一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)流行性造血器官壞死病毒的引物、試劑盒和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)流行性造血器官壞死病毒的引物、試劑 盒和檢測(cè)方法，屬分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 流行性造血器官壞死?。‥pizootie hematopoietie necrosis，EHN)是魚的一種 全身性疾病，主要感染紅鰭鱸魚和虹鱒魚，使其出現(xiàn)肝臟、脾臟和包括腎臟在內(nèi)的造血組織 壞死，以至死亡的一種魚類傳染病，由流行性造血器官壞死病毒（Epizootie hematopoietie necrosis virus，EHNV)為代表的一類病毒引起。EHNV可引起紅鰭魚盧魚高病 死率，給漁場(chǎng)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，并使野生群體的數(shù)量急劇下降，虹鱒魚感染率低而死亡 率很高，因此很難從外表健康的魚中檢測(cè)到病毒。國際獸疫局(0ΙΕ)將EHNV列入必須報(bào)告的 名錄，許多國家正在研究該病的檢測(cè)、預(yù)防和控制方法。對(duì)該病進(jìn)行精確診斷方法的研究， 是當(dāng)前我國水生動(dòng)物疫病防控的迫切需要。但是目前為止，EHNV檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法主要是用 細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒，然后用組織病理、免疫熒光、ELISA、電鏡技術(shù)和PCR等手段鑒定，抗原捕 獲ELISA可以有效鑒定該病毒，但敏感性僅為60% ;PCR方法雖然靈敏，但仍會(huì)有假陽性出現(xiàn) 的可能;其他方法不能達(dá)到在分子水平上進(jìn)行快速確證的目的。
[0003] 焦磷酸測(cè)序技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，適于 對(duì)已知短序列的測(cè)序分析，無需熒光標(biāo)記引物或核酸探針，無需電泳，具有分析快速、準(zhǔn)確、 靈敏度高、經(jīng)濟(jì)、自動(dòng)化和實(shí)時(shí)檢測(cè)的特點(diǎn)。該方法在普通PCR的基礎(chǔ)上，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè) 序，提高了檢測(cè)的特異性，且給出了分子診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)一基因序列，減少了由于PCR敏感 性高而出現(xiàn)的假陽性結(jié)果，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。焦磷酸測(cè)序技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行短 DNA序列分析，通量高、操作方便，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，因而頗受國內(nèi)外研究者的歡 迎，已廣泛應(yīng)用于病原微生物快速鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一組利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)流行性造血器官 壞死病毒的引物。
[0005] 本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)流行性造 血器官壞死病毒的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)流行性造 血器官壞死病毒的檢測(cè)方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的主要原理是利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)，通過DNA聚合酶(DNA ploymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、焚光素酶（111(^€6抑86)和雙磷酸 酶(apyrase)4種酶催化待測(cè)序DNA單鏈和測(cè)序引物的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，反應(yīng)底物為5'-鄰酰硫酸(adenosine5 'phosphosulfate，APS)和焚光素。在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，加入1種 dNTP，若該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷 酸基團(tuán)（PPi)。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驅(qū)動(dòng)熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化熒 光素的轉(zhuǎn)化，發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號(hào)，光信號(hào)由CCD攝像機(jī)檢測(cè)并由Pyrogram?反 應(yīng)為峰，每個(gè)光信號(hào)的峰高與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。ATP和未摻入的dNTP由雙磷 酸酶降解，淬滅光信號(hào)，并再生反應(yīng)體系，然后加入下一種dNTP。最終待測(cè)序列順序即可從 反應(yīng)光強(qiáng)的信號(hào)峰中讀出。
[0008] 本發(fā)明提供了一組利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)流行性造血器官壞死病毒的引物，包 括擴(kuò)增引物對(duì)和測(cè)序引物：
[0009] 擴(kuò)增引物對(duì):上游引物:5'-Biotin-CTCAAGACCAAGAAGGCCATAA-3'（SEQIDNo·2)
[0010] 下游引物：5'-TTTTCGGACATGCTCTTCTTCA-3'（SEQ ID Νο·3)
[0011] 測(cè)序引物：5'-CTTCTCGATGCAAGAGT-3'（SEQ ID Νο·4)
[0012] 其中，上游引物的5'端標(biāo)記生物素。
[0013] 本發(fā)明所述的流行性造血器官壞死病毒特異性擴(kuò)增引物及焦磷酸測(cè)序引物是根 據(jù)流行性造血器官壞死病毒0RF65基因的特異區(qū)域序列，通過Assay Design SW軟件設(shè)計(jì)流 行性造血器官壞死病毒特異性引物序列，以擴(kuò)增出特異性單一條帶，再根據(jù)擴(kuò)增區(qū)域中包 含的特異核苷酸序列(特異目標(biāo)序列SEQ ID No.1所示)設(shè)計(jì)焦磷酸測(cè)序引物以確定流行性 造血器官壞死病毒。流彳丁性造血器官壞死病毒0RF65基因的目標(biāo)序列：CCATGAGGAA ATATCTTACC CTCTCAAACT GTCTGTCG(SEQ ID No.l);其PCR擴(kuò)增片段長度為 137bp。
[0014] 本發(fā)明還提供一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)流行性造血器官壞死病毒的試劑盒， 該試劑盒包括上述檢測(cè)流行性造血器官壞死病毒的引物組，即擴(kuò)增引物對(duì)和測(cè)序引物。進(jìn) 一步地，該試劑盒還包括完成PCR反應(yīng)和焦磷酸測(cè)序所需材料和試劑，例如DNA提取試劑(可 以按照現(xiàn)有技術(shù)中公開的方法自行配制，也可以使用商業(yè)化購買的試劑盒）、PCR反應(yīng)試劑 (可以按照現(xiàn)有技術(shù)中公開的方法自行配制，也可以使用商業(yè)化購買的試劑盒）、單鏈模板 制備試劑，焦磷酸測(cè)序試劑(可以按照現(xiàn)有技術(shù)中公開的方法自行配制，也可以使用商業(yè)化 購買的試劑盒)等，上述材料和試劑可以混合包裝，也可以單獨(dú)包裝，優(yōu)選地，為單獨(dú)包裝。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)流行性造血器官壞死病毒的檢測(cè) 方法，該方法包括：
[0016] (1)提取待測(cè)樣品DNA作為模板，可以使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的提取方法或商業(yè)化試 劑盒進(jìn)行提??；
[0017] (2)使用上述擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0018] (3)若流行性造血器官壞死病毒特異PCR反應(yīng)為陽性，即擴(kuò)增片段為137bp，則回收 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板，然后使用上述測(cè)序引物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，若目的 序列與CCATGAGGAA ATATCTTACC CTCTCAAACT GTCTGTCG(SEQ ID No. 1)特異目標(biāo)序列一致， 則待測(cè)樣品中含有流行性造血器官壞死病毒;若流行性造血器官壞死病毒特異PCR反應(yīng)為 陰性，則判定樣品為非流行性造血器官壞死病毒。
[0019] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)流行性造血器官壞死病毒進(jìn)行檢 測(cè)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，該技術(shù)具有高通量、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可以精確的進(jìn)行短DNA序列分 析，測(cè)序過程耗時(shí)短，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程。PCR產(chǎn)物可直接用于測(cè)序，不需進(jìn)行產(chǎn)物純 化等二次處理，操作簡(jiǎn)便，所需樣品量少。
[0020] 下面結(jié)合說明書附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，凡依照本發(fā)明公開 內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明對(duì)流行性造血器官壞死病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果； 其中Μ為DNA Marker，1為流行性造血器官壞死病毒，2為陰性對(duì)照。
[0022] 圖2為本發(fā)明對(duì)流行性造血器官壞死病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的結(jié)果。 [0023]圖3為本發(fā)明對(duì)樣品DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果;其中Μ為DNA Marker，1為已確診為流行性造血器官壞死病毒的虹鱒魚組織樣品，2為流行性造血器官壞 死病毒感染的病魚組織樣品，3為正常虹鱒魚組織樣品，4為陰性對(duì)照。
[0024]圖4為本發(fā)明對(duì)流行性造血器官壞死病毒感染的病魚組織DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè) 序結(jié)果。
[0025] 圖5為本發(fā)明對(duì)流行性造血器官壞死病毒進(jìn)行PCR擴(kuò)增特異性檢測(cè)的瓊脂糖凝膠 電泳結(jié)果。其中Μ為DNA Marker，1為流行性造血器官壞死病毒，2為甲魚虹彩病毒，3為斑點(diǎn) 叉尾鮰病毒，4為陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)施例1檢測(cè)流行性造血器官壞死病毒的引物的設(shè)計(jì)
[0027] 通過對(duì)美國國立生物信息中心NCBI基因庫(GenBank)中已公布的流行性造血器官 壞死病毒基因序列進(jìn)行對(duì)比分析，確定EHNV 0RF65基因的特異性序列為17