢詫⒒赗NA的內(nèi)對照并入反應(yīng)混合物中，與本發(fā)明的SARS-CoV靶序列一起擴(kuò)增?？梢栽O(shè)計(jì)內(nèi)對照以驗(yàn)證陰性結(jié)果和鑒定潛在的抑制性樣品。也可以使用該對照在竟?fàn)幮栽囼?yàn)中實(shí)現(xiàn)定量目的，參見Nadeau等，Anal.Biochem.276:177-187(1999)。此外，可以將干的逆轉(zhuǎn)錄酶與此處所述SDA法聯(lián)用。干酶可以提供優(yōu)于液體酶使用時(shí)的改良工作流程(workflow)以及延長的保存期。表1和表3列出的SDA引物、緩沖引物和信號引物被設(shè)計(jì)用于根據(jù)本發(fā)明方法的RT-SDA反應(yīng)中。加下劃線的為結(jié)合序列。對于SDA引物，該序列的剩余5'部分包含SDA反應(yīng)進(jìn)行所需的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(RERS)和通用非靶特異性尾序列；而對于信號引物，5，尾包含通用非耙特異性序列，該序列與相應(yīng)凈艮道探針的相同。易于明了的是，SDA引物也可以作為擴(kuò)增引物用于替代擴(kuò)增試驗(yàn)中。同樣明了的是，靶結(jié)合序列也可以單獨(dú)使用，在不需要專門序列或結(jié)構(gòu)的反應(yīng)(例如PCR)中擴(kuò)增靶；以及可以用非RT-SDA的其它擴(kuò)增反應(yīng)所需的不同專門序列替代以下所示的含有RERS的序列(例如，RNA聚合酶啟動子)。當(dāng)寡核普酸用于擴(kuò)增反應(yīng)中時(shí)SM引物名中"F"和"R"分別指"正向"和"反向，，引物。表l:用于SARS-CoV試驗(yàn)區(qū)域C的引物、探針和序列SEQIDNO.123244567825寡核苷酸長度5'-3'序列'引物SARSrtB24*24SARSrtB21*20SARSrtB17*17pUC19緩沖引物15CDSDA引物SarCFP41SarCRP*41信號引物SarCAd誦TBD1640SarC-IACAd40SarCAd-MPC40SarCIAC-Ad240CAATGTTGTTCCTTGAGGAAGTTGGTTGTTCCTTGAGGAAGTTGGTTCCTTGAGGAAGTTGGCCTCTTCGCTATTACGATTCCGCTCCAGACTTCTCGGGAACAAAGAAGGCATCGTACCGCATCGAATGCATGTC7TGGGTGGCAGCATTGTTATTAACGTTAGCCACCATACGGAT么CCCAAAGACCACATTGGCAACTGATCCGCACTAACGACT么CCCAAAGACCACACGGACTACGTTAGCCACCATACTTGAACCCAAAGACCACATTGGCAAGCTATCCGCCATAAGCCATACCCAAAGACCACACGGACT10靶序列試驗(yàn)區(qū)域C共有克隆的乾序列試驗(yàn)區(qū)域c共有RNA轉(zhuǎn)錄物126AACAAAGAAGGCATCGTATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCCAAAGACCACATTGGCACCCGCAATCCTAATTACAATGCTGCCACCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTG126AACAAAGAAGGCAUCGUAUGGGUUGCAACUGAGGGAGCCUUGAAUACACCCAAAGACCACAUUGGCACCCGCAAUCCUAAUUACAAUGCUGCCACCGUGCUACAACUUCCUCAAGGAACAACAUUG<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表3:用于SARS-CoV試驗(yàn)區(qū)域D的引物、探針和序列SEQBD寡核苷酸長度5'-3'序列NO,_緩沖引物17SarDB22*22SDA引物18SarDFP4119SarDRP*41信號引物20SarDAd-TBD164021SarDAd-MPC40把序列22試驗(yàn)區(qū)域D111共有DM乾序列23試驗(yàn)區(qū)域Din共有RM轉(zhuǎn)錄物引物靶雜交區(qū)域以下劃線表示。BsoBI位點(diǎn)以斜體表示。*可以用于引發(fā)逆轉(zhuǎn)錄的寡核苷酸。在靶擴(kuò)增后，根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的核酸可以利用本領(lǐng)域已知的任何用于檢測特異核酸序列的方法進(jìn)行檢測。例如，但不限于，可以使用各種用于SDA的檢測方法。在美國專利6,316,200中討論了用于標(biāo)記SDA產(chǎn)物的幾種方法，該專利完整地并入此處作為參考。例如，但不限于，可以通過與寡核苷酸檢測探針的特異雜交，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。檢測探針是包括可檢測標(biāo)記物(即，產(chǎn)生可檢測信號或能夠經(jīng)過處理以產(chǎn)生可檢測信號的部分)的短寡核苷酸。可以通過切口平移、末端標(biāo)記或在探針的化學(xué)合成期間將標(biāo)記物摻入該寡核苷酸探針。本領(lǐng)域已知許多可直接和21ATGTTCCCGAAGGTGTGACTTCGATTCCGCTCCAGACTTC7UGGGACAAGGAACTGATTACAACCGCATCGAATGCATGTCTCGGGTGCGTGACATTCCAAAGACGTTAGCCACCATACGGAT￡AATTTGCTCCAAGTGCCTCACGTTAGCCACCATACTTGA￡AATTTGCTCCAAGTGCCTCGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCTCCAAGTGCCTCTOCATTCTTTGGAATGTCACGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACATGACAAGGAACUGAUUACAAACAUUGGCCGCAAAUUGCACAAUUUGCUCCAAGUGCCUCUGCAUUCUUUGGAAUGUCACGCAUUGGCAUGGAAGUCACACCUUCGGGAACAU間接檢測的標(biāo)記物可用于寡核苷酸探針。可直接檢測的標(biāo)記物包括那些無需進(jìn)一步反應(yīng)來變得可檢測的標(biāo)記物，例如，放射性同位素、熒光部分和染料?？砷g接檢測的標(biāo)記物包括那些必須與其它試劑反應(yīng)以變得可檢測的標(biāo)記物，例如，能夠產(chǎn)生有色反應(yīng)產(chǎn)物的酶(例如，堿性磷酸酶(AP)或辣根過氧化物酶)、生物素、親和素、地高辛配基(dig)、抗原、半抗原或熒光色素。來自酶標(biāo)記物的信號一般通過酶與其底物及任何為了產(chǎn)生有色酶反應(yīng)產(chǎn)物所需的其它試劑反應(yīng)來生成。生物素(或親和素)標(biāo)記物可以通過與標(biāo)記的親和素(或標(biāo)記的生物素)或標(biāo)記的抗生物素(或標(biāo)記的抗親和素)抗體結(jié)合來檢測。地高辛配基和半抗原標(biāo)記物通常通過與標(biāo)記的抗地高辛配基(抗-dig)或抗半抗原抗體特異性結(jié)合而檢測。一般地，選擇檢測探針使其與擴(kuò)增子中位于兩個(gè)擴(kuò)增引物的結(jié)合位點(diǎn)之間的核苷酸序列雜交。檢測探針也可以與擴(kuò)增引物之任一具有相同的核苷酸序列。通過與檢測探針雜交進(jìn)行體外和原位檢測的方法是本領(lǐng)域已知的。或者，可以通過檢測引物的延伸來檢測本發(fā)明的擴(kuò)增產(chǎn)物，參見Walker等，Nuc.AcidsRes.，同上。在檢測引物延伸方法中，包含可檢測標(biāo)記物的寡核苷酸引物與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交并通過添加聚合酶而得以延伸。為了檢測，可以在5，末端標(biāo)記引物，例如，使用"P或熒光標(biāo)記?；蛘撸梢栽陔s交引物延伸時(shí)摻入包含可直接或間接檢測的標(biāo)記物的dNTP類似物。例如，但不限于，引物延伸時(shí)可以摻入dig-衍生化的dNTP,然后在延伸后通過與AP抗-dig和適宜的AP底物反應(yīng)來實(shí)施檢測。此待延伸的引物可以與擴(kuò)增引物相同或者其可以是能夠與擴(kuò)增子中位于擴(kuò)增引物的結(jié)合位點(diǎn)之間的核苷酸序列雜交的不同引物。可檢測的標(biāo)記物也可以在乾序列擴(kuò)增過程中直接地?fù)饺霐U(kuò)增子內(nèi)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，通過美國專利6,316,200所述方法檢測RT-SDA產(chǎn)物，所述方法利用包含5，銜接序列的未標(biāo)記的信號引物。報(bào)道探針的3，端與該信號引物的5，端的互補(bǔ)序列雜交，產(chǎn)生5，突出端。聚合酶補(bǔ)平此突出端，然后直接或間接地檢測該報(bào)道探針尾的互補(bǔ)序列的合成，以指示靶的存在。此方法利用熒光能量轉(zhuǎn)移(FET)而不是熒光強(qiáng)度的直接檢測來檢測雜交。FET允許實(shí)時(shí)檢測SDA產(chǎn)物。表1至表3中的信號引物和報(bào)道探針被設(shè)計(jì)為利用逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)物實(shí)時(shí)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。這些引物和探針的結(jié)構(gòu)和用途描述在例如，但不限于，美國專利5,547,861;5,928,869;6,316,200;6，656，680;和6，743，582中，所有這些專利均并入此處作為參考。表1至表3中的雜交序列以下劃線表示。報(bào)道探針序列的剩余部分形成典型地被標(biāo)記以利于按照本領(lǐng)域已知的方式檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。正如從美國專利5，935，791;5,846,726;5,691,145;5，550，025;和5，593，867中所知，容易明了的是，耙序列也可以單獨(dú)用于直接雜交(典型地與可檢測標(biāo)記物連接)，以及可以使用其它的直接和間接標(biāo)記物替代發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin)，上述專利的內(nèi)容均并入此處作為參考。由于靶結(jié)合序列賦予引物或探針的靶特異性，故應(yīng)當(dāng)理解，以上示用以檢測SARS-CoV核殼核酸。例如，但不限于，本發(fā)明的耙結(jié)合序列可以用作雜交探針，在不經(jīng)擴(kuò)增的情況下或作為擴(kuò)增后的分析試驗(yàn)，直接地檢測SARS-CoV。此類雜交方法是本領(lǐng)域熟知的，典型地使用與靼結(jié)合序列締合或連接的可檢測標(biāo)記物以利于檢測雜交。此外，上述乾結(jié)合序列基本上所有都可以用作無需其它專門序列的擴(kuò)增反應(yīng)(例如PCR)中的擴(kuò)增引物或者添加至專門用于3SR、NASBA、基于轉(zhuǎn)錄的或任何其它的引物延伸擴(kuò)增反應(yīng)的適當(dāng)序列上。為擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測，可以按本領(lǐng)域已知的方式標(biāo)記包含本文所述靶結(jié)合序列的擴(kuò)增引物?；蛘?，可以按照美國專利5,547,861;5，928，869;5,593,867;5,550,025;5,935,791;5，888，739;和5,846,726(所有這些專利并入此處作為參考)所述，將包含所公開的靶結(jié)合序列的標(biāo)記的檢測引物與擴(kuò)增引物聯(lián)用，以實(shí)時(shí)均相檢測擴(kuò)增。此類檢測引物可以包含可直接或間接檢測的序列，該序列最初不與靶雜交，但一旦其與靶雜交并被延伸后則利于對檢測引物的檢測。例如，該可檢測序列可以是形成二級結(jié)構(gòu)的序列、含有限制性位點(diǎn)的序列、或可以通過標(biāo)記的寡核苷酸(有時(shí)稱作報(bào)道探針)與其互補(bǔ)序列的雜交按照本領(lǐng)域已知的方式被檢測的線性序列。或者，可以在擴(kuò)增后，通過與選自本文所公開的任何靶結(jié)合序列并位于所選擴(kuò)增引物對之間的探針雜交，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)理解，由靶結(jié)合序列和任選地所選擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列或所選檢測反應(yīng)所需的序列組成的本發(fā)明寡核苷酸也可以包括充當(dāng)間隔區(qū)、接頭、用于標(biāo)記或結(jié)合酶的序列等的某些其它序列。一般已知這些其它序列是在所選反應(yīng)中為了獲得該寡核苷酸的最佳功能而必需的，并且這些其它序列旨在通過術(shù)語"由……組成"來包括在內(nèi)。本發(fā)明也涉及在不同嚴(yán)緊雜交條件(即，用于選擇性雜交)下與本文所述核苷酸序列雜交的核酸分子。"嚴(yán)緊條件，，指確定第一核酸與第二核酸雜交的溫育和洗滌條件(例如，溫度、緩沖液濃度)。第一和第二核酸可以完全地(100%)互補(bǔ)，或者可以較不完全互補(bǔ)(即，70%、50%等)。例如，可以使用某些高嚴(yán)緊條件區(qū)分完全互補(bǔ)的核酸和那些較小程度互補(bǔ)的核酸。用于核酸雜交的"高嚴(yán)緊條件"、"中等嚴(yán)緊條件"和"低嚴(yán)緊條件，，在CurrentProtocolsinMolecularBiology中2.10.1-2.10.16頁及6.3.1-6.3.6頁(Ausubel，F(xiàn).M.等，JohnWiley&Sons(1998),其完整地并入作為參考)上進(jìn)行了解釋。本發(fā)明另一方面涉及引入了本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞。例如，本發(fā)明核酸分子可以在細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。此類適宜的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本發(fā)明還涉及包含裝有用于本發(fā)明中的一種或多種成分的一個(gè)或多個(gè)容器的包裝(pack)或試劑盒。任選地，這些容器可以伴隨具有管理藥品或生物產(chǎn)品生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)所規(guī)定的形式的通知，該通知注明獲得了有關(guān)生產(chǎn)、使用或銷售的行政機(jī)關(guān)的批準(zhǔn)。包裝或試劑盒可以是組合物的單次使用形式，或者其可以是多次使用形式。尤其是，試劑可以分開、以任何組合方式混合在一起、或存在于單個(gè)瓶中。提供以下預(yù)示性實(shí)施例舉例說明本發(fā)明的某些實(shí)施方案，但是這些實(shí)施例不旨在限制本發(fā)明。SARS系統(tǒng)D實(shí)施例檢測SARS-CoVRNA的RT-SDA以下實(shí)施例舉例說明本文公開的引物和報(bào)道探針在檢測臨床標(biāo)本中的SARS-CoVRNA中的用途。臨床標(biāo)本例如糞便樣品、咽喉拭子和鼻咽吸出物使用QIAGENQIAampViralRNAMini試劑盒根據(jù)廠商說明書并加上柱上DNA酶處理除去污染DNA，以實(shí)施加工。對于糞便標(biāo)本，包括另一加工前步驟以在上樣QIAGEN柱前除去顆粒物。用0.89%鹽水1:10稀釋糞便，4,000xg離心20分鐘。然后傾析上清液，并通過O.22jLim濾器以除去顆粒碎屑。通過QIAamp柱加工140微升樣品或糞便過濾物，用DM酶處理柱子以消化和柱基質(zhì)結(jié)合的污染性非特異DNA。洗滌除去DNA酶后，將純化的RNA洗脫在體積80ja1的水中。將30ja1洗脫物加至含有干引物、報(bào)道探針和核苷酸的引發(fā)(Priming)微量孔中，之后加入20m1含有RM酶抑制劑、AMV-RT酶和基于RNA的IAC序列的RNA轉(zhuǎn)錄物的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液。最終的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下1500uMdCJP;dATP、dGTP和dTTP各300juM;5mM乙酸鎂；1500nM緩沖引物SarDB22(SEQIDNO.:17);1500nMSDA引物SarDRP(SEQIDNO.:19);300nMSDA引物SarDFP(SEQIDNO.:18);750nM信號引物SarDAd-MPC(SEQIDNO.:21);600nMIAC信號引物；1200nM報(bào)道探針MPCD/R(SEQIDNO.:15);900nM報(bào)道探針MPC2F/D(SEQIDNO.:16);大約1000個(gè)拷貝IAC轉(zhuǎn)錄物;5%DMSO;5%甘油；43.5mMKiP04;25mMKOH;120mMN-二[羥乙基]甘氨酸；40URM酶抑制劑；10UAMV-RT。然后在48。C溫育再水化的(rehydrated)微量孔20分鐘，之后加入100ylSDA緩沖液并轉(zhuǎn)移至72。C加熱塊上。同時(shí)，含有干SDA酶(Bst聚合酶和BsoBI限制性酶)的擴(kuò)增微量孔在54'C預(yù)熱。溫育10分鐘后，將100n1樣品從引發(fā)微量孔轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增微量孔，然后密封并在BDProbeTecET讀數(shù)器中52.5'C溫育。最終的SDA反應(yīng)條件如下500jaMdCsTP;dATP、dGTP和dTTP各100juM;5.7mM乙酸鎂；500nM緩沖引物SarDB22(SEQIDNO.:17);5OOnMSDA引物SarDRP(SEQIDNO.:19);lOOnMSDA引物SarDFP(SEQIDNO.:18);25謹(jǐn)信號引物SarDAd-MPC(SEQIDNO.:21);200nMIAC信號引物;400nM耙報(bào)道探針MPCD/R(SEQIDNO.:15);300nMIAC報(bào)道探針MPC2F/D(SEQIDNO.:16);12.5%DMSO;1.67%甘油；24.5mMKiP04;82mMKOH;143mMN-二[羥乙基]甘氨酸；12UBst聚合酶;45UBsoBI限制性酶。在1小時(shí)溫育過程中，在BDProbeTecET儀的兩個(gè)光通道中每分鐘讀取熒光讀數(shù)，結(jié)果以SARS-CoV靶和IAC的PAT得分才艮告。熒光讀數(shù)從未達(dá)到過預(yù)定熒光閾值的反應(yīng)被定為PAT得分0。對應(yīng)于MPCD/R報(bào)道探針(SEQIDNO.:15)，產(chǎn)生ROXPAT得分>0的反應(yīng)被認(rèn)為是SARS-CoV陽性；而對應(yīng)于IAC報(bào)道探針MPC2F/D(SEQIDNO.:16),產(chǎn)生FAMPAT得分>0的反應(yīng)被認(rèn)為是IAC陽性。FAM和ROX信號均未達(dá)到其各自閾值(PAT得分-O)的那些反應(yīng)被認(rèn)為是不確定的。陽性和陰性外對照被包括在每一輪試驗(yàn)中以檢驗(yàn)反應(yīng)性能。為了通過儀器報(bào)告來自患者標(biāo)本的結(jié)果，需要這些對照分別產(chǎn)生陽性和陰性正確結(jié)果。預(yù)期結(jié)果和結(jié)論來自感染患者、含有足夠高于試驗(yàn)檢測限的量SARS-CoV的標(biāo)本將產(chǎn)生陽性結(jié)果(即，ROXPAT得分〉0)。來自未感染患者或來自臨床負(fù)荷低于該試驗(yàn)的分析靈敏度的患者的標(biāo)本將產(chǎn)生陰性結(jié)果(即，ROXPAT得分-0)。IAC的擴(kuò)增失敗(即，F(xiàn)AMPAT得分-O)將說明試劑污染了RM酶或程序錯(cuò)誤。表4總結(jié)了可能的結(jié)果。表4:對BDProbeTecETSARS-CoV試驗(yàn)的可能結(jié)果的總結(jié)PAT得分SARS-CoV靼IAC(FAM)(ROX)_>0任何000>0報(bào)告的結(jié)果SARS-CoV陽性不確定SARS-CoV陰性或存在低于該試驗(yàn)的分析靈敏度的病毒提供以下實(shí)驗(yàn)實(shí)施例舉例說明本發(fā)明的某些實(shí)施方案，但是這些實(shí)施例不旨在限制本發(fā)明。SARS試驗(yàn)系統(tǒng)C實(shí)施例實(shí)施例1:使用SARS-CoV特異性引物擴(kuò)增DM使用草巴區(qū)域(相應(yīng)于SARS-CoV林BJ03的28494-28619位核苷酸;GenBank登錄號AY278490)的基于pUC19的質(zhì)?？寺?，證明所公開的引物和探針組合擴(kuò)增SARS-CoV核酸的能力。用限制性酶Narl使質(zhì)粒DNA線性化，并使用PicoGreendsDNA定量試劑(MolecularProbes,Inc.，Eugene,0R)定量。擴(kuò)增前，將定量的質(zhì)粒儲液在10ng/jaL鮭精DNA中稀釋至工作濃度25拷貝/jaL。在6個(gè)靶水平之每一個(gè)下一式四份運(yùn)行SDA反應(yīng)，此外，運(yùn)行含有水代替乾DNA的對照反應(yīng)。簡言之，將DM靶加入SDA緩沖液，在沸水浴中加熱5分鐘變性。然后將150微升變性樣品加入含有干SDA引物、報(bào)道探針和核苷酸的引發(fā)微量孔。室溫20分鐘后，將引發(fā)微量孔轉(zhuǎn)移至72。C加熱塊，同時(shí)含有干Bst聚合酶和BsoBI限制性酶的相應(yīng)擴(kuò)增微量孔在54'C預(yù)熱。10分鐘溫育后，將100jul引發(fā)混合物從引發(fā)微量孔轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增微量孔，然后密封并放置在52.5。C于BDProbeTecET讀數(shù)器中。監(jiān)測熒光信號1小時(shí)，并使用開發(fā)用于該儀器的PassesAfterThreshold(PAT)算法分析。WolfeDM,WangSS，ThorntonK，KuhnAM,NadeauJG，HellyerTJ，均相鏈置換擴(kuò)增，《腿amplification-currenttechnologiesandapplications》，DemidovVV和BroudeNE(編),HorizonBioscience,Wymondham，UK。PAT分?jǐn)?shù)表示熒光讀數(shù)達(dá)到預(yù)定閾值后剩余的儀器通過次數(shù)。最終的SDA反應(yīng)條件如下50nM基于pUC19的緩沖引物CD(SEQIDNO.:24);500nMSDA引物SarCRP(SEQIDNO.:5);lOOnMSDA引物SarCFP(SEQIDNO.:4);250nM信號引物SarCAd-MPC(SEQIDNO.:8);300nM報(bào)道探針MPCD/R(SEQIDNO.:15);500uM脫氧胞苷5，-O-(l-硫代三磷酸)，S-異構(gòu)體(dCsTP);dATP，dGTP和dTTP各100pM;12.5%DMS0;24.5mMKiP04;82raMKOH;143mMN-二[羥乙基]甘氨酸；12UBst聚合酶；30UBsoBI限制性酶；5mM乙酸鎂。結(jié)果和結(jié)論使用少至每反應(yīng)6拷貝耙質(zhì)粒獲得了陽性結(jié)果，而在任何陰性對照中均未觀察到假陽性結(jié)果(表5)。這些數(shù)據(jù)說明，所公開的引物和報(bào)道探針組合能夠以高度分析靈敏度檢測SARS-CoV特異性核酸耙序列。表5:SARS-CoV特異性乾序列的擴(kuò)增和檢測PAT得分_平均值47.945.745.334.720.200000000PAT得分>0=陽性；0=陰性。實(shí)施例2:分析的特異性A部分所公開的引物和探針的分析特異性通過檢查一組51種可能存在于呼吸道和/或胃腸道標(biāo)本中的細(xì)菌和真菌進(jìn)行驗(yàn)證(表5)。由于所有這些生物都具有由DM而非RNA組成的基因組，故在這些反應(yīng)中不包括逆轉(zhuǎn)錄步驟。在含有牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽水(PBS/BSA)中以大約107-108個(gè)細(xì)胞/1111的濃度制備各生物的懸浮液。各15jal懸浮液與150UlSDA緩沖液混合，在沸水浴中加熱5分鐘。冷卻至室溫后，將150ial變性的樣品加入含有干SDA引物、報(bào)道探針和核苷酸的引發(fā)微量孔中。在室溫溫育引發(fā)微量孔20分鐘，然后轉(zhuǎn)移至72'C加熱塊，同時(shí)在54。C預(yù)熱相應(yīng)的擴(kuò)增微量孔。10分鐘溫育后，將lOOial引發(fā)混合物從引發(fā)微量孔轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增微量孔，然后密封并放入設(shè)定在52.5'C的BDProbeTecET讀數(shù)器中。監(jiān)測熒光l小時(shí)，并使用開發(fā)用于該儀器的PAT算法分析。最終的SDA反應(yīng)條件如下50nMpUC19緩沖引物CD(SEQIDNO.:24);500nMSDA引物SarCRP(SEQIDNO.:5);lOOnMSDA引物靶水平ABCD444444444967444ooo454o5o<u443oJ55536121631SarCFP(SEQIDNO.:4);250nM信號引物SarCAd-MPC(SEQIDNO.:8);300nM報(bào)道探針MPCD/R(SEQIDNO.:15);500|aMdCsTP;dATP，dGTP和dTTP各100pM;12.5%DMSO;24.5mMKiP04;82mMKOH;143raMN-二[羥乙基]甘氨酸；12UBst聚合酶；30UBsoBI限制性酶；5mM乙酸鎂。結(jié)果和結(jié)論除了作為陽性對照運(yùn)行的SARS-CoV耙序列的質(zhì)?？寺?，未獲得陽性結(jié)果，由此證明所公開的引物和報(bào)道探針檢測SARS-CoV的特異性。結(jié)果顯示在表6中。表6:用BDProbeTecETSARS-CoV試驗(yàn)測試的一組細(xì)菌和真菌<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>杰氏棒桿菌ATCC437340(Corynebacteriumjeikeium)新型隱球酵母ATCC365560(Cryptococcusneoformans)遲鈍愛德華氏菌ATCC154690(Edwardsiellatarda)嚙蝕艾肯氏菌ATCC238340(Eikenellacorrodens)產(chǎn)氣腸桿菌ATCC130480(Enterobacteraerogenes)糞腸球菌ATCC292120(Enterococcusfaecalis)大腸桿菌ATCC117750(Escherichiacoli)核粒梭桿菌ATCC255860(Fusobacteriumnucieatum)流感嗜血桿菌ATCC335330(Haemophilusinfluenzae)副流感嗜血桿菌ATCC79010(Haemophilusparainfluenzae)莢膜組織胞漿菌ATCC127000(Histoplasmacapsulatum)金氏金氏菌ATCC233300(Kingellakingae)肺炎克雷白氏桿菌肺炎亞種(KlebsiellaATCC138830pneumoniaesubsp.pneumoniae)嗜酸乳芽孢桿菌ATCC43560OLactobacillusacidophilus)侵肺軍團(tuán)桿菌ATCC331520(Legionellapneumophila)奧斯陸莫拉氏菌ATCC199760(Moraxeliaosloensis)摩氏摩根氏菌ATCC258300(Morganellamorganii)結(jié)核分枝桿菌ATCC272940(Mycobacteriumtuberculosis)肺炎枝原體ATCC293420(Mycoplasmapneumoniae)腦膜炎奈瑟氏球菌ATCC130770陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性(Neisseriameningitides)粘液奈瑟氏球菌(Neisseriamucosa)厭氧消化鏈球菌(Peptostreptococcusanaerobius)類志賀鄰單胞菌(Piesiomonasshigelloides)不解糖外啉單胞菌(Porphyromonasasaccharolytica)奇異變形菌(Proteusmirabilis)司徒氏普羅威登斯菌(Providenciastuartii)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophila)溫和鏈球菌(Streptococcusmitis)變異鏈球菌(Streptococcusmutans)肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)小韋榮氏球菌(Veillonellaparvula)副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterolitica)ATCC19696ATCC27337ATCC14029ATCC25260ATCC29906ATCC35031ATCC"853ATCC8100ATCC12598ATCCEl55ATCC13637ATCC6249ATCC25175ATCC6303ATCC19615ATCC10790ATCC17802ATCC27729陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性SARS-CoV陽性對照SARS-CoV陽性對照不適用43.5陽性SARS-CoV陰性對照不適用Q陰性SARS-CoV陰性對照不適用0陰性BD:BDDiagnosticsATCC:美國典型培養(yǎng)物保藏中心PAT得分〉0被認(rèn)為是陽性B部分使用完全RT-SDA試驗(yàn)形式，以三個(gè)非SARS相關(guān)冠狀病毒林(非-SARS-CoV)，進(jìn)行第二實(shí)驗(yàn)。從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得非-SARS-CoV的原種(stockvial)，并在PBS/BSA中稀釋。使用加入柱上DNA酶處理以去除污染性DM的改良QIAGENQIAarapViralRNAMini試劑盒方法，加工140ju1病毒懸浮液。平4亍地加工含有400個(gè)SARS-CoV病毒顆粒的懸浮液作為陽性對照。還包括第二陽性對照，該對照含有來源于SARS-CoV靼序列(SEQIDNO.:9和10)的質(zhì)?？寺〉捏w外轉(zhuǎn)錄物。將30jaL加工后的標(biāo)本通過移液管加入含有干SDA引物、報(bào)道探針和核苷酸的引發(fā)微量孔中，之后加入20mL含有RM酶抑制劑和禽成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV-RT)的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，進(jìn)行RT-SDA。含有逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物的微量孔然后在48。C溫育20分鐘。最終的反應(yīng)條件如下120mMN-二[羥乙基]甘氨酸；25mMKOH;43.5mMKiP04;5%DMSO;5%甘油；1500jaMdCJT;dATP，dGTP和dTTP各300juM;5mM乙酸鎂；1500nM緩沖引物SARSrtB24(SEQIDNO.:1);1500nMSDA引物SarCRP(SEQIDNO.:5);300nMSDA引物SarCFP(SEQIDNO.:4);750nM信號引物SarCAd-MPC(SEQIDNO.:8);600nM擴(kuò)增內(nèi)對照(IAC)信號引物SarC-IACAd(SEQIDNO.:7);1200nM耙報(bào)道探針MPCD/R(SEQIDNO.:15);900nMIAC才艮道探針MPC2F/D(SEQIDNO.:16);40URM酶抑制劑和10UAMV-RT(兩者均來自P畫egaCorp.,Madison,WI)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束時(shí)，向每個(gè)微量孔加入IO(ULSDA緩沖液，然后轉(zhuǎn)移至72n加熱塊。同時(shí)，在54。C預(yù)熱含有干SDA酶(Bst聚合酶和BsoBI限制性酶)的擴(kuò)增微量孔。IO分鐘溫育后，將100uL樣品由引發(fā)微量孔轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增微量孔，然后密封并置于設(shè)定在52.5'C的BDProbeTecET讀數(shù)器中。監(jiān)測熒光l小時(shí)，并使用開發(fā)用于該BDProbeTecET系統(tǒng)的PAT算法分析讀數(shù)。最終反應(yīng)混合物中的SDA條件如下500|aMdCsTP;dATP，dGTP和dTTP各100juM;5.7mM乙酸鎂;500nM緩沖引物SARSrtB24(SEQIDNO.:1);500nMSDA引物SarCRP(SEQIDNO.:5);lOOnMSDA引物SarCFP(SEQIDNO.:4);250nM信號引物SarCAd-MPC(SEQIDNO.:8);200nMIAC信號引物SarC-IACAd(SEQIDNO.:7);400nM靼報(bào)道探針MPCD/R(SEQIDNO.:15);300nMIAC報(bào)道探針MPC2F/D(SEQIDNO.:16);12.5%DMSO;1.7%甘油；24.5mMKiP04;82raMKOH;143mMN-二[羥乙基]甘氨酸；12UBst聚合酶;45UBsoBI限制性酶。結(jié)果和結(jié)論表7總結(jié)了結(jié)果。與先前實(shí)驗(yàn)中使用的DM擴(kuò)增系統(tǒng)一樣，除了含有SARS-CoV耙核酸的反應(yīng)外，未獲得其它陽性結(jié)果，由此說明所公開的引物和報(bào)道探針對該分析具有特異性。在這些反應(yīng)中未包括IAC靶RM，由此從MPC2F/D報(bào)道探針未檢測到高于背景的信號(數(shù)據(jù)未顯示)。表7:用BDProbeTecETSARS-CoV試驗(yàn)測試的一組非SARS-CoVPAT分?jǐn)?shù)樣品靶水平AB平均結(jié)果CoV抹E229未稀釋的000陰性CoV林0C43未稀釋的000陰性CoV林Dallas-l未稀釋的000陰性CoV抹E229原種的1:100000陰性CoV林OC43原種的1:100000陰性CoV抹Dallas-l原種的1:100000陰性SARS-CoV150個(gè)病毒粒子52.752.352.5陽性SARS-CoVw/o300個(gè)病毒粒子000陰性層-RTSARS-CoV轉(zhuǎn)錄物*300個(gè)拷貝50.546.549.5陽性陰性對照不適用000陰性*體外來源于SARS-CoV靶區(qū)(SEQIDNO.:9和10)的質(zhì)粒克隆。PAT得分〉0被認(rèn)為是陽性。實(shí)施例3:分析的檢測極限通過測試SARS-CoV靶序列(SEQIDNO.:9和10)的體外轉(zhuǎn)錄物，確定BDProbeTecETSARS-CoV試驗(yàn)的分析檢測極限(LOD)。從含有插入SP6RNA聚合酶啟動子下游的多克隆位點(diǎn)中的SARS-CoV靶拷貝的基于pUC19的質(zhì)粒，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物。在作為載體的10ng/ML酵母RM中稀釋純化的轉(zhuǎn)錄物，在6個(gè)耙水平之每一個(gè)水平下測試總共24個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。簡言之，將30jaL稀釋的靶加入含有干引物、報(bào)道探針和核苷酸的引發(fā)微量孔，之后加入20jaL含有RNA酶抑制劑、AMV-RT和1000個(gè)拷貝基于RNA的IAC(SEQIDN0.:12)的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液。逆轉(zhuǎn)錄條件如下1500jaMdCsTP;dATP,dGTP和dTTP各300jaM;5mM乙酸鎂；1500nM緩沖引物SARSrtB24(SEQIDN0.:1);1500nMSDA引物SarCRP(SEQIDNO.:5);300nMSDA引物SarCFP(SEQIDNO.:4);750nM信號引物SarCAd-MPC(SEQIDNO.:8);600nMIAC信號引物SarC-IACAd(SEQIDNO.:7);1200nM耙報(bào)道探針MPCD/R(SEQIDNO.:15);900nMIAC報(bào)道探針MPC2F/D(SEQIDNO,:16);1000個(gè)拷貝的IAC轉(zhuǎn)錄物(SEQIDNO.:12);5%DMSO;5%甘油；43.5raMKiP04;25mMKOH;120mMN-二[幾乙基]甘氨酸；40URNA酶抑制劑；10UAMV-RT。在48。C溫育再水化的微量孔20分鐘，之后加入100iaLSDA緩沖液并轉(zhuǎn)移至72。C加熱塊。同時(shí)，在54。C加熱塊上預(yù)熱含有干SDA酶(Bst聚合酶和BsoBI限制性酶)的微量孔。10分鐘溫育后，將100uL樣品從引發(fā)微量孔轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增微量孔，然后密封并放入設(shè)定在52.5'C的BDProbeTecET讀數(shù)器中。最終的SDA反應(yīng)條件如下500;dATP，dGTP和dTTP各100jLiM;5.7mM乙酸鎂；500nM緩沖引物SARSrtB24(SEQIDNO.:1);500nMSDA引物SarCRP(SEQIDNO.:5);lOOnMSDA引物SarCFP(SEQIDNO.:4);250nM信號引物SarCAd-MPC(SEQIDNO.:8);200nMIAC信號引物SarC-IACAd(SEQIDNO.:7);400nM報(bào)道探針MPCD/R(SEQIDNO.:15);300nMIAC報(bào)道探針MPC2F/D(SEQIDNO.:16);12.5%DMSO;1.7%甘油；24.5rnMKiP04;82raMKOH;143raMN-二[羥乙基]甘氨酸；12UBst聚合酶；45UBsoBI限制性酶。在1小時(shí)溫育期過程中，在BDProbeTecET儀器的兩個(gè)光通道中每分鐘讀取熒光讀數(shù)，結(jié)果以SARS-CoV靶和IAC的PAT得分報(bào)告。熒光讀數(shù)從未達(dá)到過預(yù)定熒光閾值的反應(yīng)被定為PAT得分0。對應(yīng)于MPCD/R報(bào)道探針(SEQIDNO.:15),產(chǎn)生ROXPAT得分>0的反應(yīng)被認(rèn)為是SARS-CoV陽性的;而對應(yīng)于IAC報(bào)道探針MPC2F/D(SEQIDNO.:16)，產(chǎn)生FAMPAT得分>0的反應(yīng)被認(rèn)為是IAC陽性的。FAM和ROX信號均未達(dá)到其對應(yīng)閾值(pat得分-o)的那些反應(yīng)一皮認(rèn)為是不確定的。陽性和陰性外對照被包括在每輪試驗(yàn)中以驗(yàn)證反應(yīng)性能。為了通過儀器報(bào)道來自患者標(biāo)本的結(jié)果，需要這些對照分別產(chǎn)生陽性和陰性正確結(jié)果。使用由包裝在抗核酸酶的大腸桿菌噬菌體蛋白質(zhì)外殼中的SARS-CoV靶RM序列克隆拷貝組成的ArmoredRNA⑧粒子(Ambion，Inc.,Austin,TX),進(jìn)行了類似的L0D研究。簡言之，ArmoredRM粒子稀釋在TSMG緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.0;lOOmMNaCl;ImMMgCl2;0.1%明膠)中，使用QIAGENQIAampViralRMMini試劑盒加工。為了模擬對臨床標(biāo)本的處理，加入柱上DNA酶處理步驟以l更從樣品中除去污染性DNA。將純化的rna稀釋在體積80ml7jC中，使用30ml稀釋的樣品如上所述執(zhí)行該試驗(yàn)。使用BDProbeTecET儀器收集1小時(shí)的熒光讀數(shù)，用PAT算法分析結(jié)果。結(jié)果和結(jié)論BDProbeTecETSARS-CoV試驗(yàn)的分析靈敏度被確定為每個(gè)反應(yīng)201拷貝體外轉(zhuǎn)錄物或149拷貝ArmoredRNA(表8)。盡管在ArmoredRNA實(shí)驗(yàn)中一個(gè)未加靶(unspiked)的樣品可能由于標(biāo)本加工過程中的樣品交叉污染而產(chǎn)生了陽性結(jié)果，但是未觀察到不確定的結(jié)果。表8:BDProbeTecETSARS-CoVRT-SDA試驗(yàn)對體外轉(zhuǎn)錄物和ArmoredRNA粒子的分析LOD體外轉(zhuǎn)錄物ArmoredRNA每逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的靶量%陽性8每逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的靶量%陽性'(n=24)(n=16)0006.3C5054.23143.810070.86368.820096.812587.540010025010050010050010095%L0Db20195%L0Db**149(114,287)(131，167)a陽4生結(jié)果PAT得分X)b95%的時(shí)間可檢測到的最低水平(95%置信區(qū)間)c可能由于標(biāo)本加工過程中的實(shí)驗(yàn)室交叉污染導(dǎo)致的一個(gè)假陽性結(jié)果實(shí)施例4:臨床性能在香港QueenMary醫(yī)院微生物系實(shí)施的臨床研究中評價(jià)用于SARS-CoV的半優(yōu)化RT-SDA試驗(yàn)，該研究使用2002-2003年冬SARS爆發(fā)期間獲得的回顧標(biāo)本(retrospectivespecimens)。該研究的具體目的如下1.就如下方面，估計(jì)使用BDProbeTecETSARS-CoV試驗(yàn)檢測SARS-CoV的可行性爭疾病控制和預(yù)防中心(CDC)和/或世界衛(wèi)生組織(WHO)的病例定義(針對參考陽性患者，組合的病例定義和分開的可能和疑似病例定義)(WHO.2003.用于監(jiān)督嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)的病例定義http://www,who,int/csr/sars/casedefinition/en/print,html;CDC.2003.修訂的嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)US監(jiān)督病例定義和SARS病例更新——美國和世界，2003年12月，匿R52:1202-1206)CDC實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR結(jié)果2.估計(jì)從抑制性標(biāo)本得到不確定結(jié)果的比率在開始試驗(yàn)前，從研究地點(diǎn)的InstitutionalReviewBoard獲得方案的批準(zhǔn)。通過測試一組接種了含有克隆的SARS-CoV核殼靶序列拷貝的AmbionArmoredMA粒子的模擬標(biāo)本，也證明該試驗(yàn)點(diǎn)能夠熟練地加工樣品和實(shí)施試驗(yàn)程序。表8列出了標(biāo)本入選的標(biāo)準(zhǔn)。使用BDProbeTecET系統(tǒng)的所有分析以盲檢方式進(jìn)行，操作者對RT-PCR或其它判定性測試方法的結(jié)果無先驗(yàn)知識。使用QIAampViralRNAMini試劑盒基本上按照廠商的說明一_除了加入柱上DM酶處理以除去污染性DM之外一一加工標(biāo)本。對于糞便試樣，包括一個(gè)額外的加工前步驟以在上樣QIAGEN柱子前除去顆粒物。將糞便樣品用0.89%鹽水1:IO稀釋，4，OOOXg離心20分鐘。然后傾析上清液，并通過0.22jum濾器以除去顆粒碎屑。簡言之，將140jiL臨床標(biāo)本或糞便過濾物通過QIAamp柱子加工，其中使用DM酶處理柱子以消化結(jié)合在柱子基質(zhì)上的污染性非特異性DNA。洗滌除去DM酶后，將純化的RM洗脫在8GjaL體積的水中。將30|aL洗脫物加入含有干引物、報(bào)道探針和核苷酸的引發(fā)微量孔中，之后加入20yL含有RNA酶抑制劑、AMV-RT酶和1000拷貝IACRNA轉(zhuǎn)錄物(SEQIDN0.:12)的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液。逆轉(zhuǎn)錄的最終反應(yīng)條件如下1500iaMdCJP;dATP，dGTP和dTTP各300jliM;5mM乙酸鎂;1500nM緩沖引物SARSrtB24(SEQIDNO.:1);1500nMSDA引物SarCRP(SEQIDNO.:5);300nMSDA引物SarCFP(SEQIDNO.:4);750nM信號引物SarCAd-MPC(SEQIDNO.:8);600nMIAC信號引物SarC-IACAd(SEQIDNO.:7);1200nM耙才艮道探針MPCD/R(SEQIDNO.:15);900nMIAC報(bào)道探針MPC2F/D(SEQIDNO.:16);1000個(gè)拷貝的IAC轉(zhuǎn)錄物(SEQIDNO.:12);5%DMSO;5%甘油；43.5raMKiP04;25mMKOH;120raMN-二[幾乙基]甘氨酸；40URNase抑制劑；10UAMV-RT。在48。C溫育再水化的微量孔20分鐘，之后加入100jiLSDA緩沖液并轉(zhuǎn)移至72。C加熱塊。同時(shí)，在54'C預(yù)熱含有干SDA酶(Bst聚合酶和BsoBI限制性酶)的擴(kuò)增微量孔。IO分鐘溫育后，將lOOjaL樣品從引發(fā)微量孔轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增微量孔，然后密封并放入設(shè)定在52.5'C的BDProbeTecET讀數(shù)器中溫育。最終的SDA反應(yīng)條件如下500jaMdCJP;dATP，dGTP和dTTP各100nM;5.7mM乙酸鎂；500nM緩沖引物SARSrtB24(SEQIDNO.:1);500nMSDA引物SarCRP(SBQIDNO.:5);lOOnMSDA引物SarCFP(SEQIDNO.:4);250nM信號引物SarCAd-MPC(SEQIDNO.:8);200nM信號引物SarC-IACAd(SEQIDNO.:7);400nM報(bào)道探針MPCD/R(SEQIDNO.:15);300nM報(bào)道探針MPC2F/D(SEQIDNO.:16);12.5%DMSO;1.7%甘油;24.5mM跳;82mMKOH;143mMN-二[羥乙基]甘氨酸；12UBst聚合酶；45UBsoBI限制性酶。在1小時(shí)溫育過程中，在BDProbeTecET儀器的兩個(gè)光通道中每分鐘讀取熒光讀數(shù)，結(jié)果以SARS-CoV靶和IAC的PAT得分報(bào)告。熒光讀數(shù)從未達(dá)到過預(yù)定熒光閾值的反應(yīng)被定為PAT得分0。對應(yīng)于MPCD/R報(bào)道探針(SEQIDNO.:15),產(chǎn)生ROXPAT得分>0的反應(yīng)被認(rèn)為是SARS-CoV陽性的；而對應(yīng)于IAC報(bào)道探針MPC2F/D(SEQIDNO.:16)，產(chǎn)生FAMPAT得分>0的反應(yīng)被認(rèn)為是IACP日性的。FAM和ROX信號均未達(dá)到其對應(yīng)閾值(PAT得分-O)的那些反應(yīng)被認(rèn)為是不確定的。陽性和陰性外對照被包括在每輪試驗(yàn)中以驗(yàn)證反應(yīng)性能。為了通過儀器報(bào)道來自患者標(biāo)本的結(jié)果，需要這些對照分別產(chǎn)生陽性和陰性正確結(jié)果。結(jié)果和結(jié)論表9和表10總結(jié)了從30個(gè)糞便標(biāo)本和30個(gè)NP吸出物的分析得到的結(jié)果以及相對的來自經(jīng)驗(yàn)證的RT-PCR方法的結(jié)果。PierisJSM等，Lancet361:1767-1772(2003);PoonLLM等，ClinChem49:953-955(2003);PoonLLM等，ClinChem50:67-72(2004);PoonLLM等，JClinVirol238:233-238(2003)。在SARS樣癥狀出現(xiàn)后于第8天和13天之間(平均=11天)收集糞便標(biāo)本，而對于NP吸出物，則于第3至7天收集(平均-5天)。BDProbeTecSARS-CoV試驗(yàn)對糞便樣品的靈敏度、特異性和不確定率分別為100%、100%、3.3%，而對于NP吸出物，靈敏度和特異性均為100%但未記錄到不確定結(jié)果。對于兩種標(biāo)本類型的組合，靈敏度、特異性和不確定率因此分別為100%(32/32)、100%(27/27)和l.6%(1/60)。此處給出的數(shù)據(jù)說明，BDProbeTecET試驗(yàn)?zāi)軌蜢`敏且特異地檢測臨床標(biāo)本中的SARS-CoV。此RT-SDA系統(tǒng)的臨床靈敏度被證實(shí)與經(jīng)驗(yàn)證的RT-PCR方法的靈敏度相當(dāng)，該基于RT-SDA的系統(tǒng)的另一優(yōu)點(diǎn)是該系統(tǒng)并入了基于RNA的IAC以監(jiān)測該試驗(yàn)所受到的抑制和/或污染RNA酶。在感染早期檢測NP吸出物中的SARS-CoV，^艮好的預(yù)示了BDProbeTecET試驗(yàn)在病毒于社區(qū)中散布之前實(shí)行快速治療性干預(yù)和/或感染控制措施而對患者進(jìn)行管理。表8:試樣入選標(biāo)準(zhǔn)類別包括的標(biāo)準(zhǔn)排除的標(biāo)準(zhǔn)患者群標(biāo)本類型.來自帶有可能/疑似SARS和/或?qū)嶒?yàn)室證實(shí)的SARS的患者的回顧標(biāo)本歸檔的冷凍回顧標(biāo)本呼吸道標(biāo)本糞便/直腸拭子血清殘余的純化的洗脫物*.來自無可能/疑似SARS的患者的回顧標(biāo)本.前瞻性標(biāo)本.非呼吸道標(biāo)本、糞便/直腸拭子、血清、純化的洗脫物*的其它標(biāo)本方法類型.BDProbeTecETSARSCoV試驗(yàn)，要求的.無RT-PCR結(jié)果.RT-PCRSARS-CoV試驗(yàn)，要求的.血清學(xué)(ELISA)，如果可得的話.培養(yǎng)結(jié)果，如果可得的話.免疫熒光抗原試驗(yàn)，如果可得的話*指從QIAGEN或其它核酸純化方法獲得的經(jīng)加工的標(biāo)本。表9:相對于RT-PCR，利用BDProbeTecETSARS-CoV試驗(yàn)對糞便標(biāo)本的分析<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>*RT-PCR方法中未并入IAC用于監(jiān)測試驗(yàn)抑制。表10:相對于RT-PCR，使用BDProbeTecETSARS-CoV試驗(yàn)對NP吸出物的分析<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>*RT-PCR方法中未并入IAC用于監(jiān)測試驗(yàn)抑制。"一個(gè)標(biāo)本來自符合CDC/WHO的SARS病例定義的患者。SARS試驗(yàn)系統(tǒng)D實(shí)施例實(shí)施例1:使用SARS-CoV特異性引物擴(kuò)增DM使用基因組靶區(qū)域(相應(yīng)于SARS-CoV林BJ03的28996-29076位核苷酸；GenBank登錄號AY278490)的基于pUC19的質(zhì)?？寺?，證明所公開的引物和探針組合擴(kuò)增SARS-CoV核酸的能力。用限制性酶Narl線性化該質(zhì)粒DM,使用PicoGreendsDNA定量試劑定量。在三個(gè)耙水平之每個(gè)水平下運(yùn)行一式四份SDA反應(yīng)，以及陰性對照。簡言之，將DM靶加入基于N-二[羥乙基]甘氛酸的SDA緩沖液中，并沸水浴中加熱變性。然后將110微升變性的樣品加入含有40uL如下混合物的引發(fā)微量孔中37.5mM跳;188ng//aLBSA;1900|aMdCJP;dATP，dGTP和dTTP各375pM;375nMSDA引物SarDFP(SEQIDNO.:18);1875nMSDA引物SarDRP(SEQIDNO.:19);938nM信號引物SarDAd-TBD16(SEQIDNO.:20);1875nM報(bào)道探針TBD16D/R(SEQIDNO.:13);3.75mM乙酸鎂。室溫20分鐘后，將引發(fā)微量孔轉(zhuǎn)移至72。C加熱塊，同時(shí)在54匸預(yù)熱含有干Bst聚合酶和BsoBI限制性酶的相應(yīng)擴(kuò)增微量孔。10分鐘溫育后，將100jaL引發(fā)混合物從引發(fā)微量孔轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增微量孔，然后密封并放入52.5。C的BDProbeTecET讀數(shù)器中。監(jiān)測1小時(shí)熒光信號，并使用開發(fā)用于該儀器的PAT算法分析。此SDA反應(yīng)中最終的引物和探針濃度如下500nMSDA引物SarDRP(SEQIDNO.:19);lOOnMSDA引物SarDFP(SEQIDNO.:18);250nM信號引物SarDAd-TBD16(SEQIDNO.:20);500nM報(bào)道探針TBD16D/R(SEQIDNO.:13)。結(jié)果和結(jié)論從所有含有SARS-CoV乾DNA的反應(yīng)均獲得了陽性結(jié)果(表11)。相反，陰性對照無一產(chǎn)生陽性結(jié)果，說明所公開的引物和探針組合能夠以高度的分析靈敏度檢測所靶向的SARS-CoV特異性核酸靶序列。表11:擴(kuò)增和檢測SARS-CoV特異性靼序列PAT得分靶水平ABCD平均100049.749.749.649.649.710046.449.249.444.547.41045.937.446.947.044.3000000PAT得分X)-陽性。權(quán)利要求1.包含第一擴(kuò)增引物和第二擴(kuò)增引物的寡核苷酸組，其中第一擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.4或18組成，第二擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.5或19組成。2.權(quán)利要求1的寡核苷酸組，其中第一擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:4組成，第二擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:5組成。3.權(quán)利要求1的寡核苷酸組，其中笫一擴(kuò)增引物基本上由SEQIDN0.:18組成，第二擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:19組成。4.包含第一擴(kuò)增引物和第二擴(kuò)增引物的寡核苷酸組，其中第一擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:4或18的靶結(jié)合序列組成，第二擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:5或19的耙結(jié)合序列組成。5.權(quán)利要求4的寡核苷酸組,其中第一擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:4的靶結(jié)合序列組成，第二擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:5的靼結(jié)合序列組成。6.權(quán)利要求4的寡核苷酸組，其中第一擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:18的靶結(jié)合序列組成，第二擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:19的耙結(jié)合序列組成。7.權(quán)利要求l的寡核苷酸組，還包含信號引物和報(bào)道探針，該信號引物基本上由SEQIDNO.:6、8、20或21的靶結(jié)合序列組成，該報(bào)道探針基本上由SEQIDNO.:13或15組成。8.權(quán)利要求7的寡核苷酸組，其中信號引物基本上由SEQIDNO.:6的靶結(jié)合序列組成，報(bào)道探針基本上由SEQIDNO.:13組成。9.權(quán)利要求7的寡核苷酸組，其中信號引物基本上由SEQIDNO.:8的靶結(jié)合序列組成，報(bào)道探針基本上由SEQIDNO.:15組成。10.權(quán)利要求7的寡核苷酸組，其中信號引物基本上由SEQIDNO.:20的靶結(jié)合序列組成，報(bào)道揮:4f基本上由SEQIDNO.:13組成。11.權(quán)利要求7的寡核苷酸組，其中信號引物基本上由SEQIDNO.:21的靶結(jié)合序列組成，報(bào)道探針基本上由SEQIDNO.:15組成。12.權(quán)利要求7的寡核苷酸組，還包括一個(gè)或多個(gè)基本上由SEQIDNO.:1、2、3或17組成的緩沖引物。13.權(quán)利要求8的寡核苷酸組，還包括第二信號引物和第二報(bào)道探針，該第二信號引物基本上由SEQIDNO.:25組成，該第二報(bào)道探針基本上由SEQIDNO.:14的雜交序列組成。14.權(quán)利要求13的寡核苷酸組，還包括一個(gè)或多個(gè)基本上由SEQIDNO.:1、2、3或17組成的緩沖引物。15.權(quán)利要求9的寡核苷酸組，還包括第二信號引物和第二報(bào)道探針，該第二信號引物基本上由SEQIDNO.:7組成，該第二報(bào)道探針基本上由SEQIDNO.:16的雜交序列組成。16.權(quán)利要求15的寡核苷酸組，還包括一個(gè)或多個(gè)基本上由SEQIDNO.:1、2、3或17組成的緩沖引物。17.權(quán)利要求1的寡核苷酸組，其中SEQIDNO.:4、5、18和19的靶結(jié)合序列包含擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列。18.權(quán)利要求17的寡核苷酸組，其中所述的擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列包含可被限制性核酸內(nèi)切酶切割的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。19.權(quán)利要求17的寡核苷酸組，其中所述的擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列包含RM聚合酶所識別的啟動子。20.權(quán)利要求7的寡核苷酸組，其中SEQIDNO.:6、8、13、15、20和21的雜交序列還包含可間接檢測的標(biāo)記物。21.權(quán)利要求20的寡核苷酸組，其中可間接檢測的標(biāo)記物包括銜接序列。22.權(quán)利要求4的寡核苷酸組，還包含信號引物和報(bào)道探針，該信號引物基本上由SEQIDN0.:6、8、20或21的靶結(jié)合序列組成，該報(bào)道探針基本上由SEQIDNO.:13或15組成。23.權(quán)利要求22的寡核苷酸組，其中信號引物基本上由SEQIDNO.:6的靶結(jié)合序列組成，報(bào)道探針基本上由SEQIDNO.:13組成。24.權(quán)利要求22的寡核苷酸組，其中信號引物基本上由SEQIDNO.:8的靶結(jié)合序列組成，報(bào)道探針基本上由SEQIDNO.:15組成。25.權(quán)利要求22的寡核苷酸組，其中信號引物基本上由SEQIDN0，20的靶結(jié)合序列組成，報(bào)道探針基本上由SEQIDNO.:13組成。26.權(quán)利要求22的寡核苷酸組，其中信號引物基本上由SEQIDNO.:21的靶結(jié)合序列組成，報(bào)道探針基本上由SEQIDNO.:15組成。27.權(quán)利要求22的寡核苷酸組，還包括一個(gè)或多個(gè)基本上由SEQIDNO.:1、2、3或17組成的緩沖引物。28.權(quán)利要求23的寡核苷酸組，還包括第二信號引物和第二報(bào)道探針，該第二信號引物基本上由SEQIDNO.:25組成，該第二報(bào)道探針基本上由SEQIDNO.:14的雜交序列組成。29.權(quán)利要求28的寡核苷酸組，還包括一個(gè)或多個(gè)基本上由SEQIDNO.:1、2、3或17組成的緩沖引物。30.權(quán)利要求24的寡核苷酸組，還包括第二信號引物和第二報(bào)道探針，該第二信號引物基本上由SEQIDNO.:7組成，該第二報(bào)道探針基本上由SEQIDNO.:16的雜交序列組成。31.權(quán)利要求30的寡核苷酸組，還包括一個(gè)或多個(gè)基本上由SEQIDNO.:1、2、3或17組成的緩沖引物。32.權(quán)利要求4的寡核苷酸組，其中SEQIDNO.:4、5、18和19的靶結(jié)合序列包含擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列。33.權(quán)利要求32的寡核苷酸組，其中所述的擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列包含可被限制性內(nèi)核酸切酶切割的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。34.權(quán)利要求32的寡核苷酸組，其中所述的擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列包含RNA聚合酶所識別的啟動子。35.權(quán)利要求32的寡核苷酸組，其中SEQIDNO.:6、8、13、15、20和21的雜交序列還包含可間接檢測的標(biāo)記物。36.權(quán)利要求35的寡核苷酸組，其中可間接檢測的標(biāo)記物包括銜接序列。37.包含基本上由SEQIDN0.:9、10、22或23組成的SARS冠狀病毒(SARS-CoV)耙序列的寡核苷酸。38.檢測樣品中存在或不存在SARS-CoV的方法，該方法包括(a)在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中用多個(gè)核酸引物處理樣品，其中第一引物基本上由SEQIDNO.:4或18的靶結(jié)合序列組成，第二引物基本上由SEQIDNO.:5或19的乾結(jié)合序列組成；和(b)檢測任何擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物，其中檢測到該擴(kuò)增產(chǎn)物說明存在SARSCoV。39.權(quán)利要求38的方法，其中第一引物基本上由SEQIDNO.:4組成，第二引物基本上由SEQIDNO.:5組成。40.權(quán)利要求38的方法，其中第一引物基本上由SEQIDNO.:18組成，第二引物基本上由SEQIDNO.:19組成。41.權(quán)利要求38的方法，其中步驟(a)包括鏈置換擴(kuò)增(SDA)反應(yīng)。42.權(quán)利要求41的方法，其中SDA反應(yīng)利用一個(gè)或多個(gè)基本上由SEQIDNO.:1、2、3或17組成的緩沖引物。43.權(quán)利要求38的方法，其中步驟(b)包括所述擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物與基本上由SEQIDNO.:6、8、20或21組成的信號引物雜交的步驟。44.權(quán)利要求41的方法，其中SDA反應(yīng)包括耐熱鏈置換擴(kuò)增(tSDA)反應(yīng)。45.權(quán)利要求44的方法，其中tSDA反應(yīng)是均相熒光實(shí)時(shí)tSDA反應(yīng)。46.擴(kuò)增SARS-CoV的靶核酸序列的方法，包;^舌(aM吏該核酸與(i)基本上由SEQIDNO.:4或18的革巴結(jié)合序列組成的第一擴(kuò)增引物；和(ii)基本上由SEQIDNO.:5或19的靶結(jié)合序列組成的第二擴(kuò)增引物雜交；和(b)在靶核酸序列上延伸雜交的第一和第二擴(kuò)增引物，由此擴(kuò)增該靶核酸序列。47.權(quán)利要求46的方法，其中第一擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:4的靶結(jié)合序列組成，第二擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:5的靶結(jié)合序列組成。48.權(quán)利要求46的方法，其中第一擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:18的耙結(jié)合序列組成，第二擴(kuò)增引物基本上由SEQIDNO.:19的靼結(jié)合序列組成。49.權(quán)利要求47的方法，其中SEQIDNO.:4和SEQIDNO.:5的乾結(jié)合序列包含擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列。50.權(quán)利要求48的方法，其中SEQIDNO.:18和SEQIDNO.:19的耙結(jié)合序列包含擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列。51.權(quán)利要求49的方法，其中所述的擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列包含可被限制性核酸內(nèi)切酶切割的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。52.權(quán)利要求49的方法，其中擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列包含RM聚合酶所識別的啟動子。53.權(quán)利要求50的方法，其中擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列包含可被限制性核酸內(nèi)切酶切割的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。54.權(quán)利要求50的方法，其中擴(kuò)增反應(yīng)所需的序列包含RNA聚合酶所識別的啟動子。55.權(quán)利要求46的方法，還包括通過與信號引物雜交，間接地檢測擴(kuò)增的靶核酸。56.權(quán)利要求55的方法，其中所述的信號引物基本上由SEQIDNO.:6、8、2G或21組成。57.權(quán)利要求46的方法，其中耙核酸序列基本上由SEQIDNO.:9、10、22或23組成。58.定量靶樣品中SARS-CoV核酸的量的方法，包括步驟a)將靼樣品與已知濃度的SARS-CoV內(nèi)對照核酸混合；b)在擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增靶核酸和內(nèi)對照核酸；c)檢測擴(kuò)增的核酸；和d)分析擴(kuò)增的SARS-CoV靶核酸與內(nèi)對照核酸的相對量。59.權(quán)利要求58的方法，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)利用一個(gè)或多個(gè)基本上由SEQIDNO.:6、7、8、20、21或25的雜交序列組成的信號引物和一個(gè)或多個(gè)基本上由SEQIDNO.:13、14、15或16的雜交序列組成的報(bào)道探針。60.權(quán)利要求59的方法，其中SEQIDNO.:6、7、8、13、14、15、16、20、21和25的雜交序列包含可間接檢測的標(biāo)記物。61.權(quán)利要求60的方法，其中可間接檢測的標(biāo)記物包含銜接序列。62.權(quán)利要求58的方法，其中步驟(b)包含鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)。63.權(quán)利要求62的方法，其中SDA反應(yīng)包括tSDA反應(yīng)。全文摘要本發(fā)明公開了來自SARS-CoV核酸的利于檢測和/或定量核殼基因的引物和探針。所述公開的序列可用于多種擴(kuò)增和非擴(kuò)增形式，用于檢測SARSCoV感染。文檔編號A61BGK101415844SQ200480029100公開日2009年4月22日申請日期2004年9月13日優(yōu)先權(quán)日2003年9月12日發(fā)明者D·A·尤爾西斯,D·M·沃爾夫,J·A·小普賴斯,J·婁,L·M·凱勒,T·J·赫利爾申請人:貝克頓·迪金森公司