一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)小反芻獸疫病毒的試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)小反芻獸疫病毒的試劑盒，其包括檢測(cè)小反芻獸疫的通用引物及焦磷酸測(cè)序引物，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.2-4所示。通過(guò)提取待測(cè)樣品的RNA，以上述通用引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，若引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為78bp，再進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，若測(cè)序片段與N基因目標(biāo)片段（SEQ?ID?NO.1）完全相同的，確定為小反芻獸疫病毒，若測(cè)序片段與目標(biāo)片段有一個(gè)或一個(gè)以上堿基不同，則判定樣品為陰性。本發(fā)明試劑盒可用于對(duì)小反芻獸疫病毒進(jìn)行快速檢測(cè)，具有高通量、低成本的特點(diǎn)，產(chǎn)物可直接用于測(cè)序，不需要進(jìn)行二次處理，操作極為簡(jiǎn)便，所需樣品量小，具有良好的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)小反芻獸疫病毒的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及焦磷酸測(cè)序技術(shù)，特別是涉及利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)小反芻獸疫病毒的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]小反會(huì)獸疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由副粘病毒科麻疫病毒屬的小反芻獸疫病毒(PPRV)引起的一種高度接觸性動(dòng)物疫病。該病主要感染家養(yǎng)和野生小反芻獸，山羊尤其易感，其致病性與分子學(xué)特性與牛瘟(RP)非常相似，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定為A類(lèi)動(dòng)物疫病，給發(fā)生該病的國(guó)家，尤其是非洲、中東、近東和南亞等國(guó)家的外貿(mào)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了巨大的損失。該病自發(fā)生以來(lái)，不斷向世界各地蔓延，對(duì)無(wú)該病發(fā)生的國(guó)家，尤其對(duì)呈地方性流行國(guó)家的臨近國(guó)家造成的威脅逐漸加大。長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直認(rèn)為PPRV是RPV的變異毒株，只是喪失了對(duì)牛的致病力，只對(duì)小反芻動(dòng)物有致病作用，加上RP和PPR能夠產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)，可以用RP疫苗預(yù)防PPR。因此，在很多國(guó)家和地區(qū)忽略了對(duì)PPR的研究，特別是忽視了 PPRV的病原生物學(xué)、分子生物學(xué)等方面的研究。本病目前沒(méi)有有效的治療方法，只能依靠有效地預(yù)防，因此診斷監(jiān)測(cè)技術(shù)成為控制該病的重要手段。
[0003]焦磷酸測(cè)序技術(shù)(Pyrosequencing)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種能夠進(jìn)行定量序列測(cè)定的新技術(shù)，具有高通量、快速、敏感等特點(diǎn)。目前該技術(shù)在物種鑒定、病毒的快速鑒定和分型、微生物的檢測(cè)以及寄生蟲(chóng)檢測(cè)鑒定等方面已有廣泛的應(yīng)用。
[0004]焦磷酸測(cè)序是不同于Sanger法的一種新的測(cè)序技術(shù)，它以單鏈DNA為模板，在熒光素、5'-磷酸化硫酸腺苷(APS)等底物存在，及DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸酶(ATPsulfurylase)、重組突光素酶(Iuciferase)催化下，加入與模板互補(bǔ)的dNTP時(shí)發(fā)生延伸反應(yīng)，產(chǎn)生與模板堿基數(shù)相應(yīng)強(qiáng)度的突光信號(hào)，不互補(bǔ)的dNTP被三磷酸腺苷雙磷酸酶(apyrase)降解，無(wú)熒光信號(hào)產(chǎn)生。焦測(cè)序無(wú)需熒光染料標(biāo)記和電泳步驟，能夠在短時(shí)間內(nèi)提供基因片段的序列信息，是短片段基因測(cè)序的理想平臺(tái)。焦測(cè)序技術(shù)已經(jīng)在SNP檢測(cè)，微生物分型，基因甲基化檢測(cè)等領(lǐng)域得到應(yīng)用，還應(yīng)用到大規(guī)模DNA測(cè)序中，使測(cè)序技術(shù)發(fā)生了革命性變化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的不足，提供一種小反芻獸疫病毒通用焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的不足，為我國(guó)畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)、畜產(chǎn)品加工和出口商以及國(guó)際畜產(chǎn)品貿(mào)易等方面提供一種快速、簡(jiǎn)便、高效、實(shí)用的檢測(cè)方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目·的，本發(fā)明的主要原理是利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)，通過(guò)DNA聚合酶(DNA ploymerase)、三憐酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、突光素酶(Iuciferase)和雙磷酸酶(apyrase) 4種酶催化待測(cè)序DNA單鏈和測(cè)序引物的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，反應(yīng)底物為5’ -鄰酰硫酸(adenosine5’ phosphosulfate, APS)和突光素。在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，加入I種dNTP，若該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)(PPi)。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驅(qū)動(dòng)熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化熒光素的轉(zhuǎn)化，發(fā)出與ATP量成正比的可見(jiàn)光信號(hào)，光信號(hào)由CCD攝像機(jī)檢測(cè)并由Pyrogram?反應(yīng)為峰,每個(gè)光信號(hào)的峰高與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。ATP和未摻入的dNTP由雙磷酸酶降解，淬滅光信號(hào)，并再生反應(yīng)體系。然后加入下一種dNTP。最終待測(cè)序列順序即可從反應(yīng)光強(qiáng)的信號(hào)峰中讀出。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供用于檢測(cè)小反芻獸疫病毒的試劑盒。
[0008]本發(fā)明首先提供的一種適用于焦磷酸測(cè)序檢測(cè)小反芻獸疫病毒N基因的特異目標(biāo)序列，其具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0009]本發(fā)明提供了用于檢測(cè)小反芻獸疫病毒N基因的通用引物，其核苷酸序列為:
[0010]UPPRVF:5，-ACCCTCGTGAGGCTCAAA-3’
[0011]UPPRVR:5’ -Biotin-CCTCCTGGTCCTCCAGAATC-3’。
[0012]本發(fā)明提供了與上述通用引物配合使用的焦磷酸測(cè)序引物，其核苷酸序列為:
[0013]UPPRVS: 5，-ATCGGCTGAGGCACT—3，。
[0014]本發(fā)明所述的設(shè)計(jì)小反芻獸疫病毒通用引物及焦磷酸測(cè)序引物是根據(jù)小反芻獸疫病毒N基因的特異區(qū)域序列，通過(guò)Assay Design SW軟件設(shè)計(jì)小反芻獸疫病毒通用引物序列，以擴(kuò)增出特異性單一條帶，再根據(jù)擴(kuò)增區(qū)域中包含的特異核苷酸序列(特異目標(biāo)序列SEQ ID N0.1所示)設(shè)計(jì)焦磷酸測(cè)序引物以確定小反芻獸疫病毒。小反芻獸疫病毒N基因的目標(biāo)序列:CTTCAG GCTG CAGGCCATGG CCAAGATTCT GGAGGACCAG (SEQ ID N0.1);其 RT-PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為78bp。
[0015]進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)小反芻獸疫病毒的試劑盒，含有上述的通用引物和焦磷酸測(cè)序引物。
[0016]進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒，其工作程序?yàn)?
[0017](I)提取待測(cè)樣品的RNA ;以上述的通用引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；
[0018](2)若擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為78bp，則制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板；
[0019](3)進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，若目的序列與SEQ ID N0.1所示特異目標(biāo)序列一致，則待測(cè)樣品中含有小反芻獸疫病毒。
[0020]步驟(1)所述的提取待測(cè)樣品的RNA是利用Trizol裂解液處理待測(cè)樣品，經(jīng)酚氯仿抽提，異丙醇沉淀獲得RNA，或者采用商業(yè)化的RNA提取試劑盒提取。
[0021]更進(jìn)一步地，步驟(1)的RT_PCR50y L反應(yīng)體系中含IOXOne Step RNA PCRBuffer5 μ L, MgCL225mmol/L, 10 μ L, dNTP Mixture 各 10mmol/L5 μ L, 40U/ μ L RNA 酶抑制劑 I μ L, 5U/ μ L AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 XLl μ L，AMV-Optimized Taq (5U/μ L) I μ L，IOpmol/μ L 上、下游引物各1.0 μ L，待測(cè)RNAl μ g，無(wú)RNA酶H2O補(bǔ)足50 μ L反應(yīng)體系。
[0022]本發(fā)明試劑盒工作程序中，步驟(1)的RT-PCR擴(kuò)增條件為:50°C反轉(zhuǎn)錄30min，94°C預(yù)變性2min后；94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共循環(huán)50次；然后72°C再延伸8min。
[0023]其中，步驟(I沖RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)方法為取0.6g瓊脂糖，于30mLl X TAE電泳緩沖液中加熱，充分熔化，加入SYBR GreenlOOOO倍稀釋的溶液2 μ L，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠；取5μ L RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和I μ L6 X Loading Buffer混合后，點(diǎn)樣；10V/cm恒壓電泳,直至溴酹藍(lán)指示劑遷移至凝膠中部，停止電泳，將凝膠置于紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果并記錄。
[0024]更進(jìn)一步地，步驟(2)的制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板方法為:使用20UL標(biāo)記有生物素的PCR產(chǎn)物與30 ii L ddH20混合后再與200 u g鏈霉素親和素包被的磁珠混合，室溫下置震蕩器上1400rpm震蕩孵育15min，用真空吸附泵將與磁珠結(jié)合后的PCR產(chǎn)物吸起，然后依次通過(guò)70%乙醇5s ;變性緩沖液5s ;沖洗緩沖液5s，最后移至預(yù)先每孔加入45 ii L含有
0.3mol/L測(cè)序引物的結(jié)合緩沖液的96孔板上方，釋放磁珠，將96孔板放入80°C烘箱中加熱2min后,取出冷卻至室溫。
[0025]更近一步地，步驟(3)焦磷酸測(cè)序反應(yīng)在20_28°C下于焦磷酸測(cè)序儀上進(jìn)行檢測(cè)，所采用的堿基加入順序?yàn)?5 (ATGC)，每輪測(cè)序檢測(cè)運(yùn)行時(shí)間為65min，引物鏈隨著不同dNTP的加入而延伸，隨著核酸的結(jié)合，CCD攝像機(jī)檢測(cè)到發(fā)出的光信號(hào)，讀出DNA序列。
[0026]經(jīng)過(guò)上述工序，本發(fā)明的試劑盒是根據(jù)RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果和焦磷酸測(cè)序結(jié)果來(lái)判定樣品中是否含有小反芻獸疫病毒:小反芻獸疫病毒通用RT-PCR反應(yīng)為陽(yáng)性，即擴(kuò)增片段為78bp，則制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板，進(jìn)行焦磷酸測(cè)序分析，測(cè)序片段與N基因目標(biāo)片段完全相同的，確定為小反芻獸疫病毒，若測(cè)序片段與目標(biāo)片段有一個(gè)或一個(gè)以上堿基不同，則判定樣品為非小反芻獸疫病毒。若小反芻獸疫病毒通用RT-PCR反應(yīng)為陰性，則判定樣品為非小反芻獸疫病毒。
[0027]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)小反芻獸疫病毒進(jìn)行檢測(cè)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，該技術(shù)具有高通量、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可以精確的進(jìn)行短DNA序列分析，測(cè)序過(guò)程耗時(shí)短，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程。PCR產(chǎn)物可直接用于測(cè)序，不需進(jìn)行產(chǎn)物純化等二次處理，操作簡(jiǎn)便，所 需樣品量少。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1為本發(fā)明對(duì)小反芻獸疫病毒RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；其中M為Marker, I為小反芻獸疫病毒。
[0029]圖2為本發(fā)明對(duì)小反芻獸疫病毒RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的結(jié)果。
[0030]圖3為本發(fā)明對(duì)血液樣品RNA RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果；其中M為DNA Marker，I，2為小反芻獸疫病毒感染的病羊血液樣品，3，4為小反芻獸疫疫苗免疫羊血液，5-7為健康羊血液。
[0031]圖4為本發(fā)明對(duì)病羊、免疫羊和健康羊血液樣品RNA RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的結(jié)果，其中圖4A為小反芻獸疫病毒感染的病羊血液樣品RNA RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的焦磷酸測(cè)序圖，圖4B為小反芻獸疫疫苗免疫羊血液樣品RNA RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的焦磷酸測(cè)序圖，圖4C為健康羊血液樣品RNA RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的焦磷酸測(cè)序圖。
[0032]圖5為本發(fā)明對(duì)小反芻獸疫病毒RT-PCR進(jìn)行特異性檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，其中M為DNA Marker, I為小反芻獸疫病毒,2為小反芻獸疫疫苗毒,3為口蹄疫病毒,4為水泡性口炎病毒，5為空白陰性對(duì)照。
[0033]圖6為本發(fā)明對(duì)小反芻獸疫病毒RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的特異性檢測(cè)結(jié)果，其中圖6A為小反芻獸疫病毒的焦磷酸測(cè)序圖，圖6B為小反芻獸疫疫苗毒的焦磷酸測(cè)序圖，圖6C為口蹄疫病毒的焦磷酸測(cè)序圖，圖6D為水泡性口炎病毒的焦磷酸測(cè)序圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0034]以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0035]若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。若未特別指明，實(shí)施例中所用的試劑為市售。
[0036]實(shí)施例1檢測(cè)小反芻獸疫病毒的引物的設(shè)計(jì)
[0037]通過(guò)對(duì)美國(guó)國(guó)立生物信息中心NCBI基因庫(kù)(GenBank)中已公布的各個(gè)國(guó)家和地區(qū)的PPRV N基因序列進(jìn)行對(duì)比分析，確定PPRV N基因的高度保守序列，根據(jù)該特異性序列采用Assay Design SW軟件設(shè)計(jì)通用RT-PCR引物和焦磷酸測(cè)序引物,選取得分較高的引物組進(jìn)行Blast分析，根據(jù)分析結(jié)果選取一組最佳引物進(jìn)行后續(xù)的RT-PCR和測(cè)序工作。
[0038]本發(fā)明根據(jù)小反芻獸疫病毒N基因的特異區(qū)域序列設(shè)計(jì)的小反芻獸疫病毒通用引物可針對(duì)小反芻獸疫病毒RNA擴(kuò)增出特異性單一條帶，其RT-PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為78bp。再根據(jù)擴(kuò)增區(qū)域中包含的特異核苷酸序列(特異目標(biāo)序列SEQ ID N0.1所示)設(shè)計(jì)焦磷酸測(cè)序引物以確定小反芻獸疫病毒。小反芻獸疫病毒N基因的目標(biāo)序列:CTTCAGGCTGCAGGCCATGG CCAAGATTCT GGAGGACCAG (SEQ ID N0.1)。
[0039]本發(fā)明經(jīng)過(guò)篩選，設(shè)計(jì)得到的小反芻獸疫病毒通用RT-PCR引物及測(cè)序引物分別為:
[0040]UPPRVF:5，-ACCCTCGTGAGGCTCAAA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0041]UPPRVR:5，-CCTCCTGGTCCTCCAGAATC-3’(5，端標(biāo)記 Biotin) (SEQ ID N0.3)
[0042]UPPRVS:5，-ATCGGCTGAGGCACT-3’ (SEQ ID N0.4)
[0043]實(shí)施例2利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)小反芻獸疫病毒
[0044]1、小反芻獸疫疫苗RNA的提取
[0045]以滅活的PPRV Nigeria75/1病毒(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)為原料，采用TRIZOL法提取RNA。具體步驟為:
[0046](I)取滅活的病毒培養(yǎng)液上清200uL加入滅菌1.5ml Eppendorf管內(nèi)，然后加入Trizoll.0mL,反復(fù)混勻，冰上放置5min。
[0047](2)加入200uL氯仿，小心蓋上帽蓋，用力搖動(dòng)Eppendorf管15s，室溫放置5min。4°C, 12000r/min,離心15min,溶液分為3層,上層水相含RNA。
[0048](3)轉(zhuǎn)移水相至一新Eppendorf管內(nèi)，加入500uL異丙醇，混勻，_20°C放置15min。4°C, 12000r/min,離心IOmin,離心后在Eppendorf管邊和底部可見(jiàn)有膠樣RNA沉淀(對(duì)于細(xì)胞毒而言，也可能看不到沉淀)。
[0049](4 )小心吸棄上清，加入500uL75%乙醇，小心顛倒以漂洗沉淀及管壁，4 °C，12000r/min,離心 5min。
[0050](5)小心吸棄上清，室溫干燥RNA沉淀5~lOmin。然后加入IOuL滅菌ddH20溶解沉淀，_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0051 ] 2.RT-PCR反應(yīng)體系及條件
[0052]以提取的 PPRV 疫苗·毒 RNA 為模板，用 TAKARA One Step RNA PCR Kit (AMV)(DRR024A)試劑盒進(jìn)行一步法RT-PCR，擴(kuò)增目的片段，上下游引物為實(shí)施例1設(shè)計(jì)得到的UPPRVF和UPPRVR引物，RT-PCR反應(yīng)體系如下:
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種適用于焦磷酸測(cè)序檢測(cè)小反芻獸疫病毒N基因的特異目標(biāo)序列，其具有SEQ IDN0.1所示的核苷酸序列。
2.用于檢測(cè)小反芻獸疫病毒N基因的通用引物，其核苷酸序列為:
UPPRVF:5，-ACCCTCGTGAGGCTCAAA-3’
UPPRVR:5’ -Biotin-CCTCCTGGTCCTCCAGAATC-3’。
3.與權(quán)利要求2所述通用引物配合使用的焦磷酸測(cè)序引物，其核苷酸序列為:
UPPRVS:5， -ATCGGCTGAGGCACT-3，。
4.一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)小反芻獸疫病毒的試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求2所述的通用引物和權(quán)利要求3所述的焦磷酸測(cè)序引物。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，其工作程序?yàn)? (1)提取待測(cè)樣品的RNA；以權(quán)利要求2所述的通用引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增； (2)若擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為78bp，則制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板； (3)進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，若目的序列與權(quán)利要求1所述特異目標(biāo)序列一致，則待測(cè)樣品中含有小反芻獸疫病毒。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，步驟(1)的RT-PCR50iiL反應(yīng)體系中含 IOXOne Step RNA PC`R Buffer5 u L, 25mmol/L MgCL2IOu L, dNTP Mixture 各 IOmmoI/L5 u L, 40U/ u L RNA 酶抑制劑 I U L, 5U/ u L AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 XLl u L, 5U/ u L AMV-OptimizedTaql u L，IOpmol/ u L上、下游引物各1.0 y L，待測(cè)RNAl y g，無(wú)RNA酶H2O補(bǔ)足50 y L反應(yīng)體系。
7.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，步驟(1)的RT-PCR擴(kuò)增條件為:50°C反轉(zhuǎn)錄30min，94°C預(yù)變性2min后；94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共循環(huán)50次；然后72°C再延伸8min。
8.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，步驟(1)中RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)方法為取0.6g瓊脂糖，于30mLlXTAE電泳緩沖液中加熱，充分熔化，加入SYBR GreenlOOOO倍稀釋的溶液2 u L，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠；取5 u LRT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和I y L6 X Loading Buffer混合后，點(diǎn)樣；10V/cm恒壓電泳,直至溴酹藍(lán)指示劑遷移至凝膠中部，停止電泳，將凝膠置于紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果并記錄。
9.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，步驟(2)的制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板方法為:使用20 ii L標(biāo)記有生物素的PCR產(chǎn)物與30 ii L ddH20混合后再與200 u g鏈霉素親和素包被的磁珠混合，室溫下置震蕩器上1400rpm震蕩孵育15min,用真空吸附泵將與磁珠結(jié)合后的PCR產(chǎn)物吸起，然后依次通過(guò)70%乙醇5s ;變性緩沖液5s ;沖洗緩沖液5s，最后移至預(yù)先每孔加入45 ii L含有0.3mol/L測(cè)序引物的結(jié)合緩沖液的96孔板上方，釋放磁珠，將96孔板放入80°C烘箱中加熱2min后，取出冷卻至室溫。
10.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，步驟(3)焦磷酸測(cè)序反應(yīng)在20-28°C下于焦磷酸測(cè)序儀上進(jìn)行檢測(cè)，所采用的堿基加入順序?yàn)?5 (ATGC)，每輪測(cè)序檢測(cè)運(yùn)行時(shí)間為65min，引物鏈隨著不同dNTP的加入而延伸，隨著核酸的結(jié)合，CCD攝像機(jī)檢測(cè)到發(fā)出的光信號(hào)，讀出DNA序列。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103667539SQ201310741568
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】王彩霞, 吳紹強(qiáng), 林祥梅, 呂繼洲, 袁向芬, 鄧俊花 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院