Bat3蛋白在制備由朊病毒引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供BAT3蛋白在制備由朊病毒引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種用于治療由朊病毒引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，特別是用于治療由PrP106-126毒性多肽引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，所述藥物中的有效成分為BAT3蛋白，其氨基酸序列如Seq?ID?No.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。BAT3蛋白的表達(dá)緩解了PrP106-126毒性多肽對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成的凋亡，為進(jìn)一步闡釋該蛋白對(duì)朊病毒引起的神經(jīng)元損失的治療作用機(jī)制提供了有效而集約的研究手段，另外也填補(bǔ)了該蛋白在治療方法方面的空白。
【專(zhuān)利說(shuō)明】BAT3蛋白在制備由朊病毒引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程及蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及BAT3蛋白在制備由朊病毒引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]脂質(zhì)體(Liposomes)是利用人造雙層磷脂質(zhì)，包裝DNA后形成的脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，是應(yīng)用最多的非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。脂質(zhì)體單室脂質(zhì)體、多室脂質(zhì)體，含有表面活性劑的脂質(zhì)體。按性能脂質(zhì)體可分為一般脂質(zhì)體(包括單室脂質(zhì)體、多室脂質(zhì)體和多相脂質(zhì)體等)、特殊性能脂質(zhì)體、熱敏脂質(zhì)體、pH敏感脂質(zhì)體、超聲波敏感脂質(zhì)體、光敏脂質(zhì)體和磁性脂質(zhì)體等。按電荷性，脂質(zhì)體可分為中性脂質(zhì)體、負(fù)電性脂質(zhì)體、正電性脂質(zhì)體。脂質(zhì)體區(qū)別于其它普通制劑的一個(gè)重要特點(diǎn)是其具有靶向性。脂質(zhì)體的靶向性分為被動(dòng)靶向性和主動(dòng)靶向性，被動(dòng)靶向性是脂質(zhì)體進(jìn)入人體后的自然分布，即靜注體內(nèi)的脂質(zhì)體主要定位于肝、脾、骨髓、血液中的巨噬細(xì)胞等；而主動(dòng)靶向性是改變脂質(zhì)體被動(dòng)靶向性的特點(diǎn)，使其定位于特定的細(xì)胞、組織、器官，這受到了脂質(zhì)體粒子大小及毛細(xì)血管種類(lèi)的限制。脂質(zhì)體的靶向性可以通過(guò)放射性元素標(biāo)記或高效液相色譜分析法檢驗(yàn)得以驗(yàn)證。陽(yáng)性脂質(zhì)體(cationic liposome)又稱(chēng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體，正電荷脂質(zhì)體(Positiveiy charged liposome)是一種本身帶有正電荷的脂質(zhì)囊泡。大多數(shù)陽(yáng)性脂質(zhì)體是由一種中性磷脂和一種或多種陽(yáng)性成分組成。陽(yáng)性脂質(zhì)體中使用的中性磷脂成分上與常規(guī)脂質(zhì)體相似，如膽固醇(chol)、磷脂酞膽堿(PC)、磷脂酚乙醇胺(PE)等。陽(yáng)性成分多為合成的雙鏈季按鹽型表面活性劑，具有體外穩(wěn)定性好，體內(nèi)可被生物降解的優(yōu)點(diǎn)。陽(yáng)性脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染作用機(jī)制介導(dǎo)轉(zhuǎn)染過(guò)程中，陽(yáng)性脂質(zhì)體的主要作用在于DNA形成復(fù)合物，介導(dǎo)與細(xì)胞的作用，并將DNA釋放到細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染。
[0003]陽(yáng)性脂質(zhì)體作為一種可供選擇的基因傳遞載體具有下列優(yōu)點(diǎn):(I)可防止核酸被體內(nèi)物質(zhì)降解，可將其特異性傳遞到靶細(xì)胞中；(2)無(wú)毒、無(wú)免疫性，具有生物惰性，可生物降解；(3)易于制備，使用方便，可將大的DNA片斷轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中；(4)基因轉(zhuǎn)染率高，100%離體細(xì)胞可以瞬間表達(dá)外源基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供BAT3蛋白在制備用于治療由朊病毒引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供一種用于治療由朊病毒引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于治療由朊病毒引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，所述藥物中的有效成分為BAT3蛋白。
[0007]本發(fā)明還提供一種用于治療由PrP106_126毒性多肽引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，所述藥物中的有效成分為BAT3蛋白。[0008]本發(fā)明還提供BAT3蛋白在制備治療由朊病毒引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病是指由朊病毒引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
[0009]本發(fā)明還提供BAT3蛋白在制備治療由PrP106_126毒性多肽引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用。所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病是指由PrP106-126毒性多肽引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
[0010]本發(fā)明進(jìn)一步提供重組質(zhì)粒PCMV-HA-BAT3，其核苷酸序列如Seq ID N0.3所示。
[0011]本發(fā)明還提供含有所述重組質(zhì)粒PCMV-HA-BAT3的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。所述細(xì)胞系包括但不限于Hela細(xì)胞系、N2a細(xì)胞系、原代神經(jīng)元細(xì)胞系等。
[0012]本發(fā)明中涉及到的BAT3蛋白的氨基酸序列如Seq ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0013]本發(fā)明中涉及到的PrP106_126毒性多肽的氨基酸序列如Seq IDN0.2所示。
[0014]本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建一套完善的目的基因轉(zhuǎn)移載體系統(tǒng)，在可調(diào)控的條件下在需要的時(shí)間內(nèi)表達(dá)一定量治療基因產(chǎn)物——目的蛋白。BAT3蛋白的表達(dá)緩解了 PrP106-126毒性多肽對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成的凋亡，為進(jìn)一步闡釋該蛋白對(duì)朊病毒引起的神經(jīng)元損失的治療作用機(jī)制提供了有效而集約的研究手段，另外也填補(bǔ)了該蛋白在治療方法方面的空白。
[0015]通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將已經(jīng)構(gòu)建好的pCMV-HA-BAT3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞系N2a，Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BAT3表達(dá)量的變化；用PrP106_126神經(jīng)毒性多肽處理N2a細(xì)胞，用TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒分析經(jīng)BAT3轉(zhuǎn)染或?qū)φ战M的N2a細(xì)胞的凋亡水平；Western blot檢測(cè)PrP106_126神經(jīng)毒性多肽處理前后胞漿內(nèi)細(xì)胞色素c和Bcl_2的變化，進(jìn)一步了解BAT3在神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮的作用機(jī)制。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為本發(fā)明神經(jīng)元細(xì)胞的鑒定以及證明BAT3蛋白在N2a細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)。
[0017]圖2為本發(fā)明BAT3蛋白在N2a細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)情況。
[0018]圖3為本發(fā)明BAT3蛋白與全長(zhǎng)朊蛋白發(fā)生相互作用的情況。
[0019]圖4為本發(fā)明用PrP106_126毒性多肽刺激原代神經(jīng)元或N2a細(xì)胞后，BAT3蛋白從胞核轉(zhuǎn)移到胞漿的情況；其中，A.首先用FITC標(biāo)記的PrP106-126毒性多肽刺激原代神經(jīng)元24h，用免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)，多肽刺激之后，BAT3從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到胞漿；B和C.進(jìn)一步用Western blot證實(shí)了 PrP106_126毒性多肽刺激N2a細(xì)胞后，BAT3蛋白從胞核向胞漿轉(zhuǎn)移的情況。
[0020]圖5為本發(fā)明BAT3蛋白過(guò)表達(dá)后可以緩解由PrP106_126毒性多肽引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡；其中，A.用TUNEL試驗(yàn)證實(shí)了 BAT3蛋白過(guò)表達(dá)之后，與只攻毒組以及轉(zhuǎn)染空載體+攻毒組相比，神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平明顯下降；B.用Western blot檢測(cè)BAT3在對(duì)應(yīng)組別中的
表達(dá)量。
[0021]圖6為本發(fā)明用PrP106_126毒性多肽刺激N2a細(xì)胞引起細(xì)胞色素C向胞漿中的釋放以及Bcl-2抗凋亡蛋白水平下調(diào)。
[0022]圖7A為本發(fā)明BAT3蛋白過(guò)表達(dá)后可以抑制細(xì)胞色素C向胞漿的釋放，同時(shí)穩(wěn)定胞漿中Bcl-2抗凋亡蛋白的水平。
[0023]圖7B為本發(fā)明實(shí)施例中用PrP106_126毒性多肽攻毒之后，BAT3蛋白過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞色素C釋放的抑制作用呈劑量依賴(lài)性。【具體實(shí)施方式】
[0024]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。
[0025]實(shí)施例BAT3蛋白的表達(dá)緩解了 PrP106_126毒性多肽對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成的凋亡
[0026]1.材料及來(lái)源
[0027]小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞系N2a (ATC_CCCL_131TM)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；BAT3鼠源單克隆抗體，細(xì)胞色素c兔源多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；HA鼠源單克隆抗體，Bcl-2 (P65)兔源多克隆抗體，β-actin兔源多克隆抗體,Lamin BI鼠源單克隆抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自Bioworld公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗，Alexa Fluor594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗購(gòu)自中杉金橋公司；FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗和Cy5標(biāo)記的山羊抗兔二抗,兔源TUBB3/betaIII tubulin(神經(jīng)元標(biāo)記物)購(gòu)自博奧森公司，神經(jīng)元III族-β -Tubulin (Tujl)抗體，DAPI 二氫氯化物和碘化丙啶(ΡΙ)，免疫熒光染色用的免疫固定液、免疫洗滌液，免疫封閉液購(gòu)自碧云天公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000和無(wú)血清培養(yǎng)基Opt1-ΜΕΜ購(gòu)自Invitrogen公司；胞衆(zhòng)蛋白提取試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司；多肽:朊蛋白多肽片段(KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG;PrP106-126)由上海生物公司合成；FITC標(biāo)記的PrP106-126毒性多肽購(gòu)自FANBO生化制劑公司；TUNEL試劑盒購(gòu)自Roche公司；多肽以2mM濃度溶于PBS中，存儲(chǔ)于_20°C;電泳儀:B10_RAD美國(guó)；電轉(zhuǎn)儀=BIO-RAD美國(guó)。
[0028]2.試驗(yàn)方法
[0029]2.1Hela細(xì)胞和N2a細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)
`[0030]取出液氮罐中裝有N2a細(xì)胞的凍存管，立即放入預(yù)熱至37°C的水浴中并搖動(dòng)，使管中細(xì)胞懸液快速融化，然后低速800r/min離心5min，離心后棄去凍存液，取Iml完全DMEM培養(yǎng)基加至管中反復(fù)吹打，吸出吹打后的液體加至培養(yǎng)瓶中，重復(fù)沖洗吹打一次。用含20%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)基4-5ml，37°C、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)。12h待細(xì)胞貼壁后，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
[0031]2.2原代神經(jīng)元的分離與培養(yǎng)
[0032]出生24h內(nèi)的SD乳鼠75%酒精浸泡消毒5_10min，浸于無(wú)菌水中清洗，然后將頭剪掉置于無(wú)菌平皿中，小剪刀沿大腦中部將皮膚剪開(kāi)，露出顱骨。眼科剪沿著顱骨中縫剪開(kāi)，用小止血鉗去除顱骨，暴露出大腦皮質(zhì)和小腦，小心分離出大腦,置(冰上)4 V DMEM液中，在解剖顯微鏡下分離出雙側(cè)大腦皮層，仔細(xì)剝除軟腦膜和血管，然后沉淀洗滌分離出的組織5-6次(每次靜止2min，棄上清)，將分離的大腦皮質(zhì)部分剪碎成l_2mm3的小組織塊。將組織懸液置于無(wú)菌的瓶中消化(這樣消化液在瓶里形成淺而廣闊的一層，均勻分布著組織塊，從而徹底解決消化不完全的情況)，加入終濃度3mg/mL木瓜蛋白酶+適量(0.05mg/ml)DNA酶。37度培養(yǎng)箱消化30-40分鐘，每10分鐘稍微搖動(dòng)一下。加入少許血清終止反應(yīng)，(papain置于37度30min徹底溶解)，1000rpm, 5min離心棄上清,加入3_4mL DMEM0用大口徑吸管(配合槍頭吹打)輕輕吹打組織塊使細(xì)胞均勻分散為初細(xì)胞懸液。對(duì)初級(jí)細(xì)胞懸液經(jīng)75微米的不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)箱培養(yǎng)30min (差速去雜細(xì)胞)后，胎盤(pán)藍(lán)染色后細(xì)胞計(jì)數(shù)。然后細(xì)胞離心1000rpm，5min，用10%胎牛血清的DMEM / F12+0.5%B27培養(yǎng)液懸起細(xì)胞沉淀。將初細(xì)胞懸液經(jīng)計(jì)數(shù)稀釋到2 X IO6個(gè)/ mL,接種到預(yù)先經(jīng)50 μ g/ml的多聚左旋賴(lài)氨酸包被的培養(yǎng)板中，12孔板500 μ L，置CO2培養(yǎng)箱中孵育24h換液，每孔加Iml培養(yǎng)基，24h后半量換液，加入10 μ mol/L的阿糖胞苷以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，以后每隔48h半量換液I次。6-7天使用細(xì)胞。
[0033]2.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
[0034]收獲處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞、N2a細(xì)胞或原代神經(jīng)元細(xì)胞，以2X IO5/孔接種于12孔培養(yǎng)板中，370C，5%C02環(huán)境中培養(yǎng)24h，細(xì)胞長(zhǎng)至80%~90%融合，按轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的比例為2 μ g:3 μ L，轉(zhuǎn)染過(guò)程使用Opt1-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后5h換為正常細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的10%FBS培養(yǎng)基。用于Western blot檢測(cè)的細(xì)胞分為陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pCMV-HA空載體)和實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染pCMV-HA-BAT3重組質(zhì)粒。用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞接種于之前鋪好爬片的12孔培養(yǎng)板中。轉(zhuǎn)染48h后收集蛋白進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)。
[0035]PCMV-HA-BAT3質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下:
[0036]根據(jù)GenBank 中公布的 AAD18085.1, Homo sapiens BAG6BCL2_associatedathanogene6(BAT3)mRNA序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增BAT3全長(zhǎng)基因序列的PCR引物(由上海生工生物公司合成)。以Hela細(xì)胞的cDNA作為模板，上游引物5' -GGAAGATCTCATGGAGCCTAATGATAGTACCAGTACCGCTG-3';下游引物 5' -AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAAGGATCATCAGCAAAGGCCCGCTG-3'，兩端分別插入BglI1、NotI酶切位點(diǎn)。用BglI1、NotI雙酶切的目的基因與同樣雙酶切的pCMV-HA進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HA-BAT3(Seq ID N0.3),經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0037]2.4免疫熒光實(shí)驗(yàn)
[0038]用潔凈的蓋玻片，70%乙醇中浸泡后，用無(wú)菌的鑷子放置到12孔板內(nèi)，然后用無(wú)菌的生理鹽水、PBS或培養(yǎng)液洗去殘留的乙醇。種入細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼在蓋玻片上生長(zhǎng)良好后，進(jìn)行過(guò)表達(dá)或用毒性多肽處理。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行免疫熒光染色。用免疫染色固定液室溫固定30分鐘以上。固定完畢后，用免疫染色洗滌液洗滌兩次，每次5分鐘。加入免疫染色封閉液，封閉60分鐘。按照適當(dāng)比例用稀釋一抗:BAT3抗體為1:100、HA抗體為:1:1000, TUBB3/beta IIItubulin 神經(jīng)元標(biāo)記物為:1:100、Tujl 為:1:250。吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，37°C孵育兩個(gè)小時(shí)。然后棄去一抗，洗滌液洗滌5分鐘，共洗滌3次。按照適當(dāng)比例稀釋二抗:Alexa Fluor594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗、FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗和Cy5標(biāo)記的山羊抗兔二抗稀釋比例都為1:100(相應(yīng)的一抗為鼠源，二抗就用山羊抗鼠孵育；一抗為兔源，二抗用山羊抗兔的孵育，Alexa Fluor594和Cy5激發(fā)紅色熒光，F(xiàn)ITC激發(fā)綠色熒光)。吸盡洗滌液后，立即加入稀釋好的二抗，37°C孵育一小時(shí)。之后加入免疫染色洗滌液，洗滌5分鐘，共洗滌3次。最后加入DAPI染核3分鐘，洗滌5分鐘，共洗漆3次。用抗淬滅劑封片,在正置激光共聚焦顯微鏡(Olympus, Tokyo, Japan)下觀察試驗(yàn)結(jié)果。
[0039]Prion 毒性多肽:PrP106-126 的氨基酸序列為 KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG (SEQ IDN0.2)，由上海生工合成，多肽的純度達(dá)到95%。多肽在0.1M的PBS中溶解成ImM濃度，然后再37°C放置12h，實(shí)驗(yàn)用終濃度為100 μ M0 FITC標(biāo)記的PrP106_126多肽購(gòu)自北京泛博生物化學(xué)有限公司。[0040]2.5TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況
[0041]將培養(yǎng)好的細(xì)胞調(diào)整到2X IO5個(gè)/mL，加入鋪好爬片的12孔培養(yǎng)板上。首先進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別將BAT3重組質(zhì)粒和空載體轉(zhuǎn)染入N2a細(xì)胞，然后將室溫處理過(guò)的終濃度為200 μ mo I/L PrP106-126作用于經(jīng)轉(zhuǎn)染的N2a細(xì)胞以及設(shè)立未轉(zhuǎn)染對(duì)照組，每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)24h后按照試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行TUNEL檢測(cè)，最后用PI染核，以顯示所有細(xì)胞數(shù)目。使用正置激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本東京)進(jìn)行結(jié)果觀察。
[0042]2.6ffestern blot檢測(cè)細(xì)胞色素c、Bcl_2、BAT3等蛋白的變化情況
[0043]細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白的提取按照試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)說(shuō)明書(shū)操作。提取各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的胞漿蛋白，將樣品調(diào)成相同的濃度，加入5XSDS凝膠加樣緩沖液，沸水煮lOmin，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉37°C封閉lh，將膜與一抗4°C孵育過(guò)夜，一抗的稀釋濃度分別兔抗HA標(biāo)簽抗體1:3000稀釋?zhuān)皇罂笲AT3抗體1:100稀釋?zhuān)籐aminB抗體1:1000稀釋?zhuān)煌每辜?xì)胞色素c抗體1:500稀釋?zhuān)煌每笲cl-2抗體1:500稀釋?zhuān)煌迷?0-&(^丨11抗體1:3000稀釋。用TBST洗膜三次，每次5分鐘，再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠源(1:5000)或兔源(1:5000) 二抗在室溫下孵育lh，TBST洗膜三次，每次5分鐘,用化學(xué)發(fā)光液室溫孵育5分鐘,曝光。
[0044]3.試驗(yàn)結(jié)果
[0045]3.1神經(jīng)元細(xì)胞的鑒定
[0046]如圖1所示，利用免疫熒光技術(shù)，用兩種神經(jīng)元特異性抗體分別鑒定所分離培養(yǎng)的神經(jīng)元純度，左圖為神經(jīng)元特異性抗體TUBB3/betaI 11 tubulin神經(jīng)元標(biāo)記物(稀釋比例為1:100)，二抗為Alexa Fluor594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗(稀釋比例為1:100);右圖為神經(jīng)元特異性標(biāo)記物Tujl (稀釋比例為1:250), 二抗為FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗(稀釋比例為1:100)。用DAPI染細(xì)胞核。
[0047]3.2證明BAT3在N2a細(xì)胞中的過(guò)表達(dá):
[0048]如圖2所示，PCMV-HA-BAT3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入N2a細(xì)胞,用western bolt檢測(cè)其過(guò)表達(dá)成功，試驗(yàn)分成五組，每組轉(zhuǎn)染的質(zhì)?？偭慷紴? μ g，BAT3質(zhì)粒的比例不同，如圖所示，分別為0、0.1、0.3、1、3118，其余的用空質(zhì)粒補(bǔ)齊。第一行:HA為標(biāo)簽抗體，顯示外源BAT3蛋白的表達(dá)量，隨著B(niǎo)AT3質(zhì)粒增加，外源BAT3的表達(dá)量也相應(yīng)增加，同時(shí)證明外源蛋白的表達(dá)成功。第二行:顯示內(nèi)源與外源BAT3蛋白的表達(dá)。第三行:用β-actin作為內(nèi)參蛋白，確定上樣量。HA標(biāo)簽抗體1:3000稀釋?zhuān)皇罂笲AT3抗體1:100稀釋?zhuān)煌迷?β-actin抗體1:3000稀釋。
[0049]3.3BAT3與全長(zhǎng)的朊蛋白發(fā)生相互作用
[0050]如圖3所不，PCCN:primary cerebral cortex neuronal cell,原代大腦皮層神經(jīng)元；merge指第一列與第二列圖片的合圖。
[0051 ] 將構(gòu)建好的帶綠色熒光標(biāo)簽的全長(zhǎng)PRP載體，分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入Hela細(xì)胞和原代神經(jīng)元細(xì)胞。用免疫熒光染色方法觀察到BAT3與PRP在胞漿共定位。
[0052]帶綠色熒光蛋白全長(zhǎng)PRP質(zhì)粒的構(gòu)建:
[0053]根據(jù)GenBank 中 AY569456 公布的 Homo sapiens prion protein (PRNP)mRNA 序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增PrP全長(zhǎng)基因序列的PCR引物(由上海生工生物公司合成)。以Hela細(xì)胞的cDNA 作為模板，上游引物:5/ -ATACTC GAG ATG GCG AAC CTT GGC TGC T-3';下游引物:5' -ACTAAG CTT TCC CAC TAT CAG GAA GAT GAG-3;，兩端分別插入 HindII1、XhoI 酶切位點(diǎn)。經(jīng)用Hind IIiahoI雙酶切的目的基因與同樣雙酶切的PGEFP-Nl進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0054]免疫突光染色:
[0055]用潔凈的蓋玻片，70%乙醇中浸泡后，用無(wú)菌的鑷子放置到12孔板內(nèi)，然后用無(wú)菌的生理鹽水、PBS或培養(yǎng)液洗去殘留的乙醇。種入細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼在蓋玻片上生長(zhǎng)良好后，轉(zhuǎn)染攜帶綠色熒光蛋白的全長(zhǎng)朊蛋白質(zhì)粒。用免疫染色固定液室溫固定30分鐘以上。固定完畢后，用免疫染色洗滌液洗滌兩次，每次5分鐘。加入免疫染色封閉液,封閉60分鐘。按照適當(dāng)比例用稀釋一抗:BAT3抗體為1:100。吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，37°C孵育兩個(gè)小時(shí)。之后棄去一抗，洗滌液洗滌5分鐘，共洗滌3次。按照適當(dāng)比例稀釋二抗:AleXaFluor594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗，稀釋比例為1:100。吸盡洗滌液后，立即加入稀釋好的二抗，37°C孵育一小時(shí)。之后加入免疫染色洗滌液，洗滌5分鐘，共洗滌3次。最后加入DAPI染核3分鐘，洗滌5分鐘，共洗滌3次。用抗淬滅劑封片，在正置激光共聚焦顯微鏡(Olympus,日本東京)下觀察試驗(yàn)結(jié)果(圖4)。
[0056]3.4用PrP106-126毒性多肽刺激原代神經(jīng)元或N2a細(xì)胞后，BAT3從胞核轉(zhuǎn)移到胞漿
[0057]3.4.1首先用FITC標(biāo)記的PrP106_126毒性多肽刺激原代神經(jīng)元24h，用免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)，多肽刺激之后，BAT3從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到胞漿
[0058]方法同上，即用潔凈的蓋玻片，70%乙醇中浸泡后，用無(wú)菌的鑷子放置到12孔板內(nèi)，然后用無(wú)菌的生理鹽水、PBS或培養(yǎng)液洗去殘留的乙醇。種入細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼在蓋玻片上生長(zhǎng)良好后，試驗(yàn)組加入IOOul帶FITC標(biāo)簽的PrP106-126毒性多肽，作用24h，對(duì)照組加入IOOul PBS0用免疫染色固定液室溫固定30分鐘以上。固定完畢后，用免疫染色洗滌液洗滌兩次，每次5分鐘。加入免疫染色封閉液，封閉60分鐘。按照適當(dāng)比例用稀釋一抗:BAT3抗體為1:100。吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，37°C孵育兩個(gè)小時(shí)。之后棄去一抗，洗漆液洗漆5分鐘,共洗漆`3次。按照適當(dāng)比例稀釋二抗:Alexa Fluor594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗，稀釋比例為1:100。吸盡洗滌液后，立即加入稀釋好的二抗，37°C孵育一小時(shí)。之后加入免疫染色洗滌液，洗滌5分鐘，共洗滌3次。最后加入DAPI染核3分鐘，洗滌5分鐘，共洗滌3次。用抗淬滅劑封片，在正置激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本東京)下觀察試驗(yàn)結(jié)果。
[0059]3.4.2進(jìn)一步用Western blot證實(shí)了 PrP106_126毒性多肽刺激N2a細(xì)胞后，BAT3蛋白從胞核向胞漿的轉(zhuǎn)移。分別收獲不同時(shí)間段(3h、6h、9h、12h和24h)的細(xì)胞，提取胞漿和胞核BAT3蛋白，分別用β-actin和Lamin BI作為胞楽;和胞核的內(nèi)參蛋白，經(jīng)過(guò)蛋白相對(duì)密度分析，我們證實(shí)了 BAT3蛋白的核輸出。鼠抗BAT3抗體1:100稀釋?zhuān)籐aminB抗體1:1000稀釋?zhuān)煌迷?β-actin抗體1:3000稀釋。**P < 0.01，表示極差異顯著。
[0060]3.5BAT3過(guò)表達(dá)后可以緩解由PrP106_126毒性多肽引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡
[0061]3.5.1用TUNEL試驗(yàn)證實(shí)了 BAT3過(guò)表達(dá)之后，與僅攻毒組以及轉(zhuǎn)染空載體+攻毒組相比，神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平明顯下降。將培養(yǎng)好的細(xì)胞調(diào)整到2X IO5個(gè)/mL，加入鋪好爬片的12孔培養(yǎng)板上。首先進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別將BAT3重組質(zhì)粒和空載體轉(zhuǎn)染入N2a細(xì)胞，然后將室溫處理過(guò)的終濃度為200 μ mo I/L PrP106-126作用于經(jīng)轉(zhuǎn)染的N2a細(xì)胞以及設(shè)立未轉(zhuǎn)染對(duì)照組，每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)24h后按照試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行TUNEL檢測(cè)，最后用PI染核，以顯示所有細(xì)胞數(shù)目。使用正置激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本東京)進(jìn)行結(jié)果觀察。(圖5)
[0062]3.5.2用Western blot檢測(cè)BAT3在對(duì)應(yīng)組別中的表達(dá)量
[0063]鼠抗BAT3抗體1:100稀釋?zhuān)沪?actin為胞衆(zhòng)內(nèi)參蛋白。兔源-β-actin抗體1:3000 稀釋。
[0064]3.6用PrP106_126毒性多肽刺激N2a細(xì)胞引起細(xì)胞色素C向胞漿中的釋放以及Bcl-2抗凋亡蛋白水平下調(diào)
[0065]分別收集攻毒6h、9h、12h和24h的樣品,進(jìn)行Western blot檢測(cè)，β-actin為胞衆(zhòng)內(nèi)參蛋白。兔抗細(xì)胞色素c抗體1:500稀釋?zhuān)煌每笲cl-2抗體1:500稀釋?zhuān)煌迷?β -actin抗體1:3000稀釋。(圖6)
[0066]3，7BAT3過(guò)表達(dá)后可以抑制細(xì)胞色素C向胞漿的釋放，同時(shí)穩(wěn)定胞漿中Bcl_2抗凋亡蛋白的水平
[0067]細(xì)胞鋪板后，BAT3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后，用毒性多肽作用24h，收樣。試驗(yàn)組加入100 μ I多肽，對(duì)照組加入100 μ I PBS,用Western blot檢測(cè)，β-actin為胞衆(zhòng)內(nèi)參蛋白，HA標(biāo)簽抗體1:3000稀釋?zhuān)每辜?xì)胞色素c抗體1:500稀釋?zhuān)煌每笲cl-2抗體1:500稀釋?zhuān)迷?β-actin抗體1:3000稀釋?zhuān)籅.攻毒之后，BAT3過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞色素C釋放的抑制作用呈劑量依賴(lài)性。用6孔板鋪板，試驗(yàn)分成五組，每組轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒總量都為4 μ g，BAT3質(zhì)粒的比例不同，如圖所示，分別為0、1.0、2.0、3.0、4.0 μ g，其余的用空質(zhì)粒補(bǔ)齊。隨著B(niǎo)AT3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒含量的增加，細(xì)胞色素c胞楽;向胞楽；內(nèi)釋放的含量減少。用Western blot檢測(cè)細(xì)胞色素c的變化，β-actin為胞漿內(nèi)參`蛋白。鼠抗BAT3抗體1:100稀釋?zhuān)籋A標(biāo)簽抗體1:3000稀釋?zhuān)煌迷?β -actin抗體1:3000稀釋?zhuān)煌每辜?xì)胞色素c抗體1:500稀釋?zhuān)煌每笲cl_2抗體1:500稀釋。#P < 0.01，表示極差異顯著。(圖7A和B)
[0068]采用上述方法能夠有效緩解及治療朊病毒引起的人類(lèi)和動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元損失；對(duì)于BAT3蛋白在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中作用的研究表明，BAT3的過(guò)表達(dá)抑制了由PrP106-126毒性多肽引起的細(xì)胞色素c的過(guò)渡釋放并且維持細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl_2的穩(wěn)定，同時(shí)通過(guò)TUNEL試劑盒對(duì)凋亡情況的分析，保證了該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，不易污染、易于標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)點(diǎn)，為進(jìn)一步闡釋該蛋白對(duì)朊病毒引起的神經(jīng)元損失的治療作用機(jī)制提供了有效而集約的研究手段，另外也填補(bǔ)了 BAT3蛋白在治療方法方面的空白。
[0069]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0070]參考文獻(xiàn)
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【權(quán)利要求】
1.一種用于治療由朊病毒引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，其特征在于，所述藥物中的有效成分為BAT3蛋白，其氨基酸序列如Seq ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.一種用于治療由PrP106-126毒性多肽引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，其特征在于，所述藥物中的有效成分為BAT3蛋白，其氨基酸序列如Seq ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列； 其中，PrP106_126毒性多肽的氨基酸序列如Seq ID N0.2所示。
3.BAT3蛋白在制備治療由瓶病毒引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用，所述BAT3蛋白的氨基酸序列如Seq ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病是指由朊病毒引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
5.BAT3蛋白在制備治療由PrP106-126毒性多肽引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的應(yīng)用，所述BAT3蛋白的氨基酸序列如Seq ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列； 其中，PrP106_126毒性多肽的氨基酸序列如Seq ID N0.2所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述神經(jīng)系統(tǒng)疾病是指由PrP106-126毒性多肽引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
7.一種重組質(zhì)粒pCMV-HA-BAT3，其核苷酸序列如Seq ID N0.3所示。
8.含有權(quán)利要求7所述重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。`
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞系包括但不限于Hela細(xì)胞系、N2a細(xì)胞系、原代神經(jīng)元細(xì)胞系。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103751764SQ201310741576
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】楊利峰, 趙德明, 宋志琦, 王運(yùn)盛, 周向梅, 尹曉敏, 趙化粉 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)