專利名稱：：通過檢測腦毒素診斷和監(jiān)控神經系統(tǒng)疾病的方法通過檢測腦毒素診斷和監(jiān)控神經系統(tǒng)疾病的方法相關申請的交叉引用本申請要求2003年1月27日申請的美國臨時申請No.60/443，219的優(yōu)先權。該申請的內容在這里整體引入作為參考政府撥款本發(fā)明的一部分獲得國家衛(wèi)生研究所的項目支持，項目號No.AG12548。美國政府也享有本申請的某些權利。發(fā)明概述本發(fā)明涉及神經系統(tǒng)疾病的臨床表現(xiàn)與通過染病的腦單核吞噬細胞產生的神經毒素的相互關系。本發(fā)明也涉及了通過測定受試者生物試樣中神經毒素來診斷神經系統(tǒng)疾病或認知損失危險的方法。神經毒素，腦毒素，已發(fā)現(xiàn)通過神經系統(tǒng)疾病中長期損傷神經元的炎性級聯(lián)反應釋放，所述神經系統(tǒng)疾病例如為HIV-1-相關的癡呆(HAD)，神經-AIDS，克雅氏病，輕度的認知損傷，朊病毒疾病，輕度的認知/運動功能障礙，急性中風，急性神經創(chuàng)傷，和阿爾茨海默氏病(AD)。炎性級聯(lián)反應包括單核吞噬細胞的激活和突觸連接和神經元的損失，由此導致信息處理，注意力，學習以及信息檢索的下降以及智力功能的全面損失。發(fā)明背景認知損失以及與神經系統(tǒng)疾病有關的癡呆是由作為記憶，學習和信息處理的解剖學基礎的神經元和突觸的損傷引起的。盡管非常重要，但目前人們還沒有解釋出導致這些紊亂中漸進性神經元損失的生化途徑。全世界有超過1500萬的人患阿爾茨海默氏病(AD)并且是導致老年人癡呆的最常見的原因(Teny,R.D.等，(eds.)，ALZHEIMER'SDISEASE,RavenPress,NewYork,1994)。AD被認為涉及破壞神經元和突觸連接的機制。此紊亂的神經病理學包括含有Ae1-42聚集的老年斑的形成(Selkoe，Neuron,1991，6:487-498;Yankner等，NewEng丄Med"簡，325:1849-1857;Price等，Neurobiol.Aging，1992，13,623-625;Younkin，Ann.Neurol.，1995，37:287-288)。在AD病人灰質中發(fā)現(xiàn)的老年斑與反應性小神經膠質細胞接觸并且與神經元損傷有關(Terry等，"StructuralBasisoftheCognitiveAlterationsinAlzheimerDisease",ALZHEIMER'SDISEASE,NY,RavenPress,1994,Ch.11,179-196;Terry，R.D.等(eds.),ALZHEIMER'SDISEASE,RavenP固，NewYork，1994;Perlmutter等，J.Neurosci.Res,1992,33:549-558)。體外試驗的與AP斑相互作用的小神經膠質細胞的斑組分被發(fā)現(xiàn)刺激小神經膠質細胞釋放有效的神經毒素，由此將反應性小神經膠細胞增生與AD神經元病理聯(lián)系起來(Giulian等,Neurochem.Int.，1995,27:119-137)?，F(xiàn)在一系列證據(jù)支持了小神經膠質細胞-衍生的神經毒素導致AD病理的原理。首先，小神經膠質細胞-衍生的毒素可以提取自滿載斑的AD腦區(qū)域而非提取自同齡對照的相同的腦區(qū)域或ALS腦組織(Giulian等，(1995)Neurochem.Int.,27:119-137;Giulian等(1996)J.Neurosci.,16:6021-6037)。第二，毒素活性的區(qū)域性分布表明在AD皮層組織和海馬中顯示出小神經膠質細胞-衍生的神經元毒素的最大濃度(相對于對照或ALS)，所述AD皮層組織和海馬為含有大量的反應性小膠質細胞的區(qū)域。相反，來自正常或ALS病人的小腦，白質和皮層組織，其具有很少的，如果有的話，反應性小神經膠質簇，顯示出很少的神經毒素活性。此外，各腦區(qū)域中的相對數(shù)量的反應性小神經膠質簇顯著地與從其區(qū)域提取的神經毒素活性的水平相關聯(lián)(p0.005)。第三，分離的斑片段或合成的AP1-40或APl-42肽被發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中激活人小神經膠質細胞釋放神經毒素(Giulian等(1995)Neurochem.Int.,27:119-137;Giulian等(1996)J.Neurosci.，16:6021-6037)。然而，當斑或肽直接置于神經元頂上或當小神經膠質細胞暴露于缺少由AD，ALS或正常的老年對照腦分離的斑的級分時，沒有檢測到神經毒的作用(Giulian等，(1995)Neurochem.Int.27:119-137;Giulian等(1996)J.Neurosci.l6:6021-6037)。由此，分離的斑對神經元的毒素作用是間接的并且由斑刺激的小神經膠質細胞釋放的神經毒活性介導。第四，在來自AD病人的CSF中發(fā)現(xiàn)神經毒活性，但是在來自疾病對照的樣品中沒有檢測到(Giulian的U.S專利6,043,283;Giulian等(1999)Am丄Hum.Genet.，65:13-18)。第五，將AP偶聯(lián)的微球體輸注到海馬中在大鼠中的輸注位點產生了炎性應答(Giulian的U.S.專利No.6,043，283)。這些數(shù)據(jù)共同表明了斑剌激的小神經膠質細胞通過與AP肽接觸在AD腦的離散區(qū)域產生了殺神經元因子(Giulian等(1995)Neurochem.Int.,27:119-137)。盡管大多數(shù)患AD的病人將經歷輕度認知損傷(MCI)的過渡期，它們常常在疾病的早期不訪問醫(yī)生。研究小組一致認為具有MCI的受試者處于發(fā)展為AD的危險中(Grundman等(1996)Neurology46:403;Flicker等(1991)Neurology41:1006-1009;Masur等(1994)Neurology44:1427-1432;Tiemey等(1996)Neurology46:149-154)。記憶損傷通常是MCI最重要的特征但是可能包括其它的模式，包括主要是語言或視覺表現(xiàn)的缺陷(Hughes等(1982)Br丄Psychiatry，140:566-572;Berg(1988)Psychopharnzacol,Bull"24:637-639;Morris(1993)Neurology,43:2412-2414;Rubin等(1989)Arcll.Neuro1.,46:379-382;Gnmdman等(1996)Neurology，46:403;Flicker等(1991)Neurology,41:1006-1009;Masur等(1994)Neurology,44:1427-1432;Tierney等(1996)Neurology,46:149-154)。已經利用臨床的癡呆大鼠(CDR)等級進行鑒定輕度認知損傷的嘗試，其癡呆嚴重性的等級為不存在，輕度，中度，或嚴重。Rubin等((1989)Arch.Neurol.,46:379-382)認為大多數(shù)情況下中具有0.5CDR的個體可能具有"非常輕度的"AD[CDR0.5分級的特征是穩(wěn)定的健忘，被認為輕度的，其在其它的功能諸如方向，社會事務，家以及嗜好，判斷以及私人管理中具有很少的損傷]。其它的方法也已被用于鑒定MCI受試者。例如，延遲回憶已被證明是在未精神錯亂的老年受試者中發(fā)展的最佳指示，隨后癡呆的最佳指示，以及自然老化和輕度AD的之間最好的鑒別因素(Flicker等(1991)Neurology，41:1006-1009;Masur等(1994)Neurology,44:1427-1432;Tierney等(1996)NeuroIogy,46:149-154)。具有MCI的受試者發(fā)展成臨床診斷的AD所需的時間已經由阿爾茨海默氏病合作研究所(ADCS)推測大約30%的為2年并且45%的為3年。HIV-1感染和神經-AIDS對腦和脊髓產生毀壞作用。盡管HIV-1感染過程中對于損傷認知的解剖學基礎仍然是模糊的，在癡呆的嚴重疾病的新皮層中分散的大神經元減少了高達40%(Masliah等(1992)J.NeuropathExpNeuro1.，51:585-593)以及顯著的早期突觸損失(Asare等(1996)AmJPath148:31-38;Everall等(1993)J.Neuropath.Exp.Neurol.52:561-566)。HIV-1相關的癡呆(HAD)具有認知功能障礙，運動機能下降以及行為變化的特征。當CD4細胞數(shù)相對低時，其主要地發(fā)生在HIV感染的較嚴重階段。雖然功能障礙的發(fā)展是變化的，其被認為是具有致死后果的嚴重并發(fā)癥。由于HIV引起的認知損失的診斷是通過排除法進行的--不存在認可的標記來監(jiān)控HIV-對CNS的特異性損傷。沒有這種標記，則直至出現(xiàn)顯著的功能損失之前就沒有評價病人的臨床指標，并且有很少的機會開發(fā)新的治療策略來預防HIV腦損傷。因此，人們非常希望在早期的癥狀前階段確診病人。在HAART(在這里定義為利用3或更多種抗-逆轉錄病毒藥物的聯(lián)合治療)之前，60%的AIDS患者發(fā)展為癡呆。該發(fā)病率看來像是下降了約10到15%，但是認知功能障礙對于超過一半的HIV/AIDS人群而言仍然是個難題(Giulian等(1990)Science,250:1593-1596;Giulian等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci"90:2769-2773;Giulian(1995)在NEUROGLIA(HKettenmann,BRansomEds)OxfordUniversityPress,pp.671-684;Giulian等(1998)在INFLAMMATORYMECHANISMSOFNEURODEGENERAT薩ANDITSMANAGEMENT(P.Wood，ed.);HumanaPress,Vol4，pp.l09-128)。HIV-1腦病理涉及新皮層中擴散突觸的損傷，皮層神經元以及感染的、反應性單核吞噬細胞，包括侵入性血液單核細胞、小神經膠質細胞、和多核巨細胞的群體的損失。這些巨細胞為HIV-感染的包被逆轉錄包膜蛋白gpl20單核吞噬細胞的融合；巨細胞的存在與HIV-1感染期間的認知損傷相關。目前，大部分的研究小組認為通過感染單核吞噬細胞釋放的毒素是HIV-1(+)群體中認知損失的主要原因(Vitokovic等(1998)MedicalSciences,321:1015-1021;Morgello等(2001)Neuropath.App.Neurobio1.，27:326-335;Lawrence等.(2002)MicrobesandInfection,4:301-308;Masliah等(1992)J.Neuropath.Exp.Neuro1.,51:585-593;Maslliah等(1995)J.Neuropath.andExp.Neurol"54:350-357;Asare等(1996)Ant丄Path.，14831-38;Everall等(1993)J.Neuropath.Exp.Neuro1.,52:561-566)。一系列的證據(jù)現(xiàn)在支持單核吞噬細胞-衍生的神經毒素導致HIV-1感染過程中腦內神經元的損傷的理論。首先，HIV-1既不感染神經元又沒有對神經元顯示出直接的毒性作用(Giulian等(1996)J.Neurosci.，16:3139-3153,Giulian等(1990)Science250:1593-1596;Levine等(1976)Bioclaim.Biophys.Acta，452:458-467)。第二，當體外感染HIV-1時，HIV-1單核吞噬細胞(THP-1，U937，人血液單核細胞，和人腦小神經膠質細胞)釋放神經毒素；相反，淋巴細胞(H9,人血液淋巴細胞)沒有(Giulian等(1996)J.Neurosci.，16:3139-3153;Giulian等(1990)Science,250:1593-1596)。第三，分離自感染供體的人單核吞噬細胞(血液單核細胞和小神經膠質細胞)釋放與體外實驗中回收的相同的神經毒素；同樣，分離的感染的淋巴細胞沒有(Giulian等(1996)J.Neurosci.，16:3139-3153)。第四，可以由感染個體的腦組織中恢復神經毒活性(Giulian等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.,90:2769-2773;Giulian(1995)在NEUROGLIA(HKettenmann,BRansom,Eds，)OxfordUniversityPress，pp.671-684;Giulian等(1998)在INFLAMMATORYMECHANISMSOFNEURODEGENERATIONANDITSMANAGEMENT(P.Wood，ed.);H畫naPress,Vol4，pp.l09-128)。第五，病毒包膜糖蛋白gpl20，可以刺激由人血液單核細胞和小神經膠質細胞釋放神經毒素；其它包括tat的病毒蛋白不能(Levine等(1976)Biochem.Biophys.Acta,452:458-467)。第六，在HIV-l(+)個體的腦脊髓液中發(fā)現(xiàn)高濃度的神經毒素。以及第七，可以由HIV-1感染細胞和HIVCSF中分離神經毒的乙酰肝素低聚糖家族。盡管反應性單核吞噬細胞釋放大量的生物-活性物質，但這些化合物中很少實際上能以神經退行性疾病中發(fā)現(xiàn)的濃度損害神經元(Hardy等(2002)Science,297:353;Mourdian等，(1989)Neurosci丄ett.,105:233;Milstein等(1994)J.Neurochemistry,63,1178;Giulian等(1990)Science,250:1593)。此外，很少的候選神經元毒素都存在于AD和HAD兩者中。例如，增加組織濃度的AP1-42的"毒性"形式為AD的特征(Hardy等(2002)Science，297:353)，但是在HAD不存在。類似地，在HAD受試者的腦脊髓液(CSF)中具有增加的喹啉酸水平(Mourdian等(1989)Neurosci丄ett.,105:233)，但是在AD中不是(Milstein,等(1994)J.Neurochemistry,63:1178)。相反，AD和HAD兩者腦組織都含有異源組具有有效神經毒作用的小的穩(wěn)定分子(Giulian等(1990)Science,250:1593:Giulian等(1995)Neurochem.Int"27:119;Giulian等(1996)J.Neurosciencel6:6021)。通過暴露于淀粉樣斑、合成的e-淀粉樣肽，HIV-1，或gpl20激活的培養(yǎng)的單核吞噬細胞，產生這些相同的神經毒素(Giulian,等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,902769;Giulian等(1998)J.Biol.Chem.，273:29719)。這種觀察結果表明在AD和HAD兩者中共同的，盡管未經確認的途徑介導免疫-驅動的神經元病理。由于神經系統(tǒng)疾病的臨床表現(xiàn)僅在神經元損失和突觸損傷的顯著程度超過充分適應功能的臨界極限之后才出現(xiàn)，疾病病理的早期癥狀前檢測提供了減緩疾病發(fā)展的機會。本發(fā)明提供了診斷神經系統(tǒng)疾病和損失認知危險包括，例如，阿爾茨海默病，HIV-1相關的癡呆(HAD)，神經-AIDS，克雅氏病，輕度的認知損傷(MCI)，朊病毒疾病，輕度的認知/運動功能障礙，急性中風或急性神經創(chuàng)傷的方法。本發(fā)明的方法允許神經系統(tǒng)疾病和認知損失危險的早期檢測，因此允許在疾病發(fā)展中較早地千預。也提供了通過監(jiān)控受試者的腦毒素水平監(jiān)控神經系統(tǒng)疾病的發(fā)展和治療的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了診斷受試者的神經系統(tǒng)疾病或認知損失危險的方法的各種實施方案。這些通過檢測受試者生物試樣中的腦毒素進行。在本發(fā)明的某些實施方案中，腦毒素的檢測包括將受試者的生物試樣與神經元在腦毒素的抑制劑存在和缺少兩種情況下接觸并且比較腦毒素抑制劑存在下的神經元存活率與腦毒素抑制劑缺少時神經元的存活率。缺少腦毒素時神經元存活率的減少是神經系統(tǒng)疾病或認知損失危險的指示。在本發(fā)明的某些實施方案中，通過測定生物試樣在存在和缺少腦毒素抑制劑兩種情況下的吸光度來檢測腦毒素，缺少腦毒素抑制劑時吸光度的增加是神經系統(tǒng)疾病或認知損失危險的指示。優(yōu)選地，在232納米(nm)波長處測定吸光度。在本發(fā)明的某些實施方案中，腦毒素為具有至少一個有N-硫酸鹽化和06-硫酸鹽化的葡糖胺的低聚糖；缺少肽鍵；并且具有小于約2000道爾頓的分子量。優(yōu)選地，腦毒素具有4到8個糖單位。優(yōu)選地，腦毒素的分子量在約700和1900道爾頓之間。在某些實施方案中，腦毒素抑制劑為肝素裂解酶I，亞硝酸，葡糖胺-6-硫酸酯酶，或N-磺酰胺酶。優(yōu)選地，亞硝酸溶液具有約1.5的pH。在本發(fā)明的某些實施方案中，生物試樣為腦脊髓液，脊髓組織或腦組織?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法診斷或監(jiān)控的神經系統(tǒng)疾病包括神經退行性和神經-炎性疾病和紊亂諸如，但不限于，阿爾茨海默氏病，克雅氏病，人類免疫缺陷性病毒-l(HIV-l)-相關的癡呆(HAD)，輕度的認知損傷(MCI)，朊病毒疾病，輕度的認知/運動功能障礙，急性中風，急性神經創(chuàng)傷，和神經-AIDS。在各種實施方案中，本發(fā)明的方法可以用于診斷或監(jiān)控人，靈長類動物，牛，馬，犬，貓，豬，或嚙齒類受試者。在本發(fā)明的某些實施方案中，神經元存活率的比較包括比較腦毒素抑制劑存在下腦毒素的ED5Qs與缺少腦毒素抑制劑時腦毒素的ED5Qs，其中缺少腦毒素抑制劑時腦毒素相對于腦毒素抑制劑存在下時腦毒素的ED5Qs較低則是神經系統(tǒng)疾病或認知損失危險的指示。在本發(fā)明進一步的實施方案中，提供了監(jiān)控治療受試者神經系統(tǒng)疾病的方法。在某些實施方案中，監(jiān)控的方法包括比較受試者第一和第二生物試樣的腦毒素水平，其中第一生物試樣取自受試者比第二生物試樣較早時間點，其中第二生物試樣取自神經系統(tǒng)紊亂治療后的受試者，以及通過生物試樣的吸光度測定腦毒素水平，第二生物試樣吸光度的增加是神經系統(tǒng)疾病發(fā)展的指示。在某些實施方案中，第一生物試樣由治療后(例如，給藥)的神經系統(tǒng)疾病受試者中獲取，移取或提取。在本發(fā)明進一步的實施方案中，提供了監(jiān)控受試者神經系統(tǒng)疾病發(fā)展的方法包括檢測所述受試者的腦毒素水平隨著的增加，其中檢測腦毒素水平增加包括測定受試者第一生物試樣中腦毒素的吸光度相對于受試者第二生物試樣中腦毒素的吸光度的增加，其中第二生物試樣在第一生物試樣之前取自受試者，增加的吸光度是神經系統(tǒng)疾病發(fā)展的指示。本發(fā)明的實施方案也提供了監(jiān)控受試者神經系統(tǒng)疾病發(fā)展的方法，包括檢測所述受試者的腦毒素水平隨著時間的增加，其中檢測增加包括將受試者的第一生物試樣與神經元接觸，將受試者的第二生物試樣與神經元接觸，以及檢測在第二生物試樣存在下降低的神經元存活率，其中第二生物試樣取自比第一生物試樣較晚的時間點；且其中第二生物試樣存在下降低的神經元存活率是神經系統(tǒng)疾病發(fā)展的指示。在本發(fā)明的某些實施方案中，生物試樣之一在所述神經系統(tǒng)疾病有前驅癥狀的過程中獲取。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了通過檢測所述受試者的腦毒素水平隨著時間的增加監(jiān)控受試者神經系統(tǒng)疾病治療的方法，其中檢測腦毒素水平的增加包括將受試者的第一生物試樣與神經元接觸，將受試者的第二生物試樣與神經元接觸，以及檢測在第二生物試樣存在下降低的神經元存活率，其中第二生物試樣取自比第一生物試樣較晚的時間點并且在神經系統(tǒng)疾病治療后；且其中降低的神經元存活率是神經系統(tǒng)疾病發(fā)展的指示。附圖的簡要說明圖1顯示了通過各種對硫酸乙酰肝素和肝素特異的方法滅活腦毒素。如圖1A所示，通過pH1.5的亞硝酸，通過肝素裂解酶I(E.C.4.2.2.7)，和通過裂解0-6且來自N-硫酸鹽化葡糖胺(GlcNS)(葡糖胺-6-硫酸酯酶(E.C.3丄6.14)和N-sulfaminidase(E.C.3.10.1.l))的硫酸酯酶滅活BV2小神經膠質細胞釋放的腦毒素。如圖1B所示，在AD腦的室性腦脊髓液中發(fā)現(xiàn)的腦毒素被通過亞硝酸pH1.5，通過肝素裂解酶I，以及通過分解0-6且來自GlcNS的硫酸酯酶所滅活。如圖1C所示，在AD受試者的腰椎脊髓液中提取的腦毒素被通過亞硝酸pH1.5，通過肝素裂解酶I，以及通過分解0-6且來自GlcNS的硫酸酯酶所滅活。圖2圖解了利用具有300到3000道爾頓的線性濾網(wǎng)的TSK-GW2500PXL測定腦毒素的分子量。市售的乙酰肝素寡聚物被用作標準。來自可能的AD的CSF樣品(100ul)顯示了約700到1，900道爾頓大小的神經毒活性的次要的峰和主要的峰。這些推測的分子量表明至少腦毒素的一些形式包括約4到8個糖殘基。圖3顯示分離自可能的AD，MCI和正常的老齡受試者的腦毒素的劑量反應曲線。在具有較大的認知損傷的受試者中發(fā)現(xiàn)增加量的毒素。圖4A顯示通過陰離子-交換HPLC由AP1-42刺激的小神經膠質BV2細胞分離腦毒素的結果(ProPAKPAl，O.O到0.7MNaCl，UV@232nm)。檢測到腦毒素的三個峰(峰38，48和53)。峰38，48和53的腦毒素是l)對肝素裂解酶I敏感，2)對亞硝酸pH1.5敏感以及，3)對海馬神經元有毒性(數(shù)據(jù)未顯示)。如在圖4B顯示的，這些相同的峰在回收于未暴露于APl-42的對照BV2細胞的條件培養(yǎng)基則不存在。圖5A圖解了回收于尸體解剖病例的腦室和腰椎的CSF中存在腦毒素。圖5B說明了回收于尸體解剖病例活體的腦室和腰椎的CSF中存在腦毒素。數(shù)據(jù)表示為引起培養(yǎng)的海馬神經元死亡所需要的CSF體積。如劑量反應曲線(圖5A)所示，小體積的高毒素濃度曲線移向左側，發(fā)現(xiàn)這些受試者具有明確的AD(通過尸體解剖鑒定)。這些數(shù)據(jù)還可以表示為ED5Qs(產生50%最大死亡所需CSF的體積)。如圖5B所示，在具有潛在AD(臨床診斷)的受試者中發(fā)現(xiàn)其具有小的ED5。s(0.1到10ul)，其后MCI組中的那些具有中度的值(IO到200lU)。重要地，各種的其它診斷組沒有顯示可檢測的腦毒素(EDs()S〉1000n1)。圖6顯示AD(A，B)和MCI(C)CSF中陰離子交換HPLC的峰38,48和53，但在正常老齡對照(D)中沒有。這些峰是肝素裂解酶敏感的(數(shù)據(jù)未顯示)。如圖6E所示，這些HPLC級分的生物測定證實相同的峰是具神經毒性的級分。圖7表明在陰離子-交換HPLC中(O到2.0MNaCl的線性梯度持續(xù)卯分鐘)，在100lU來自明確AD(圖7A)，潛在AD(圖7B)和HAD(圖7C)的CSF中發(fā)現(xiàn)3個神經毒性活性的不連續(xù)的峰。從血管癡呆(圖7A)中沒有回收到毒性活性。肝素裂解酶I和N-sulfaminidase，而不是肝素裂解酶II，消除了所有的毒素峰。圖8說明了來自各種神經系統(tǒng)紊亂的腦脊髓液(CSF)樣品的腦脊髓液CSF神經毒性指標[計算為在標準化大鼠海馬神經元培養(yǎng)物分析后產生50%的總死亡作用的CSF當量體積的值]。如圖8A所示，來自明確阿爾茨海默氏病(AD)和HIV-1感染的樣品含有腦毒素。常規(guī)腰椎脊髓選影(Myelograms)過程中獲得的腦脊髓液來自無記憶障礙的受試者。神經病是指受試者具有頭顱或周圍神經紊亂，而診斷為有精神病學的受試者沒有神經系統(tǒng)疾病的跡象。其它神經系統(tǒng)病包括真菌性腦膜炎，神經-梅毒，多發(fā)性硬化(MS)以及肌萎縮性側索硬化(ALS)。圖8B比較沒有認知損失、輕度認知運動功能障礙(MCMD)或HAD的HIV-1(+)志愿者的CSF指標記分。在MCMD和HAD之間存在顯著的差異，再一次支持了更多毒素與認知損傷的更大程度有關的模式。圖8C比較了沒有認知損失，患MCI，具有潛在AD或無AD癡呆(由外傷，血管或乙醇損傷所引起)的老齡志愿者的CSF指標記分。MCI顯示出腦毒素一致和顯著增加的水平高于癡呆的其它形式。條表示中值。圖8D比較標準間隔聽覺系列加法測驗(PASAT，信息處理的敏感性測定)的神經毒性指標值與T記分。如所顯示的，CSF神經毒性指標和這些認知測定之間存在顯著的線性關系(n二26;p<0.0001;相關系數(shù)=0.74)。圖9顯示來自老齡受試者CSF的神經毒性指標記分的對比。潛在AD和MCI顯示顯著的毒素水平，在數(shù)值分布上具有重疊。CSF神經毒素水平明顯地區(qū)分AD病理與其它普遍的老齡種類(條帶=平均值)。圖IO顯示兩個對CSF腦毒素水平藥物作用的實例。單一藥物治療6-周試驗后(藥物的相同性保持編碼)不能提供毒素的完全抑制(即，如表1所示，指標記分轉變?yōu)?gt;100的正常范圍)。相反，迄今為止，在所有目前試驗的受試者中6周DAP/HCQ提供了毒素產生的完全抑制(5/5)。參考的專利，專利申請和科學文獻在這里整體引入作為參考。任意在這里引用參考文獻和本說明書的特異性教導之間的抵觸應參考后者。同樣地，單詞或短語的技術理解定義與如本說明書中具體討論的單詞或短語的定義之間的任意抵觸應當有利于后來的解決。此處所述的術語"約"是指接近可接受范圍內的設定的值。優(yōu)選地該范圍為設定值的+/-10%。利用大多人采用的神經病理學的標準尸體解剖診斷明確的AD(TheNIA-ReaganWorkingGroup.普遍采用阿爾茨海默氏病的剖尸診斷(1997)Neurobio1.Aging,18:S1)。潛在AD的臨床定義遵循普遍的建議(McKhann等(1984)Neurology34:939)，損傷定義為智力測驗表現(xiàn)下降至少2標準偏差(SD)，學習/記憶低于平均正常的平均值[通過韋氏記憶量表-III邏輯記測驗，HopkinsVerbalLearningTest-修訂，或BriefVisualMemoryTest-修訂，和下列認知領域內的至少一個試驗低于正常平均2SD:注意力/信息處理[VerbalSustainedAttentionTest,SymbolDigitModalitiesTest,WechslerAdultIntelligenceTest-IllDigitSpan,TrailsATest,和PacedAuditorySerial-AdditionTest(PASAT)]，方向(方向詢問)，語言[名稱和種類純熟度，F(xiàn)AS試驗]，執(zhí)行功能[WisconsinCardSortTest和TrialsBTest]。MCI受試者定義為沒有癡呆但是其顯示出遺忘(癥)特征包括經提供消息者證實記憶障礙與通過相同AD試驗組測定至少在正常平均值以下1.5SD的記憶損傷。HIV-相關認知損傷的臨床定義遵循普遍的建議(WorkingGroupofAmericanAcademyofNeurologyAIDSTaskForce(1992)Neurology,41:778)受試者沒有其它病原學的跡象。測定的HIV-相關癡呆(HAD)的損傷在以下試驗方面的一個方面低于正常平均值2.5SD或在至少兩個方面低于正常平均值2SD:學習/記憶，語言，注意力/信息處理，抽象/問題解決，以及運動機能[求釘板測驗]。具有輕度認知-運動功能障礙(MCMD)的受試者定義為那些在任意試驗中至少兩個認知方面低于平均正常值1.5SD或在單一方面中低于平均值2.0SD。如在這里應用的，"認知損失"或其變化是指至少信息處理、注意力、學習、信息檢索與智力功能的全面損失中一個下降。損失認知可以通過本領域任意已知的方法進行測定，包括，例如，注意力/信息處理[VerbalSustainedAttentionTest,SymbolDigitModalitiesTest,WechslerAdultIntelligenceTest-IllDigitSpan,TrailsATest,禾口PacedAuditorySerial-AdditionTest(PASAT)]，方向(方向詢問)，語言[NamingandCategoryFluency,FASTest],執(zhí)行功能[WisconsinCardSortTestandTrialsBTest],學習/記憶，抽象/問題解決，運動機能[求釘板測驗]，和HopkinsVerbaltests。認知損失危險的受試者沒有可衡量的認知損失但是比平均群體具有更大的認知損失的機會。例如，一級相對的阿爾茨海默氏病患者處于認知損失的危險中。此處所述的術語"接觸"是指彼此在一起，直接或間接地，化合物物理鄰近于目的分子。接觸可能發(fā)生，例如，在任意數(shù)目的緩沖劑，鹽，溶液，或在細胞或細胞提取物中。術語"肽鍵"是指通過一個氨基酸的羧基與第二氨基酸的氨基之間脫去水分子形成的共價酰胺鍵。術語"糖"或"糖單位"包括氧化的，還原的或取代的糖。本發(fā)明的糖包括，但不限于，核糖，阿拉伯糖，木糖，來蘇糖，阿洛糖，阿卓糖，葡萄糖，甘露糖，果糖，古洛糖，艾杜糖，半乳糖，塔羅糖，核酮糖，山梨糖，塔格糖，葡糖酸，葡糖醛酸，glucaricacididuronicacid鼠李糖，巖藻糖，N-乙酰葡萄糖胺，N-乙酰半乳糖胺，N-乙酰基神經氨酸，唾液酸，N-硫酸鹽化葡糖胺(GIcNS)，2-硫酸鹽化艾杜糖醛酸(IdoA2S)，糖的衍生物諸如乙縮醛，胺和磷酸化糖，寡聚糖，以及各種的糖的開鏈形式等。"寡聚糖"是指具有另個或多個糖單位的分子。術語"純化的"，當用于描述本發(fā)明神經毒素的狀態(tài)時，是指神經毒素基本上不含其它的細胞物質。"基本上不含"是指至少約60%或約70%,更優(yōu)選地至少約80%或約90%,以及最優(yōu)選地至少約95%,約98%,或約100%不含其它的細胞物質。神經退行性或神經-炎性疾病的病理的前驅階段在這里定義為其認知、行為或社交障礙的臨床表現(xiàn)還沒有達到MCI(記憶試驗的遺忘特征低于正常平均數(shù)1.5SD)或AD(記憶與至少一個其它的認知領域低于正常平均值2SD)的診斷的疾病階段。按照此定義，前驅階段將包括，例如，臨床定義的認知損傷，沒有癡呆(CIND)群體(Toukko等(2001)IntPsychogeriatr.，Supp.1:183-202)，Hom描述的處于無癥狀危險中的群體((1994)J.Cliti.Exp.NeuroL，16:568-576)，年齡-相關的記憶損傷(AAMI，Goldman等(2001)Alz.Dis.Assoc.Dis.，15:72-79)，F(xiàn)armington研究的亞臨床群體(Elias等(2000)Arch.Neurol.57:808-813)或尸體解剖鑒定確定的臨床前的AD群體(Price等(2001)Arch.Neurol.，58:1395-1402)。通常，所有的這些組顯示記憶測試值(語言，階段性記憶)低于根據(jù)年齡、教育和種族調整的正常平均記分大約1SD?？偟恼f來，處于AD危險中的群體由校正的記憶測試記分測驗顯示出以每年約0.3到0.6SD的速度縱向下降。與通過本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的神經退行性疾病有關的信號級聯(lián)反應包括作用(l)單核吞噬細胞激活；(2)腦毒素的單核吞噬細胞釋放；以及(3)腦毒素對神經元的毒性作用。通過單核吞噬細胞活化劑誘導的單核吞噬細胞的神經毒性可通過在這里描述的藥物如神經毒素抑制劑或滅活劑抑制或滅活。單核吞噬細胞是具有單核和吞噬粒子能力也稱為吞噬作用的免疫細胞。單核吞噬細胞被發(fā)現(xiàn)存在于血液和軀體組織中，包括中樞神經系統(tǒng)和腦，并且包括，例如，小神經膠質細胞，單核細胞，巨噬細胞，組織細胞，樹突細胞，小神經膠質細胞的前體細胞，單核細胞的前體細胞，巨噬細胞的前體細胞，小神經膠質細胞樣細胞系，巨噬細胞樣細胞系，或被修飾表達小神經膠質細胞樣表面分子的細胞系，也即具有上述定義的單核吞噬細胞的活性。本發(fā)明定義的神經元包括神經元和類神經元細胞，其是被修飾來表達N-甲基-D-天冬氨酸受體的細胞，其中神經元于典型正常的，非-患病狀態(tài)條件下顯示出神經元活性。單核吞噬細胞激活啟動引起神經毒素釋放的程序。單核吞噬細胞激活在這里也相當于免疫激活，其標記是致使單核吞噬細胞更加有活力和具有活性特征的任意程序，并且更在于諸如但不限于增加運動，吞噬作用，形態(tài)改變，和生物合成，表達，產生，或分子的分泌，諸如蛋白，與膜相關聯(lián)包括補體、清除劑、AP和血細胞抗原、組織相容性抗原。分子的產生包括參與生物活性因子的生物合成的酶，諸如一氧化氮合成酶，過氧化物歧化酶，小分子諸如類二十烷酸，細胞因子，自由基和一氧化氮。釋放的因子包括蛋白酶，阿樸脂蛋白諸如阿樸脂蛋白E，和細胞因子諸如白介素-1，腫瘤壞死因子以及其它的分子諸如腦毒素和過氧化氫。單核吞噬細胞神經毒性或神經元毒性是指導致神經元的損傷、破壞或死亡的過程，其通過生物化學的或組織學方法測定代謝功能損失，胞內物質釋放，不穩(wěn)定染料的滲透，細胞數(shù)的減少來進行。例如，生物化學標記的改變諸如神經絲或突觸小泡蛋白的損失或乳酸脫氫酶釋放，或其它細胞損傷的證據(jù)諸如不穩(wěn)定染料包括熒光核染料和臺盼藍的滲透。這些及其它的鑒定細胞損傷、破壞或死亡，或測定神經元功能的策略，是本領域技術人員公知的并且也是本發(fā)明關注的。神經毒素在這里定義為一種損傷、損傷或死亡神經元的物質，而不傷害其它中樞神經系統(tǒng)細胞諸如神經膠質細胞的物質。神經毒素按照此種方式與神經元相互作用來破壞神經元的功能和存活。神經毒素對神經元可能的作用，在這里稱為神經元損傷，包括抑制或破壞正常細胞的代謝，包括葡萄糖代謝,ATP的產生以及維持離子梯度穿過細胞膜包括Na+、Ca2+和K+離子通道，蛋白和核酸的合成，和線粒體呼吸，和細胞死亡。在這里應用的腦毒素是指一類具有低分子量(<2000道爾頓)，熱穩(wěn)定性，蛋白酶抗性，以及暴露于亞硝酸，N-磺酰胺酶，葡糖胺-6-硫酸酯酶以及肝素裂解酶I后活性喪失的神經毒素。腦毒素包括至少一個GlcNS殘基。腦毒素優(yōu)選地具有約700至1,900道爾頓之間的分子量。腦毒素優(yōu)選地具有4到8個糖殘基。腦毒素滅活劑或抑制劑為滅活神經毒素或抑制神經毒素作用的藥物，所述神經毒素由激活的單核吞噬細胞中釋放。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，使抑制、抑制、使滅活、滅活及其變化與減少、抑制、延遲、減緩和中止同義使用。滅活或抑制也指神經毒素級聯(lián)反應的完全抑制因此級聯(lián)反應被制止，終止或阻斷。腦毒素滅活包括神經毒性減少約10%，20%，50%，更優(yōu)選地約80%,90%或95%,且最優(yōu)選地約98%，99%或100%。舉例來說，如果化合物減少腦毒素的神經毒性或增加神經元的存活率，那么該化合物就是是腦毒素滅活劑，因此暴露于腦毒素后處于損傷危險中的神經元在腦毒素和化合物存在下沒有損傷。優(yōu)選地，超過約10%，20%或50%的處于危險中的神經元在腦毒素滅活劑存在下沒有被腦毒素損傷。更優(yōu)選地，約80%，90%或95%，且最優(yōu)選地，約98%，99%或100%的處于危險的中神經元在腦毒素滅活劑存在下沒有被腦毒素損傷。本發(fā)明優(yōu)選的腦毒素滅活劑包括肝素裂解酶I，N-sulfaminidase，葡糖胺-6-硫酸酯酶以及亞硝酸。亞硝酸優(yōu)選地具有約1.5的pH。更優(yōu)選地，在室溫下暴露于亞硝酸。單核吞噬細胞和活化劑的有效量是除了添加腦毒素滅活劑各自通常在級聯(lián)反應中產生作用的量。有效量是技術人員參見本發(fā)明可以知曉的并且可以依據(jù)單核吞噬細胞，神經元，活化劑或組分以及細胞的哺乳動物來源進行變化。本發(fā)明的體外神經毒性分析檢測腦毒素的存在及其滅活以及利用已經修飾表達N-甲基-D-天冬氨酸受體的神經元或類神經元細胞系的培養(yǎng)物。神經毒活性的存在，或神經元功能的測定或神經元存活率的測定，可通過檢測細胞數(shù)目的減少，生物化學標記的變化諸如細胞代謝功能的喪失，胞內物質的釋放，不穩(wěn)定染料諸如且不限于熒光核染料以及臺盼藍的滲透，神經絲或突觸小泡蛋白的喪失，乳酸脫氫酶釋放，或其它細胞損傷的證據(jù)來測定。測定神經元功能的其它方法包括檢測正常細胞代謝的抑制包括破壞葡萄糖代謝，ATP產生，跨膜離子梯度維持，以及蛋白質合成，核酸合成，以及線粒體呼吸。試驗生物試樣的神經元炎性標記或損傷的減少可以與對照相比較。這些及其它的鑒定細胞神經毒性或測定神經元功能的策略，其可以顯示為細胞損傷，是本領域技術人員公知的并且是本發(fā)明所關注的。利用本發(fā)明的分析系統(tǒng)，在早期，例如，神經系統(tǒng)疾病的癥狀前或前驅階段診斷受試者成為可能。進一步可以利用本發(fā)明的方法，通過檢測受試者生物試樣中的腦毒素來鑒定受試者或處于危險中的群體的認知損失。本發(fā)明的方法也允許通過檢測受試者腦毒素水平隨著時間的增加來監(jiān)控神經系統(tǒng)疾病的發(fā)展。按照本發(fā)明診斷的病人或受試者包括且不限于哺乳動物諸如人，靈長目動物諸如且不限于猴子，黑猩猩，以及猿，嚙齒類，諸如且不限于大鼠和小鼠，豚鼠，狗，貓，兔以及豬。本發(fā)明方法中的生物試樣包括中樞神經系統(tǒng)組織，諸如腦或脊髓組織，或腦脊髓液(CSF)。根據(jù)本發(fā)明鑒定或監(jiān)控的神經系統(tǒng)疾病諸如，但不限于，阿爾茨海默氏病，克雅氏病，HIV-1-相關的癡呆(HAD)，輕度的認知損傷(MCI)，朊病毒疾病，輕度的認知/運動功能障礙，急性中風，急性神經創(chuàng)傷，和神經-AIDS，以及免疫-介導的腦炎。本發(fā)明的方法包括患者生物試樣的神經毒素分析，其可用于診斷受試者的神經系統(tǒng)疾病或紊亂或認知損失危險。本發(fā)明的方法也可用作早期檢測方法，參考到他們的年齡，家族史，早期癥狀或其它的危險因素來鑒定具有神經病或紊亂發(fā)展危險的個體。例如，生物試樣，諸如血液，脊髓組織，腦脊髓液，或腦組織，可取自患者并且用本發(fā)明的腦毒素滅活劑評價，如在這里描述的，來鑒定患者中腦毒素的存在或來鑒定可能患神經系統(tǒng)疾病的患者?；颊叩臉悠房梢耘c對照比較來確定是否存在增加的神經毒素水平。類似地，本發(fā)明方法利用本發(fā)明的神經毒素滅活劑通過在治療之前和整個治療過程中測定患者系統(tǒng)中存在的神經毒素量，來監(jiān)控患者的治療或疾病發(fā)展的速率。本方法也可用于監(jiān)控神經毒素水平從而調整藥物劑量。例如，本發(fā)明提供了分析患者體內腦毒素的存在和水平的方法，通過將患者的生物試樣與腦毒素滅活劑諸如肝素裂解酶I,N-sulfaminidase,葡糖胺-6-硫酸酯酶或亞硝酸接觸。其后，在滅活劑存在下的抑制量與測定的對照進行比較。當腦毒素水平與對照相比增加時，受試者體內腦毒素的增加。本發(fā)明提供了神經退行性疾病或認知損失危險的早期檢測的策略，因此從而可以進行疾病發(fā)展的早期干預。下面的實施例僅僅是示例性的并且并不是用來限制本發(fā)明的范圍。實施例腦毒素的純化通過HPLC篩分色譜法(TSK-GELG2500PWXL柱；7.8X300mm，來自TosohBioscience;Montgomeryville,PA)用2MNaCI洗脫；通過陰離子交換HPLC(串聯(lián)ProPacPAl柱4X250mm，來自Dionex公司；Sunnyvale,CA)用2MNaCI的線性梯度180分鐘；或通過吸附色譜法(OasisCartridges,Waters)使用生產商規(guī)定的流程，由腦脊髓液分離腦毒素。腦毒素的結構鑒定和滅活通過各種亞硝酸裂解流程進行腦毒素(通過有機萃取，凝膠過濾和連續(xù)的C18HPLC由-刺激的小神經膠質細胞系BV2分離的)的結構鑒定和滅活。通過pH1.5亞硝酸處理而不是通過其它pH4.0的酸處理或利用肼解作用來消除神經毒活性(圖1)。結果表明腦毒素的內部結構含有至少一個GlcNS殘基。通過用高度選擇性的酶處理進一步檢驗腦毒素的化學結構，髙度選擇性的酶其攻擊肝素或硫酸乙酰肝素(HS)聚合物。傳統(tǒng)上，肝素裂解酶I主要作用于含GlcNS(l—4)IdoA2S序列的肝素且肝素裂解酶III主要作用于HS上的GlcNAc(1—4)IdoA或GlcNAc(1—4)GIcA。(通常，這些酶需要至少4個殘基的寡聚物。)最后，用對在2,3或6位置(在HS和肝素中發(fā)現(xiàn)的)的Osulfation位點高度選擇性的硫酸酯酶以及裂解N-硫酸鹽化位點的N-磺酰胺酶處理腦毒素(圖1)。肝素裂解酶IGlcNS(1—4)IdoA2S]，而不是肝素裂解酶III，滅活的腦毒素如用硫酸酯酶進行的除去來自0-6S和GlcNS的基團。另外，化學方法修飾末端胺(乙?；琍FPA修飾，等等)表明末端胺的存在，諸如未被取代的GlcN殘基。因此，腦毒素含有至少4個具有GlcNS，IdoA2S，GlcN殘基加上在位置6處的O-連接的硫酸鹽化的殘基的肝素類寡聚糖。利用具有300到3000道爾頓的線性篩的TSK-GW2500PXL測定腦毒素的分子量。市售的乙酰肝素寡聚物被用作標準。來自可能的AD的CSF樣品(lOOul)顯示出具有約700到1,900道爾頓大小的低分子量的神經毒活性的次要峰和主要峰。這些推測的分子量表明寡聚糖約4到8個殘基的長度(圖2)。神經毒素生物測定由大鼠海馬制備的培養(yǎng)物神經元用于毒性研究。這些培養(yǎng)物包括星形神經膠質(〉70%)與小神經膠質細胞5-10%)混合薄層頂上的經處理的神經元(總細胞群體的10-20%)。為了除去小神經膠質細胞，培養(yǎng)物暴露于與10ug/毫升乙?；疞DL耦合的皂草素18小時。在72小時終點，培養(yǎng)物室溫下固定在3%仲甲醛中12小時并且與抗-神經絲抗體(SMI-311,1:150;RT-97，1:150;SternbergerMonoclonals,Inc)加上抗-MAP-2(l:200;BoehringerMannheim，184959;)的混合物4'C在2%馬血清和0.3%TritonX-100存在下隔夜培養(yǎng)進行免疫染色來描繪神經元細胞體和軸突。每一區(qū)域免疫-標記的細胞利用熒光顯微術在200x放大率下記分。神經元死亡率表示為平均存活百分比，用三個蓋玻片的每個蓋玻片的至少8個隨機選定區(qū)域的記分后的平行未處理對照培養(yǎng)物來表示。通過吸附色譜法分餾1毫升的CSF，真空干燥，以及在含有電解質諸如NaCl和葡萄糖的人工腦脊髓液中重組。分餾毒素的增加量(O.l到500ul與原始試樣當量的體積)被添加到一式三份的培養(yǎng)物中。結果繪制為體積對神經元死亡的百分比(死亡計算為免疫-染色的海馬神經元與未處理對照培養(yǎng)物相比損失的百分比)。例如，通過肝素裂解酶I,N-sulfaminidase，葡糖胺-6硫酸酯酶，或亞硝酸處理進行滅活，用于證實每個CSF試樣試驗中腦毒素的存在。如圖3所示，對于AD而言毒素為高水平(曲線左移)，MCI的中間水平(曲線右移)，并且無毒素(平的線)分布圖為取自疾病對照的樣品。為了比較不同的群體，CSF神經毒性指標被改進來進行反映神經毒素水平的記分。這些指標被計算為EDsoS(產生50%的神經元死亡最大水平的當量CSF體積)。利用這些測定，高神經毒素水平具有低的指標記分；例如，高毒素濃度具有約1的低指標記分，中間水平在大約在大約5到100，并且正常的老齡顯示1000的值。腦毒素的化學分析建立檢測腦毒素的陰離子-交換HPLC的條件(0.0-0.7mNaCI梯度；ProPAKPA-l柱；232nmUV監(jiān)控)。小神經膠質細胞系BV2暴露于人AP1-4248小時并且通過吸附色譜法分級分離條件培養(yǎng)基?；厥諏谕ㄟ^232nm檢測的三個峰的三個生物學-活性的峰(峰38,48，和53)(圖4A)。所有的3個峰對1.5亞硝酸pH和肝素裂解酶I敏感(數(shù)據(jù)未顯示)。重要地，這些峰不能從未刺激的BV2細胞的對照培養(yǎng)物中回收(圖4B)。腦毒素作為神經退行性疾病的CSF生物標志物利用來自迅速尸體解剖病例的腦室CSF，腦毒素被確定高濃度地存在于所有來自AD病例的CSFs中(通過病理證實)，但在年齡相當?shù)恼；駻LS病例不存在(圖5)。重要地，取自具有可能的AD臨床診斷的受試者的腰椎CSF也顯示出驚人的模式，具有非常高的如0.1到5u1ED5Qs的腦毒素測定濃度。建立研究方案來評價樣品，不僅評價來自具有認知損傷的老齡受試者，而且評價來自我們臨床神經病學家看到的其它的組。后一群體包括各種診斷的種類，最大的組患頭痛，多發(fā)性硬化或非-AD癡呆(血管，神經創(chuàng)傷)。[受試者同意利用獲自用于其它臨床指示分析的剩余CSF等分試樣對后一群體的神經毒素進行分析。]因此遠非受試者獲得的數(shù)據(jù)表明所有具有潛在AD的病人具有高水平的神經毒素，CSF當量體積的ED5()s為0.5到1.5iU(注意低ED5()s體積表明較高的毒素濃度)；老齡MCI受試者具有位于50和200lU之間的ED5。s。對于分類的非參量性Kruskal-Wallis單向方差分析顯示神經毒素水平在試驗的疾病組(潛在的AD，MCI，非-AD癡呆，頭痛，以及MS;p-0.000001)中顯著地不同(通過ED50s測定)。Kruskal-Wallis多重-比較檢驗法表明AD和MCI二者的神經毒素水平顯著地大于在MS，頭痛或非-AD癡呆中發(fā)現(xiàn)的水平(所有的比較p<0.02)?？偟恼f來，這些觀察揭示了一些重要的趨勢。首先，具有潛在AD的受試者具有最高的毒素濃度，落在一個窄的范圍內，類似于來自AD尸體解剖病例的腦室CSF。第二，具有次于非炎性機制的嚴重的損傷或癡呆(血管的，神經創(chuàng)傷后)在CSF中沒有顯示出可檢測量的腦毒素。[雖然神經毒素可以在中風或神經創(chuàng)傷后的急性損傷組織中發(fā)現(xiàn)，但如同急性炎性應答消散一樣這些神經毒素水平消散(損傷后3到7天；Giulian等(1990)Ann.Neurol.，27:33-42;Giulian等(1993)Stroke,24:84-93;Giulian(1993)Glia,7:102-110)]。以及第三，好象趨勢是MCI受試者顯示顯著量的腦毒素，但是僅僅是ADCSFs中發(fā)現(xiàn)的總毒素活性的1/10到1/100(圖5)。為了測定是否與腦毒素有關的寡聚糖也存在于人CSF中，通過吸附色譜法類似從小神經膠質細胞培養(yǎng)基，由CSF分離腦毒素并且用相同的肝素裂解酶，亞硝酸處理，以及硫酸酯酶進行處理。來自AD病例的腦室CSF以及來自潛在AD受試者的腰椎CSF顯示相同的滅活分布圖(圖l)，表明患病人體內的腦毒素含有類肝素寡聚物。這種神經毒性寡聚糖的存在的證實來自陰離子交換HPLC，表明由小神經膠質腦毒素級分中回收的神經毒性峰38的存在。AD和MCI的CSF樣品之間通過陰離子交換分布(峰38和48)發(fā)現(xiàn)具有相似性，如在小神經膠質培養(yǎng)物(圖4)中標注在MCI組中具有附加峰53(圖6)。明確AD病例的腦室腦脊髓液的HPLC-分布圖幾乎與潛在AD志愿者(圖7B)和來自HAD志愿者的腰椎液體(圖7C)相同。通過肝素裂解酶I和通過N-sulfamindase進行的酶處理除去了所有這些神經毒性的峰。通過陰離子交換HPLC回收的神經元-死亡活性對肝素裂解酶II(圖7B)，蛋白酶，或肝素裂解酶III處理(數(shù)據(jù)未顯示)不敏感。為了研究神經系統(tǒng)紊亂中產生神經毒素的流行性，檢驗各種疾病群體的受試者的腦脊髓液。神經毒素濃度，表示為CSF神經毒性指標記分[表示為在標準大鼠海馬培養(yǎng)物分析中產生50%總神經元死亡作用的CSF的當量體積]，表明僅僅具有明確AD(剖尸診斷；11=7)或HIV-1感染(n二52)的受試者具有可檢測水平的CSF神經毒素(圖8A)?？梢鹇苑磻悦庖邞?，諸如多發(fā)性硬化(MS;n==20)，肌萎縮性側索硬化(ALS;n=8)，或神經病(n-14)的神經病學紊亂，沒有CSF神經毒素。類似地，患精神病(n^5)，頭痛(11=6)，或各種其它神經疾病(n-21;包括真菌性腦膜炎和神經梅毒)的受試者沒有可檢測的神經毒素。且最后，從進行常規(guī)脊髓造影(n-20)的志愿者中獲得的CSF樣品不含有神經毒素活性。明確AD病例的神經毒性指標值介于1和10之間，而HIV(+)群體中具有廣泛的分布(0.1到1000)。為了研究HIV-l(+)群體的神經毒素水平的更廣泛分布，通過國家神經-AIDS組織聯(lián)合會獲得來自HIV-l(+)志愿者的7個編號的腰椎CSF樣品，該志愿者經歷了廣泛的醫(yī)學，神經學和神經心理學的評價(Morello等(2001)Neuropath.Appl.Neurobiol.,27:326-335)。在具有認知功能障礙(n二4)的受試者中檢測到神經毒素，但在正常認知的受試者(n-3Fisher'sExactTest，p二0.028)中沒有檢測妾U。在具有HAD的HIV(+)受試者中檢測到低的CSF神經毒性指標記分(從0.1到4.0);在很少或沒有認知損傷的HIV(+)受試者中檢測到高指標記分(均〉200)，且中間的指標記分(1.0到21.0)與具有輕度認知-運動紊亂的HIV(+)受試者相關(MCMD;WorkingGroupofAmericanAcademyofNeurobiologyAIDSTaskForce(1992)Neurology,41:778;圖8B)。MCMD(中值7.3;平均十/隱SE，9.0+/-2.7;n-8)和HAD(O.l中值；0.8+/-0.3;n=14)之間指標值的顯著差異顯示高置信度的水平(p-0.0001;KruskalWallis)。具有MCMD的HIV-l(+)受試者組和沒有認知損傷(中值1000.0;平均900+/-99.7Ul;n=8)之間的差異也是顯著的(p二0.001)。HIV損傷CNS的程度反映了CSF神經毒素的水平，暗示認知損傷，腦病理學階段以及神經元毒素產生之間的因果關系。為測定神經毒素水平是否也反映老齡群體認知的下降，CSF獲自具有遺忘(癥)型的輕度認知損傷的老齡志愿者(MCI;主觀記憶缺陷，沒有癡呆；Bischkopf等(2002)ActaPsychiatr.Scand.,106:403-414;n=6),損傷記憶的病癥被認為反映AD的早期(DeKosky等(2003)Science,302:830)。具有MCI的受試者與作為對照的老齡志愿者(>70歲并且無記憶障礙；11=8)的組之間的比較顯示出顯著的區(qū)別(圖8C)。MCI的神經毒性指標記分為約7到20(中值10.0;平均11.5+/-1.6;11=6)并且顯著地低于從老齡對照(所有的>1000;n=8;Kruskal-Wallis;p-0.0005)中測得的。具有潛在AD(臨床標準限定的)的志愿者的指標記分顯示0.1到10范圍的值(中值1.7，平均3.0+/-0.8;n=21)。潛在的AD和MCI值也顯著地不同的(p-0.0111;Kruskal-Wallis),進一步證明CSF腦毒素的水平和經歷認知功能障礙的腦病理學階段之間的聯(lián)系。重要地，其它沒有慢性腦炎癥形式的癡呆，諸如繼發(fā)性的神經創(chuàng)傷、酒精中毒或血管損傷，幾乎沒有產生可檢測的CSF神經毒素(中值1000;平均933.0+/-66.6;n=12)。這些觀察結果與在尸體解剖-證實明確AD(圖8A)和血管癡呆(圖8A)的病例中發(fā)現(xiàn)的CSF腦毒素值相符合。為按照CSF神經毒素濃度分組，進行三個HIV(+)受試者診斷種類和三個老齡種類的判別分析。如表1所示，CSF神經毒性指標精確地預測在那些具有MCMD(1-100)或HAD(〈1)的組中HIV(+)志愿者幾乎沒有認知損傷(取舍點〉100)。類似地，指標正確地區(qū)分具有非阿爾茨海默氏癡呆(取舍點>100)的受試者與具有MCI或AD的老年人。>100的取舍值也100%精確地預示那些老齡人沒有記憶障礙(參見圖8C)。表l.根據(jù)疾病種類，CSF神經毒性指標的取舍值<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>CSF腦毒素作為疾病病理發(fā)展的生物標記來自164個受試者的數(shù)據(jù)表明所有患AD的病人在具有相當于0.5到15u1的CSF體積的ED5。s的CSF中具有高水平的神經毒素。具有輕度認知損傷的老齡受試者具有50和200ul之間的水平。具有各種其它神經系統(tǒng)紊亂包括神經退行性疾病的受試者，沒有可檢測的毒性(ED5oS>lOOOu1);血管和神經創(chuàng)傷后非-AD癡呆也沒有毒性。HIV-l(+)受試者顯示了廣泛圍的毒素濃度(ED5oS從0.6u1到〉1000u1)。檢驗來自40個HIV-l(+)個體的CSF。毒性的水平與認知損傷的程度有關。例如，具有正常認知的HIV-l(+)受試者顯示EDs。s〉1000lU，而那些具有中度到嚴重的認知缺陷的受試者產生0.6到5ul的神經毒素水平，類似于在具有確定癡呆的AD受試者中發(fā)現(xiàn)的范圍。具有輕度的到中度認知損傷的HIV-l(+)受試者具有中等的具有10至U300ul范圍內ED5Qs的CSF神經毒素水平。測定各種診斷組中的神經毒性指標并與明確AD(n=7;利用死后獲得的腦室CSF神經病理學診斷所定義的)比較。如圖8A所示，AD及其它沒有可測毒素的診斷種類之間具有顯著的差異(1000的指標記分)，由此證明廣泛群體的神經毒性指標的值。此外，如圖9所示，當與MCI(具有遺忘(癥)特征)或潛在AD群體(利用NINCDS-ADRDA診斷標準)相比，CSF腦毒素水平在無記憶障礙或非-AD癡呆(血管的，外傷后的，神經病)的老齡人之間明顯地不同。判別分析(表IB)確定AD的神經毒性指標值取舍點<4且MCI的為4到100，提供了基于MCI或潛在AD的毒素值對比其它組的毒素值正確診斷的能力。潛在的病理過程發(fā)展了，使得受試者由癥狀前狀態(tài)轉化為輕度的損傷(具有低于標準化記憶試驗標準1.5SD的MCI)然后轉化為更高等的癡呆階段(具有低于標準記憶以及至少一個其它領域2SD的AD)。顯著記憶損失之前疾病的較早階段(MCI診斷之前的階段)包括神經元-損傷免疫級聯(lián)反應其是可通過CSF腦毒素的存在檢測。此無癥狀的階段是AD病理的前驅階段。毒素水平和疾病發(fā)展的臨床表現(xiàn)之間的相互關系已被解釋。具有CSF腦毒素的MCI和輕度的AD受試者(MMSE>20;CDR"Cl)被歸于具體的神經-認知組。進行簡單線性回歸分析比較來自系列描述主要認知領域的標準試驗的神經毒性指標值與T記分。(T記分被校正到50，用10作為SD;依據(jù)年齡性別、種族以及教育水平調整原始記分)。如表2所示，指標記分和異常記憶之間存在高度顯著的相互關系；也就是說，在具有較大記憶缺陷而其它認知領域(抽象化，語言，處理速度)沒有缺陷的受試者中沒有發(fā)現(xiàn)較高的毒素濃度。表2.認知領域執(zhí)行功能Wisconsin卡片分類TrailsBp=相關系數(shù)=NSNS記憶/學習Hopkins語言WMS-III信息處理數(shù)字符號符號檢索TrailsA0.0070.001NSNSNS0.7840.800FASNS表3比較HlV-l(+)志愿者(n-33)之間特異性認知試驗的CSF神經毒素指標值和T記分。置信度水平基于線性回歸分析并且表明注意力/信息處理和學習/記憶領域的認知缺陷與CSF腦毒素的量密切相關，而語言和運動機能不是。分析之前，神經毒性指標被對數(shù)轉化使得數(shù)據(jù)遵循近似于正態(tài)分布。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>檢驗小神經膠質細胞抑制劑對CSF腦毒素水平的作用使用腦毒素作為生物標志物監(jiān)控藥物治療和疾病發(fā)展在比較一些藥物與安慰劑用初級終點作為CSF中腦毒素水平變化的6-周雙盲隨機研究中進行檢測。盡管隱蔽了組分配，顯著的模式被鑒定，如圖IO中的典型的數(shù)據(jù)所表示的。盡管某些接受編碼藥物的受試者顯示毒素減少約10-倍，這種降低沒有將受試者轉變到在正常老齡人中發(fā)現(xiàn)的指標記分的范圍中(也就是說，指標記分維持在低于100的MCI取舍值)。這些數(shù)據(jù)表明在這些試驗使用的有效藥物都不是充分地劑量來提供完全的神經保護。顯著異常腦毒素濃度的持續(xù)使得單一藥物試驗不大可能改變AD的臨床進程。第二終點用于評價藥物治療減少培養(yǎng)的血液單核細胞中AP誘導毒性的能力。在動物研究中發(fā)現(xiàn)血液單核吞噬細胞反映腦小神經膠質對AP的應答。因此，進入掩蔽的單藥物試驗后，檢驗藥物治療之前登記的具有基線毒性的血液單核細胞培養(yǎng)物中的藥物應答。測定76個單核細胞樣品的Ae-誘導毒性，結果顯示如下l)在一些病例中單一藥物(同一性掩蔽)完全地抑制血液單核細胞的AP-激活；2〕抑制血液單核細胞的單一藥物僅僅提供CSF腦毒素水平的部分抑制；3)利用來自無藥物抑制證據(jù)的受試者的血液單核細胞進行的離體研究證明了在1/10劑量對DAP/HCQ組合的細膩敏感性。在本文件中引用或描述的各專利、專利申請以及出版物的內容整體引入作為參考。本發(fā)明除了那些在這里顯示和描述之外的各種修飾對于本領域技術人員而言由上述描述而是顯而易見。此類修飾也落在附屬權利要求的范圍之中。權利要求1.診斷受試者神經系統(tǒng)疾病或認知損失危險的方法，包括檢測所述受試者生物試樣中的腦毒素，其中所述檢測包括在腦毒素滅活劑存在和缺少兩種情況下將所述受試者的生物試樣與神經元接觸并且比較腦毒素滅活劑存在下的神經元存活率與所述腦毒素滅活劑缺少時的神經元存活率，所述腦毒素滅活劑缺少時神經元存活率的減少是所述神經系統(tǒng)疾病的指示，腦毒素是含有至少一個具有N-硫酸鹽化和O6-硫酸鹽化的葡糖胺的寡聚糖；所述腦毒素缺少肽鍵；以及所述腦毒素具有小于約2000道爾頓的分子量；腦毒素滅活劑為肝素裂解酶I，N-sulfaminidase，葡糖胺-6-硫酸酯酶，或亞硝酸溶液。2.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述神經系統(tǒng)疾病為HIV-1相關的癡呆(HAD)，神經-AIDS，克雅氏病，輕度的認知損傷，朊病毒疾病，輕度的認知/運動功能障礙，急性中風，急性神經創(chuàng)傷或阿爾茨海默氏病(AD)。3.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述生物試樣為腦脊髓液，脊髓組織或腦組織。4.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述腦毒素具有約700到約1900道爾頓的分子量。5.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述受試者為人，靈長類動物，牛，馬，犬，貓，豬或嚙齒動物。6.根據(jù)權利要求5的方法，其中所述受試者為人。7.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述亞硝酸溶液具有約1.5的pH。8.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述比較神經元存活率的步驟包括比較腦毒素抑制劑存在下腦毒素的ED5Q與缺少腦毒素抑制劑時腦毒素的EDso，其中缺少所述腦毒素抑制劑時腦毒素的ED5(D比所述腦毒素抑制劑存在下時腦毒素的ED5o低則是神經系統(tǒng)疾病的指示。9.診斷受試者中神經系統(tǒng)疾病或認知損失危險的方法，包括檢測所述受試者生物試樣中的腦毒素，其中所述檢測步驟包括比較腦毒素滅活劑存在下所述生物試樣的吸光度與所述腦毒素滅活劑缺少時所述生物試樣的吸光度，所述腦毒素缺少時增加的吸光度是所述神經系統(tǒng)疾病的指示，腦毒素為含有至少一個具有N-硫酸鹽化和06-硫酸鹽化的葡糖胺的寡聚糖，缺少肽鍵，以及具有小于約2000道爾頓的分子量10.根據(jù)權利要求9的方法，其中所述吸光度在232納米(nm)波長處測定。11.根據(jù)權利要求9的方法，其中腦毒素抑制劑為肝素裂解酶I，N-sulfaminidase，葡糖胺-6-硫酸酯酶或亞硝酸溶液。12.根據(jù)權利要求11的方法，其中所述亞硝酸溶液具有約1.5的pH。13.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述腦毒素含有4到8個糖單位14.根據(jù)權利要求9的方法，其中所述腦毒素具有約700到約1900道爾頓的分子量。15.根據(jù)權利要求9的方法，其中所述腦毒素含有4到8個糖單位。16.根據(jù)權利要求9的方法，其中所述神經系統(tǒng)疾病為HIV-9相關的癡呆(HAD)，神經-AIDS，克雅氏病，輕度的認知損傷，朊病毒疾病，輕度的認知/運動功能障礙，急性中風，急性神經創(chuàng)傷或阿爾茨海默氏病(AD)17.監(jiān)控受試者中神經系統(tǒng)疾病治療的方法，包括比較所述受試者第一和第二生物試樣中的腦毒素水平，其中所述第一生物試樣在比所述第二生物試樣較早的時間點取自所述受試者，其中所述第二生物試樣在所述神經系統(tǒng)紊亂治療后取自所述受試者，且其中通過所述生物試樣的吸光度測定所述腦毒素的水平，所述第二生物試樣吸光度的增加是所述神經系統(tǒng)疾病發(fā)展的指示，腦毒素為含有至少一個具有N-硫酸鹽化和06-硫酸鹽化的葡糖胺的寡聚糖；所述腦毒素缺乏肽鍵；以及所述腦毒素具有小于約2000道爾頓的分子量。18.根據(jù)權利要求17的方法，其中所述腦毒素具有約700到約1900道爾頓的分子量。19.根據(jù)權利要求17的方法，其中所述腦毒素含有4到8個糖單位20.根據(jù)權利要求17的方法，其中所述吸光度在232納米(nm)波長處測定。21.根據(jù)權利要求17的方法，其中所述第一生物試樣在治療所述神經系統(tǒng)疾病后取自所述受試者。22.根據(jù)權利要求17的方法，其中所述神經系統(tǒng)疾病為HIV-l相關的癡呆(HAD)，神經-AIDS，克雅氏病，輕度的認知損傷，朊病毒疾病，輕度的認知/運動功能障礙，急性中風，急性神經創(chuàng)傷或阿爾茨海默氏病(AD)。23.根據(jù)權利要求17的方法，其中所述受試者為人，靈長類動物，牛，馬，犬，貓，豬或嚙齒動物。24.根據(jù)權利要求23的方法，其中所述受試者為人。25.監(jiān)控受試者中神經系統(tǒng)疾病發(fā)展的方法，包括檢測所述受試者中腦毒素水平隨時間的增加，其中所述檢測步驟包括測定所述受試者第一生物試樣中腦毒素的吸光度相對于所述受試者第二生物試樣的腦毒素吸光度的增加，其中所述第二生物試樣在所述第一生物試樣之前取自所述受試者，且其中所述腦毒素含有至少一個具有N-硫酸鹽化和06-硫酸鹽化的葡糖胺的寡聚糖，缺少肽鍵，以及具有小于約2000道爾頓的分子量，所述吸光度的增加是所述神經系統(tǒng)疾病發(fā)展的指示。26.根據(jù)權利要求25的方法，其中所述神經系統(tǒng)疾病為fflV-l相關的癡呆(HAD)，神經-AIDS,克雅氏病，輕度的認知損傷，朊病毒疾病，輕度的認知/運動功能障礙，急性中風，急性神經創(chuàng)傷或阿爾茨海默氏病(AD)。27.根據(jù)權利要求25的方法，其中所述吸光度在232納米(nm)波長處測定。28.根據(jù)權利要求25的方法，其中所述腦毒素具有約700到約l卯0道爾頓的分子量。29.根據(jù)權利要求25的方法，其中所述腦毒素含有4到8個糖單位。30.監(jiān)控受試者神經系統(tǒng)疾病發(fā)展的方法，包括檢測所述受試者中腦毒素水平隨時間的增加，其中所述檢測步驟包括將所述受試者的第一生物試樣與神經元接觸，將所述受試者的第二生物試樣與神經元接觸，以及檢測所述第二生物試樣存在下神經元存活率的降低，其中所述第二生物試樣在比所述第一生物試樣較晚的時間點獲取，其中所述腦毒素含有至少一個具有N-硫酸鹽化和06-硫酸鹽化的葡糖胺的寡聚糖，缺少肽鍵，以及具有小于約2000道爾頓的分子量；并且所述神經元存活率的降低是所述神經系統(tǒng)疾病發(fā)展的指示。31.根據(jù)權利要求30的方法，其中所述神經系統(tǒng)疾病為HIV-1相關的癡呆(HAD)，神經-AIDS，克雅氏病，輕度的認知損傷，朊病毒疾病，輕度的認知/運動功能障礙，急性中風，急性神經創(chuàng)傷或阿爾茨海默氏病(AD)。32.根據(jù)權利要求30的方法，其中所述腦毒素具有約700到約1900道爾頓的分子量。33.根據(jù)權利要求30的方法，其中所述腦毒素含有4到8個糖單位34.根據(jù)權利要求30的方法，其中所述生物試樣為腦脊髓液，脊髓組織或腦組織。35.根據(jù)權利要求30的方法，其中所述受試者為人，靈長類動物，牛，馬，犬，貓，豬或嚙齒動物。36.根據(jù)權利要求30的方法，其中所述受試者為人。37.根據(jù)權利要求30的方法，其中所述生物試樣之一在所述神經系統(tǒng)疾病的前驅癥狀期間獲取。38.根據(jù)權利要求30的方法，其中通過比較所述第一生物試樣的ED5o與第二生物試樣的ED5o測定所述神經元存活率的降低，其中第二生物試樣的ED5o比第一生物試樣的ED5Q低是所述神經系統(tǒng)疾病發(fā)展的指示。39.監(jiān)控受試者神經系統(tǒng)疾病治療的方法，包括檢測所述受試者中腦毒素水平隨時間的增加，其中所述檢測步驟包括將所述受試者的第一生物試樣與神經元接觸，將所述受試者的第二生物試樣與神經元接觸，以及檢測所述第二生物試樣存在下神經元存活率的降低，其中所述第二生物試樣在比所述第一生物試樣較晚的時間點并且在所述神經系統(tǒng)疾病治療后獲?。黄渲兴瞿X毒素含有至少一個具有N-硫酸鹽化和06-硫酸鹽化的葡糖胺的寡聚糖，缺少肽鍵，以及具有小于約2000道爾頓的分子量；并且所述神經元存活率的降低是所述神經系統(tǒng)疾病發(fā)展的指示。40.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述神經系統(tǒng)疾病為HIV-1相關的癡呆(HAD)，神經-AIDS，克雅氏病，輕度的認知損傷，朊病毒疾病，輕度的認知/運動功能障礙，急性中風，急性神經創(chuàng)傷或阿爾茨海默氏病(AD)。41.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述腦毒素具有約700到約1900道爾頓的分子量。42.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述腦毒素含有4到8個糖單位。43.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述生物試樣為腦脊髓液，脊髓組織或腦組織。44.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述受試者為人，靈長類動物，牛，馬，犬，貓，豬或嚙齒動物。45.根據(jù)權利要求39的方法，其中所述受試者為人。46.根據(jù)權利要求39的方法，其中通過比較所述第一生物試樣的EDsG與第二生物試樣的EDso測定所述神經元存活率的降低，其中第二生物試樣的ED50比第一生物試樣的EDso低是所述神經系統(tǒng)疾病發(fā)展的指示。47.根據(jù)權利要求9、17或25的方法，其中所述生物試樣包括腦脊髓液，腦組織或脊髓組織。48.根據(jù)權利要求9或25的方法，其中所述受試者為人，靈長類動物，牛，馬，犬，貓，豬或嚙齒動物。49.根據(jù)權利要求48的方法，其中所述受試者為人。全文摘要通過激活單核吞噬細胞產生的腦毒素(Encephalotoxin)存在于患有神經系統(tǒng)疾病的個體中，神經系統(tǒng)疾病包括神經退行性和神經炎性疾病，諸如阿爾茨海默氏病(AD)，HIV-1-相關的癡呆(HAD)，克雅氏病，輕度的認知損傷，朊病毒疾病，輕度的認知/運動功能障礙，急性中風，急性神經創(chuàng)傷，或神經-AIDS。按照本發(fā)明方法進行的腦毒素生物化學檢測將允許神經系統(tǒng)疾病早期、癥狀發(fā)生前階段的診斷，因此允許在疾病發(fā)展進行早期干預以及鑒定處于發(fā)展成神經退行性疾病的危險中的受試者或群體。本發(fā)明的方法同樣提供了監(jiān)控神經系統(tǒng)疾病的發(fā)展和治療的機制。文檔編號A61K31/47GK101238370SQ200480008393公開日2008年8月6日申請日期2004年1月27日優(yōu)先權日2003年1月27日發(fā)明者達納·J·朱利亞恩申請人:貝勒醫(yī)學院