專利名稱：一種定量檢測塔瑪亞力山大藻的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于利用免疫學方法檢測海洋環(huán)境中微型生物的技術領域。具體地說，本發(fā)明涉及通過競爭性抗原抗體結合抑制檢測塔瑪亞力山大藻的方法和試劑盒，及其用于檢測塔瑪亞力山大藻的用途。
背景技術：
塔瑪亞力山大藻(Alexandrium tamarense)是一種在世界范圍內廣泛存在的浮游植物，也是我國近海常見的甲藻優(yōu)勢種之一。本種是我國近海常見的赤潮生物，曾經有多次引發(fā)赤潮的報道，會引起大量魚類死亡、貝類和人中毒事件，給海洋漁業(yè)和人類健康帶來巨大威脅。因此，及時、準確、快速地檢測塔瑪亞力山大藻，隨時了解其在海洋中的動態(tài)變化具有重要意義。
在分類學上，塔瑪亞力山大藻屬于甲藻門亞力山大藻屬。傳統(tǒng)的鑒別方法，即從形態(tài)學上區(qū)分塔瑪亞力山大藻，主要是利用光學顯微鏡直接觀察和計數，操作時存在一定困難，且過程煩瑣，費時、費力，當樣品量多時工作量極大，主要用于藻的定性和分離，而不適用于藻的定量研究。因此，發(fā)展用于快速檢測塔瑪亞力山大藻的新方法和新技術極具現實意義。但是，目前國內國際關于這方面的研究進展不大，尚未形成非常有效的對藻類進行定性和定量測定的成熟技術。
基于抗體技術的競爭性ELISA方法具有特異、靈敏、高效、易操作、造價低廉等優(yōu)點，且能同時分析大量的樣本，是一種對目標抗原進行定性定量分析的有效手段。目前，競爭性ELISA方法主要在醫(yī)學檢測和微生物學檢測研究中應用，尚未用于對整個藻細胞進行檢測的報道。另外，雖然藻細胞抗體的制備過程簡單，但不易獲得高特異性的抗體。
因此，本領域迫切的需要一種快速檢測塔瑪亞力山大藻的方法。

發(fā)明內容
因此，在本發(fā)明的第一個方面，公開了一種檢測待測樣品中塔瑪亞力山大藻數量的免疫學方法，包括步驟
(a)使固定有塔瑪亞力山大藻細胞裂解碎片的固相載體同時與待測樣品以及抗塔瑪亞力山大藻抗體接觸；(b)將固相載體與待測樣品和抗塔瑪亞力山大藻抗體分開；(c)檢測與固相載體結合的抗塔瑪亞力山大藻抗體的量，所述固定在固相載體上的塔瑪亞力山大藻細胞裂解碎片與待測樣品中的塔瑪亞力山大藻細胞競爭結合抗塔瑪亞力山大藻抗體，而且存在于所述待測樣品中的塔瑪亞力山大藻細胞數目是根據抗塔瑪亞力山大藻抗體與固定在固相載體上的塔瑪亞力山大藻細胞裂解碎片結合或不結合的相對程度測定的。
在該方面的一個優(yōu)選實施方式中，抗塔瑪亞力山大藻抗體是多克隆或單克隆是抗體。更優(yōu)選的，多克隆抗體是通過用塔瑪亞力山大藻細胞、細胞裂解物或細胞分離組分免疫動物制備的，優(yōu)選動物選自兔、鼠、豚鼠、雞、羊、牛、馬、狗、豬。
在該方面的另一個優(yōu)選實施方式中，塔瑪亞力山大藻細胞裂解碎片以106-107細胞/毫升的濃度固定在固相載體上。
在該方面的另一個優(yōu)選實施方式中，步驟(c)的檢測是通過抗塔瑪亞力山大藻多克隆抗體的二抗，其中二抗與標記物偶聯(lián)。優(yōu)選標記物選自放射性同位素、生物素、酶、熒光素或化學發(fā)光物質。更優(yōu)選的酶是辣根過氧化物酶。
在該方面的還有一個優(yōu)選實施方式中，固相載體是酶標板。
在本發(fā)明的第二個方面，公開了一種試劑盒，含有(a)固定有塔瑪亞力山大藻細胞裂解碎片的固相載體；(b)抗塔瑪亞力山大藻細胞的抗體；和(c)偶聯(lián)有標記物的二抗，針對抗塔瑪亞力山大藻細胞抗體。
在本發(fā)明的第三個方面，公開了上述試劑盒的用途，用于檢測塔瑪亞力山大藻細胞。


圖1顯示了抗塔瑪亞力山大藻抗血清效價測定曲線，分別用不同稀釋比例稀釋的包被物包被酶標板，經過常規(guī)ELISA步驟后分別獲得的結果。
圖2顯示了實施例3中用已知濃度的系列稀釋的塔瑪亞力山大藻定標繪制的標準曲線。
圖3顯示了實施例3中根據圖2的標準曲線繪制的直線方程。
具體實施例方式
本發(fā)明的目的是提供塔瑪亞力山大藻免疫學檢測的方法，它可以客觀、準確地對該藻進行檢測。具體包括本發(fā)明提供的檢測方法，即競爭性間接ELISA法，以專一性地識別塔瑪亞力山大藻的抗體作為基礎。
抗體的產生本發(fā)明所述的抗體可以經由塔瑪亞力山大藻免疫實驗動物而獲得，這些實驗動物是本領域技術人員所熟知的，通常包括(但不局限于)兔、鼠、豬、狗、牛、羊、馬等。特異性的抗體可以直接使用，另一方面抗體的特異性可以經由一些常規(guī)的手段，如抗體封閉技術等，得到提高，這也是為本領域內技術人員熟知的，另外，抗體本身也可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學發(fā)光物質進行標記而進行使用。
本發(fā)明所述的抗塔瑪亞力山大藻抗體具有較好的種特異性。利用競爭ELISA測定所述的抗體與其它藻之間的交叉反應率，結果表明它只能識別塔瑪亞力山大藻而不識別其它藻，故可用于塔瑪亞力山大藻的定性鑒別。
本發(fā)明所述的二抗可以經由直接購買通用的二抗或由一種動物的IgG免疫另一種實驗動物而獲得，這一技術是本領域技術人員所熟知的。
與二抗偶聯(lián)的標記物可以是一直接可檢測基團，如金屬溶膠(如金溶膠)、發(fā)色團或熒光團(如花青、酞菁、部花青、三苯基甲基、馬菁)等的結合位點，見應用化學論題，紅外吸收發(fā)色團、M.Matsuoka編，Plenum Press，New York，NY，1990，應用化學論題，染料的化學和應用，Waring等，Plenum Press，New York，NY，1990，和熒光探針和研究化學手冊，Haugland，Molecular Probes，Inc.1996，和放射性標記、酶、磁性顆粒，濁度誘導劑等的結合位點，或它可已攜帶這樣的可直接檢測的基團。
酶聯(lián)免疫檢測技術酶聯(lián)免疫檢測技術具有靈敏度高(可百倍于常規(guī)檢測技術)、操作簡便、步驟可控、高效快速等優(yōu)點，且能同時分析大量的樣本，是一種對目標抗原進行定量分析的有效手段。
標準曲線的確定(1)以塔瑪亞力山大藻細胞裂解液包被酶標板，過夜后用BSA溶液封閉，孵育后洗板，加入已知數量的塔瑪亞力山大藻懸浮液，加入塔瑪亞力山大藻的抗體稀釋液，孵育后洗板，加入酶標二抗溶液，孵育，洗板后加入酶反應底物，孵育后加入終止液終止反應；(2)用酶標儀測定板上各孔的吸光值，經過數據轉換后，得出塔瑪亞力山大藻定量檢測的標準曲線，其線形范圍經過計算得出直線方程，根據得到的方程對待測樣品中的塔瑪亞力山大藻進行定量。
用酶標儀測定板上各孔的吸光值，然后計算出相應的抑制率％，計算公式為A/A0×100％，其中A0為最大值，即加入的已知濃度的藻細胞系列梯度稀釋液中，藻細胞數為0時的吸光值；A為其它各孔的吸光值，接著計算出各孔抑制率的自然對數值，以之為縱坐標，以藻細胞系列梯度稀釋液中藻細胞數目的常用對數值為橫坐標，繪制出塔瑪亞力山大藻定量檢測的標準曲線，找出其線性范圍并計算出抑制率的自然對數值和對應的藻細胞數目常用對數值的直線相關方程，線性相關系數必須在0.99以上。
本發(fā)明的最主要理論基礎是特異性的抗體可以專一地識別特定的抗原決定簇，因而可對抗原進行定性和定量檢測。該方法的基本原理如下一定量的藻細胞經破碎后，裂解物包被于固相載體上(如酶標板等)，經封閉后，同時加入抗體和競爭抗原(即含有目標藻的標準品或待檢測樣品)，這樣，固相上的藻細胞和液相中的藻細胞就會競爭結合抗體，通過檢測固相上競爭到的抗體量即可算出相應的競爭樣本中的藻細胞含量，因此可準確地對未知樣品進行定量測定。
這種分析方法不僅克服了塔瑪亞力山大藻常規(guī)檢測中的缺點，而且分析所需的樣品量少，檢出極限低，靈敏度高。
本發(fā)明首次提供了快速、簡便、大批量定量檢測該藻的方法，使監(jiān)測某海區(qū)或養(yǎng)殖場內海水中塔瑪亞力山大藻的動態(tài)變化成為可能。通過監(jiān)測到的動態(tài)數據，可以掌握海水污染狀況，并即時做出調整以減少經濟損失；同時，將這些動態(tài)數據與其他數據(諸如營養(yǎng)鹽、其他物種的數量、氣象資料等)結合，可為科學研究海洋生態(tài)中各因素之間的相互影響關系提供一些有益幫助。
以下通過實施例進一步說明本發(fā)明實施例1本發(fā)明所用的塔瑪亞力山大藻藻種由中國海洋大學生命科學與技術學部提供。通過反復在顯微鏡下挑取單個藻細胞獲得純培養(yǎng)物。所用的培養(yǎng)基是常規(guī)的f/2培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為光照/黑暗周期為12h/12h，光照強度為4000Lx，培養(yǎng)溫度為22℃～25℃。
處于對數生長期的塔瑪亞力山大藻培養(yǎng)液，用甲醛固定(終濃度1.5～2％)后，10000r/min離心10min收集藻細胞，再用蒸餾水清洗一遍，PBS清洗兩遍，每步均通過離心收集藻細胞，離心條件均為10000r/min，10min。將藻細胞轉入1.5ml Eppendorf管，甩去殘余水分，-20℃保存?zhèn)溆?。臨用前取出，每管用0.6ml滅菌的PBS重懸浮，混勻，與等體積的福氏完全佐劑(SIGMA公司)混合乳化，乳化程度盡量完全，乳化物用于免疫新西蘭大白兔(購自中科院上海生物工程研究中心動物房)，選擇皮下注射和肌肉注射方式，劑量為107個細胞/兔。間隔兩周后加強免疫，除佐劑換為福氏不完全佐劑(購自SIGMA公司)外，其它步驟不變，之后每隔兩周加強免疫一次。從第3次加強免疫后一周，兔耳靜脈取血，分離血清，用常規(guī)ELISA檢測血清效價，當血清效價到達較高水平時，不再免疫，采集家兔全血清，檢驗后分裝保存于-20℃。如圖1所示，最后獲得的抗塔瑪亞力山大藻抗血清效價為1∶64000。
實施例2本實施例選用了膠州灣常見的幾株優(yōu)勢浮游植物作為參照藻，它們是旋鏈角毛藻(Chaetoceros curvisetus)、柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)、纖細角毛藻(Chaetoceros gracilis)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、米氏裸甲藻(Gymnodinium mikimotoi)、裸甲藻(Gymnodinium sp)、諾氏海鏈藻(Thalassiosiranordenskioeldii)、尖刺偽菱形藻(Pseudonitzschia pungens)、新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)、膜質舟形藻(Navicula membranacea)，它們均分離自膠州灣天然海水，通過反復在顯微鏡下挑取單個藻細胞獲得純培養(yǎng)物。按實施例1所述的方法培養(yǎng)和收集這些藻。
用競爭ELISA步驟進行抗塔瑪亞力山大藻抗血清的特異性鑒定。所有藻用1ml PBS重懸浮，顯微鏡計數后，取相同細胞量(3.2×106)懸浮于PBS(終體積1ml)。各個海藻分別用PBS稀釋成濃度梯度。
以塔瑪亞力山大藻細胞裂解液包被酶標板，每孔50-100微升，4℃過夜或37℃，3-5小時后用1-3％BSA溶液封閉，孵育1-2小時后洗板，加入各海藻稀釋液，加入塔瑪亞力山大藻的抗體稀釋液，37℃或室溫孵育30-60分鐘后洗板，加入酶標二抗溶液，37℃或室溫孵育30-60分鐘，洗板后加入酶反應底物，孵育10分鐘后加入終止反應液終止反應。分別作競爭抑制曲線，根據結果算出各個海藻與抗塔瑪亞力山大藻抗血清之間的交叉反應率，結果列于表1。
表1 各海藻與抗塔瑪亞力山大藻抗血清的交叉反應率(％)

從表中可以看出，以塔瑪亞力山大藻的交叉反應率為標準(100％)，其他海藻的交叉率都在3％以下，這樣的反應率是非常低的，說明抗塔瑪亞力山大藻抗血清有很高的特異性，可以專一地識別塔瑪亞力山大藻，因此可用于塔瑪亞力山大藻的定性檢測。
因此，對于某待檢樣品，以本實施例所述的步驟進行競爭ELISA反應，如果有明顯較高的交叉反應率，即可判定該樣品中有塔瑪亞力山大藻的存在；如果該樣品為純培養(yǎng)物，則可判定該純培養(yǎng)物為塔瑪亞力山大藻。這種定性測定方法的優(yōu)點是，由于使用的是塔瑪亞力山大藻的專一性抗血清，因此能非常準確地檢測樣品中是否存在塔瑪亞力山大藻。
實施例31.按實施例1所述的方法培養(yǎng)和收集塔瑪亞力山大藻。
2.以106～107個細胞/毫升的塔瑪亞力山大藻細胞裂解液包被酶標板(每孔100微升)，4℃過夜后用2％BSA溶液封閉，37℃孵育2小時后洗板，加入分別含有40～6.25×106個細胞的塔瑪亞力山大藻梯度稀釋液，加入抗體稀釋液(1∶10000)，37℃孵育45分鐘后洗板，加入酶標二抗溶液(羊抗兔IgG-HRP，稀釋10000倍)，37℃孵育45分鐘，洗板后加入酶反應底物TMB基質液，孵育10分鐘后加入2mol/L硫酸終止反應，讀取板上各孔450nm處的吸光值。
3.標準曲線以塔瑪亞力山大藻標準梯度稀釋液中藻細胞數目的常用對數值為橫坐標，以標準樣品的抑制率(％)，即標準樣品孔吸光值(A)/最大吸光值(A0)×100，為縱坐標，作標準曲線(見圖2)。以塔瑪亞力山大藻標準梯度稀釋液中藻細胞數目的常用對數值為橫坐標，以抑制率的自然對數值，即1n(A/(A0-A)，為縱坐標，建立標準曲線線性范圍的直線方程(見圖3)。
4.定量計算和分析如步驟2所述，加入待測樣品。根據待測樣品的吸光值，首先計算出各自的抑制率，接著計算出抑制率的自然對數值，代入標準曲線的線性方程，求出相應的1g[藻細胞數]值，即可方便地計算出待測樣品中塔瑪亞力山大藻細胞的數目，對應的原始水樣中塔瑪亞力山大藻的濃度也可經過簡單計算得出結果。
實施例4.
以103～104個細胞/毫升的塔瑪亞力山大藻細胞裂解液包被酶標板(每孔100微升)，按實施例3所述的競爭ELISA步驟操作，最后獲得的競爭抑制曲線相關方程為1n(A/(A0-A)＝-1.5534×1g(藻細胞數)+6.2990，線性相關系數為R2＝0.9731，競爭抑制的線性范圍在125000～5000000個細胞之間。
實施例5.
以106～107個細胞/毫升的塔瑪亞力山大藻細胞裂解液包被酶標板(每孔100微升)，按實施例3所述的競爭ELISA步驟操作，最后獲得的競爭抑制曲線相關方程為1n(A/(A0-A)＝-1.2941×1g(藻細胞數)+5.6354，線性相關系數為R2＝0.993，競爭抑制的線性范圍在24～6250000個細胞之間。
實施例6.
以109～1010個細胞/毫升的塔瑪亞力山大藻細胞裂解液包被酶標板(每孔100微升)，按實施例3所述的競爭ELISA步驟操作，最后獲得的競爭抑制曲線相關方程為1n(A/(A0-A)＝-1.0784×1g(藻細胞數)+4.0026，線性相關系數為R2＝0.9888，競爭抑制的線性范圍在10000～6250000個細胞之間。
實施例7以106～107個細胞/毫升的塔瑪亞力山大藻細胞裂解液包被酶標板(每孔100微升)，按實施例3所述的競爭ELISA步驟操作，加入分別含有0～108個細胞的塔瑪亞力山大藻梯度稀釋液時，最后獲得的競爭抑制曲線相關方程ln(A/(A0-A)＝-1.8432×lg(藻細胞數)+6.0041，線性相關系數為R2＝0.9565。
實施例8.
以106～107個細胞/毫升的塔瑪亞力山大藻細胞裂解液包被酶標板(每孔100微升)，按實施例3所述的競爭ELISA步驟操作，加入分別含有50～7×106個細胞的塔瑪亞力山大藻梯度稀釋液時，最后獲得的競爭抑制曲線相關方程為ln(A/(A0-A)＝-1.2941×lg(藻細胞數)+5.6354，線性相關系數為R2＝0.993。
實施例9.
以106～107個細胞/毫升的塔瑪亞力山大藻細胞裂解液包被酶標板(每孔100微升)，按實施例3所述的競爭ELISA步驟操作，加入分別含有0～104個細胞的塔瑪亞力山大藻梯度稀釋液時，最后獲得的競爭抑制曲線相關方程ln(A/(A0-A)＝-1.7796×lg(藻細胞數)+6.1167，線性相關系數為R2＝0.9632。
根據實施例4-9的實驗結果，優(yōu)選用106-107個細胞/毫升的塔瑪亞力山大藻細胞裂解液包被酶標板；用分別含有50～7×106個細胞的塔瑪亞力山大藻梯度稀釋液作為標準競爭抗原。
實施例10根據實施例3所述的方法，對采自青島膠州灣水域的6份海水樣品進行了塔瑪亞力山大藻的競爭ELISA定量檢測。對這6份海水樣品，分別用競爭ELISA法和顯微計數法檢測后，結果列于表2。
表2 海水樣品中塔瑪亞力山大藻數目的定量結果


表2中數據為50微升加樣液(相當于250毫升原始海水樣品)中塔瑪亞力山大藻的細胞數目(個)，均為5次測定結果的平均值±標準差。經比較分析表2中的數據，發(fā)現這兩種方法所獲的定量結果基本相同。說明用競爭ELISA檢測塔瑪亞力山大藻，可獲得與常規(guī)定量方法一樣準確的效果。
本發(fā)明中，發(fā)明人成功地制備了高特異性的抗塔瑪亞力山大藻多克隆抗體，并建立了競爭ELISA方法，應用該方法可定性定量地檢測塔瑪亞力山大藻。發(fā)明人在世界上首次將競爭ELISA方法用于藻細胞的定性定量檢測，并取得了好的結果。
本方法的優(yōu)點本方法最大的優(yōu)點是能同時進行定量和定性檢測，通過該方法既可知道待檢樣品中是否有塔瑪亞力山大藻存在，還可同時知道該藻的數目有多少。本方法的另一個明顯的優(yōu)點是定量結果準確。
另外本方法操作過程簡單、省時，整個過程數小時內即可全部完成，可以實現海區(qū)中塔瑪亞力山大藻的動態(tài)跟蹤監(jiān)測。
權利要求
1.一種檢測待測樣品中塔瑪亞力山大藻數量的免疫學方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)使固定有塔瑪亞力山大藻細胞裂解碎片的固相載體同時與待測樣品以及抗塔瑪亞力山大藻抗體接觸；(b)將固相載體與待測樣品和抗塔瑪亞力山大藻抗體分開；(c)檢測與固相載體結合的抗塔瑪亞力山大藻抗體的量，所述固定在固相載體上的塔瑪亞力山大藻細胞裂解碎片與待測樣品中的塔瑪亞力山大藻細胞競爭結合抗塔瑪亞力山大藻抗體，而且存在于所述待測樣品中的塔瑪亞力山大藻細胞數目是根據抗塔瑪亞力山大藻抗體與固定在固相載體上的塔瑪亞力山大藻細胞裂解碎片結合或不結合的相對程度測定的。我廠
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗塔瑪亞力山大藻抗體是多克隆或單克隆抗體。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述多克隆抗體是通過用塔瑪亞力山大藻細胞、細胞裂解物或細胞分離組分免疫動物制備的，所述動物選自兔、鼠、豚鼠、雞、羊、牛、馬、狗、豬。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，塔瑪亞力山大藻細胞裂解碎片以106-107細胞/毫升的濃度固定在固相載體上。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)的檢測是通過抗塔瑪亞力山大藻多克隆抗體的二抗，其中所述二抗與標記物偶聯(lián)。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述標記物選自放射性同位素、生物素、酶、熒光素或化學發(fā)光物質。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶是辣根過氧化物酶。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相載體是酶標板。
9.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有(a)固定有塔瑪亞力山大藻細胞裂解碎片的固相載體；(b)抗塔瑪亞力山大藻細胞的抗體；和(c)偶聯(lián)有標記物的二抗，針對抗塔瑪亞力山大藻細胞抗體。
10.權利要求9所述的試劑盒的用途，其特征在于，該試劑盒用于檢測塔瑪亞力山大藻細胞。
全文摘要
公開了一種檢測待測樣品中塔瑪亞力山大藻數量的免疫學方法，包括步驟(a)使固定有塔瑪亞力山大藻細胞裂解碎片的固相載體同時與待測樣品以及抗塔瑪亞力山大藻抗體接觸；(b)將固相載體與待測樣品和抗塔瑪亞力山大藻抗體分開；(c)檢測與固相載體結合的抗塔瑪亞力山大藻抗體的量，所述固定在固相載體上的塔瑪亞力山大藻細胞裂解碎片與待測樣品中的塔瑪亞力山大藻細胞競爭結合抗塔瑪亞力山大藻抗體，而且存在于所述待測樣品中的塔瑪亞力山大藻細胞數目是根據抗塔瑪亞力山大藻抗體與固定在固相載體上的塔瑪亞力山大藻細胞裂解碎片結合或不結合的相對程度測定的。還公開了用于該檢測方法的試劑盒及其用途。
文檔編號G01N33/532GK1760673SQ200410067109
公開日2006年4月19日 申請日期2004年10月13日 優(yōu)先權日2004年10月13日
發(fā)明者于志剛, 李榮秀, 辛澤毓, 亓海剛, 米鐵柱 申請人:中國海洋大學, 上海交通大學