專利名稱：：一種羽葉鬼針草富集鈾基因片段、獲取方法及運用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用分子生物學(xué)方法檢測鈾污染的
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，是涉及一種羽葉鬼針草富集鈾基因片段及其獲取方法，還涉及一種以羽葉鬼針草中富集鈾基因片段為探針檢測鈾污染的方法。
背景技術(shù)：
：鈾礦開采以及核能的利用過程都會造成鈾在環(huán)境中富集并產(chǎn)生污染。鈾尾礦和廢石中含有鈾及其全部子體，其放射性核素含量比本底高2到3個數(shù)量級。不適當(dāng)?shù)亩逊e或處置這些廢料就會導(dǎo)致鈾通過流失散布到土壤表面，經(jīng)風(fēng)蝕進入空氣，或者通過淋洗而進入地下水。此外，鈾礦冶煉過程會將大量的放射性廢水不斷地排出，也直接污染了天然水體和土壤。傳統(tǒng)的鈾污染及環(huán)境中放射性物質(zhì)的檢測通常采用放射性檢測儀檢測，采用的是a、P、x、Y多功能射線檢測儀探頭來檢測放射劑量，傳統(tǒng)方法雖然能夠檢測一定劑量的放射源，但是很難區(qū)分究竟是哪種放射性物質(zhì)產(chǎn)生的污染；另外，其靈敏度具有一定局限性。所以采用靈敏，準確的檢測手段勢在必行。羽葉鬼針草(Bidensmaximovicziana.)菊科，鬼針草屬，一年生草本。在中國某地的鈾尾礦上生長著大量的羽葉鬼針草，表明其對鈾有某種耐受或富集機制。生長于鈾尾礦區(qū)和對照區(qū)中的羽葉鬼針草因處于不同的生長環(huán)境，其基因必定存在著某些差異。以羽葉鬼針草為材料，利用分子生物學(xué)方法，鑒定環(huán)境是否受到鈾污染，是目前的一個重要研究方向。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是遠離污染環(huán)境對鈾污染進行安全準確的檢測，提供了一種用于檢測羽葉鬼針草受鈾污染的基因片段及其獲取方法，還提供了一種利用該基因片段檢測鈾污染的方法。本發(fā)明技術(shù)方案是一種羽葉鬼針草富集鈾基因片段是，從鈾尾礦區(qū)羽葉鬼針草和非污染對照區(qū)域羽葉鬼針草的植株中提取總RNA，通過酶促反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈，經(jīng)過抑制性消減雜交(SSH)分離到對重金屬鈾脅迫下特異性表達的基因片段。所述基因片段的序列如下TCTTGAATTTCACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGAA。羽葉鬼針草富集鈾基因片段的獲取方法，其步驟包括3(D-i96t:液氮冷藏鈾尾礦區(qū)的羽葉鬼針草和非污染對照區(qū)羽葉鬼針草；(2)改進的異硫氰酸胍法提取總RNA;(3)抑制性消減文庫的構(gòu)建以非污染對照區(qū)羽葉鬼針草cDNA為Tester,位于鈾尾礦區(qū)羽葉鬼針草cDNA為Driver,同時使用RevertAicTFirstStrardcDNASynthesisKit(Ferment公司)和PCR-SelectTMcDNASubtractionKit(Clontech公司)兩種試劑盒進行SSH試驗，包括l)cDNA第一鏈合成；2)cDNA第二鏈合成；3)RsaI酶切；4)連接接頭；5)第一輪雜交；6)第二輪雜交；7)兩輪PCR擴增；(4)將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中；(5)插入片段的篩選與鑒定；(6.)cDNA克隆測序與序列分析。羽葉鬼針草富集鈾基因片段在鈾污染檢測中的運用，檢測方法有兩種(l)將羽葉鬼針草富集鈾基因片段與從待檢測環(huán)境中的羽葉鬼針草提取的RNA雜交，按常規(guī)核酸雜交方法，如有陽性雜交信號，顯示有同源片段，則說明環(huán)境受到鈾污染，反之則相反。(2)以羽葉鬼針草富集鈾基因片段兩端序列為引物，做RT-PCR檢測環(huán)境中的羽葉鬼針草cDNA，如能擴增出相應(yīng)片段，則說明環(huán)境受到鈾污染，反之則相反。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明首次在羽葉鬼針草中獲得了鈾脅迫下特異性表達的基因片段，發(fā)明了以植物羽葉鬼針草中鈾誘導(dǎo)下特異表達的基因為探針來檢測鈾污染的方法，解決了污染區(qū)周邊環(huán)境鈾污染難以準確檢測的問題。該方法可以遠離污染環(huán)境進行安全檢測，其靈敏度高且特異性專一，可以準確的檢測環(huán)境中的鈾污染。圖1接頭序列；圖2PCR引物序列和巢氏PCR引物序列；圖3總RNA電泳圖；圖中，M:hela細胞RNA;1、2:非污染對照區(qū)羽葉鬼針草1號、2號總RNA;3、4:環(huán)境區(qū)羽葉鬼針草1號、2號總RNA;圖4雙鏈cDNA的質(zhì)量檢測電泳圖，圖中M:Marker-F1:消減雜交產(chǎn)物2:非消減雜交產(chǎn)物；圖5雙鏈cDNA的質(zhì)量檢測電泳圖，圖中M:Marker-Fl:消減雜交產(chǎn)物2:非消減雜交產(chǎn)物；圖6藍白斑篩選結(jié)果圖，圖中1-5:藍斑；圖7重組質(zhì)粒電泳結(jié)果圖，圖中，1-17:白斑質(zhì)粒；18:藍斑質(zhì)粒；圖8插入片段擴增電泳圖，圖中，1:Marker-F2-10:插入片段(注2為目的克隆片段)；具體的實施方式實施例一羽葉鬼針草富集鈾基因片段的獲取方法1.采用鈾尾礦區(qū)的羽葉鬼針草和非污染對照區(qū)羽葉鬼針草，將整株羽葉鬼針草放置于-196t:液氮冷藏待用；2.改進的異硫氰酸胍法提取總RNA，如圖3;(1)分別取lg環(huán)境中的羽葉鬼針草和非污染對照區(qū)羽葉鬼針草(含根莖葉)，在液氮下迅速研磨成粉末；(2)轉(zhuǎn)入10mL離心管中，加入3mL預(yù)冷的RNA提取緩沖液混勻，置于冰上；(3)每管加入3Mo1L—、aAc200iiL，充分混勻；(4)加入酸酚3mL，充分混勻；(5)加氯仿異戊醇600iiL，充分混勻；(6)冰浴15min，使之分層；(7)4。C條件下，8000rpm離心20min;(8)吸上清于1.5mL離心管中(可吸取700yL)，加入等體積氯仿異戊醇混勻；(9)4。C條件下，15000rpm離心15min;(10)吸上清加入等體積的異丙醇混勻后置于_201:冰箱冷凍lh以上；(11)4。C條件下，15000rpm離心20min;(12)去上清，用70%乙醇清洗2-3次；(13)棄上清。倒置于干凈吸水紙上，以去除殘留的乙醇；(14)風(fēng)干，干燥后溶于適量DEPC水中，取liiL進行檢測，其余-78t:冰箱中保存。3.抑制性消減文庫的構(gòu)建以非污染對照區(qū)羽葉鬼針草cDNA為Tester,位于鈾尾礦區(qū)羽葉鬼針草cDNA為Driver。同時使用RevertAidFirstStrardcDNASynthesisKit(Ferment公司)禾口PCR-SelectcDNASubtractionKit(Clontech公司)兩種試劑盒進行SSH試驗。cDNA第一鏈的合成使用了RevertAidFirstStrardcDNASynthesisKit，第二鏈合成使用了PCR-SelectcDNASubtractionKit(clontech公司)。3.lcDNA第一鏈合成(1)對每一份Tester和DriverRNA，在0.5mLEP管中加入:PolyA+RNA27iiL，Oligo(dT)18Primer(0.5iig/iiL)2iiL;(2)將混合物在PCR熱循環(huán)儀中7(TC溫育5min;(3)冰浴冷卻2min，短暫離心；(4)將上述離心管放在冰上，按順序加入下列成分5XRectionBuffer8iiL，RibolockTMRibo薦leaseinhibitor(20u/iiU1PL，d證2iiL;(5)輕輕的渦旋混合液，短暫離心；(6)將其放在PCR儀中37t:保溫5min;(7)力口入RevertAidTMReverseTranscriptase(20unite/liU1PL;[OO62](8)將混合物42"空氣浴lh;(9)冰上放置終止第一鏈反應(yīng)，并迅速進行第二鏈cDNA合成步驟。3.2cDNA第二鏈合成用Tester、DrivercDNA每一鏈cDNA完成下面步驟(1)加入以下成份到第一鏈合成反應(yīng)EP中(10iiL):加Sterile1120至48.41^，5XSecond-StrandBuffer16.0iiL，dNTPMixQOmM)1.6iiL，20XSecond-StrandEnzymeCocktail4.OnL;(2)混合各組分并短暫離心，總體積應(yīng)為80L;(3)在水浴上或PCR儀上，16"保溫2h;(4)加入2iiL(6u)T4DNApolymerase，混勻反應(yīng)液；(5)16。C水浴或PCR儀上保溫30min;(6)加4iiL20XEDTA/GlycogenMix終止第二鏈合成；(7)力B100iiL酚氯仿:異戊醇(25:24:1);(8)充分渦旋，14，OOOrpm離心lOmin(室溫);(9)將上層液體移入新的0.5mLEP中；(10)加100iiL的氯仿:異戊醇(24:1);(11)重復(fù)步驟8和9;(12)加40iiL4MNH4AC和300yL的95%乙醇(立即開始沉淀，不需將EP管放置在-2(TC，在此條件下放置時間過長可能會使不需要的鹽沉淀)；(13)充分渦旋混勻，室溫14000rpm離心20min;(14)小心收集上清；(15)用500iiL80%乙醇輕輕覆蓋沉淀；(16)14000rpm離心lOmin;(17)仔細移出上清；(18)空氣中干燥lOmin，讓剩余的乙醇全部揮發(fā)；(19)用50iiL滅菌水溶解沉淀；(20)轉(zhuǎn)移6L到一個干凈的EP管中，于-20°〇冰箱中保存，用于在Rsal酶切后電泳，檢測dscDNA分子的產(chǎn)量和大小范圍。3.3RsaI酶切。對每個實驗用Tester和DriverdscDNA完成以下操作1)加入以下i式齊U:dscDNA43.5iiL;10XRsaIRestrictionBuffer5.0iiL;Rsa1(10unite/uL)1.5uL;2)渦旋混勻，短暫離心；3)37。C溫育1.5h;4)取出5iiL酶切混合物，分析RsaI酶切效率；5)加入2.5iiL20XEDTA/Glycogen混合物，終止反應(yīng)；6)力卩50iiL酚氯仿異戊醇(25:24:1);7)充分渦旋，室溫14000rpm離心10min，使液體分層；8)小心收集上清，轉(zhuǎn)入新的0.5mLEP管中；9)加入50iiL氯仿異戊醇(24:1);10)重復(fù)步驟7和8;11)力Q25iiL4MNH4AC和187.5yL95%乙醇(注立即開始沉淀，不需將EP管放置在-2(TC，在此條件下放置時間過長可能會使不需要的鹽沉淀)；12)重復(fù)步驟7);13)棄上清;14)用200iiL80%乙醇輕輕覆蓋沉淀；15)14000rpm離心5min;16)仔細移出上清；17)空氣中干燥沉淀lOmin;18)用5.5iiL水溶解沉淀，存于-2(TC冰箱中。3.4連接接頭對Tester進行接頭連接，接頭序列如圖1:1)用5iiL無菌水稀釋1yLRsaI酶切的cDNA;2)在O.5iiLEP管中準備連接用MasterMix:無菌水1yL，5X連接Buffer2yL，T4DNALigase(400皿ite/iiU3iiL;3)對每一組實驗用Tester,在0.5iiLEP管中按順序(表1)加入試劑，用槍吸打液體充分混勻；表l建立連接反應(yīng)體系成分樣品Testerl-1樣品Testerl-2DilutedTestercDNAAdaptorl(IO岸)一Adaptor2R(10nM)—MasterMix6jxLFinalvolumeIOhL4)混合2iiLTesterl-1和2iiLTesterl-2在一個新的EP管中，作為非消減Tester1對照；連接反應(yīng)后，大約有1/3的cDNA分子帶有兩種不同的接頭在每一個非消減Tester對照管中；5)短暫離心，16"溫育過夜；6)加1iiLEDTA/Glycogen混合液終止連接反應(yīng)；7)72。C保溫5min失活ligase;8)短暫離心，實驗用加接頭cDNA的Tester和非消減的Tester對照現(xiàn)在已完成；9)取1iiL非消減Tester對照并用水稀釋至lmL，這些樣品用于后面的PCR擴增檢測；10)樣品貯存在-20°〇冰箱。3.5第一輪雜交。在進行下面的步驟中，過量的DrivercDNA加入到每個TestercDNA中，樣品被加熱變性，重新退火，剩余的差異表達的單鏈cDNA被明顯富集，由于非靶基因cDNA出現(xiàn)在Tester中禾口DrivercDNA形成雜交。注意雜交之前，將4XHybridizationbuffer加熱至室溫至少15-20min，檢查buffer,確保用之前無可見的小塊沉淀物，如果需要，可在37t:加熱bufferlOmin溶解沉淀。1)對于每一個樣品的雜交，按順序(表2)在EP管中加入下列試劑；表2建立第一輪雜交<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2)用一滴礦物油覆蓋樣品并做簡單離心；[O129]3)在熱循環(huán)儀上溫育樣品(98°C，1.5min);4)68t:，溫育樣品8h(樣品雜交可能需6-12h，不要讓其溫育超過12h)。3.6第二輪雜交。將第一輪雜交的兩個樣品混合在一起，將新變性好的DriverDNA加入到混合樣品中，以進一步富集差異表達序列，含差異表達的cDNA以其連接不同的接頭形成新雜交分子。注意不要在此階段將首輪雜交樣品變性，也不要將雜交樣品從熱循環(huán)儀上取出的時間超過加入新的Driver的必要時間。1)在滅菌管中加入以下試齊U:DrivercDNA1iiL，4XHybridizationBuffer1iiL，SterileH202iiL;2)取出上述混合物1yL到一個新的0.5mL離心管中，在其上覆蓋一滴礦物油；3)熱循環(huán)儀上98"溫育1.5min;4)從熱循環(huán)儀上移出新的新變性的Driver,使用以下步驟同時將Driver與雜交樣品1和2混合在一起；①將微量移液槍調(diào)至15iiL;②輕輕地將槍頭放在雜交樣品2的EP管的礦物油/樣品交界面；③小心吸取整個樣品的一部分到槍頭里，如果有少量礦物油也一起轉(zhuǎn)移也沒關(guān)系；④把槍頭從EP管中移出，吸入少量空氣到槍頭里，在這一滴樣品下創(chuàng)建一個小的空氣空間；⑤重復(fù)b-d以含新變性Driver的EP管，現(xiàn)在移液槍頭應(yīng)該含有兩個樣品(雜交樣品2和變性Driver)，這兩個樣品由一個小空氣泡隔開；⑥轉(zhuǎn)移整個步驟⑤的兩個樣品到含雜交樣品1的EP管中；⑦用槍頭吹打混勻；5)如果需要，可短暫離心；6)68t:溫育過夜；7)加200iiLdilutionbuffer并用槍頭混勻;8)在熱循環(huán)儀上68。C加熱7min;9)-20。C保存。3.7PCR擴增，如圖4。按此部分所做兩輪反應(yīng)，差異表達的cDNA被選擇性擴增，首先熱循環(huán)，通過75°C短暫溫育，缺失接頭的鏈被填補，這就為PCR引物創(chuàng)造了一個結(jié)合位點(參看圖1)。在第一輪擴增，只有在序列兩端帶有不同接頭的cDNA鏈被指數(shù)形式擴增，在第二輪擴增中，嵌套式PCR被用于進一步減少表達相同的序列，并富集差異表達的序列。PCR引物序列和巢氏PCR引物序列如圖2所示1)取1iiL各種稀釋了的cDNA到一個作了相應(yīng)標記的EP管中；2)為所有的首輪PCR管準備MasterMix,每個反應(yīng)準備好后，將下列試劑按順序(表3)加入到一個0.5mL的EP管中。對每個其他實驗cDNA，也如表3所述準備相應(yīng)量的MasterMix。表3首輪PCRMasterMix的準備<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3)渦旋混勻，并簡單離心；4)在第一步所準備的每一個反應(yīng)管中加入24iiLMasterMix;5)用50iiL液體石蠟覆蓋；6)在熱循環(huán)儀上75t:，5min溫育反應(yīng)混合物以延伸接頭(不要從熱循環(huán)儀上移出樣品)，這步填補了丟失的接頭，因此創(chuàng)建了一個PCR引物的結(jié)合位點；7)立即開始熱循環(huán)(27cycles):94。C30sec，66。C30sec，72。C1.5min;8)于27iiL水中稀釋3yL各種首輪PCR混合物，以此作為第二輪PCR的模板；9)取1iiL各種來自第8)步的稀釋好的首輪PCR產(chǎn)物混合物到1個作了相應(yīng)標記的EP管中；10)按照表4的順序加入試劑來準備第二輪PCR反應(yīng)的MasterMix(對于其它試驗cDNA，為其反應(yīng)準備相應(yīng)的MasterMix);表4第二輪PCRMasterMix的準備試劑PerRxn滅菌水18舉lOxPCRreactionbuffer2單NesteedPCRPrimed(鄭M)l單NesteedPCRPrimer2R1.0-(IO一)dNTPMix(lOmM)O單50xAdvantagecDNAO單polymeraseMix11)渦旋混勻并作簡單離心；12)把24iiLMasterMix加入到第10步的反應(yīng)體系中；13)用1滴液體石蠟覆蓋，立即開始熱循環(huán)(10-12cycles):94°C30sec;66°C30sec;72。C1.5min;14)于-2(TC保存反應(yīng)產(chǎn)物(到現(xiàn)在PCR產(chǎn)物中富集了差異表達的cDNA)。4.將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，如圖5;5.插入片段的篩選與鑒定，如圖6、圖7;6.cDNA克隆測序與序列分析，如圖8;實施例二從待檢測環(huán)境中采取羽葉鬼針草，放置于-196t:液氮冷藏待用，將實施例1中獲取的基因片段與環(huán)境中的羽葉鬼針草提取的RNA雜交。按常規(guī)核酸雜交方法，如有陽性雜交信號，顯示有同源片段，則說明環(huán)境受到鈾污染，反之則相反。實施例三以實施例1中獲取的基因片段兩端序列設(shè)計引物；做RTPCR檢測環(huán)境中的羽葉鬼針草cDNA。按常規(guī)基因工程方法，如能擴增出相應(yīng)片段，則說明環(huán)境受到鈾污染，反之則相反。序列表TCTTGAATTTCACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGAA權(quán)利要求一種羽葉鬼針草富集鈾基因片段，是從鈾尾礦區(qū)羽葉鬼針草和非污染對照區(qū)域羽葉鬼針草的植株中提取總RNA，通過酶促反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈，經(jīng)過抑制性消減雜交(SSH)分離到對重金屬鈾脅迫下特異性表達的基因片段。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的羽葉鬼針草富集鈾基因片段，其序列如下TAGCGTGGTCGCGGCGGCCGCTCGAA3.權(quán)利要求1所述的羽葉鬼針草富集鈾基因片段的獲取方法，其步驟包括(1)-196t:液氮冷藏鈾尾礦區(qū)羽葉鬼針草和非污染對照區(qū)羽葉鬼針草；(2)改進的異硫氰酸胍法提取總RNA;(3)抑制性消減文庫的構(gòu)建以非污染對照區(qū)羽葉鬼針草cDNA為Tester,位于鈾尾礦區(qū)羽葉鬼針草cDNA為Driver,同時使用RevertAidFirstStrardcDNASynthesisKit(Ferment公司)和PCR-SelectcDNASubtractionKit(Clontech公司)兩種試劑盒進行SSH試驗，包括1)cDNA第一鏈合成；2)cDNA第二鏈合成；3)RsaI酶切；4)連接接頭；5)第一輪雜交；6)第二輪雜交；7)兩輪PCR擴增；(4)將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中；(5)插入片段的篩選與鑒定；(6)cDNA克隆測序與序列分析。4.權(quán)利要求1所述的羽葉鬼針草富集鈾基因片段在鈾污染檢測中的運用。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的羽葉鬼針草富集鈾基因片段在鈾污染檢測中的運用，其特征在于將羽葉鬼針草富集鈾基因片段與從待檢測環(huán)境中的羽葉鬼針草提取的RNA雜交，按常規(guī)核酸雜交方法，如有陽性雜交信號，顯示有同源片段，則說明環(huán)境受到鈾污染，反之則相反。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的羽葉鬼針草富集鈾基因片段在鈾污染檢測中的運用，其特征在于以羽葉鬼針草富集鈾基因片段兩端序列為引物，做RT-PCR檢測環(huán)境中的羽葉鬼針草cDNA，如能擴增出相應(yīng)片段，則說明環(huán)境受到鈾污染，反之則相反。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于檢測羽葉鬼針草受鈾污染的基因片段及其獲取方法，是從鈾尾礦區(qū)羽葉鬼針草和非污染對照區(qū)域羽葉鬼針草的植株中提取總RNA，通過酶促反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈，經(jīng)過抑制性消減雜交(SSH)分離到對重金屬鈾脅迫下特異性表達的基因片段。利用該基因片段檢測鈾污染的方法有兩種(1)將羽葉鬼針草富集鈾基因片段與從待檢測環(huán)境中的羽葉鬼針草提取的RNA雜交，按常規(guī)核酸雜交方法，如有陽性雜交信號，顯示有同源片段，則說明環(huán)境受到鈾污染，反之則相反。(2)以羽葉鬼針草富集鈾基因片段兩端序列為引物，做RT-PCR檢測環(huán)境中的羽葉鬼針草cDNA，如能擴增出相應(yīng)片段，則說明環(huán)境受到鈾污染，反之則相反。文檔編號C12N15/29GK101792768SQ20091004438公開日2010年8月4日申請日期2009年9月22日優(yōu)先權(quán)日2009年9月22日發(fā)明者馮濤,肖璐,高利臣申請人:湖南科技大學(xué)