專(zhuān)利名稱(chēng)：一種美洲商陸中鈾相關(guān)基因片段、獲取方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是公開(kāi)一種美洲商陸中與鈾相關(guān)的基因片段，以及該基因片段的獲取方法，進(jìn)一步涉及該基因片段在檢測(cè)環(huán)境鈾污染中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
鈾礦開(kāi)采以及核能的利用過(guò)程是鈾在環(huán)境中富集并產(chǎn)生污染的重要途徑。鈾尾礦和廢石中含有鈾及其全部子體，其放射性核素含量比本底高2到3個(gè)數(shù)量級(jí)。不適當(dāng)?shù)亩逊e或處置這些廢料就會(huì)導(dǎo)致鈾通過(guò)流失散布到土壤表面，經(jīng)風(fēng)蝕進(jìn)入空氣，或者通過(guò)淋洗而進(jìn)入地下水。此外，鈾礦冶煉過(guò)程會(huì)將大量的放射性廢水不斷地排出，也直接污染了天然水體和土壤。所以采用靈敏，準(zhǔn)確的檢測(cè)手段勢(shì)在必行。
傳統(tǒng)的鈾污染及環(huán)境中放射性物質(zhì)的檢測(cè)通常采用放射性檢測(cè)儀檢測(cè)，采用的是α、β、χ、γ多功能射線檢測(cè)儀探頭來(lái)檢測(cè)放射劑量，傳統(tǒng)方法雖然能夠檢測(cè)一定劑量的放射源，但是很難區(qū)分究竟是哪種放射性物質(zhì)產(chǎn)生的污染；另外，其靈敏度具有一定局限性。
美洲商陸(Phytolacca americana L.pokeweed)，又名垂序商陸、十蕊商陸。在中國(guó)某地的鈾尾礦上生長(zhǎng)著大量的美洲商陸，這表明美洲商陸對(duì)重金屬鈾有著某種耐受機(jī)制。生長(zhǎng)于鈾尾礦區(qū)和對(duì)照區(qū)中的美洲商陸因處于不同的生長(zhǎng)環(huán)境，其基因必定存在著某些差異。利用這種差異，采用分子生物學(xué)方法，即利用核酸雜交分析方法鑒定環(huán)境受到鈾污染是可行途徑。但目前，這種方法國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)報(bào)道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于檢測(cè)美洲商陸受鈾污染的一個(gè)基因片段及該基因片段的獲取方法，以及利用該基因片段在檢測(cè)環(huán)境鈾污染中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的美洲商陸中鈾相關(guān)基因片段是從鈾尾礦區(qū)的美洲商陸和非污染對(duì)照區(qū)域美洲商陸的根部組織提取總RNA，通過(guò)酶促反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈，經(jīng)過(guò)抑制性消減雜交(SSH)分離到對(duì)重金屬鈾脅迫下特異性表達(dá)的基因片段，該基因片段的序列為 AACTGGCTTGTGGCAGCCAAGCGTTCATAGCGACGTTGCTTTTTGATCCTTCGATGACGTCTCTTCCTATCATTGTGAAGCAGATTTCACCAAGTGTTGGATTGTTCCCCCACCACCAGGGAACGTGAGTTGGGATTAGACCGTCGGGAAACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGACAGGGCCGGGATGGTAATTCAACCTAGTACTTCGGCCGCGACCACGCTAATCCCTAGTGCGGCCGCCTGCTGGCCAACCTTAGGGAAGAGTTCCTAACCCGTGGATTGCTGTATTAGAGTTTCCTGTCGTGCCCCTCAAAAAGTTGGGACGATCCTGGCTCTTATTTGTTTCCTGTTAAAAGCCGCGTATTCTTCACCATTTTTGCCTGTTGACGATCCTCA。
該基因片段的獲取方法包括以下步驟 (1)在-196℃液氮冷藏鈾尾礦區(qū)的美洲商陸和非污染對(duì)照區(qū)域美洲商陸的根部組織； (2)提取美洲商陸的根部組織總RNA； (3)以非污染對(duì)照區(qū)商陸根組織cDNA為T(mén)ester，位于鈾尾礦區(qū)美洲商陸根組織cDNA為Driver，同時(shí)使用RevertAidTM First Strard cDNA Synthesis Kit和PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit兩種試劑盒進(jìn)行抑制性消減雜交(SSH)試驗(yàn)，包括 1)cDNA第一鏈合成； 2)cDNA第二鏈合成； 3)Rsa I酶切； 4)連接接頭； 5)第一輪雜交； 6)第二輪雜交； 7)兩輪PCR擴(kuò)增。
(4)將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中； (5)插入片段的篩選與鑒定； (6)cDNA克隆測(cè)序與序列分析。
以上方法獲取的基因片段可用于環(huán)境鈾污染的檢測(cè)，方法是以該基因片段為探針與環(huán)境中的美洲商陸提取的RNA雜交，按常規(guī)核酸雜交方法，如有陽(yáng)性雜交信號(hào)，顯示有同源片段，則說(shuō)明環(huán)境受到鈾污染，反之則相反；或以該基因片段兩端序列為引物，做RT-PCR檢測(cè)環(huán)境中的美洲商陸cDNA，如能擴(kuò)增出相應(yīng)片段，則說(shuō)明環(huán)境受到鈾污染，反之則相反。
本發(fā)明首次在美洲商陸中獲得了鈾脅迫下特異性表達(dá)的基因片段，發(fā)明了以植物美洲商陸中鈾誘導(dǎo)下特異表達(dá)的基因?yàn)樘结榿?lái)檢測(cè)鈾污染的方法，解決了污染區(qū)周邊環(huán)境鈾污染難以準(zhǔn)確檢測(cè)的問(wèn)題。本發(fā)明的有益效果是由于傳統(tǒng)方法只能檢測(cè)污染的輻射劑量，不能確定是何種污染物，所以采用本發(fā)明方法可以準(zhǔn)確確定污染源及是否環(huán)境被鈾污染。



圖1為總RNA電泳結(jié)果，其中左圖為環(huán)境對(duì)照區(qū)商陸(tester)總RNA，右圖為鈾尾礦區(qū)商陸(driver)總RNA； 圖2為第二輪PCR產(chǎn)物電泳圖，其中1Mark-F，2PCR產(chǎn)物； 圖3為藍(lán)白斑篩選結(jié)果，其中箭頭所指為藍(lán)斑； 圖4為克隆質(zhì)粒電泳圖，其中1-11白斑質(zhì)粒，12藍(lán)斑對(duì)照質(zhì)粒； 圖5為巢式PCR電泳圖，其中1-7PCR產(chǎn)物，8Mark-F； 圖6為獲取基因片段測(cè)序結(jié)果圖。
具體的實(shí)施方式 實(shí)施例1 1.取鈾尾礦區(qū)的美洲商陸和非污染對(duì)照區(qū)域美洲商陸的根部組織，放置于液氮-196℃冷藏待用； 2.提取美洲商陸的根部組織總RNA，如圖1 (1)取預(yù)冷的RNA提取緩沖液(4mol/L異硫氰酸胍、25mmol/L檸檬酸鈉(pH7.0)、0.5％(W/V)十二烷基肌氨酸鈉、4％(V/V)β-巰基乙醇(使用前加入))10mL加入無(wú)Rnase的50mL離心管中，置于冰上； (2)稱(chēng)取4g美洲商陸根系在裝有過(guò)量液氮的研缽中充分研磨，用預(yù)冷的藥匙將美洲商陸根系粉末轉(zhuǎn)入離心管中，劇烈震蕩10min，冰上靜置5min； (3)加入1mL 2mol/L醋酸鈉(pH 4.0)，搖勻； (4)加入10mL水飽和酚(pH 4.5)，搖勻； (5)加入2mL氯仿∶異戊醇(24∶1)，搖勻，4℃、12000r/min離心20min； (6)吸取上清，轉(zhuǎn)入另1支新的無(wú)Rnase的50mL離心管，重復(fù)(4)、(5)步驟； (7)吸取上清，分裝到新的無(wú)Rnase的1.5mL離心管，加入等體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，置于-20℃沉淀1.5h； (8)4℃、13000r/min離心15min，棄上清，倒置空干，加入0.6mL 75％乙醇，懸浮沉淀； (9)4℃、14000r/min離心5min，棄上清，加入0.5mL 75％乙醇，洗滌RNA沉淀，室溫下干燥10min，溶于40μL 0.1％DEPC水后置于-80℃下保存。
3.抑制性消減文庫(kù)的構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)同時(shí)使用了RevertAidTM First Strard cDNA Synthesis Kit(Ferment公司)和PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit(Clontech公司)兩種試劑盒進(jìn)行SSH試驗(yàn)。cDNA第一鏈的合成使用了RevertAidTM First Strard cDNA Synthesis Kit，第二鏈合成使用了PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit(clontech公司)。以非污染對(duì)照區(qū)商陸根組織cDNA為T(mén)ester，位于鈾尾礦區(qū)美洲商陸根組織cDNA為Driver。
3.1cDNA第一鏈合成 (1)對(duì)每一份Tester和Driver RNA，在0.5mLEP管中加入PolyA+RNA 2μg，cDNA synthesis primer(10μm)1μL，如需要，加無(wú)菌水，調(diào)總體積為5μL，混勻后短暫離心； (2)在PCR熱循環(huán)儀中70℃溫育2min； (3)冰浴冷卻2min，短暫離心； (4)每個(gè)反應(yīng)加入下列成分5×First-strand Buffer 2μL，dNTP mix(10mMeach)1μL，Sterile H2O 1μL，AMV Reverse Transcriptase(20unite/μL)1μL； (5)輕輕的渦旋混合液，短暫離心； (6)42℃空氣浴1.5hr(注不能用水浴或PCR儀，蒸發(fā)可以減少反混合物體積，因此而降低反應(yīng)效率)； (7)冰上放置終止第一鏈反應(yīng)，并迅速進(jìn)行第二鏈cDNA合成步驟。
3.2cDNA第二鏈合成 用Tester、Driver cDNA每一鏈cDNA完成下面步驟 (1)加入以下成份到第一鏈合成反應(yīng)EP中(10μL)Sterile H2O 48.4μL，5×Second-Strand Buffer 16.0μL，dNTP Mix(10mM)1.6μL，20×Second-StrandEnzyme Cocktail 4.0μL； (2)混合各組分并短暫離心，總體積應(yīng)為80μL； (3)在水浴上或PCR儀上，16℃保溫2h； (4)加入2μL(6u)T4DNApolymerase，混勻反應(yīng)液； (5)16℃水浴或PCR儀上保溫30min； (6)加4μL20×EDTA/Glycogen Mix終止第二鏈合成； (7)加100μL酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)； (8)充分渦旋，14,000rpm離心10min(室溫)； (9)將上層液體移入新的0.5mLEP中； (10)加100μL的氯仿∶異戊醇(24∶1)； (11)重復(fù)步驟(8)和(9)； (12)加40μL4M NH40Ac和300μL的95％乙醇(立即開(kāi)始沉淀，不需將EP管放置在-20℃，在此條件下放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)使不需要的鹽沉淀)； (13)充分渦旋混勻，室溫14,000rpm離心20min； (14)小心收集上清； (15)用500μL 80％乙醇輕輕覆蓋沉淀； (16)14,000rpm離心10min； (17)仔細(xì)移出上清； (18)空氣中干燥10min，讓剩余的乙醇全部揮發(fā)； (19)用50μL滅菌水溶解沉淀； (20)轉(zhuǎn)移6μL到一個(gè)干凈的EP管中，于-20℃冰箱中保存，用于在RsaI酶切后電泳，檢測(cè)dscDNA分子的產(chǎn)量和大小范圍。
3.3Rsa I酶切 對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)用Tester和Driver dscDNA完成以下操作 (1)加入以下試劑dscDNA 40μL；10×Rsa I Restriction Buffer 5μL；Rsa I(10unite/μL)1.5μL； (2)渦旋混勻，短暫離心； (3)37℃溫育1.5h； (4)取出5μL酶切混合物，分析Rsa I酶切效率； (5)加入2.5μL 20×EDTA/Glycogen混合物，終止反應(yīng)； (6)加50μL酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)； (7)充分渦旋，室溫14,000rpm離心10min，使液體分層； (8)小心收集上清，轉(zhuǎn)入新的0.5mL EP管中； (9)加入50μL氯仿∶異戊醇(24∶1)； (10)重復(fù)步驟7和8； (11)加25μL 4M NH4OAc和187.5μL95％乙醇(注立即開(kāi)始沉淀，不需將EP管放置在-20℃，在此條件下放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)使不需要的鹽沉淀)； (12)重復(fù)步驟(7)； (13)棄上清； (14)用200μL 80％乙醇輕輕覆蓋沉淀； (15)14,000rpm離心5min； (16)仔細(xì)移出上清(如果用dCTP[-32P]同位素標(biāo)記，則可用蓋革計(jì)數(shù)器測(cè)定)； (17)空氣中干燥沉淀10min； (18)用5.5μL水溶解沉淀，存于-20℃冰箱中。
3.4連接接頭 (1)用5μL無(wú)菌水稀釋1μL Rsa I酶切的cDNA； (2)在0.5μLEP管中準(zhǔn)備連接用Master Mix，確保你有足夠的Master Mix滿(mǎn)足下列反應(yīng)無(wú)菌水1μL，5×連接Buffer 2μL，T4DNA Ligase(400unite/μL)3μL； (3)對(duì)每一組實(shí)驗(yàn)用Tester，在0.5μLEP管中按表1按順序加入試劑，用槍吸打液體充分混勻； 表1建立連接反應(yīng)體系
(4)混合2μLTester1-1和2μLTester1-2在一個(gè)新的EP管中，作為非消減Tester1對(duì)照；同樣其他每組Tester做法相同。連接反應(yīng)后，大約有1/3的cDNA分子帶有兩種不同的接頭在每一個(gè)非消減Tester對(duì)照管中； (5)短暫離心，16℃溫育過(guò)夜； (6)加1μLEDTA/Glycogen混合液終止連接反應(yīng)； (7)72℃保溫5min失活ligase； (8)短暫離心，實(shí)驗(yàn)用接頭的Tester加接頭cDNA和非消減的Tester對(duì)照現(xiàn)在已完成準(zhǔn)備； (9)取1μL非消減Tester對(duì)照并用水稀釋至1μL，這些樣品用于后面的PCR擴(kuò)增檢測(cè)； (10)樣品貯存在-20℃冰箱。
3.5第一輪雜交 在進(jìn)行下面的步驟中，過(guò)量的Driver cDNA加入到每個(gè)Tester cDNA中，樣品被加熱變性，重新退火，剩余的差異表達(dá)的單鏈cDNA被明顯富集，由于非靶基因cDNA出現(xiàn)在Tester中和Driver cDNA形成雜交。
注意雜交之前，將4×Hybridization buffer加熱至室溫至少15～20min，檢查buffer，確保用之前無(wú)可見(jiàn)的小塊沉淀物，如果需要，可在37℃加熱buffer 10min溶解沉淀。
(1)對(duì)于每一個(gè)樣品的雜交，按順序照以下表2在EP管中加入下列試劑； 表2建立第一輪雜交
(2)用一滴礦物油覆蓋樣品并做簡(jiǎn)單離心； (3)在熱循環(huán)儀上溫育樣品(98℃，1.5min)； (4)68℃，溫育樣品8h(樣品雜交可能需6～12min，不要讓其溫育超過(guò)12h)。
3.6第二輪雜交 將第一輪雜交的兩個(gè)樣品混合在一起，將新變性好的Driver DNA加入到混合樣品中，以進(jìn)一步富集差異表達(dá)序列，含差異表達(dá)的cDNA以其連接不同的接頭形成新雜交分子。注意不要在此階段將首輪雜交樣品變性，也不要將雜交樣品從熱循環(huán)儀上取出的時(shí)間超過(guò)加入新的Driver的必要時(shí)間。
(1)在滅菌管中加入以下試劑Driver cDNA 1μL，4×Hybridization Buffer1μL，Sterile H2O 2μL； (2)取出上述混合物1μL到一個(gè)新的0.5mL離心管中，在其上覆蓋一滴礦物油； (3)熱循環(huán)儀上98℃溫育1.5min； (4)從熱循環(huán)儀上移出新的新變性的Driver，同時(shí)將Driver與雜交樣品1和2混合在一起，即將微量移液槍調(diào)至15μL；輕輕地將槍頭放在雜交樣品2的EP管的礦物油/樣品交界面；小心吸取整個(gè)樣品的一部分到槍頭里，把槍頭從EP管中移出，吸入少量空氣到槍頭里，在這一滴樣品下創(chuàng)建一個(gè)小的空氣空間；重復(fù)b～d以含新變性Driver的EP管，現(xiàn)在移液槍頭應(yīng)該含有兩個(gè)樣品(雜交樣品2和變性Driver)，這兩個(gè)樣品由一個(gè)小空氣泡隔開(kāi)；轉(zhuǎn)移兩個(gè)樣品到含雜交樣品 1的EP管中；用槍頭吹打混勻； (5)如果需要，可短暫離心； (6)68℃溫育過(guò)夜； (7)加200μL dilution buffer并用槍頭混勻； (8)在熱循環(huán)儀上68℃加熱7min； (9)-20℃保存。
3.7兩輪PCR擴(kuò)增 按此部分所做兩輪反應(yīng)，差異表達(dá)的cDNA被選擇性擴(kuò)增，首先熱循環(huán)，通過(guò)75℃短暫溫育，缺失接頭的鏈被填補(bǔ)，這就為PCR引物創(chuàng)造了一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在第一輪擴(kuò)增，只有在序列兩端帶有不同接頭的cDNA鏈被指數(shù)形式擴(kuò)增，在第二輪擴(kuò)增中，嵌套式PCR被用于進(jìn)一步減少表達(dá)相同的序列，并富集差異表達(dá)的序列，如圖2。
(1)取1μL各種稀釋了的cDNA到一個(gè)作了相應(yīng)標(biāo)記的EP管中； (2)為所有的首輪PCR管準(zhǔn)備Master Mix，每個(gè)反應(yīng)準(zhǔn)備好后，將下列試劑按順序(表3)加入到一個(gè)0.5mL的EP管中。對(duì)每個(gè)其他實(shí)驗(yàn)cDNA，也如表4所述準(zhǔn)備相應(yīng)量的Master Mix。
表3首輪PCR Master Mix的準(zhǔn)備

(3)渦旋混勻，并簡(jiǎn)單離心； (4)在第一步所準(zhǔn)備的每一個(gè)反應(yīng)管中加入24μLMaster Mix； (5)用50μL礦物油覆蓋； (6)在熱循環(huán)儀上75℃，5min溫育反應(yīng)混合物以延伸接頭(不要從熱循環(huán)儀上移出樣品)，這步填補(bǔ)了丟失的接頭，因此創(chuàng)建了一個(gè)PCR引物的結(jié)合位點(diǎn)； (7)立即開(kāi)始熱循環(huán)(12cycles)94℃30sec，66℃30sec，72℃1.5min； (8)于27μL水中稀釋3μL各種首輪PCR混合物，以此作為第二輪PCR的模板； (9)取1μL各種來(lái)自第8)步的稀釋好的首輪PCR產(chǎn)物混合物到1個(gè)作了相應(yīng)標(biāo)記的EP管中； (10)按照表4的順序加入試劑來(lái)準(zhǔn)備第二輪PCR反應(yīng)的Master Mix(對(duì)于其它試驗(yàn)cDNA，為其反應(yīng)準(zhǔn)備相應(yīng)的Master Mix)； 表4第二輪PCR Master Mix的準(zhǔn)備
(11)渦旋混勻并作簡(jiǎn)單離心， (12)24μL Master Mix加入到第(9)步的反應(yīng)體系中， (13)用1滴礦物油覆蓋，立即開(kāi)始熱循環(huán)(10-12cycles)94℃30sec；66℃30sec；72℃1.5min。
(14)于-20℃保存反應(yīng)產(chǎn)物(到現(xiàn)在PCR產(chǎn)物中富集了差異表達(dá)的cDNA) 4.將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，如圖3； 5.插入片段的篩選與鑒定圖4，圖5； 6.cDNA克隆測(cè)序與序列分析(結(jié)果參見(jiàn)圖6)； 7、以獲取的基因片段為探針與環(huán)境中的美洲商陸提取的RNA雜交。
實(shí)施例2 1.步驟同實(shí)施例一1； 2.步驟同實(shí)施例一2； 3.步驟同實(shí)施例一3； 4.步驟同實(shí)施例一4； 5.步驟同實(shí)施例一5； 6.步驟同實(shí)施例一6； 7.以該特異表達(dá)基因片段兩端序列設(shè)計(jì)引物； 8.做RT-PCR檢測(cè)環(huán)境中的美洲商陸cDNA。
序列表
AACTGGCTTGTGGCAGCCAAGCGTTCATAGCGACGTTGCTTTTTGATCCTTCGATGACGTCTCTTCCTATCATTGTGAAGCAGATTTCACCAAGTGTTGGATTGTTCCCCCACCACCAGGGAACGTGAGTTGGGATTAGACCGTCGGGAAACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGACAGGGCCGGGATGGTAATTCAACCTAGTACTTCGGCCGCGACCACGCTAATCCCTAGTGCGGCCGCCTGCTGGCCAACCTTAGGGAAGAGTTCCTAACCCGTGGATTGCTGTATTAGAGTTTCCTGTCGTGCCCCTCAAAAAGTTGGGACGATCCTGGCTCTTATTTGTTTCCTGTTAAAAGCCGCGTATTCTTCACCATTTTTGCCTGTTGACGATCCTCA
權(quán)利要求
1.一種美洲商陸中鈾相關(guān)基因片段，是從鈾尾礦區(qū)的美洲商陸和非污染對(duì)照區(qū)域美洲商陸的根部組織提取總RNA，通過(guò)酶促反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈，經(jīng)過(guò)抑制性消減雜交分離到對(duì)重金屬鈾脅迫下特異性表達(dá)的基因片段，該基因片段的序列為
AACTGGCTTGTGGCAGCCAAGCGTTCATAGCGACGTTGCTTTTTGATCCTTCGATGACGTCTCTTCCTATCATTGTGAAGCAGATTTCACCAAGTGTTGGATTGTTCCCCCACCACCAGGGAACGTGAGTTGGGATTAGACCGTCGGGAAACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGACAGGGCCGGGATGGTAATTCAACCTAGTACTTCGGCCGCGACCACGCTAATCCCTAGTGCGGCCGCCTGCTGGCCAACCTTAGGGAAGAGTTCCTAACCCGTGGATTGCTGTATTAGAGTTTCCTGTCGTGCCCCTCAAAAAGTTGGGACGATCCTGGCTCTTATTTGTTTCCTGTTAAAAGCCGCGTATTCTTCACCATTTTTGCCTGTTGACGATCCTCA。
2.如權(quán)利要求1所述的美洲商陸中鈾相關(guān)基因片段的獲取方法，其特征在于，包括以下步驟
(1)在-196℃下液氮冷藏鈾尾礦區(qū)的美洲商陸和非污染對(duì)照區(qū)域美洲商陸的根部組織；
(2)提取美洲商陸的根部組織總RNA；
(3)抑制性消減文庫(kù)的構(gòu)建以非污染對(duì)照區(qū)商陸根組織cDNA為T(mén)ester，位于鈾尾礦區(qū)美洲商陸根組織cDNA為Driver，同時(shí)使用RevertAidTM First StrardcDNA Synthesis Kit和PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit兩種試劑盒進(jìn)行抑制性消減雜交試驗(yàn)，包括
1)cDNA第一鏈合成；
2)cDNA第二鏈合成；
3)Rsa I酶切；
4)連接接頭；
5)第一輪雜交；
6)第二輪雜交；
7)兩輪PCR擴(kuò)增。
(4)將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中；
(5)插入片段的篩選與鑒定；
(6)cDNA克隆測(cè)序與序列分析。
3.如權(quán)利要求1所述的美洲商陸中鈾相關(guān)基因片段在檢測(cè)環(huán)境鈾污染中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的美洲商陸中鈾相關(guān)基因片段在檢測(cè)環(huán)境鈾污染中的應(yīng)用，其特征在于，以該基因片段為探針與環(huán)境中的美洲商陸提取的RNA雜交，按常規(guī)核酸雜交方法，如有陽(yáng)性雜交信號(hào)，顯示有同源片段，則說(shuō)明環(huán)境受到鈾污染，反之則相反。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的美洲商陸中鈾相關(guān)基因片段在檢測(cè)環(huán)境鈾污染中的應(yīng)用，其特征在于，以該基因片段兩端序列為引物，做RT-PCR檢測(cè)環(huán)境中的美洲商陸cDNA，如能擴(kuò)增出相應(yīng)片段，則說(shuō)明環(huán)境受到鈾污染，反之則相反。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種美洲商陸中鈾相關(guān)基因片段，是從鈾尾礦區(qū)的美洲商陸和非污染對(duì)照區(qū)域美洲商陸的根部組織提取總RNA，通過(guò)酶促反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈，經(jīng)過(guò)抑制性消減雜交(SSH)分離到對(duì)重金屬鈾脅迫下特異性表達(dá)的基因片段，以該基因片段為探針與環(huán)境中的美洲商陸提取的RNA雜交或以該特異表達(dá)基因片段兩端序列為引物，做RT-PCR檢測(cè)環(huán)境中的美洲商陸cDNA。本發(fā)明以植物美洲商陸中鈾誘導(dǎo)下特異表達(dá)的基因?yàn)樘结榿?lái)檢測(cè)鈾污染，解決了污染區(qū)周邊環(huán)境鈾污染難以準(zhǔn)確檢測(cè)的問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101792769SQ200910044388
公開(kāi)日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2009年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月22日
發(fā)明者高利臣, 肖璐, 馮濤 申請(qǐng)人:湖南科技大學(xué)