焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)cyp2e1基因多態(tài)性的引物對(duì)及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)CYP2E1基因多態(tài) 性的引物對(duì)，包含所述引物對(duì)的試劑盒及該試劑盒的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] CYP2E1是代謝內(nèi)源和外源性物質(zhì)的細(xì)胞色素酶P450超家族中的一員，主要參與 亞硝胺及其前致癌物N-亞硝基二甲胺和N-亞硝基四吡咯烷的代謝，同時(shí)參與酒精的氧化 代謝和產(chǎn)生自由基而啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化。
[0003] CYP2E1 基因多態(tài)性包括 C1053T (即 rs2031920 位點(diǎn)）、G1293C (即 rs3813867 位 點(diǎn)）等多種突變類型，它們與肺癌、肝癌和鼻咽癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。
[0004] 當(dāng)前國(guó)內(nèi)外廣泛使用的分子生物學(xué)檢測(cè)CYP2E1基因多態(tài)性的方法中，熒光定量 PCR存在著檢測(cè)通量的局限性和假陽(yáng)性的缺點(diǎn)，所以都還不能真正滿足臨床診斷檢測(cè)的需 要。傳統(tǒng)的固相生物芯片（Biochip)或基因芯片技術(shù)存在著可重復(fù)性差、靈敏度不夠好以 及操作繁瑣的突出弱點(diǎn)。
[0005] 焦磷酸測(cè)序技術(shù)（Pyrosequencing)是新一代DNA序列分析技術(shù)，具備同時(shí)對(duì)大量 樣品進(jìn)行測(cè)序分析的能力，為高通量、低成本、快速、直觀地進(jìn)行核苷酸分析和臨床檢驗(yàn)提 供了非常理想的技術(shù)操作平臺(tái)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出一種焦磷酸測(cè)序法 同時(shí)檢測(cè)CYP2E1基因多態(tài)性的引物對(duì)以及含有所述引物對(duì)的試劑盒，可以同時(shí)檢測(cè) C1053T(rs2031920)和G1293C(rs3813867)兩種突變類型，具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn) 確度、檢測(cè)迅速等優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提出了一種焦磷酸測(cè)序法同時(shí)檢 測(cè)CYP2E1基因多態(tài)性的引物對(duì)，所述的CYP2E1突變位點(diǎn)為C1053T (rs2031920)和 G1293C(rs3813867)中的任意一種或兩種，其特征在于，所述引物對(duì)包括：
[0008] (1)對(duì)于 C1053T(rs2031920)突變位點(diǎn)：
[0009] 擴(kuò)增引物為：
[0010] 上游引物：5，-GGCATAACTCAAAATCCACAAGTG-3，，
[0011] 下游引物：5' -CAGACCCTCTTCCACCTTCTATGA-3'，
[0012] 其中上游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0013] 測(cè)序引物為：
[0014] 5' -AATTCATAGGTTGCAATT-3r ；
[0015] (2)對(duì)于 G1293C(rs3813867)突變位點(diǎn)：
[0016] 擴(kuò)增引物：
[0017] 上游引物：5' -CCCCTTCTTGGTTCAGGAGAG-3'，
[0018] 下游引物：5' -GTCATTGGTTGTGCTGCACCTAA-3'，
[0019] 其中上游引物的Y端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0020] 測(cè)序引物：
[0021] 5' -GCTGCACCTAACACTG-S， 。
[0022] 本發(fā)明進(jìn)一步提出了一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)CYP2E1基因多態(tài)性的試劑盒，所述 的CYP2E1突變位點(diǎn)為C1053T(rs2031920)和G1293C(rs3813867)中的任意一種或兩種，其 特征在于，所述試劑盒包含質(zhì)控品和如下引物：
[0023] (1)對(duì)于 C1053T(rs2031920)突變位點(diǎn)：
[0024] 擴(kuò)增引物：
[0025] 上游引物：5，-GGCATAACTCAAAATCCACAAGTG-3，，
[0026] 下游引物：5' -CAGACCCTCTTCCACCTTCTATGA-3'，
[0027] 其中上游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0028] 測(cè)序引物：
[0029] 5' -AATTCATAGGTTGCAATT-3r ；
[0030] (2)對(duì)于 G1293C(rs3813867)突變位點(diǎn)：
[0031] 擴(kuò)增引物：
[0032] 上游引物：5' -CCCCTTCTTGGTTCAGGAGAG-3'，
[0033] 下游引物：5' -GTCATTGGTTGTGCTGCACCTAA-3'，
[0034] 其中上游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0035] 測(cè)序引物：
[0036] 5' -GCTGCACCTAACACTG-S， 。
[0037] 其中，所述質(zhì)控品包括陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，其中，所述的陽(yáng)性對(duì)照品為含有 C1053T(rs2031920)和G1293C(rs3813867)突變位點(diǎn)的質(zhì)粒的混合液，所述的陰性對(duì)照品 與陽(yáng)性對(duì)照品相比，為不含C1053T(rs2031920)和G1293C(rs3813867)突變位點(diǎn)的質(zhì)粒溶 液。
[0038] 本發(fā)明還提出了上述引物對(duì)及包含上述引物對(duì)的試劑盒在制備檢測(cè)CYP2E1基因 多態(tài)性的試劑中的應(yīng)用。
[0039] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)CYP2E1基因多態(tài)性的試 劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)C1053T(rs2031920)和G1293C(rs3813867)兩 種基因多態(tài)性，為制備用于檢測(cè)C1053T(rs2031920)和G1293C(rs3813867)突變位點(diǎn)的試 劑提供了理論基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 實(shí)驗(yàn)材料：
[0041] 引物由invitrogen公司合成；DNA提取試劑盒、多重PCR試劑盒及焦磷酸測(cè)序試 劑購(gòu)置于QIAGEN公司。
[0042] 一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)CYP2E1基因多態(tài)性的試劑盒，CYP2E1的突變位點(diǎn)為 C1053T(rs2031920)和G1293C(rs3813867)中的任意一種或兩種，包括質(zhì)控品和如下引物：
[0043] (1)對(duì)于 C1053T(rs2031920)位點(diǎn)：
[0044] 擴(kuò)增引物：
[0045] 上游引物：5' -GGCATAACTCAAAATCCACAAGTG-3'，
[0046] 下游引物：5' -CAGACCCTCTTCCACCTTCTATGA-3'，
[0047] 其中上游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0048] 測(cè)序引物：
[0049] 5' -AATTCATAGGTTGCAATT-3，，
[0050] (2)對(duì)于 G1293C(rs3813867)位點(diǎn)：
[0051] 擴(kuò)增引物：
[0052] 上游引物：5' -CCCCTTCTTGGTTCAGGAGAG-3'，
[0053] 下游引物：5' -GTCATTGGTTGTGCTGCACCTAA-3'，
[0054] 其中上游引物的5'端進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0055] 測(cè)序引物：
[0056] 5' -GCTGCACCTAACACTG-S， 。
[0057] 其中，質(zhì)控品（質(zhì)控品DNA)包括陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，所述的陽(yáng)性對(duì)照品 為含有C1053T(rs2031920)和G1293C(rs3813867)突變位點(diǎn)的質(zhì)粒的混合液；所述的陰 性對(duì)照品作為陰性對(duì)照，與陽(yáng)性對(duì)照品相比，陰性對(duì)照品為不含C1053T(rs2031920)和 G1293C(rs3813867)突變位點(diǎn)的質(zhì)粒溶液。
[0058] 檢測(cè)方法包括如下步驟：
[0059] ( -）DNA 提?。?br>[0060] 1?26號(hào)樣本為中國(guó)人外周靜脈血（EDTA或肝素抗凝）或唾液及口腔粘膜采集的 樣本。對(duì)于外周靜脈血（EDTA或肝素抗凝）樣本，按照QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒的說(shuō)明提取DNA。對(duì)于唾液及口腔粘膜采集的樣本，按照QIAGEN公司的 Gentra Puregene Buccal Cell Kit 試劑盒的說(shuō)明提取 DNA。
[0061] (二）多重 PCR 擴(kuò)增：
[0062] 按照如下方法對(duì)上述的1?26號(hào)樣本的DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，采用的是QIAGEN 公司的多重Multiplex PCR試劑盒，反應(yīng)體系如下：
[0063] Template DNA 或j貢控二 DNA 10μ1 2xQIAGEN Multiplex PCR Master Mix 25μ1 IQxPrimcr mix 5μ1 RNasc-free water 10μ1 終體積為50 μ?
[0064] 其中，2XQIAGEN Multiplex PCR Master Mix 中含熱啟動(dòng)TaqDNA酶、MgC12和 dNTP Mix ; 10 XPrimer mix為包含上述兩種突變位點(diǎn)的引物對(duì)的混合物。
[0065] PCR 擴(kuò)增程序：95°C 15min ;94°C 30s，55°C 90s，72°C 90s，35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ; 4 C保溫。
[0066] 通過(guò)上述步驟，獲得PCR產(chǎn)物。
[0067] (三）焦磷酸測(cè)序
[0068] 首先，用微珠固定PCR產(chǎn)物，其主要是將生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物固定到鏈霉親和素 包被的瓊脂糖微珠 （Streptavidin Sepharose High Performance)上，包括如下步驟：
[0069] (1)輕搖包被鏈霉親和素的瓊脂糖微珠，直至獲得均質(zhì)溶液；
[0070] (2)在一個(gè)試管中混合鏈霉親和素包被的瓊脂糖微珠總量（2 μ 1/樣品）與結(jié)合緩 沖液（40 μ 1/樣品），添加超純水至一定體積，該體積與后續(xù)所要添加優(yōu)化好的生物素