一種同時檢測mdr1和cyp19a1基因多態(tài)性的引物與方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時檢測MDR1和CYP19A1基因多態(tài) 性的與及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 多藥耐藥基因（MDR1)編碼P-糖蛋白（P-gp)，它是人體藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中最重要的轉(zhuǎn)運(yùn) 體，能主動將疏水性抗腫瘤藥物栗出胞外，從而減少細(xì)胞內(nèi)藥物濃度。幾乎所有的腫瘤，包 括各種實體瘤、白血病、淋巴瘤等均有MDR1表達(dá)。
[0003] 現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，MDR1基因多態(tài)性直接影響p-gp的表達(dá)，與抗腫瘤藥物與免疫抑制 劑等多種藥物的代謝動力學(xué)有重要關(guān)聯(lián)。 rs1045642(C3435T)、rsll28503(C1236T)和 rs2032582(G2677T/A)是蛋白編碼區(qū)最常見的SNP位點，與藥物代謝密切相關(guān)。MDR1基因 3435 CC/CT型使得MDR1表達(dá)增加，增大腫瘤細(xì)胞的耐藥性，使蒽環(huán)類抗腫瘤藥療效不顯著， 而TT型患者，能較好地吸收化療藥物，使藥物在體內(nèi)維持相對較高的血藥濃度，對藥物較為 敏感。MDR1基因 G2677T/A多態(tài)性，與紫杉醇的療效相關(guān)，2677GG基因型患者的總生存期差于 6八、61'、1'1'、了4基因型患者。
[0004] 芳香化酶是細(xì)胞色素 P450酶超家族成員，編碼基因為CYP19A1，可催化睪酮、雄烯 二酮向雌酮、雌二醇轉(zhuǎn)化，在雌激素生物合成中起最終的限速催化作用。芳香化酶抑制劑 (AIs)通過抑制芳香化酶，使雌激素水平下降，從而消除雌激素對腫瘤生長的刺激作用。絕 經(jīng)后婦女的雌激素主要來源于雄激素前體物質(zhì)在外周組織的芳香化，故該類藥物主要用于 自然絕經(jīng)或人工絕經(jīng)后的乳腺癌患者。阿那曲唑、來曲唑(第三代非留體類AIs)對芳香化酶 的抑制程度可達(dá)99%以上。
[0005] 臨床研究證實，CYP19A1基因多態(tài)性對芳香化酶抑制劑在乳腺癌的治療效果有著 很大的影響作用。在接受來曲唑治療的絕經(jīng)后激素受體陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，攜帶 CYP19A1基因 rs4646G>T突變患者的的疾病進(jìn)展時間比正常者明顯延長。因此，CYP19A1 3'-UTR rs4646G>T是乳腺癌患者接受芳香化酶抑制劑治療療效的有效預(yù)測指標(biāo)。
[0006] 因此，檢測MDR1和CYP19A1基因的多態(tài)性，可以有效的預(yù)測絕經(jīng)期晚期乳腺癌患者 接受芳香化酶抑制劑的治療療效；同時還可以預(yù)測多種抗腫瘤藥物與免疫抑制劑療效及不 良反應(yīng)風(fēng)險，具有重要的臨床價值。
[0007] 中國專利CN102816845B公開了一種MDR1的G2677T/A單核苷酸多態(tài)性檢測試劑 盒，所述試劑盒包括紅細(xì)胞裂解液、DNA提取液、PCR試劑、單鏈純化試劑和測序試劑，可用 于檢測MDRUG2677T/A)位點是否發(fā)生突變。
[0008] 中國專利CN101781684B公開了 CYP19A1基因 SNP檢測液相芯片及檢測方法，所述液 相芯片包括有針對CYP19A1基因的SNP位點分別設(shè)計的野生型和突變型特異性ASPE引物，每 種ASPE引物由5 '端的tag序列和3'端的針對目的基因 SNP位點的特異性引物序列組成。該檢 測方法檢測特異性好，可以實現(xiàn)多個SNP位點的并行檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種同時檢測MDR1和CYP19A1基因多態(tài)性的引物與方法， 該引物主要用于檢測MDR1 基因的MDR1_G2677T/A (SNP: rs2032582)、MDRl_C3435T (SNP: rsl045642)兩個位點和CYP19A1基因 c.*161T>G(SNP:rs4646)位點，具有特異性好、靈敏度 高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點，為MDR1和CYP19A1基因多態(tài)性提供了一種簡單有效的檢測方法。
[0010]本發(fā)明提供了 一種同時檢測MDR1和CYP19A1基因多態(tài)性的引物，包括PCR擴(kuò)增引物 和SNaPshot PCR引物；所述PCR擴(kuò)增引物包括：針對MDR1_G2677T/A的上游引物5 ' -CCCATCATTGCAATAGCAGGAGT-3'（SEQ ID ~0.1)和下游弓丨物5'-GCATGAAAAAGATTGCTTTGAGGA-3 '（ SEQ ID NO · 2 )，針對MDR1_C3435T的上游引物5 ' -GATGGCAAAGAAATAAAGCGACTG-3'（SEQ ID N0.3)和下游弓丨物5'-ACTCGATGAAGGCATGTATGTTG-3 '（SEQ ID NO · 4)，針對CYP19Al_rs4646的上游引物5'_ TCAAACTCTTGGCCTCTGCTTT-3'（SEQ ID N0.5)和下游引物5'- TGGCCCATGGCATTTTATAGG -3' (SEQ ID NO.6);所述SNaPshot PCR引物包括：針對MDR1_G2677T/A的SNaPshot PCR引物5'-TTTTTTATTTAGTTTGACTCACCTTCCCAG-3'（SEQIDN0.7)Ji^tMDRl_C3435lt9SNaPshotPCR 引物5'- TTTTTTTTTTTTTTTGTTGGCCTCCTTTGCTGCCCTCAC-3'（SEQ ID N0.8)Ji^tCYP19Al_ rs4646的SNaPshot PCR引物5 ' - TTTTTTTTTTTTTTTTCTATGGGTTGTCACCAAGCTAGGTGCTATT-3 ' (SEQ ID N0.9)〇
[0011] 進(jìn)一步地，所述 PCR 擴(kuò)增引物中 MDR1_G2677T/A、MDR1_C3435T 和 CYP19Al_rs4646 的 引物濃度比為1:1:1，所述SNaPshot PCR引物中MDR1_G2677T/A、MDR1_C3435T和CYP19A1_ rs4646的引物濃度比為1:1:1。
[0012] 另外，本發(fā)明提供一種同時檢測MDR1和CYP19A1基因多態(tài)性的方法，包括如下步 驟： S1提取DNA樣品； S2以步驟S1提取的DNA樣本為模板，采用權(quán)利要求1中所述的PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化； S3以步驟S2純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用權(quán)利要求1中所述的SNaPshot PCR引物 進(jìn)行SNaPshot PCR擴(kuò)增，并對SNaPshot PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化； S4采用毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行檢測，對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，確定SNP位點及其基因型。
[0013] 進(jìn)一步地，所述步驟S1中的DNA樣品為EDTA抗凝外周血的DNA樣品。
[0014] 進(jìn)一步地，所述步驟S2中的多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:階段1:98°C 3min;階段2: 98°C 10s;階段3:58°C 30s;階段4:72°C lmin;階段5:返回到階段2,29個循環(huán);階段6:72°C 5min;階段7:25°C保溫。
[0015] 進(jìn)一步地，所述步驟S3中的SNaPshot PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:階段1:96°C 10s;階 段2:55°C 5s;階段3:60°C 30s;階段4:返回到階段1，25個循環(huán);階段5:4°C保溫。
[0016] 進(jìn)一步地，所述步驟S4中采用GENEMAPPERID V4.1軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行分析。
[0017] 除此之外，本發(fā)明提供的所述的同時檢測MDR1和CYP19A1基因多態(tài)性的引物在制 備檢測MDR1和CYP19A1基因多態(tài)性試劑中的用途。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有以下優(yōu)勢:本發(fā)明提供的同時檢測 MDR1和CYP19A1基因多態(tài)性的引物具有特異性好，不會發(fā)生交叉反應(yīng)，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點，實 現(xiàn)了同時檢測MDR1和CYP19A1基因多態(tài)性的檢測，可以有效的預(yù)測絕經(jīng)期晚期乳腺癌患者 接受芳香化酶抑制劑的治療療效；同時還可以預(yù)測多種抗腫瘤藥物與免疫抑制劑療效及不 良反應(yīng)風(fēng)險。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明提供的MDR1_G2677T/A基因引物的擴(kuò)增片段； 圖2為本發(fā)明提供的MDR1_C3435T基因引物的擴(kuò)增片段； 圖3為本發(fā)明提供的CYP19Al_rs4646基因引物的擴(kuò)增片段； 圖4為本發(fā)明提供的MDR1和CYP19A1基因 SNaPshot PCR引物的檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0021] 實施例一、引物 本發(fā)明提供的MDR1和CYP19A1基因引物如表1所示，包括PCR擴(kuò)增引物和SNaPshot PCR 引物，所述PCR擴(kuò)增引物和SNaPshot PCR引物是相對應(yīng)的。本發(fā)明提供的所有引物序列均通 過UCSC數(shù)據(jù)庫比對，無已知SNP位點。
[0022]表1本發(fā)明提供的引物
實施例二、引物的特異性 將本發(fā)明提供的引物于UCSC中進(jìn)行Blasting，結(jié)果如下： 1)MDR1和CYP19A1基因