一種選擇性整體擴增不同長度dna片段的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉分子生物學領(lǐng)域，公開了一種通過調(diào)節(jié)變性溫度選擇性擴增小片段DNA的方法。首先通過改良的接頭連接技術(shù)將底物DNA與通用接頭相連接，然后利用連接產(chǎn)物為底物，以通用接頭為模板，利用通用引物，進行底物DNA的PCR選擇性擴增。本發(fā)明所述方法能夠在保證DNA分子完整性的同時，選擇性擴增小片段DNA分子。
【專利說明】一種選擇性整體擴增不同長度DNA片段的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學以及臨床分子診斷領(lǐng)域，特別涉及DNA整體擴增與不同片段DNA分離，尤其涉及血漿游離不同長度DNA片段分離領(lǐng)域，具體指一種通過優(yōu)化PCR擴增反應條件進行選擇性整體擴增不同長度DNA片段的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]血漿中存在著少量的游離DNA(Cell-free DNA，)，這些DNA已逐步成為臨床分子診斷重要的材料來源，包括針對產(chǎn)科學的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)、腫瘤早期診斷以及靶向藥物敏感性的分子診斷，糖尿病相關(guān)基因診斷等。但是由于指導疾病診斷的血清DNA(如來源于胎兒細胞以及腫瘤細胞等)含量極少，僅為血漿總游離DNA的19%左右，并且與體細胞釋放的DNA混雜在一起，造成高的機體正常DNA背景干擾下進行的，極容易引起誤差。如何提高這些與疾病相關(guān)DNA濃度，從而提高診斷的靈敏度與特異性，已經(jīng)成為了亟待解決的問題。
[0003]在血漿內(nèi)DNA片段長度存在的一定的差異，DNA片段大小從幾千Kb到幾十Kb不等，對疾病診斷有關(guān)的DNA片段長度往往集中于一定范圍內(nèi)。如在孕婦母體內(nèi)的血漿胎兒DNA片段大小集中于300bp左右，而大多數(shù)母體DNA分子片段長度大于300bp，血漿腫瘤細胞的DNA片段大小也多在200bp左右，主要是由于這些特殊DNA的來源由于細胞凋亡釋放。從此有效富集這一長度片段DNA將有利于疾病診斷的敏感性?，F(xiàn)有富集血漿中的不同片段DNA方法主要為以下兩種:一種是通過瓊脂糖凝膠電泳法將小片段的DNA與大片段DNA分離開，這種方法精確度低，并且極容易帶入外源性核酸污染物；另一種是在磁珠法或硅膠模法提取DNA的基礎(chǔ)上，通過調(diào)整吸附反應體系，選擇性吸附小片段的DNA分子，從而達到富集cffDNA的目的。然而血漿中的DNA含量非常少，即使提取效率能夠達到100%，仍然需要幾毫升甚至幾十毫升的血液樣品才能夠滿足常規(guī)檢測的要求。
[0004]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，提供一種通過優(yōu)化擴增反應選擇性擴不同片段DNA的方法，該方法能夠選擇性擴增不同片段的雙鏈DNA分子，特別血漿中的DNA，并且在擴增的同時最大程度上保留DNA片段的完整性。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
(1)底物DNA的預處理:通過改良的接頭連接技術(shù)將底物DNA與通用接頭相連接；
(2)利用步驟(I)產(chǎn)物為底物，以通用接頭為模板，利用通用引物，進行底物DNA的PCR選擇性擴增，所述PCR反應按如下步驟進行:
PCR 反應體系:3μ I 的步驟(I)產(chǎn)物、2 μ I 的 1XTaq Polymerase Buffer、1.6 μ I 的dNTP (2.5mM each)、1.2 μ I 的 MgCl2 (25mM)、0.5 μ I 的通用引物(20 μ Μ)、0.5 μ I 的 TaqPolymerase (2U/ μ I)、11.2μ I 的 ddH20 ；
反應條件是:
(a)72。。接頭延伸5min,
(b)76.6-86.6°C 預變性 3min，
(c)76.6-86.6變性 20s，
(d)72°C退火(每個循環(huán)較前一循環(huán)降低0.5°C)20s,
(e)72°C延伸 2min，
(f)重復(c)-(e) 30個循環(huán)，
(g)76.6-86.6°C 變性 20s，
(h)57°C退火 20s，
(i)72°C 延伸 2min，
(j)重復(g)_ (i) 10-20 個循環(huán)，
(k)72°C 延伸 5min，
(1)4°C 保溫。
[0007]本發(fā)明的有益效果是，能夠在保證DNA分子完整性的同時，選擇性擴增小片段DNA分子。
[0008]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1是實施例2-7產(chǎn)物的電泳結(jié)果，其中泳道I為DL2000 DNA Marker,泳道2為實施例2產(chǎn)物，泳道3為實施例3產(chǎn)物，泳道4為實施例4產(chǎn)物，泳道5為實施例5產(chǎn)物，泳道6為實施例6產(chǎn)物，泳道7為實施例7產(chǎn)物，泳道8為空白對照。
[0010]

【具體實施方式】
[0011]以下用實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，但并不限定本發(fā)明的保護范圍。
[0012]實施例1 底物DNA的預處理
(I)利用T4 Polymerase將底物DNA的末端鈍化。
[0013](2)利用 Taq DNA Polymerase 將步驟(I)產(chǎn)物 DNA 加 A。
[0014](3)利用T4 DNA Ligase將將步驟(2)產(chǎn)物DNA與通用引物接頭鏈接。
[0015]實施例2
DNA的PCR選擇性擴增:以實施例1產(chǎn)物為模板，進行如下反應(總體系20μ I):
實施例1產(chǎn)物3 μ I
1XPlatinum HiProof Taq PCR Buffer2 μ I
MgCl2 (25mM)1.2μ I
dNTP (2.5mM each)1.6μ I
通用引物(20μΜ)0.5μ I
Platinum HiProof Taq (2U/μ I)0.5 μ I
ddH20 補至20 μ I
PCR擴增反應條件如下:
72 0C接頭延伸5min
76.6 °C 預變性3min
76.6°C 變性20s π
72°C退火(每個循環(huán)降低0.5°C)20s (30個循環(huán))
72 °C延伸2min」 76.6°C 變性20s π
57°C退火20s (10個循環(huán))
72 °C延伸2min」
72 °C 延伸5min
4 0C保溫00擴增產(chǎn)物即是選擇性擴增的DNA。
[0016]實施例3
DNA的PCR選擇性擴增:以實施例1產(chǎn)物為模板，進行如下反應(總體系20μ I):
實施例1產(chǎn)物3 μ I
1XPlatinum HiProof Taq PCR Buffer2 μ I
MgCl2 (25mM)1.2μ I
dNTP (2.5mM each)1.6μ I
通用引物(20μΜ)0.5μ I
Platinum HiProof Taq (2U/μ I)0.5 μ I
ddH20 補至20 μ I
PCR擴增反應條件如下:
72 0C接頭延伸5min
78.4°C 預變性3min
78.4°C 變性20s π
72°C退火(每個循環(huán)降低0.5°C)20s (30個循環(huán))
72 °C延伸2min」
78.4°C 變性20s π
57°C退火20s (10個循環(huán))
72 0C延伸2min」
72 °C 延伸5min
4 0C保溫00擴增產(chǎn)物即是選擇性擴增的DNA。
[0017]實施例4
DNA的PCR選擇性擴增:以實施例1產(chǎn)物為模板，進行如下反應(總體系20μ I):
實施例1產(chǎn)物3 μ I
1XPlatinum HiProof Taq PCR Buffer2 μ I
MgCl2 (25mM)1.2μ I
dNTP (2.5mM each)1.6μ I
通用引物(20μΜ)0.5μ I
Platinum HiProof Taq (2U/μ I)0.5 μ I
ddH20 補至20 μ I
PCR擴增反應條件如下:
72 0C接頭延伸5min
80.4°C 預變性3min 80.4°C 變性20s π
72°C退火(每個循環(huán)降低0.5°C)20s (30個循環(huán))
72 °C延伸2min」
80.4°C 變性20s π
57°C退火20s (10個循環(huán))
72 °C延伸2min」
72 °C 延伸5min
4 0C保溫00擴增產(chǎn)物即是選擇性擴增的DNA。
[0018]實施例5
DNA的PCR選擇性擴增:以實施例1產(chǎn)物為模板，進行如下反應(總體系20μ I):
實施例1產(chǎn)物3 μ I
1XPlatinum HiProof Taq PCR Buffer2 μ I
MgCl2 (25mM)1.2μ I
dNTP (2.5mM each)1.6μ I
通用引物(20μΜ)0.5μ I
Platinum HiProof Taq (2U/μ I)0.5 μ I
ddH20 補至20 μ I
PCR擴增反應條件如下:
72 0C接頭延伸5min
82.4°C 預變性3min
82.4°C 變性20s π
72°C退火(每個循環(huán)降低0.5°C)20s (30個循環(huán))
72 °C延伸2min」
82.4°C 變性20s π
57°C退火20s (10個循環(huán))
72 0C延伸2min」
72 °C 延伸5min
4 0C保溫00擴增產(chǎn)物即是選擇性擴增的DNA。
[0019]實施例6
DNA的PCR選擇性擴增:以實施例1產(chǎn)物為模板，進行如下反應(總體系20μ I):
實施例1產(chǎn)物3 μ I
1XPlatinum HiProof Taq PCR Buffer2 μ I
MgCl2 (25mM)1.2μ I
dNTP (2.5mM each)1.6μ I
通用引物(20μΜ)0.5μ I
Platinum HiProof Taq (2U/μ I)0.5 μ I
ddH20 補至20 μ I PCR擴增反應條件如下:
72 0C接頭延伸5min
84.6 °C 預變性3min
84.6°C 變性20s π
72°C退火(每個循環(huán)降低0.5°C)20s (30個循環(huán))
72 °C延伸2min」
84.6°C 變性20s π
57°C退火20s (10個循環(huán))
72 0C延伸2min」
72 °C 延伸5min
4 0C保溫00擴增產(chǎn)物即是選擇性擴增的DNA。
[0020]實施例7
DNA的PCR選擇性擴增:以實施例1產(chǎn)物為模板，進行如下反應(總體系20μ I):
實施例1產(chǎn)物3 μ I
1XPlatinum HiProof Taq PCR Buffer2 μ I
MgCl2 (25mM)1.2μ I
dNTP (2.5mM each)1.6μ I
通用引物(20μΜ)0.5μ I
Platinum HiProof Taq (2U/μ I)0.5 μ I
ddH20 補至20 μ I
PCR擴增反應條件如下:
72 0C接頭延伸5min
86.6 °C 預變性3min
86.6°C 變性20s π
72°C退火(每個循環(huán)降低0.5°C)20s (30個循環(huán))
72 °C延伸2min」
86.6°C 變性20s π
57°C退火20s (10個循環(huán))
72 0C延伸2min」
72 °C 延伸5min
4 0C保溫00擴增產(chǎn)物即是選擇性擴增的DNA。
[0021]實施例2-7產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖1所示，其中泳道I為DL2000 DNA Marker，泳道2為實施例2產(chǎn)物，泳道3為實施例3產(chǎn)物，泳道4為實施例4產(chǎn)物，泳道5為實施例5產(chǎn)物，泳道6為實施例6產(chǎn)物，泳道7為實施例7產(chǎn)物，泳道8為空白對照。
[0022]本發(fā)明使用一種通過調(diào)節(jié)變性溫度選擇性擴增小片段DNA的方法，能夠在保證DNA分子完整性的同時，選擇性擴增小片段DNA分子。
【權(quán)利要求】
1.通過調(diào)節(jié)變性溫度選擇性擴增小片段DNA的方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: (1)底物DNA的預處理:通過改良的接頭連接技術(shù)將孕婦血漿游離DNA與通用接頭相連接； (2)利用步驟(I)產(chǎn)物為底物，以通用接頭為模板，利用通用引物，進行底物DNA的PCR選擇性擴增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(I)通過改良的接頭連接技術(shù)是通過對于樣本DNA進行末端鈍化、加A反應制備成3’端為A粘性末端的底物DNA，再然后將末端為A粘性末端的DNA與連接面的5’端磷酸化、3’端為T粘性末端的通用接頭進行連接反應。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(2)通用引物是與通用接頭序列互補的寡核苷酸引物，具體指序列為5’-GCG GTG ACC CGG GAG ATC TGA ATT CT-3’的寡核苷酸引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(2)PCR選擇性擴增是按如下步驟進行: PCR 反應體系:3μ I 的步驟(I)產(chǎn)物、2 μ I 的 1XTaq Polymerase Buffer、1.6 μ I 的dNTP (2.5mM each)、1.2 μ I 的 MgCl2 (25mM)、0.5 μ I 的通用引物(20 μ Μ)、0.5 μ I 的 TaqPolymerase (2U/ μ I)、11.2μ I 的 ddH20 ； 反應條件是: (a)72。。接頭延伸5min,
(b)76.6-86.6°C 預變性 3min， (c)76.6-86.6變性 20s， (d)72°C退火(每個循環(huán)較前一循環(huán)降低0.5°C)20s,
(e)72aC 延伸 2min， (f)重復(c)-(e) 30個循環(huán)，
(g)76.6-86.6°C 變性 20s， (h)57°C退火 20s，
(i)72°C 延伸 2min， (j)重復(g)_ (i) 10-20 個循環(huán)， (k) 72V 延伸 5min， (1)4°C 保溫。
【文檔編號】C12N15/10GK104313011SQ201410365311
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月29日
【發(fā)明者】張桂珍, 楊麒巍, 杜珍武, 宋旸, 于杉, 任明 申請人:張桂珍