人副流感病毒ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ型四重pcr檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒檢測(cè)試劑盒技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種人副流感病毒I、π、m、iv型 四重pcr檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR在基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域都有廣 泛應(yīng)用，其基本原理為:在PCR反應(yīng)體系中引入一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光信號(hào)強(qiáng) 度，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖，如圖1所 示，在曲線指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可進(jìn)行定 量分析。
[0003] 人類副流感病毒(HPIVs)常常引起兒童下呼吸道感染的一種病毒，其致病性僅次 于呼吸道合胞病毒(RSV)。與RSV-樣，人類副流感病毒可以造成反復(fù)發(fā)作的上呼吸道感染 (如感冒和喉嚨痛）。它也能造成嚴(yán)重的反復(fù)感染的下呼吸道疾病(如肺炎，支氣管炎和細(xì)支 氣管炎），特別是在老年人中和有免疫缺陷人群中。人類副流感病毒是單鏈的RNA病毒。病毒 表面含有溶合酶和紅血球凝聚素-神經(jīng)氨酸苷酶的醣蛋白。從血清學(xué)上人類副流感病毒可 分為4型（I型到IV型），其中IV型又分a和b兩個(gè)亞型。病毒顆粒大小不一(平均直徑大小在 150-300nm之間），形態(tài)各異。人類副流感病毒的四種亞型各有不同的臨床和流行病學(xué)特征。 其中，I型和Π 型的最典型臨床特征是造成兒童喉氣管支氣管炎，而I型是這種兒童喉氣管 支氣管炎的主要原因，Π 型次之，此外，I型和Π 型均能造成其它的上呼吸道和下呼吸道疾 ??；m型經(jīng)常導(dǎo)致肺炎和細(xì)支氣管炎;IV型很難檢出，可能是因?yàn)樗苌賹?dǎo)致嚴(yán)重的疾病。 人類副流感病毒的潛伏期一般在1-7天左右。
[0004] 人副流感病毒存在于呼吸道分泌物中，通過人與人的直接接觸和飛沫經(jīng)呼吸道傳 播。對(duì)于成人，HPIV主要侵犯呼吸道黏膜的表層組織，在上皮細(xì)胞內(nèi)增殖，引起的病變較輕， 一般表現(xiàn)為上呼吸道感染(URI)。小于5歲的嬰幼兒，病毒常侵犯氣管、支氣管黏膜上皮細(xì) 胞，引起細(xì)胞變性、壞死增生和黏膜糜爛。當(dāng)侵犯肺泡上皮及間質(zhì)細(xì)胞，則引起間質(zhì)性肺炎 或表現(xiàn)為急性阻塞性喉氣管支氣管炎和肺炎。HPIV感染可產(chǎn)生局部抗體和血清抗體。人副 流感病毒感染后人的免疫力下降，到目前為止，尚未找到有效的預(yù)防與特效治療方法。
[0005] 嬰幼兒呼吸道感染是最常見的感染性疾病，主要由多種病毒引起，據(jù)統(tǒng)計(jì)大約30-40%的嬰幼兒急性呼吸道感染都是副流感病毒引起的。副流感病毒引起的感染癥狀和流感 病毒相似，僅依靠臨床癥狀及常規(guī)的檢測(cè)方法進(jìn)行病毒病原的確定并不可靠。因此早期快 速診斷呼吸道病毒感染能夠及時(shí)指導(dǎo)臨床治療，為合理選擇抗病毒、抗細(xì)菌藥物提供依據(jù)， 并在避免濫用抗生素方面具有重要意義。目前，檢測(cè)病毒感染的方法很多，呼吸道病毒感染 病毒學(xué)診斷方法主要包括病毒培養(yǎng)、免疫熒光技術(shù)、血清學(xué)試驗(yàn)、常規(guī)分子生物學(xué)方法等， 以培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)。其中，病毒分離培養(yǎng)最為經(jīng)典，過去常作為金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法耗時(shí)、耗 力，不能及時(shí)指導(dǎo)臨床治療，而且標(biāo)本內(nèi)所含病毒數(shù)量少可出現(xiàn)假陰性;電鏡可檢測(cè)病毒顆 粒，但操作復(fù)雜、昂貴，不適用于臨床;病毒核酸檢測(cè)靈敏度高，但實(shí)驗(yàn)條件嚴(yán)格，容易被污 染。病毒特異性抗體檢測(cè)是臨床常見的檢測(cè)病毒感染的指標(biāo)，但特異性IgG陽性只能表明有 相應(yīng)病毒感染，不能用于早期感染判斷和療效監(jiān)測(cè)，IgM類抗體是感染早期或潛伏病毒活化 時(shí)產(chǎn)生的，但嬰幼兒可因免疫反應(yīng)較弱而出現(xiàn)假陰性，且病毒特異性抗體檢測(cè)一次只能檢 測(cè)一種呼吸道病毒。抗原檢測(cè)較抗體檢測(cè)更敏感，是快速而又準(zhǔn)確的方法，被廣泛引用于 HPIV感染的快速診斷，但結(jié)果并不穩(wěn)定，而且有些HPIV病毒株不容易被特異性單克隆抗體 檢測(cè)到。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種人副流感病毒I、n、m、IV型四重PCR檢測(cè)試劑盒，旨 在解決現(xiàn)有技術(shù)操作繁瑣、準(zhǔn)確度不高的問題。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種人副流感病毒I、n、m、IV型四重PCR檢測(cè)方法。
[0008] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種人副流感病毒I、π、m、iv型四重pcr檢測(cè)試劑盒，包括 PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括人副流感病毒特異性引物和基因探針；
[0009] 所述人副流感病毒特異性引物包括：
[0010] 人副流感病毒1上游引物：5'-046了六6〇^64了6了6了6了〇：1'1'(：-3'；
[0011]人副流感病毒I下游引物：
[0012] 5 '-CTTAGGGTTAAAGACAATCCAGYCAAC-3 '；
[0013] 人副流感病毒 Π 上游引物:5 ' -ACCATTTACCTAAGTGATGGAATCA-3 ' ；
[0014] 人副流感病毒 Π 下游引物:5 ' -GATCAGTYGTGGCATAATCTTCT-3 ' ；
[0015] 人副流感病毒111上游引物：5'-0六661^60六11^^1^^1'(^61'(：-3'；
[0016] 人副流感病毒111下游引物:5'-60^6(：1^61'7^〇￥(：1'1'1'-3'；
[0017] 人副流感病毒IV上游引物:5' -CCTGGAGTCCCATCAAAAGT-3' ；
[0018] 人副流感病毒1￥下游引物:5'-厶厶〇厶0^6(：1^61'(：1'(：11^1'-3'；
[0019] 所述人副流感病毒基因探針包括：
[0020] 人副流感病毒I基因探針：
[0021 ] 5 '-CCGTGGARTTRTCATTTCGGGTTGTAGA-3 '；
[0022] 人副流感病毒Π 基因探針：
[0023] 5 '-CGCAAAAGCTGTTCAGTCACTGCTATACC-3 '；
[0024] 人副流感病毒m基因探針：
[0025] 5，-CCCAGTCATAACTTACTCAACAGCAACCG-3，；
[0026] 人副流感病毒IV基因探針:5'-TAGCAAGACCCATATTATCTGGAACC-3'。
[0027] 以及，一種人副流感病毒I、Π 、m、IV型四重PCR檢測(cè)方法，該方法使用上述人副流 感病毒I、π、m、IV型四重PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，包括以下步驟：
[0028] 標(biāo)本處理；
[0029] 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)；
[0030] 結(jié)果判斷，
[0031] 其中，所述實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的參數(shù)設(shè)置為：
[0032] 50-55〇C：5-10min；
[0033] 94-95〇C：2-3min；
[0034] 94-95°C: 5-10S，55-60°C: 40-80S; 45 個(gè)循環(huán)。
[0035] 本發(fā)明提供的人副流感病毒I、Π 、m、IV型四重PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，采 用特異性設(shè)計(jì)的病原體引物和病原體基因探針，進(jìn)行RT-PCR，可以大大提高了擴(kuò)增效率，從 而用普通的TaqDNA聚合酶仍能使檢測(cè)結(jié)果具有很高的檢測(cè)靈敏度，解決了傳統(tǒng)多重PCR擴(kuò) 增效率低和檢測(cè)靈敏度低的問題。本發(fā)明具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、快速、安全等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng) 用于人副流感分型的快速檢測(cè)，早期快速診斷人副流感病毒感染并及時(shí)指導(dǎo)臨床治療。此 外，所述試劑盒運(yùn)用分裝技術(shù)，比一般的PCR試劑盒節(jié)省配制反應(yīng)液的步驟，更有利用臨床 的大量樣本檢測(cè)，省時(shí)方便。
【附圖說明】
[0036]圖1是提供的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線示意圖；
[0037] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的人副流感病毒I、Π 、m、IV型四重PCR檢測(cè)方法示意圖；
[0038] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的人副流感病毒I、Π 、m、IV型四重PCR檢測(cè)方法陽性結(jié) 果和陰性結(jié)果示意圖；
[0039] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的人副流感病毒I、n、m、IV型四重PCR檢測(cè)結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合 實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋 本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0041 ]本發(fā)明實(shí)施例中，對(duì)下述名詞作出如下解釋。
[0042] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR):是體外酶促合成特異DNA片 段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復(fù)性)及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn) 行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。
[0043] 實(shí)時(shí)熒光PCR法:是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān) 測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定性定量分析的方法。
[0044] Ct值:每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
[0045] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種人副流感病毒I、Π 、m、iv型四重PCR檢測(cè)試劑盒，包括 PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括人副流感病毒特異性引物和基因探針；
[0046] 所述人副流感病毒特異性引物包括：
[0047] 人副流感病毒1上游引物：5'-046了46〇^64了6了6了6了〇：1'1'(：-3'；
[0048]人副流感病毒I下游引物：
[0049 ] 5 '-CTTAGGGTTAAAGACAATCCAGYCAAC-3 '；
[0050]人副流感病毒 Π 上游引物:5 ' -ACCATTTACCTAAGTGATGGAATCA-3 ' ；
[0051 ]人副流感病毒 Π 下游引物：5 ' -GATCAGTYGTGGCATAATCTTCT-3 ' ；
[0052] 人副流感病毒111上游引物：5'-04661^60411^^1^^1'(^61'(：-3