一種褐潮藻種檢測方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及藻類檢測技術領域，尤其涉及一種褐潮藻種檢測方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 褐潮藻種Aureococcus anophagefferens在分類學上屬于原生藻菌門 (Stramenopiles)、浮生藻綱（Pelagophyceae)。自2009年開始，我國秦皇島近岸海域出現(xiàn) 了由 Aureococcus anophagefferens (簡寫為 A. anophagefferens)引發(fā)的有害赤潮--褐 潮，給北戴河濱海旅游業(yè)和水產養(yǎng)殖造成極為嚴重的影響。對于我國而言，褐潮是一種新型 生態(tài)災害，其原因種A. anophagefferens的藻細胞不僅太小（約3 μπι)，而且沒有明顯的形 態(tài)特征，采用在顯微鏡下觀察藻細胞形態(tài)的傳統(tǒng)方法進行物種鑒定非常困難，急需找到一 種快速有效的定性定量檢測技術，為監(jiān)測褐潮的發(fā)生和發(fā)展過程、及時預防褐潮暴發(fā)所帶 來的危害提供技術支持。目前分子探針技術是對藻類種群動態(tài)進行直接監(jiān)測的主要發(fā)展 方向，而大量、連續(xù)甚至實時跟蹤監(jiān)測目標藻類種群動態(tài)變化過程，是開展有害褐潮暴發(fā)機 理、預防褐潮暴發(fā)研宄的基礎。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術問題是，鑒于傳統(tǒng)方法鑒定褐潮藻種比較困難，提供一種 定性、定量的褐潮藻種檢測方法，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、連續(xù)可測、操作簡便、易于控制、 分析時間短等優(yōu)點。
[0004] 本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案如下：
[0005] 一種褐潮藻種檢測方法，包括以下步驟：
[0006] 1)設計并合成特異引物和探針：
[0007] 采用序列比對軟件（如ClustalW)比對A. anophagefferens和GenBank中與其親 緣關系較近的藻種（如Aureoumbra Iagunensis和Pelagococcus subviridis)的 18S rDNA 序列，設計A. anophagefferens的特異性引物AanF、AanR和探針Aan probe，進行合成；
[0008] 所述引物 AanF 具有如 SEQ ID NO. 1 所示的序列：AAAGCTCGTAGTTGGATTCCTGG ;
[0009] 所述引物 AanR 具有如 SEQ ID NO. 2 所示的序列：GTGTTCAACGCAGGCTTACG ;
[0010] 所述探針 Aan probe 具有如 SEQ ID NO. 3 所示的序列：CTTGCGATGGTCTATCCT ;
[0011] 2)構建重組質粒標準品：
[0012] a)選擇標準品藻株：由于目前我國褐潮暴發(fā)藻種還未實現(xiàn)室內純化培養(yǎng)，因 此選擇A. anophagefferens (CCMP1784)藻株作為標準品藻株，所述標準品藻株購自 NCMA (National Center for Marine Algae and Microbiota)，經檢測與我國褐潮原因種具 高度同源性（同源性可以達到99.7%)，接種，采用（f/2+Si)培養(yǎng)液培養(yǎng)，獲得標準品藻株 培養(yǎng)液；
[0013] b)利用顯微鏡檢測標準品藻株培養(yǎng)液的藻細胞數(shù)，利用0. 45 μ m濾膜過濾，收集 藻細胞，將帶有藻細胞的濾膜_20°C保存；
[0014] c)將步驟b)所述濾膜上的藻細胞提取DNA，并利用引物SSU-F (如SEQ ID NO. 4 所示）和SSU-R (如SEQ ID NO. 5所示）PCR擴增后測序驗證，當測序結果與預期序列一致 后，即為藻細胞標準品DNA提取液；
[0015] d)以步驟c)得到的藻細胞標準品DNA提取液為模板，利用引物AanF和引物AanR 進行PCR擴增，得到PCR產物，并純化，得到純化產物；將純化后的PCR產物采用TaKaRa pMD?18-T Vector Cloning Kit進行連接轉化克隆，提取質粒并測序，比對序列，與預期序 列一致說明結果正確，得到的質粒即為重組質粒標準品。
[0016] 3)構建標準曲線：
[0017] a)選取步驟2)獲得的重組質粒標準品，利用Nanodrop 2000測定其質量濃度，根 據(jù)質粒濃度與拷貝數(shù)換算公式：拷貝數(shù)濃度=(質量濃度X 1〇_9Χ6. 02X 1023V(堿基對 數(shù)X 660)，計算獲得質粒拷貝數(shù)濃度（copies/μ L)，將其按照10倍梯度系列稀釋；
[0018] 取至少5個梯度的重組質粒標準品，每個濃度樣品一式三份，作為熒光定量PCR擴 增的模板，利用引物AanF、AanR和探針Aan probe進行熒光定量PCR擴增，得到Ct值；將質 粒拷貝數(shù)的對數(shù)值（以10為底）與相應Ct值進行線性回歸分析，最終獲得重組質粒標準 品的Ct-質?？截悢?shù)標準曲線；
[0019] b)選取步驟2)得到的已知A. anophagefferens藻細胞數(shù)量的藻細胞標準品DNA 提取液，進行10倍系列梯度稀釋，取至少5個梯度的藻細胞標準品DNA提取液模板作為模 板，每個濃度樣品一式三份，用AanF、AanR和探針Aan probe進行熒光定量PCR擴增，得到 Ct值；將藻細胞數(shù)的對數(shù)值（以10為底）與相應Ct值進行線性回歸分析，得到藻細胞標 準品DNA提取液的Ct-藻細胞數(shù)標準曲線；
[0020] c)通過步驟a)中得到的重組質粒標準曲線和步驟b)中得到的藻細胞標準曲線， 以質?？截悢?shù)為橫坐標、藻細胞數(shù)對數(shù)（以10為底）為縱坐標，得到質粒拷貝數(shù)-藻細胞 數(shù)標準曲線；
[0021] 4)引物和探針特異性驗證：分別提取中肋骨條藻、三角褐指藻、海洋小球藻和海 洋原甲藻中的DNA，分別以雙蒸水、中肋骨條藻DNA提取液、三角褐指藻DNA提取液、海洋小 球藻DNA提取液和海洋原甲藻DNA提取液為陰性對照，以引物AanF、引物AanR和探針Aan Probe進行熒光定量PCR擴增，當檢測不到擴增曲線時，說明所用引物和探針不能用于這些 樣品的檢測，進一步說明所述引物和探針為褐潮藻種的特異性引物和探針
[0022] 5)檢測樣品和結果分析：
[0023] a)提取待測樣品DNA :采集表層水樣，記錄待測樣品的體積，每個站位取至少3個 平行樣，立即用〇. 45 μ m濾膜過濾，藻細胞被濾膜收集，帶有藻細胞的濾膜-20°c保存；提取 濾膜上的藻細胞中的DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，分裝，保存，作為未知待測樣品DNA提 取液；
[0024] b)步驟a)得到的未知待測DNA提取液為模板，利用引物AanF、AanR和探針Aan probe進行熒光定量PCR擴增，得到Ct值，根據(jù)步驟3)得到的Ct-質?？截悢?shù)標準曲線、 Ct-藻細胞數(shù)標準曲線、質?？截悢?shù)-藻細胞數(shù)標準曲線，計算待測樣品中的藻細胞數(shù)，除 以待測樣品的體積，得到藻細胞密度。
[0025] 本發(fā)明所述的DNA提取方法可以采用常規(guī)的DNA提取方法，也可以采用市售的試 劑盒進行提取，如本發(fā)明所述的實施例中利用土壤DNA提取試劑盒UltraClean? Soil DNA Isolation Kit (Mo Bio Laboratories, Inc.，Solana Beach, California, USA)提取 DNA〇
[0026] 本發(fā)明所述的藻細胞標準品DNA提取液和重組質粒標準品可以在_80°C下長期保 存（一年以內），保存時間超過1年后，為了保證檢測結果的精確性，藻細胞標準品DNA提取 液和重組質粒標準品建議重新提取A. anophagefferens的DNA和構建重組質粒標準品。
[0027] 一種利用上述褐潮藻種檢測方法制備的褐潮藻種檢測試劑盒，包括：重組質粒標 準品、藻細胞標準品DNA提取液、引物AanF、引物AanR、探針Aan prob e、陰性對照、焚光定量 PCR擴增試劑。
[0028] 所述熒光定量 PCR 擴增試劑包括：2XPROBE FAST qPCR Master Mix Universal、 ROX校正染料、PCR級無菌水，所述熒光定量PCR擴增試劑均為市售。
[0029] 所述陰性對照為雙蒸水、中肋骨條藻DNA提取液、三角褐指藻DNA提取液、海洋小 球藻DNA提取液和海洋原甲藻DNA提取液。
[0030] 本發(fā)明的有益效果是：
[0031] 本發(fā)明所述的褐潮藻種檢測方法是一種針對褐潮藻種的快速、有效的檢測技術， 既可以用于定性檢測，也可以用于定量檢測；為監(jiān)測褐潮的發(fā)生和發(fā)展過程、及時預防褐潮 暴發(fā)所帶來的危害提供技術支持；通過分子探針技術對藻類種群動態(tài)進行直接監(jiān)測，可以 大量、連續(xù)甚至實時跟蹤監(jiān)測目標藻類種群動態(tài)變化過程，是開展有害褐潮暴發(fā)機理、預防 褐潮暴發(fā)研宄的基礎。本發(fā)明所述的褐潮藻種檢測方法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、連續(xù)可 測、操作簡便、易于控制、分析時間短等優(yōu)點，本發(fā)明所述的特異性引物和探針具有良好的 特異性。
[0032] 另外，本發(fā)明所述的褐潮藻種檢測方法還具備如下優(yōu)勢：A. anophagefferens的 藻細胞標準品DNA提取液和制作好的A. anophagefferens重組質粒標準品保存在-80°C下， 可以長期保存。因此不需要每次測定樣品都需要提取藻細胞DNA和構建重組質粒標準品， 只需要利用已構建好的重組質粒標準品和藻細胞標準品DNA提取液構建標準曲線，生成質 ?？截悢?shù)-藻細胞數(shù)標準曲線，使檢測步驟更為簡潔，檢測時間短。
[0033] 在上述技術方案的基礎上，本發(fā)明還可以做如下改進。進一步根據(jù)本發(fā)明所述的 褐潮藻種檢測方法，將本發(fā)明所述的特異性引物AanF、AanR和探針Aan probe試劑、藻細 胞標準品DNA提取液、重組質粒標準品等試劑組裝成試劑盒，以檢測試劑盒的形式提供，方 便、快捷的用于褐潮藻種的定性、定量檢測。
【附圖說明】
[0034] 圖1為倒置顯微鏡下的A. anophagefferens藻細胞；
[0035] 圖2為A. anophagefferens重組質粒標準品擴增圖；
[0036] 圖3為A. anophagefferens重組質粒標準品Ct-質?？截悢?shù)標準曲線；
[0037] 圖4為A. anophagefferens藻細胞標準品DNA提取液擴增圖；
[0038] 圖5為A. anophagefferens藻細胞標準品DNA提取液的Ct-藻細胞數(shù)標準曲線；
[0039] 圖6為雙蒸水、中肋骨條藻DNA提取液、三角褐指藻DNA提取液、海洋小球藻DNA 提取液、海洋原甲藻DNA提取液的熒光定量PCR結果。
【具體實施方式】
[0040] 以下結合附圖對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并 非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0041] 一種褐潮藻種檢測方法，包括以下步驟：
[0042] 1)設計并合成特異引物和探針：
[0043] 采用ClustalW軟件比對A. anophagefferens和GenBank中與其親緣關系較近的 藻種（如 Aureoumbra Iagunensis 和 Pelagococcus subviridis)的 18S rDNA 序列，設計 A. anophageff