專利名稱：溫度敏感和冷適應的2型人副流感病毒(hpiv－2)及基于該病毒的疫苗的制作方法
背景技術：
本發(fā)明涉及2型人副流感病毒(HPIV-2)的分離的減毒病毒株，其在活疫苗制備中有用。這些病毒株顯示出溫度敏感和冷適應表型，這對在接種的哺乳動物體內激發(fā)保護性免疫應答而不產生由野生型病毒引起的嚴重癥狀有用。
1、2、3型人副流感病毒(HPIV)是嬰兒及年幼兒童的重要致病原。HPIV通常引起中耳炎、咽炎和普通感冒。通常發(fā)生這些上呼吸道感染(URI)并可伴隨下呼吸道感染(LRI)，包括哮吼、肺炎和細支氣管炎。年幼兒童的初次感染伴有下呼吸道疾病，并常導致住院。副流感病毒作為一個群體，是因呼吸道感染而入院的第二大最常見的原因，僅次于作為年幼兒童重要致病原的呼吸道合胞病毒。副流感病毒中唯有3型副流感病毒具備通常感染小于六月齡年幼嬰兒的能力。感染該型病毒的嬰兒通常有細支氣管炎和肺炎；在這點上，3型副流感病毒與呼吸道合胞病毒相似。最近一些關于這些病毒感染不同方面的有關HPIV的綜述已經發(fā)表(Ray和Compans,1990；Kingsbury,1991；Henrickson等人，1994)。
在美國HPIV-2感染每年爆發(fā)一次(Downham等人，1974)。該病原體高峰發(fā)病率在秋季至初冬，與HPIV-1相比其“季節(jié)”稍長。哮吼是該病毒引起的最頻發(fā)的LRI，但它也可引起任何其它與HPIV-1相關的呼吸道疾病。HPIV-2感染的高峰發(fā)生率出現(xiàn)在一生中的第二年，大約有60％的感染發(fā)生在小于5歲的兒童中。在一項研究中有趣地觀察到，與HPIV-1或3引起的LRI相比，更多女孩比男孩具有HPIV-2引起的LRI癥狀(Downham等人，1974)。已報道HPIV-2引起的LRI不如HPIV-1和HPIV-3引起的LRI頻發(fā)。新近的報道指出地理差異或分離和檢測技術的差別可能造成該病毒的過低報道(Downham等人，1974；Henrickson等人，1994)。估計在美國1991年的流行中，由于HPIV-2感染，有157000名5歲以下的兒童進入急診室，35000名兒童入院。這次流行導致HPIV-1和2合計的直接患者醫(yī)療花費幾乎2億美元。
所有的人副流感病毒在結構、物理化學、和生物學性質上非常相似。原型HPIV病毒體由單鏈RNA組成，RNA負極包裹著宿主細胞來源的脂質包膜。這些多形的，或者多種形狀的病毒平均直徑150-250nm。典型的HPIV基因組包含大約15000個核苷酸的遺傳信息(Storey等人，1984)，編碼至少六個病毒蛋白質(3”-NP-P(+C)M-F-HN-L-5’)(Storey等人，1984)。另外，HPIV-1、2、和3編碼額外的非結構蛋白質“C”，HPIV-2編碼蛋白質“V”。這些蛋白質由P基因內的重疊讀碼框架產生，并可能需要的RNA編輯(Matsuoka等人，1991)。HPIV-2基因組的全部核苷酸序列尚未公布。
人副流感病毒在副粘病毒科的屬內分類。該屬內有五種主要的血清型HPIV 1-4和腮腺炎病毒。HPIV的血清型根據(jù)抗原性劃分為兩組(1)HPIV-1和HPIV-3，在副粘病毒屬內，和(2)HPIV-2和HPIV-4，在Rubulavirus屬內(Collins等人，1996)。HPIV均享有公共抗原，在感染期間常檢測到可變的異型抗體水平。因此，很難確定是否異型應答是以往感染的表現(xiàn)，或僅僅是血清學化驗中相似抗原的交叉反應。然而，在標準分析中，可利用過去的特定超免疫動物血清和更近的單克隆抗體來區(qū)分這些病毒(Sarkkinen等人，1981)。
鼻和咽粘膜是副流感病毒感染的初始部位。輕微疾病的患者可能還有局限的支氣管累及。更廣泛的HPIV-1和HPIV-2感染累及喉和氣管上部，導致哮吼綜合征。隨著變濃粘液的積累及造成的肺膨脹不全(不完全的肺膨脹)和肺炎，感染也可蔓延至氣管下部和支氣管。與發(fā)生的感染局限于上呼吸道的年齡相近的患者相比，發(fā)生副流感病毒哮吼的嬰兒和兒童的局部病毒特異IgE抗體產生得早且量大，通過對該現(xiàn)象的觀察提示免疫應答對該病發(fā)病機制的可能作用(Welliver等人，1982)。已報道與只出現(xiàn)上呼吸道疾病的感染嬰兒相比，在患副流感病毒細支氣管炎的嬰兒中針對副流感病毒抗原的細胞介導的免疫應答及副流感病毒特異的IgE抗體應答更強。在慢性支氣管炎和肺氣腫患者中觀察到HPIV-3攜帶的狀態(tài)延長(Gross等人，1973)。已提出健康成年人可間歇性釋放感染性病毒并感染易感個體；調查者進一步提出可能發(fā)生持續(xù)感染(Parkinson等人，1980)。
倉鼠提供了公認的HPIV感染動物模型。受染動物肺部形成不因被動施用抗體而改變的可識別病理變化(Glezen和Femald,1976)。感染期間，受染的倉鼠不顯示出明顯的呼吸道疾病征兆及顯著的體重下降。另外，如下面實施例4-6中所證明的，猴子可用作感染的動物模型。
多年來開發(fā)了多種疫苗以防止各種病毒感染動物和人。使用的疫苗主要有兩種類型死病毒和減毒活病毒。死病毒一般通過化學和物理處理滅活，但在激發(fā)持久的免疫應答方面一般不如減毒活病毒有效。一般減毒活病毒更有效，但在體內可能返祖回其毒力狀態(tài)。在開發(fā)死疫苗或減毒活疫苗上的時間及花費是驚人的。
減毒活疫苗可從分離自受染動物的子代病毒直接獲得。例如Straub的美國專利第3927209公開了作為病毒株從牛呼吸道分離的3型副流感疫苗。減毒活疫苗也可通過將野生型株經過適合的培養(yǎng)重復冷傳代直至該病毒喪失最初的致病性而獲得?！袄鋫鞔笔侵覆《驹诘陀谄湔椭茰囟鹊臈l件下經歷完整生命周期(感染宿主細胞、在宿主細胞中增殖、和逃離宿主細胞)的生長。例如cp45這一冷適應的溫度敏感株是通過將HPIV-3野生型病毒(JS株)在降低的溫度下傳代45次而得到的(Belshe和Hissom,1982)。目前為用作人HPIV-3的候選疫苗，cp45這一溫度敏感株正在評估中(Karron等人，1995；Hall等人，1993；Belshe等人，1992；Clement等人，1991；Crookshanks-Newman和Belshe,1996)。近來在兒童中的評估揭示cp45株高度滅活，并在激發(fā)免疫原應答中有效(Karron等人，1995；Belshe等人，1992)。盡管冷傳代技術已用來生產A型和B型流感疫苗，但是還沒有HPIV-2病毒成功冷傳代的類似描述。
評價特定疫苗株的減毒通常談到該株的三個表型冷適應、溫度敏感和組織培養(yǎng)中空斑大小或產量。冷適應(ca)涉及病毒在25℃左右降低的溫度下生長的能力。溫度敏感(ts)涉及這種生長是否在40℃左右受到抑制?？瞻叩味仁嵌吭u估病毒生長程度的分析，通常用來評估冷適應和/或溫度敏感表型之程度。確定疫苗是否減毒的其他方法包括給靈長類動物施用疫苗。例如，新的脊髓灰質炎疫苗項目在被美國食品及藥物管理局(FDA)批準銷售前一般在猴子中做減毒實驗。
考慮到HPIV-2疾病在嬰兒和年幼兒童中引起嚴重呼吸窘迫的傾向及最終入院治療的必需性，能預防嚴重感染的疫苗倍受期望。盡管認識到需要HPIV-2疫苗已經超過二十年，盡管在二十世紀八十年代早期分離HPIV-3疫苗株就已成功，目前仍沒有可用的疫苗可免疫兒童防止HPIV-2。在本申請者的發(fā)現(xiàn)之前HPIV-2尚不能成功地冷傳代。與HPIV-3病毒相比，分離HPIV-2病毒減毒株的困難可從這兩種病毒間形態(tài)學和表型上的巨大差別來解釋。盡管它們在抗原性上相似，但是與HPIV-3相比，HPIV-2更難適應體外生長條件及降低的溫度。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個目的是提供可用來免疫哺乳動物(包括人)防止野生型HPIV-2感染的HPIV-2疫苗株。提供與感染野生型HPIV-2病毒株相比，感染疫苗株后產生之癥狀大大減輕的疫苗株是本發(fā)明進一步的目的。提供能使施用的患者產生保護性免疫應答的HPIV-2疫苗株是本發(fā)明進一步的目的。
申請者已從圣路易斯大學(Saint Louis University)命名為SLU7255的野生型HPIV-2株中培養(yǎng)和分離了冷適應的HPIV-2疫苗株。已經分離了幾個具有期望的冷適應和溫度敏感表型的減毒株。
因此，本發(fā)明涉及顯示出冷適應和溫度敏感表型特性的分離的HPIV-2減毒株。具有這些特性的優(yōu)選分離株是命名為C3396、C3464、C3490、C3440和C3444的那些。更優(yōu)選的病毒株是命名為C3464、C3490和C3440的那些。另外，本發(fā)明涉及顯示出冷適應和溫度敏感表型的分離的HPIV-2減毒株，它們是被命名為C3396、C3464、C3490、C3440和C3444的分離株之子代或亞克隆。
另外本發(fā)明涉及用作減毒活疫苗的疫苗組合物，它們包括上述任意HPIV-2病毒株及藥學可接受的載體。這些組合物也可包括任意藥學可接受的賦形劑、稀釋劑、和/或佐劑。
本發(fā)明還涉及通過給哺乳動物接種本發(fā)明的減毒活病毒株，從而在哺乳動物中引起保護性免疫應答的方法。
附圖簡述

圖1顯示在說明書中描述的分離病毒株C3440和C3490譜系之冷傳代圖解。圖2該圖顯示收集自用病毒株C3490(■)、C3440(□)、C3464(◆)或野生株453庫(◇)接種之倉鼠鼻洗液中的活性病毒滴度。圖3該圖顯示收集自用病毒株C3490(■)、C3440(□)、C3464(◆)或野生株453庫(◇)接種之倉鼠支氣管/肺洗液中的活性病毒滴度。
發(fā)明詳述與HPIV-3不同，經證實能成功培養(yǎng)及體外維持的野生型HPIV-2株很難分離。在發(fā)現(xiàn)能在體外培養(yǎng)中成功維持的野生型株之前，申請者試驗了五十多株不同來源的野生型病毒。如下面公開內容中所顯示的，申請者已從非溫度敏感和非冷適應的野生型(wt)HPIV-2病毒株中培育了分離的溫度敏感(ts)和冷適應(ca)的病毒株。如圖1所示，申請者成功地改良了野生型HPIV-2株，使其在降低的溫度下生長，創(chuàng)造了優(yōu)選地適應低于30℃的毒株，更優(yōu)選適應低于26℃，最優(yōu)選適應低于24℃左右的毒株。然后分析這些冷適應株，以證實它們有合適的溫度敏感性。申請者已發(fā)現(xiàn)，一部分冷適應株顯示出的溫度敏感性達到了防止病毒在下呼吸道中生長和增殖及伴隨的HPIV-2疾病嚴重癥狀所必需之程度。這些形成的毒株能在較低的生產溫度下不受限制地生長，而且在施用的患者中是減毒的，因此培育的這些毒株ca和ts聯(lián)合表型使它們成為用作防止HPIV-2感染的活疫苗的極好減毒株。
盡管是利用了一個特定HPIV-2 wt株來培育下面公開的病毒株，但是相信應用申請者所示的方法，任何能以體外培養(yǎng)物維持的wt株均可用來形成HPIV-2的ts和ca減毒株。胎恒河猴肺(FRhL-2)細胞是疫苗研究中充分表征的細胞，因此優(yōu)選其作為冷傳代的宿主細胞。然而，在生產本發(fā)明的減毒病毒株中考慮了使用其它培養(yǎng)的哺乳動物宿主細胞。同樣的，本領域技術人員可選擇改良冷傳代的技術，其方法是使用不同的溫度或在每一溫度下冷傳代不同次數(shù)。然而，與下面申請者的那些描述類似，這些改良將優(yōu)選保持逐步降低的溫度。
2型副流感病毒(HPIV-2)的SLU7255株分離自因患哮吼和肺炎而住院的六月齡兒童(保藏存放于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號--)。盡管SLU7255最初分離自原代恒河猴腎(RMK)細胞，但是已使其適于在胎恒河猴肺(FRhL-2)細胞(一種用于疫苗研究的二倍體細胞系)中生長。適應FRhL細胞后，SLU7255以與HPIV-3的JS株類似的方式在冷的條件下(≤30℃)連續(xù)傳代，以產生候選疫苗，方法在Belshe和Hissom(1982)中有描述，這里引入作為參考。wt株先于30℃?zhèn)鞔?次，然后于28℃?zhèn)鞔?次、于26℃?zhèn)鞔?次、于24℃?zhèn)鞔?3次。見圖1的冷傳代過程圖解。申請者驚奇地發(fā)現(xiàn)與HPIV-3不同，為成功地改造HPIV-2病毒，冷傳代的溫度不得不逐步降低，而HPIV-3可立即在22℃冷傳代。冷適應后，在原代非洲綠猴腎(AGMK)細胞中運用標準空斑分析將巴斯德移液器穿過上層覆蓋的瓊脂糖挑選克隆，其方法是抽吸瓊脂糖填料，并將克隆接種到含有原代AGMK細胞的組織培養(yǎng)管中。初次克隆篩選后，將克隆C2450和C2768在23-24℃進一步冷傳代18-30次，產生分離的克隆C3464(保藏于ATCC，保藏號--)、C3440(保藏于ATCC，保藏號--)、和C3490(保藏于ATCC，保藏號--)(隨后亞克隆，產生C3605)。以前沒有公開過HPIV-2病毒成功冷傳代。
運用紅細胞吸附空斑分析比較每個克隆在32℃和39℃的滴度，來確定HPIV-2克隆是否溫度敏感。當39℃的滴度與32℃的滴度相比，如果其顯示滴度下降100倍以上，則認為該克隆“溫度敏感”，相反，39℃的滴度與32℃的滴度相比，如果其顯示下降＜100倍，則認為該克隆是野生型(wt)病毒。更優(yōu)選地，克隆在39℃時滴度＜1.0pfu/ml。運用紅細胞吸附篩選分析鑒定ts表型的結果表明，大多數(shù)檢測的克隆顯示ts表型。
將克隆在23℃和32℃的生長情況加以比較來確定其是否具有冷適應特性。見表1。每個克隆均接種到組織培養(yǎng)管的單層Vero細胞或原代AGMK細胞(未顯示數(shù)據(jù))中，于23℃或32℃培養(yǎng)。接種后于第7天和第14天(對于23℃培養(yǎng)的)及第7天(32℃培養(yǎng)的)收獲每個克隆的管培養(yǎng)物。通過于32℃對Vero細胞進行空斑分析確定培養(yǎng)上清液中的病毒滴度。通過將細胞用蘇木精和伊紅染色5天后，觀察平皿。認為于23℃的滴度在32℃的滴度的一百倍之內的克隆是冷適應的(ca)。
分析的克隆中有六個為冷適應的，然而，它們中的一個克隆C3252在兩個溫度下均不生長。與冷適應的克隆(C3396、C3464、t3490、C3457、V3440和C3444)形成對比，野生型的親本對照453庫23℃時在Vero細胞中不生長。
進行空斑形成效率(EOP)分析來確定每個克隆的溫度閥值。在32℃、36℃、37℃、38℃和39℃分析了每一個候選疫苗在Vero細胞中形成空斑的能力。見表2。C3464、C3490、C3457、C3440和C3444顯示的溫度閥值為38℃，而這些克隆中的兩個(C3396和C3444)其39℃與32℃的生長情況相比限制了1000倍。
以類似申請者公開的方式，從野生型HPIV-2病毒培育和分離的也顯示ts和ca表型的C3396、C3464、C3490、C3457、C3440、和C3444以外的克隆也在本發(fā)明范圍之內。參照本說明書中第四部分的實施例和教導，本領域中的普通技術人員將能運用常規(guī)方法從野生型HPIV-2病毒培育和分離ts和ca克隆。另外，公開的優(yōu)選株亞克隆之進一步冷傳代，或為在其它宿主細胞中培養(yǎng)而利用已建立的方法對這些株之改造，均完全在病毒學領域技術人員的普通技能之內。因此，以上優(yōu)選株的亞克隆和子代也在本發(fā)明范圍之內。
如下面實施例中所顯示，在疫苗組合物中，本發(fā)明分離的病毒株對在哺乳動物中誘導保護性免疫應答有效。本發(fā)明中分離的HPIV-2病毒減毒株優(yōu)選作為活疫苗以有效量施用，為產生期望的免疫應答，所用有效量將容許病毒的少許生長和增殖，但不會產生HPIV-2疾病癥狀。活疫苗中使用病毒的合適量依賴于幾個因素，包括特定的分離HPIV-2減毒株的毒力或耐力；將施用疫苗的患者年齡；將施用疫苗的患者體重和總體健康情況；和將施用疫苗的患者免疫系統(tǒng)是否受到損害。
本發(fā)明中分離的HPIV-2減毒株可制成疫苗組合物，用于以任意通常的途徑(作為腹膜內或靜脈內注射、局部應用制劑、口服施用制劑等等)給患者施用，但最優(yōu)選制成噴霧或洗液，應用于上呼吸道粘膜。這種應用能協(xié)助激發(fā)局部粘膜免疫，其會提供更強的保護，防止以后野生型HPIV-2病毒感染。這些疫苗制劑包括本發(fā)明分離的減毒病毒及藥學可接受的載體，例如無菌鹽水。另外，疫苗制劑可包括藥學可接受的賦形劑、稀釋劑、和/或佐劑，在患者中它們將協(xié)助產生保護性免疫應答?？捎迷诒景l(fā)明疫苗制劑中的賦形劑包括能幫助病毒粘附粘膜及沿上呼吸道表面?zhèn)鞑サ脑噭鐦淠z或淀粉。
為引起保護性免疫應答，可將本發(fā)明分離的HPIV-2減毒株以疫苗制劑施用給哺乳動物患者。接種后，患者的免疫系統(tǒng)將顯示出致敏的免疫應答，對抗野生型HPIV-2病毒攻擊，緩解HPIV-2感染和疾病之嚴重性。盡管本發(fā)明的疫苗株是給人類患者使用，但是在本發(fā)明范圍內也考慮了給其它顯示出感染HPIV-2之有害癥狀的哺乳動物使用。為防止更嚴重的常發(fā)生于幼年的感染，本發(fā)明的疫苗株優(yōu)選在年紀小時給患者施用。盡管目前預期單次施用本發(fā)明的疫苗株將足夠誘導引發(fā)免疫應答，對抗稍后的野生型HPIV-2病毒攻擊，但是根據(jù)類似上述那些諸如劑量的因素，可能需要不止一次施用。本領域中的普通技術人員不用過多的試驗即可為具體患者設計適當?shù)膭┝糠桨浮?br> 幾個使用本發(fā)明分離的HPIV-2減毒株的實施例舉例說明如下。應當知曉，這些是作為本發(fā)明之舉例說明而提供的，并不意味著以任何形式限制本發(fā)明的實施方案。
在剛斷奶倉鼠的鼻甲和肺中wt HPIV-2親本生長地同樣良好(見圖2和3)。病毒的釋放期持續(xù)4天，其中第3天鼻甲的高峰滴度為5.5pfu/gm組織(在這些實施例中所有pfu/gm的值均以log10計)，第2天肺組織的平均高峰滴度為5.2pfu/gm組織。第3天至第7天自倉鼠鼻甲中釋放克隆C3490(cp51)。第7天回收的C3490的平均高峰滴度為4.5pfu/gm組織。只從少數(shù)接種C3440或C3464的動物中回收到HPIV-2，這說明這些克隆的傳染力最小。從接種了三種冷適應的克隆中的一種克隆之任何動物的肺中均回收不到病毒。這三種冷適應的溫度敏感克隆在倉鼠中是減毒的，并可因其它體內特性而應用。
除應激試驗外，我們從這三種冷傳代病毒的每種中挑選空斑，確定是否該病毒庫內有病毒表型的混合。(表6)從474庫(克隆3490)中挑選的10個亞克隆中的每一個均為明顯ts，并在39℃顯示出完全截斷。從477庫(克隆3440)中挑選的10個亞克隆中的兩個在39℃顯示出少許生長，但是在39℃與在32℃相比，滴度至少低100倍。所有從484庫(克隆3464)中挑選的6個亞克隆均在39℃有完全截斷，并保持其ts表型。這些結果表明，與有表型混合的克隆C3440形成對比，克隆3490和克隆3464均為單一表型。為獲得更純系的候選疫苗，我們從C3440中挑選亞克隆(C3605)。
在Vero細胞中制備wt HPIV-2親本及ca/ts克隆C3490和C3605的庫。C3605是分離株C3440的亞克隆。在最初兩個實驗中新伊比利亞半島(New Iberia)的人員在接種時稀釋了病毒，但是當確定實施例5的接種后個體≤2.0pfu/ml(而其預期為6.0pfu/ml)時，我們改變了步驟。包括ca/ts候選疫苗C3605及wt HPIV-2攻擊病毒的實施例6之接種體均在圣路易斯大學制備，并以想要的劑量冰凍后船運至新伊比利亞半島。
第0天(接種前)及鼻內和氣管內接種105.5pfu病毒或安慰劑后第3、5、7、10、12、14、17、19、和21天，從每只猴子采集鼻洗液(NW)樣品及支氣管灌洗(BL)樣品。將樣品與轉運載體混合后分裝，在干冰/酒精浴中速凍并保存于-70℃。接種前及接種后第7、14、21、28、42、和56天從每只猴子采集血清樣品。
將樣品接種到重復的原代恒河猴腎組織培養(yǎng)管中，32℃孵育。在第5、9、和14天用豚鼠紅細胞對RMK管進行紅細胞吸附。用免疫熒光(IF)鑒定紅細胞吸附陽性管。也通過在32℃對單層Vero細胞的空斑分析對每個樣品定量。通過血凝抑制反應(HAI)檢測血清樣品中抗wt HPIV-2的抗體。在受體破壞酶(RDE)處理和熱激活后對所有樣品用相同的分析檢測。
結果從第一個實驗的四只接種恒河猴中每只的NW和BL樣品中回收到野生型HPIV-2。見表8。從NW和BL樣品中回收到相似的HPIV-2滴度，其中第7天NW樣品的平均高峰滴度≥1.73pfu/ml，第5天BL樣品的平均高峰滴度≥1.53pfu/ml。接種后21天內在4只動物中的每一只均觀察到抗wt HPIV-2的HAI抗體應答。安慰劑接受者既不釋放病毒也無HAI抗體應答。
檢測C3490和C3605這兩個HPIV-2 ca/ts候選疫苗。見表9A和9B。盡管它們中的兩只僅釋放病毒一天(95N148和95N139)，我們仍從4只接受C3490的猴子中的每一只的鼻洗液(NW)樣品中分離到病毒。我們從4只接受C3605(502庫)的猴子中3只的NW中分離到病毒。C3605組中一只動物95N152盡管其接種時為血清陽性(HAI滴度=32)，但有兩天釋放病毒。第7天從釋放HPIV-2動物的NW中回收病毒之平均高峰滴度對C3490為1.5pfu/ml，對C3605為1.4pfu/ml。接種C3490或C3605ca/ts HPIV-2候選疫苗的8只猴子中沒有一只從下呼吸道(也就是支氣管灌洗樣品)中釋放病毒。從安慰劑接受者中的任何一只也未分離到HPIV-2?？偟膩碚f，在C3490組的兩只動物(95N140和95N139)中HAI數(shù)值顯示出極小的增加(＜4至8)，而在95N148號猴子中HAI滴度從第28天的8增加至第42天和第56天的32。然而，該猴子從第0天至21天顯示的滴度為16，因此滴度從8增加至32可能并不代表抗體應答的有力事實。
在接受C3605組或安慰劑接受者中沒有HAI抗體增加。分裝的稀釋疫苗的反向滴定結果顯示，該實驗的接種物太低。確定后接種物的反向滴定對C3490來說大約1.0pfu/ml，對C3605來說大約2.5pfu/ml。從該數(shù)據(jù)中，任何人都能看出疫苗株在下呼吸道是減毒的。
在最初用ca/ts克隆C3605接種后六十五天，用單個wt HPIV-2接種體攻擊四只猴子中的每一只。見表11。安慰劑接受者也接受wt HPIV-2攻擊病毒。從任何接種C3605的猴子中都回收不到病毒；但是，兩只最初接受安慰劑然后用wt HPIV-2攻擊的動物，從其NW和BL樣品中均有病毒釋放。接種C3605的4只猴子中有3只對wt HPIV-2攻擊病毒的HAI抗體應答非常強。用wt HPIV-2攻擊后至第7天有明顯的≥64的HAI滴度。第四只猴子95N204在攻擊后至第28天血清轉換。接受安慰劑然后接受攻擊病毒的動物，其HAI抗體應答上升至類似實施例4中接種wt HPIV-2的猴子之水平。也就是兩只猴子在攻擊后至第21天均血清轉換。
為舉例說明和描述，已介紹了前述本發(fā)明之描述及優(yōu)選實施方案。它們并不完全也不是要把發(fā)明限制于公開的具體形式，按照上面的講授，許多修改和變化是可能的。這些對本領域熟練技術人員顯而易見的修改和變化在本發(fā)明范圍之內。
表1對wt親本和PIV-2(SLU7255)所選克隆冷適應特性的表征病毒滴度(logpfu/ml)克隆#23℃ D723℃ D1432℃ D7C3252＜2＜2 ＜2C33964.86.7 6.4C34643.15.3 6.8C34903.86.0 5.7C34574.06.4 6.2C34403.45.8 6.5C34443.85.7 5.3Pool453 ＜2＜2 6.1(野生型PIV-2)
表2wt親本(453庫)和PIV-2(SLU7255)所選克隆之空斑形成效率(EOP)分析克隆cp病毒滴度(pfu/mL)# 水平 32℃ 36℃ 37℃ 38℃39℃C3252382.83.02.52.7 ＜2C3396506.36.46.05.9 2.8C3464506.15.85.34.6 ＜2C3490635.24.94.54.4 ＜2C3457565.45.34.95.2 ＜2C3440474.84.94.64.5 ＜2C3444635.85.75.15.3 2.8庫4530 7.07.27.17.0 6.9
表3PIV-2所選克隆的冷適應和溫度敏感表型
表4用于接種倉鼠的wt和ca PIV-2庫的滴度
表5病毒滴度(32℃的log pfu/ml)周1 周2 周3周4
周1周2 周3 周4
表6PIV-2亞克隆的表型親代克隆 亞克隆 病毒滴度(log pfu/mL)# #庫#32℃39℃C3490 C35914744.4＜1C3490 C35924745.4＜1C3490 C35934745.3＜1C3490 C35944747.0＜1C3490 C35954746.2＜1C3490 C35964746.7＜1C3490 C35974746.3＜1C3490 C35984747.4＜1C3490 C35994746.8＜1C3490 C36004745.8＜1C3440 C36014777.23.1C3440 C36024776.9＜1C3440 C36034777.3＜1C3440 C36044776.6＜1C3440 C36054777.3＜1C3440 C36064776.6＜1C3440 C36074777.1＜1C3440 C36084777.1＜1C3440 C36094774.7＜1C3440 C36104776.74.4C3464 C36214845.5＜1C3464 C36224846.0＜1C3464 C36234845.5＜1C3464 C36254846.2＜1C3464 C36274846.9＜1C3464 C36284847.0＜1對照 4916.46.2
表7用于血清陰性恒河猴接種的HPIV-2(SLU7255)之wt和減毒庫的滴度庫#克隆#冷傳代水平病毒滴度(log pfu/ml)32℃39℃499C3464505.4 2.0500C3490637.2 1.3502C3605*477.8 ＜1.0504wt 0 6.4 6.6*C3605是C3440的亞克隆表8來自用wt HPIV-2接種的恒河猴的樣品
a)NW=鼻洗液b)BL=支氣管灌洗；*=以RMK數(shù)據(jù)為根據(jù)的滴度，一個陽性管=1.0，兩個HA陽性管=≥1.5
表9A收集自用C3490或C3605 HPIV-2候選疫苗接種的恒河猴樣品的病毒學和免疫學結果
表9B收集自用C3490或C3605 HPIV-2候選疫苗接種的恒河猴樣品的病毒學和免疫學結果
a)NW=鼻洗液；b)BL=支氣管灌洗；c)=未分離到病毒；d)=所有時間點的血樣5/21/98的HAI數(shù)據(jù)*以RMK數(shù)據(jù)為根據(jù)的滴度，一個HA陽性管=1.5，兩個HA陽性表10來自用502庫或安慰劑接種的恒河猴的樣品
a)NW=鼻洗液；b)BL=支氣管灌洗；*=以RMK數(shù)據(jù)為根據(jù)的滴度，一個陽性管=1.0，兩個HA陽性管=≥1.5
表11來自用502庫或安慰劑接種然后用wt HPIV-2攻擊的恒河猴的樣品
a)NW=鼻洗液；b)BL=支氣管灌洗；*=以RMK數(shù)據(jù)為根據(jù)的滴度，一個陽性管=1.0，兩個HA陽性管=≥1.5參考文獻Belshe,R.B.，和Hissom,F.K.(1982).3型副流感病毒的冷適應誘導三種表型標志，醫(yī)學病毒學雜志(J.Med.Virol.)10,235-242.
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權利要求
1．一種分離的2型人副流感病毒減毒病毒株。
2．權利要求1的分離的減毒病毒株，其在用Vero細胞的空斑分析中顯示滴度，32℃左右在哺乳動物宿主細胞中生長時其滴度比23℃左右在哺乳動物宿主細胞中生長時其滴度的100倍小，并且與39℃左右在哺乳動物宿主細胞中生長時其滴度的大約100倍相比相等或較小。
3．權利要求1的分離的減毒病毒株，其在用Vero細胞的空斑分析中顯示滴度，當于39℃左右在哺乳動物宿主細胞中生長時，滴度小于或等于大約1.0pfu/ml。
4．權利要求1的分離的減毒病毒株，其選自命名為C3396、C3464、C3490、C3457、C3440、C3444的病毒株組、及任何前面提到的病毒株之亞克隆或子代。
5．權利要求1的分離的減毒病毒株，其選自命名為C3464、C3490、C3440的病毒株、及任何前面提到的病毒株之亞克隆或子代。
6．一種含有權利要求1的分離的減毒病毒株及藥學可接受的載體的疫苗組合物。
7．權利要求6的疫苗組合物，其進一步包括藥學可接受的賦形劑。
8．權利要求6的疫苗組合物，其進一步包括藥學可接受的佐劑。
9．權利要求6的疫苗組合物，其中分離的減毒病毒株是權利要求2的病毒株。
10．權利要求9的疫苗組合物，其進一步包括藥學可接受的賦形劑。
11．權利要求9的疫苗組合物，其進一步包括藥學可接受的佐劑。
12．權利要求6的疫苗組合物，其中分離的減毒病毒株是權利要求4的病毒株。
13．權利要求12的疫苗組合物，其進一步包括藥學可接受的賦形劑。
14．權利要求12的疫苗組合物，其進一步包括藥學可接受的佐劑。
15．權利要求6的疫苗組合物，其中分離的減毒病毒株是權利要求5的病毒株。
16．權利要求15的疫苗組合物，其進一步包括藥學可接受的賦形劑。
17．權利要求15的疫苗組合物，其進一步包括藥學可接受的佐劑。
18．一種在哺乳動物中誘導保護性免疫應答的方法，包括給哺乳動物施用足夠引起保護性免疫應答的量的權利要求1之分離的減毒病毒株。
19．權利要求18的方法，其中分離的減毒病毒株是權利要求2的病毒株。
20．權利要求18的方法，其中分離的減毒病毒株是權利要求3的病毒株。
21．權利要求18的方法，其中分離的減毒病毒株是權利要求4的病毒株。
22．權利要求18的方法，其中分離的減毒病毒株是權利要求5的病毒株。
全文摘要
本發(fā)明涉及2型人副流感病毒(HPIV－2)的分離的減毒病毒株,其用于活疫苗制備。這些病毒株顯示出溫度敏感和冷適應表型,這對在接種的哺乳動物體內激發(fā)保護性免疫應答而不產生嚴重癥狀有用。
文檔編號A61P31/16GK1314940SQ99808842
公開日2001年9月26日 申請日期1999年8月31日 優(yōu)先權日1998年9月1日
發(fā)明者R·B·貝爾希, F·K·紐曼 申請人:圣路易斯大學