溫度敏感型載體pBBR1MCS-2-Ts4及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中溫度敏感型載體pBBR1MCS-2-Ts4及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 把一段有用的目的DNA片段通過DNA重組技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行復(fù)制和表 達(dá)的工具叫載體（Vector)。質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體，質(zhì)粒存在于許多細(xì)菌以及 酵母菌等生物中，是細(xì)胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子。一個(gè)理想的載體 大致應(yīng)有下列一些特性：（1)分子量小、多拷貝、松弛控制型；（2)具有多種常用的限制性內(nèi) 切酶的單切點(diǎn)；（3)能插入較大的外源DNA片段；(4)具有遺傳標(biāo)記，便于鑒定和篩選；（5) 對宿主細(xì)胞無害。
[0003] 寬宿主質(zhì)粒pBBRlMCS-2是應(yīng)用性很廣的載體，該質(zhì)粒由pBBRl質(zhì)粒改造而來。 pBBRl質(zhì)粒來源于革蘭氏陰性菌BordetellabronchisepticaS87(AntoineRandLocht C.Isolationandmolecularcharacterizationofanovelbroad-host-rangeplasmid fromBordetellabronchisepticawithsequencesimilaritiestoplasmidsfrom Gram-positiveorganisms.MolMicrobiol. 1992, 6 (13) : 1785-1799)。pBBRlMCS-2 含有一 個(gè)卡那霉素（kan)抗性篩選標(biāo)記，它的大小僅有5145bp，這些特性使得該質(zhì)粒適用于DNA克 隆、蛋白表達(dá)，廣泛用于革蘭氏陰性菌的分子操作。
[0004] 溫度敏感型質(zhì)粒載體可以方便的控制質(zhì)粒在宿主中的存在。當(dāng)溫度比較低時(shí)，質(zhì) 粒可以存在宿主中，而當(dāng)溫度提高后，溫度敏感型質(zhì)粒載體將丟失或整合到染色體上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何構(gòu)建溫度敏感型載體。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了構(gòu)建重組載體的方法。
[0007] 本發(fā)明所提供的構(gòu)建重組載體的方法，是將SEQIDNo. 1的第1557-2526位所示 的DNA片段替換為目的基因表達(dá)盒，并保持SEQIDNo. 1的其他核苷酸不變，得到的重組 DNA即為所述重組載體，將該重組載體命名為pBBRlMCS-2-Ts3;
[0008] 所述目的基因表達(dá)盒編碼的蛋白質(zhì)為將SEQIDNo. 2所示的蛋白質(zhì)進(jìn)行A4)的改 造、保持SEQIDNo.2的其它氨基酸殘基均不變得到的蛋白質(zhì)得到的蛋白質(zhì)，即所述目的基 因表達(dá)盒編碼的蛋白質(zhì)為SEQIDNo. 10所示的蛋白質(zhì)；所述A4)為如下A41)和/或A42):
[0009]A41)將 SEQIDNo. 2 第 25 位的Lys 突變?yōu)镚lu;
[0010] A42)將 SEQIDNo. 2 第 146 位的lie突變?yōu)閂al。
[0011] 上述方法中，所述目的基因表達(dá)盒中的目的基因?yàn)閷EQIDNo. 1的第1794-2456 位核苷酸所示的DNA分子進(jìn)行B4)的改造、保持SEQIDNo. 1的第1794-2456位核苷酸所 示的DNA分子中的其它核苷酸均不變得到的DNA分子；所述B4)為如下B41)和/或M2):
[0012] B41)將 SEQIDNo. 1 第 1866 位的A 突變?yōu)镚;
[0013] B42)將 SEQIDNo. 1 第 2229 位的A 突變?yōu)镚。
[0014] 其中，SEQIDNo. 1由5145個(gè)核苷酸組成，SEQIDNo. 1的第1794-2456位核苷酸 為rep的編碼基因，編碼SEQIDNo. 2所示的rep蛋白。
[0015] 上述方法中，所述目的基因表達(dá)盒的序列可為SEQIDNo. 9。
[0016] 其中，SEQIDNo. 9的第238-900位編碼SEQIDNo. 10所示的蛋白質(zhì)。
[0017] 上述方法中，所述目的基因表達(dá)盒中啟動(dòng)所述目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子為將SEQID No. 1的第1557-1793位所示的DNA分子進(jìn)行如下C2)、C3)和C4)這三種中至少一種的改 造、保持SEQIDNo. 1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不變得 到的DNA分子：
[0018] C2)如下C21)和 / 或C22):
[0019] C21)將 SEQIDNo. 1 第 1732 位的 A突變?yōu)镚 ;
[0020] C22)將 SEQIDNo. 1 第 1780 位的 G突變?yōu)門 ;
[0021] C3)如下C31)和 / 或C32):
[0022] C31)將 SEQIDNo. 1 第 1747 位的 C突變?yōu)門 ;
[0023]C32)將 SEQID No. 1第 1776 位的 T突變?yōu)锳;
[0024] C4)將SEQIDNo. 1 第 1751 位的T突變?yōu)锳;
[0025] 所述目的基因表達(dá)盒中終止所述目的基因表達(dá)的終止子為SEQIDNo.1的第 2457-2526位所示的DNA分子。
[0026] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了由所述方法構(gòu)建的重組載體。
[0027] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了含有所述重組載體的重組微生物或重組細(xì) 胞系。
[0028] 所述重組微生物具體可為細(xì)菌、酵母、藻和真菌。其中，所述細(xì)菌可為大腸桿 菌或類球紅細(xì)菌。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌EscherichiacoliT1、大腸桿菌 EscherichiacoliDH5a、大腸桿菌EscherichiacoliBW25113 或大腸桿菌Escherichia coliS17-1。所述類球紅細(xì)菌具體可為類球紅細(xì)菌Rhodobactersphaeroides2. 4. 1。
[0029] 所述重組細(xì)胞系不包括繁殖材料。
[0030] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述蛋白質(zhì)。
[0031] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述目的基因。
[0032] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了DNA分子。
[0033] 本發(fā)明所提供的DNA分子，為將SEQIDNo.1的第1557-1793位所示的DNA分子 進(jìn)行所述C4)的改造、保持SEQIDNo.1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其 它核苷酸均不變得到的DNA分子。
[0034] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述目的基因或所述DNA分子在制備溫度 敏感載體中的應(yīng)用。
[0035] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述任一應(yīng)用：
[0036] L1、所述DNA分子在作為啟動(dòng)子中的應(yīng)用；
[0037] L2、所述重組載體在作為溫度敏感載體中的應(yīng)用。
[0038]上述L2所述應(yīng)用可為所述重組載體在大腸桿菌或類球紅細(xì)菌中作為溫度敏 感載體中的應(yīng)用。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌EscherichiacoliT1、大腸桿菌 EscherichiacoliDH5a、大腸桿菌EscherichiacoliBW25113 或大腸桿菌Escherichia coliS17-1。所述類球紅細(xì)菌具體可為類球紅細(xì)菌Rhodobactersphaeroides2. 4. 1。
[0039] 本申請中，所述溫度敏感載體為所述載體在一定溫度下可存在于宿主中，而改變 溫度后，所述載體不能存在于所述宿主中。具體可為所述載體在30°C下可存在于宿主中，當(dāng) 溫度為37°C-42°C時(shí)，所述載體不能存在于所述宿主中。
[0040] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的重組載體PBBRlMCS-2-Ts4為溫度敏感載體：在宿主菌 分別為大腸桿菌EscherichiacoliT1、大腸桿菌EscherichiacoliDH5a、大腸桿 菌EscherichiacoliBW25113 和大腸桿菌EscherichiacoliS17-1 時(shí)，pBBRlMCS-2 和pBBRlMCS-2-Ts4在30°CLB液體培養(yǎng)基和30°CLB+kan液體培養(yǎng)基中的丟失率以及 pBBRlMCS-2在42°CLB液體培養(yǎng)基中的丟失率均在10%以下，而pBBRlMCS-2-Ts4在42°CLB 液體培養(yǎng)基中的丟失率均達(dá)到99. 99%;在宿主菌為類球紅細(xì)菌Rhodobactersphaeroides 2. 4. 1 時(shí)，pBBRlMCS-2 和pBBRlMCS-2-Ts4 在 30°CLB液體培養(yǎng)基和 30°CLB+kan液體培 養(yǎng)基中的丟失率以及PBBR1MCS-2在37°CLB液體培養(yǎng)基中的丟失率均在13 %以下，而 pBBRlMCS-2-Ts4在37°CLB液體培養(yǎng)基中的丟失率均達(dá)到78. 57%。
[0041] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的重組載體PBBRlMCS-2-Ts4為溫度敏感載體可應(yīng)用于：（1)載 體消除，即通過提高溫度移去載體；（2)單交換同源重組，即通過提高溫度，讓載體DNA整合 到染色體的同源區(qū)域；（3)雙交換同源重組，即通過提高溫度，讓載體DNA替換染色體上一 段DNA。
【附圖說明】
[0042] 圖 1 為pBBRlMCS-2 的圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0044] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0045] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0046] 下述實(shí)施例中的寬宿主載體pBBRlMCS-2為Biovector中國質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株 基因保藏中心產(chǎn)品。
[0047] 下述實(shí)施例中的大腸桿菌Escherichia coli T1為北京全式金生物技術(shù)有限公司 產(chǎn)品，目錄號(hào)為CD501-01。
[0048] 下述實(shí)施例中的大腸桿菌EscherichiacoliDH5a為寶生物工程（大連）有限 公司，目錄號(hào)為9057。
[0049] 下述實(shí)施例中的大腸桿菌EscherichiacoliBW25113為Biovector中國質(zhì)粒載 體菌株細(xì)胞株基因保藏中心產(chǎn)品。
[0050] 下述實(shí)施例中的大腸桿菌EscherichiacoliS17-1為Biovector中國質(zhì)粒載體 菌株細(xì)胞株基因保藏中心產(chǎn)品。
[0051] 下述實(shí)施例中的類球紅細(xì)菌Rhodobactersphaeroides2. 4. 1為美國模式菌種收 集中心（ATCC)產(chǎn)品，菌株號(hào)為17023。
[0052] 下述實(shí)施例中的Sistrom培養(yǎng)基在文獻(xiàn)（SistromWR.Thekineticsof the synthesis of photopigments in Rhodopseudomonas sphaeroides. J.Gen. Microbiol. 1962. 28:607-616)中報(bào)道過。
[0053] 下述實(shí)施例中的LB液體培養(yǎng)基為由溶質(zhì)和溶劑組成無菌培養(yǎng)基，溶劑為水，溶質(zhì)